DETECCIN E IDENTIFICACIN DE LOS VIRUS PATGENOS DE CULTIVOS DE GULUPA (Passiflora edulis Sims) EN LA REGIN DEL SUMAPAZ (CUNDINAMARCA) VIVIANA MARCELA CAMELO GARCA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE AGRONOMA Bogot D.C. 2010 DETECCIN E IDENTIFICACIN DE LOS VIRUS PATGENOS DE CULTIVOS DE GULUPA (Passiflora edulis Sims) EN LA REGIN DEL SUMAPAZ (CUNDINAMARCA) VIVIANA MARCELA CAMELO GARCA Cdigo: 790635 Trabajo de grado presentado para optar al ttulo de M. Sc. en Fitopatologa Dirigido por: SCAR ARTURO OLIVEROS GARAY M.Sc. Ph.D. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE AGRONOMA Bogot D.C. 2010 Esteesotropasoenmicaminocomoinvestigadora.Amifamilia,amigosyacadaunadelas personas que me apoyaron y estuvieron a mi lado, muchas gracias. Viviana TABLA DE CONTENIDO 1.RESUMEN1 2.INTRODUCCIN3 3.MARCO TERICO6 3.1. Enfermedades causadas por virus en pasifloras 6 3.1. Principales virus que infectan especies del gnero Passiflora9 3.1.1.Potyvirus9 3.1.2.Cucumber mosaic virus (CMV)12 3.1.3.Passiflora latent virus (PLV)13 3.1.4.Passion fruit yellow mosaic virus (PFYMV)14 4.OBJ ETIVOS15 4.1. Objetivo general 15 4.2. Objetivos especficos15 5.MATERIALES Y MTODOS16 5.1. Muestreo y recoleccin de material vegetal16 5.2. Extraccin de RNA16 5.3. Diseo de primers17 5.4. Retrotranscripcin (RT) y Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)19 5.5. Clonacin y secuenciacin20 5.6. Anlisis de secuencias20 5.7. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)21 5.8. Inoculacin mecnica en plntulas22 6.RESULTADOS Y DISCUSIN23 6.1. Sntomas asociados a infeccin viral en gulupa 23 6.2. Extraccin de RNA25 6.3. Deteccin de virus de gulupa mediante RT-PCR27 6.4. Anlisis de secuencias30 6.5. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)38 6.6. Inoculacin mecnica en plntulas40 7.CONCLUSIONES43 8.AGRADECIMIENTOS44 9.LITERATURA CITADA45 10.ANEXOS51 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Virus reportados que infectan especies del gnero Passiflora. Tabla 2. Primers evaluados para la identificacin de virus en gulupa. Tabla 3. Deteccin mediante RT-PCR de virus que infectan gulupa. Tabla4.DeteccinmedianteRT-PCRdeinfeccionesmixtasporSoybeanmosaicvirusy Cucumber mosaic virus en plantas de gulupa. Tabla5. Descripcin de los aislamientos evaluados mediante RT-PCR usando los primers CI y CP para Soybean mosaic virus. Tabla 6. Distancias genticas del gen CI en aislamientos de Soybean mosaic virus. Tabla 7. Comparacin de procedimientos de deteccin de Cucumber mosaic virus. Tabla8. Comparacin de procedimientos de deteccin de Potyvirus, Soybeanmosaicvirus y Cowpea aphid-borne mosaic virus. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Diagrama de la organizacin del genoma de los virus del gnero Potyvirus. Figura 2. Diagrama de la organizacin del genoma de Cucumber mosaic virus. Figura 3. Diagrama de la organizacin del genoma de los virus del gnero Carlavirus. Figura 4. Sntomas asociados a infeccin viral en frutos de gulupa. (a) Manchas verdes en frutos inmaduros. (b) Manchas anulares en frutos maduros. Figura 5. Sntomas asociados a infeccin viral en rea foliar de gulupa. (a) Deformacin en las puntas terminales de las ramas. (b) Deformacin foliar. (c) Mosaicos foliares y clorosis. Figura6.PatroneselectroforticosdeRNAdeplantasdegulupaqueexhibensntomas sugestivos de infeccin viral, obtenidos mediante dos procedimientos de extraccin de RNA. Figura7. Anlisis RT-PCR empleando primers degenerados para Potyvirus en extractos RNA obtenidos por dos procedimientos de extraccin. Figura 8. Deteccin de Cucumber mosaic virus en plantas de gulupa mediante RT-PCR usando primers especficos. Figura 9. Deteccin de Potyvirus mediante RT-PCR usando primers degenerados. Figura 10. Anlisis PCR empleando primers degenerados de Potyvirus para verificar la presencia del inserto (producto PCR Potyvirus) en los clones seleccionados. Figura 11. Deteccin de Soybean mosaic virus mediante RT-PCR usando primers especficos del gen CI. Figura 12. Deteccin de Soybean mosaic virus mediante RT-PCR usando primers especficos del gen CP. Figura 13. Anlisis PCR empleando primers del gen CI de Soybean mosaic virus para verificar la presencia del inserto (producto PCR SMV) en los clones seleccionados. Figura14. rboles de mxima parsimonia de relaciones filogenticas en el gen CI de Soybean mosaic virus. Los rboles fueron construidos con boostrap de 1000 rplicas. (a) rbol sin raz de las secuencias de SMV. (b) rbol filogentico incluyendo como grupo externo un aislamiento de Cowpea aphid-borne mosaic virus. Figura15. Deteccin de Soybeanmosaicvirus mediante RT-PCR en muestras de plntulas de gulupa provenientes de diferentes viveros de propagacin. Figura 16. Sntomas asociados a infeccin viral en plntulas de gulupa. (a) Mosaicos foliares. (b) Deformacin foliar (plegamientos de lmina foliar). (c) Plantas control no inoculadas. LISTA DE ANEXOS Anexo1.Origengeogrficodelmaterialvegetalrecolectadoyresultadosdelaevaluacin mediante RT-PCR para deteccin de virus en gulupa. Anexo 2. Protocolo de extraccin de RNA protocolo modificado de Chang et al., 1993. Anexo 3. Protocolo de retrotanscripcin (RT). Anexo 4. Protocolo de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Anexo 5. Protocolo de electroforesis en gel de agarosa 1,5%. 1 1.RESUMEN El cultivo de gulupa en Colombia representa un nuevo e importante regln de exportacin del sectorfrutcola.Lainformacinyprcticasagronmicasparaelsistemadegulupason extrapoladasdeotroscultivosdepasifloras,porlocualesprioritarioinvestigarsobrelos problemas fitosanitarios en esta especie. El objetivo del presente trabajo fue detectar virus que infectangulupamedianteprocedimientosserolgicosymoleculares,ydefinirsuidentidad mediante secuenciacin. El muestreo se realiz en cultivos ubicados en la regin del Sumapaz (Cundinamarca). Las plantas evaluadas exhiban sntomas asociados a infeccin viral, tales como manchasverdesenfrutosinmaduros,manchasanularesenfrutosmaduros,deformacinen puntasterminalesderamas,deformacinymosaicosfoliares.Seevaluarontresmtodosde extraccindeRNAapartirdetejidofoliar:CromatografaencolumnadecelulosaCF-11 (Whatman),TRIzolyprotocolodeextraccinparapino.LadeteccinmedianteRT-PCRse realizempleandoprimersespecficosparaCowpeaaphid-bornemosaicvirus(CABMV), Passionfruityellowmosaicvirus(PFYMV), Cucumbermosaicvirus (CMV), Tomatoringspot virus(ToRSV)ySoybeanmosaicvirus(SMV);adicionalmente,seevaluaronprimers degeneradosparalosgnerosPotyvirusyCarlavirus.LapresenciadeCMVyPotyvirusfue detectada mediante RT-PCR, la evaluacin con los otros primers no permiti la deteccin de los otros virus. La identidad nucleotdica de los productos de PCR obtenidos con primers Potyvirus correspondiaSMV.ElanlisisserolgicomedianteELISApermitiladeteccindeCMV, SMV, CABMV y Potyvirus. Este trabajo es el primer reporte de infeccin por SMV y CMV en gulupa. Palabras claves: Extraccin RNA, RT-PCR, ELISA, secuenciacin, Soybean mosaic virus. 2 ABSTRACT The crop of gulupa in Colombia represents a significant new export screed in the fruit sector. Informationandagronomicpracticesforgulupasystemareextrapolatedfromotherpasiflora crops; hence research on plant protection of this specie has been constituted in a priority. The aim of this study was to detect viruses infecting gulupa by serological and molecular procedures, and to define their identity by sequencing. Sampling was performed in crops located in the region of Sumapaz (Cundinamarca). The tested plants exhibited symptoms associated with viral infection, such as green spots on immature fruits, ring spots on mature fruits, deformation on endpoints of branches, leaf deformation and mosaic. We evaluated three methods for RNA extraction from leaf tissue: CF-11 cellulose (Whatman) column chromatography, TRIzol and extraction protocol from pine. The RT-PCR detection was performed using specific primers for Cowpea aphid-borne mosaicvirus (CABMV), Passionfruityellowmosaicvirus (PFYMV), Cucumbermosaicvirus (CMV),Tomatoringspotvirus(ToRSV)andSoybeanmosaicvirus(SMV).Additionally, degenerate primers were evaluated for the genera Potyvirus and Carlavirus. CMV and Potyvirus infections were detected by RT-PCR, the evaluation with the other primers did not allow the detection of other viruses. The nucleotide identity of PCR Potyvirus products revealed to SMV. TheserologicalanalysisbyELISAallowedthedetectionofCMV,SMV,CABMVand Potyvirus. This work is the first report of SMV and CMV infection in gulupa. Key words: RNA extraction, RT-PCR, ELISA, sequencing, Soybean mosaic virus. 3 2.INTRODUCCIN El cultivo de las pasifloras en Colombia representa un importante rengln en el sector frutcola. DentrodelafamiliaPassifloraceaeexisteunagrandiversidaddeespeciesdeimportancia agrcola (maracuy, granadilla, gulupa y curuba), lo que permite brindar una amplia gama de potenciales productos al mercado nacional e internacional (J imnez, 2006). En 1991, la superficie sembrada con especies de Passiflora spp. fue superior a las 5.000 hectreas (Guyot, 1991). En 2003, el rea total sembrada con maracuy fue de 5.089 hectreas y con granadilla fue de 1.821 hectreas. En 2004 el rea sembrada a nivel nacional con maracuy disminuy a 1.890 hectreas y el rea total con granadilla aument a 2.661 hectreas (Asohofrucol y DANE, 2004). El incremento del rea cultivada con pasifloras no ha sido tan acelerado como se proyectaba en 1991, principalmente debido a enfermedades virales y a la falta de asistencia tcnica, unido a factores de comercializacin y mercadeo. Las enfermedades virales en el cultivo de maracuy se presentancomounodelosfactoresmslimitantesdesuproduccin,yaqueafectanel crecimiento del cultivo causando cada prematura de hojas (ms del 50%) y hacen que el cultivo sea improductivo antes de 15 meses de edad (Varn etal., 1991; Fischer & Rezende, 2008). Tambinenmaracuysehareportadoqueelincrementoenlasreascultivadasfavoreceel aumento en la incidencia de virus, especialmente del gnero Potyvirus (Benscher etal., 1996; Hodson, 2005). La gulupa (Passifloraedulis Sims) es una fruta de reciente consumo en el mercado nacional, mientras que su demanda en Europa va en aumento. La exportacin de gulupa hacia ese mercado ocupa el tercer rengln de frutas, despus del banano y la uchuva (J imnez, 2006). En Colombia 4 loscultivosdegulupaseencuentranubicadosentre1.800y2.400msnm.El80%delrea sembrada con gulupa se encuentra en Cundinamarca y el 20% restante se encuentra dispersa entre los departamentos de Boyac, Quindo y Tolima. Por otro lado, las entidades de asistencia a los agricultores(UMATAS)delosmunicipiosdelaregindelSumapazreportanunreatotal sembrada con gulupa de 595 hectreas y una produccin de 6.620 toneladas. En Cundinamarca losprincipalescultivosdegulupaseencuentranubicadosenlaregindelSumapaz,enlos municipiosdeSanBernardo,Venecia,Silvania,GranadayCabrera.Recientementesehan establecido cultivos en el municipio de Tibacuy y en la regin del Tequendama en los municipios de Anolaima y La Mesa. As como en otras especies del gnero Passiflora, entre los factores que limitan la produccin de lagulupaseencuentranplagasyenfermedades,principalmentelasocasionadasporvirusy hongos(Hodson,2005).ProductoresdelaszonasdeCundinamarcareportanprdidasenel cultivodegulupaporproblemasfitosanitariosentreel10%y30%delaproduccinpara exportacin. Aunque la gulupa es un frutal promisorio por sus caractersticas organolpticas de sabor y aroma, son muy pocas las investigaciones sobre los aspectos relevantes del sistema de produccin (J imnez, 2006). En consecuencia, la mayora de las prcticas realizadas son tomadas yadaptadasdeotroscultivosdePassifloraspp.,talescomomaracuyygranadilla.Un acercamiento al conocimiento de los virus presentes en el cultivo de gulupa resulta prioritario, conelfindelograrhacerunmanejoefectivodelcultivo,yevitarladisminucindelrea sembrada y su productividad como sucedi en el cultivo de maracuy. A nivel mundial se encuentra un gran listado de enfermedades virales reportadas para especies del gnero Passiflora (Brunt et al., 1996; Liberato & Murilo, 2003), reflejando la gran diversidad 5 de agentes virales y sntomas que se pueden presentar en los sistemas productivos de pasifloras. EnColombia,especficamenteparaelcultivodegulupanosehanidentificadolosposibles agentesvirales,yparaotrasespeciesdelgneroPassiflora(maracuyygranadilla)hansido reportados Soybean mosaic virus (SMV) (Benscher et al., 1996; Morales et al., 2001) y Passion fruit yellow mosaic virus (PFYMV) (Morales et al., 2001; Morales et al., 2002). Lasestrategiasparaelcontroldelasenfermedadesdeplantascausadasporvirusinvolucran erradicacinodisminucindelpatgenoenunaregingeogrfica,y/ocuandoesfactible incorporando resistencia en la planta econmicamente importante. Un primer paso crtico en el controldeestospatgenoseslaimplementacindeprocedimientosparasudeteccine identificacin(Hadidietal.,1998).Undiagnsticoprecisodelasenfermedadesvirales combinado con una sensible, rpida y temprana deteccin del virus en la planta es crtico para un manejo efectivo del sistema productivo. As mismo, el procedimiento apropiado para el control puede ser efectivamente aplicado nicamente si la enfermedad es correctamente identificada y su distribucin en un rea es conocida (Hadidi et al., 1998). La propuesta presentada en este trabajo est dirigida a detectar e identificar algunos de los virus que infectan los cultivos de gulupa, lo cual constituye el primer acercamiento para definir un correcto diagnstico y plantear estrategias para el manejo de las enfermedades virales en este cultivo. 6 3.MARCO TERICO 3.1. Enfermedades causadas por virus en pasifloras El gnero Passiflora incluye ms de 450 especies (Vanderplank, 1996), las cuales en su mayora son nativas de las regiones tropicales y subtropicales de Suramrica, siendo Brasil el centro de diversidaddelafamiliaPassifloraceae(Fisch,1975;Morton,1987;Aguiar-Menezesetal., 2002). De las 60 especies de pasifloras que producen frutos comestibles, las ms importantes son: P.edulis(gulupa),P.edulisf.flavicarpa(maracuy),P.ligularis(granadilla),P.mollissima (curuba), P.quadrangularis (badea), P.alata (pasionaria dulce), P.caerulea (pasionaria azul) yP.laurifolia(pasionariadelimn)(Aguiar-Menezesetal.,2002;Manicometal.,2003; Naqvi, 2004). P.edulis, P.edulisf.flavicarpa y P.alata son las especies ms cultivadas en el mundo. Los principalesproductoresdepasiflorasseencuentranenSuramrica,principalmenteenBrasil, Colombia,PeryEcuador.TambinseencuentrancultivoscomercialesenAustralia,Hawai, Estados Unidos, India, Nueva Guinea, Kenia, Sudfrica, Sri Lanka y Costa Rica (Manicom et al., 2003). En Colombia, el cultivo de pasifloras fue introducido a mediados de 1950, principalmente en el Valle del Cauca (Morton, 1987). Elconocimientodelosagentescausalesdelasenfermedadesengulupaeslimitadoanivel internacional, por lo cual su estudio se orienta a partir de los hallazgos en enfermedades de otras especiesdelgneroPassiflora,talescomomaracuyygranadilla.Conrespectoalas enfermedadesviraleshansidodescritosunampliorangodevirusqueinfectanpasifloras,los cuales se encuentran listados en la Tabla 1 (Brunt etal., 1996; Liberato & Murilo, 2003). 7 La enfermedad viral causada por Passionfruit woodiness virus (PWV) es la ms importante en los cultivos de maracuy a nivel mundial (Nascimento et al., 2006). Tabla 1. Virus que infectan especies del gnero Passiflora. GNEROESPECIES PotyvirusPassionfruit woodiness virus (PWV) Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) Soybean mosaic virus (SMV) Passion fruit crinkle virus (PCV) Passionfruit mottle virus (PaMV) Passiflora ringspot virus (PFRSV) East Asian passiflora virus (EAPV) Sri Lankan passion fruit mottle virus (SLPMoV) RhabdovirusPassion fruit green spot virus (PGSV) Passion fruit vein clearing virus (PVCV) TobamovirusMaracuja mosaic virus (MarMV) Tobacco mosaic virus (TMV) TymovirusPassion fruit yellow mosaic virus (PFYMV) CucumovirusCucumber mosaic virus (CMV) CarlavirusPassiflora latent virus (PLV) NepovirusTomato ringspot virus (ToRSV) BegomovirusPassion flower little leaf mosaic virus (PLLMV) Passionfruit severe leaf distortion virus (PSLDV) 8 Los sntomas foliares asociados a enfermedades virales en pasifloras son arrugamientos, puntos clorticos,moteados,mosaicosyaclaramientodenervaduras(Liberato&Murilo,2003),en frutossepresentandeformaciones,endurecimiento(woodiness)ymanchas.Encultivosde maracuyygranadilla,lasinfeccionesporSoybeanmosaicvirus(SMV)secaracterizanpor producir acortamiento de entrenudos,mosaicos, defoliacin ymanchas anilladas en los frutos (Benscheretal.,1996).Passionfruitwoodinessvirus(PWV)producemosaicosamarillos, deformaciones foliares y endurecimiento de los frutos (J an & Yeh, 1995; Naqvi, 2004; Rigden & Newett, 2005; Nascimento etal., 2006). Passionfruitgreenspotvirus (PGSV) produce puntos verdesconamarilloenlosfrutos,lesionesnecrticasenlostallosyparchesverdesenhojas senescentes (Kitajima et al., 2003; Moraes et al., 2006). Los principales mecanismos de transmisin de virus en pasifloras son la transmisin por insectos vectores y por lesiones mecnica. Especies de fidos han sido reportadas como vectores de CMV, PLV y virus del gnero Potyvirus (Shukla etal., 1998; Gioria etal., 2002; Nascimento etal., 2006;Spiegeletal.,2007;Haetal.,2008).ElcolepteroDiabroticaspeciosatransmiti experimentalmenteconbajaeficienciaelaislamientobrasilerodePFYMVencondiciones experimentales(Crestanietal.,1986).Lasmoscasblancas(Bemisiatabaci)seencuentran asociadasconlatransmisindevirusdelgneroBegomoviruscomoPLLMVyPSLDV (Novaesetal.,2003;Ferreiraetal.,2010).Asmismo,loscaros(Brevipalpusphoenecis) transmiten PGSV (Kitajima et al., 2003; Moraes et al., 2006). Dos especies virales han sido reportadas en Colombia como agentes causales de enfermedad en el gneroPassiflora,particularmenteenmaracuyy/ogranadilla:Soybeanmosaicvirus(SMV) (Benscheretal.,1996;Moralesetal.,2001)yPassionfruityellowmosaicvirus(PFYMV) 9 (Morales et al., 2001; Morales et al., 2002). El estudio de enfermedades virales en Colombia no ha sido enfocado sobre virus que infectan gulupa. Por lo anterior, se considera que los virus que infectan maracuy y granadilla probablemente infectan gulupa. Un primer acercamiento hacia el diagnstico de enfermedades virales en gulupa ha sido realizado en la clnica de plantas y el laboratoriodebiotecnologavegetaldelaFacultaddeAgronoma(UniversidadNacionalde Colombia,sedeBogot),enelcualmuestrasdeplantasdegulupaprovenientesdeVenecia (Cundinamarca) con sntomas asociados a infeccin viral revelaron la presencia de fragmentos de dsRNA empleando el mtodo de extraccin por cromatografa en columna de celulosa Whatman CF-11, lo cual sugiri la presencia de virus no identificados en este cultivo. 3.2. Principales virus que infectan especies del gnero Passiflora 3.2.1. Potyvirus LafamiliaPotyviridaeeslafamiliamsnumerosadevirusdeplantasconRNAdecadena sencilla con sentido positivo (ssRNA). A partir de las caractersticas genmicas y los vectores de transmisin, los miembros de la familia son clasificados en siete gneros: Potyvirus, Ipomovirus, Brambyvirus,Macluvirus,Tritimovirus,BymovirusyRymovirus,deloscualeselgneroms grande es Potyvirus (Shukla etal., 1998; Ha etal., 2008; Carstens, 2010). Los miembros del gnero Potyvirus tienen partculas largas flexuosas de 650 a 950 nm de longitud y 11 a 15 nmde ancho, su genoma es monoportatita ssRNA con sentido positivo de ~10 Kb y codifica una poliprotena de ~350 kDa (J an & Yeh, 1995; Benscher et al., 1996; Brunt et al., 1996; Fischer & Rezende, 2008). 10 Figura 1. Diagrama de la organizacin del genoma de los virus del gnero Potyvirus. El genoma se caracteriza por una regin 5 no traducida (5 NTR), una protena ligada al genoma (VPg),unnicomarcoabiertodelectura(ORF)yunaregin3notraducida(3NTR) terminando en una cola poliadenilada (polyA) (Figura 1). El ORF codifica una nica poliprotena de350kDaqueesprocesadaendiezprotenasfuncionalesllamadas:primeraprotena(P1), componenteasistenteproteasa(HC-Pro),terceraprotena(P3),6K1,protenadeinclusin cilndrica (CI), 6K2, pequea protena de inclusin nuclear (NIa; incluyendo dominios VPg y proteasa NIa-Pro), gran protena de inclusin nuclear (NIb; replicasa) y protena de cpside (CP) (Shukla et al., 1998; Mlotshwa et al., 2002; Ha et al., 2008). VariasenfermedadesdepasiflorashansidoasociadasconvirusdelgneroPotyvirusen diferentes lugares del mundo. Entre los virus reportados se encuentran Passionfruitwoodiness virus(PWV),Cowpeaaphid-bornemosaicvirus(CABMV),Soybeanmosaicvirus(SMV), Passifloraringspotvirus (PFRSV),Passionfruitcrinklevirus (PCV),Passionfruitmottlevirus (PaMV), East Asian passiflora virus (EAPV) y Sri Lankan passion fruit mottle virus (SLPMoV) (Brunt etal., 1996; Liberato & Murilo, 2003). Los sntomas inducidos por estos potyvirus son variables. PWV y CABMV causan mosaicos, rugosidad y distorsin en las hojas, reduccin del desarrollo de la planta, y endurecimiento y deformacin de los frutos (Fischer & Rezende, 2008). La infeccin con SMV ha sido asociada a mosaicos, epinastia, defoliacin y muerte prematura de lasplantas(Benscheretal.,1996).PasiflorasinfectadasconPFRSVmostraronmoteadosen 11 hojasymanchasanularesenhojasjvenes(DeWijs,1974).PaMVseencuentraasociadoa mosaicos (Chang, 1992). Plantas infectadas con EAPV muestran puntos clorticos en las hojas y moteados o decoloracin en los frutos (Iwai et al., 2006). La mayora de los potyvirus son transmitidos por varias especies de fidos, tales como Myzus persicae, Aphis gossypii, A. spiraecola, Toxoptera citricidus, en una manera no persistente y no circulativa, tambinsontransmitidosmecnicamenteyenlassemillasdealgunoshospederos (Shukla etal., 1998; Nascimento etal., 2006; Fischer & Rezende, 2008; Ha etal., 2008). En cultivos de maracuy de Sao Paulo - Brasil, se observ la transmisin mecnica de CABMV durante las prcticas de podas por cuchillos, tijeras y agujas. As mismo, ninguno de los potyvirus reportados para Passiflora spp. fueron transmitidos por semilla (Fischer & Rezende, 2008). El rango de hospederos de PWV, CABMV, PFRSV, PaMV y EAPV se encuentra restringido a especiesdelasfamiliasPassifloraceae,Fabaceae(Legumonisae),Solanaceae (Nicotiana benthamiana,N.clevelandiiyN.tabacum),Chenopodiaceae (Chenopodiumalbum, C.amaranticoloryC.quinoa)yAmaranthaceae (Gomphrenaglobosa).Algunasespeciesde pasiflorassusceptiblesalosmecionadospotyvirus,desarrollaroninfeccinsistmica,lacual puedesersintomticaolatente.Especiesdefabceaspuedendesarrollarinfeccinsistmica sintomticaolatentedependiendodelainteraccinespecie/variedad/potyvirus.Especiesde nicotianassusceptiblesusualmentedesarrollaninfeccinsistmica,mientrasquelas chenopodiaceas nicamente muestran lesiones locales en las hojas inoculadas (De Wijs, 1974; Chang, 1992; Fischer & Rezende, 2008). 12 3.2.2. Cucumber mosaic virus (CMV) Cucumber mosaic virus es el miembro tipo del gnero Cucumovirus. Se encuentra distribuido en todo el mundo y tiene el rango ms amplio de hospederos de todos los virus que infectan plantas, causandogravesprdidaseconmicasencultivosdehortalizas,frutasyornamentales.Las partculas virales son isomtricas icosahdricas de ~30 nm en dimetro. Figura 2. Diagrama de la organizacin del genoma de Cucumber mosaic virus. El genoma de CMV es RNA de cadena sencilla con sentido positivo dividido en tres segmentos (RNA 1, 2 y 3), los cuales son encapsidados separadamente en la misma protena de cpside, la presencia de las tres partculas es requerida para la infeccin (Figura 2). Los RNA1 y RNA2 codifican las protenas 1a y 2a, respectivamente, las cuales son necesarias para la replicacin de RNA viral en cultivo celular. El RNA2 tambin codifica la protena 2b, la cual probablemente est involucrada en el movimiento del virus a larga distancia especfico del hospedero. El RNA3 codifica dos protenas, 3a y la protena de cpside (CP). La protena 3a es traducida directamente delRNA3mientrasquelaCPestraducidadelRNA4subgenmicoysupesomoleculares26kDa.Estasprotenassonnecesariasparaelmovimientoclulaaclula,mientrasqueCP 13 tambin est implicada en el movimiento a larga distancia del virus (Gioria et al., 2002; Fischer & Rezende, 2008). El virus es transmitido naturalmente por varias especies de fidos en una manera no persistente, y tambin se transmite mecnicamente a plntulas (Gioria et al., 2002; Fischer & Rezende, 2008). La deteccin de CMV en plantas de maracuy (Passiflora edulis f. flavicarpa) fue reportada por primeravezenAustralia.AlgunasinvestigacioneshandetectadoinfeccinmixtadeCMVy PWV;sinembargo,enBrasil,CMVhasidoconsideradounpatgenodemenorimportancia debido a que el virus presenta movimiento sistmico limitado en la planta (Gioria etal., 2002). Los sntomas causados por CMV en pasifloras estn restringidos a pequeas porciones de las ramas, las hojas infectadas presentan puntos o manchas anulares de color amarillo brillante, la intensidaddelossntomasdisminuyehacialapuntadelarama,algunashojasamedidaque crecen pueden volver a ser asintomticas. La reduccin de los sntomas es acompaada por la desaparicindeCMV, yelmecanismoporel cualocurre estefenmenoes andesconocido (Gioria et al., 2002; Rigden & Newett, 2005; Fischer & Rezende, 2008). 3.2.3. Passiflora latent virus (PLV) Passiflora latent virus pertenece al gnero Carlavirus, la secuencia completa de su genoma y su relacin con otros carlavirus se public en el 2007 (Spiegel etal., 2007). Las partculas virales son flexuosas de 600 a 700 nm de longitud y 12 a 13 nm de ancho, su genoma es monoportatita ssRNA con sentido positivo de ~8386 nucletidos excluyendo la cola poliadenilada (Figura 3) (Pares et al., 1997; Spiegel et al., 2007; Gaspar et al., 2008). 14 Figura 3. Diagrama de la organizacin del genoma de los virus del gnero Carlavirus. Elvirusestransmitidoporfidosenunamaneranopersistenteynocirculativa.Elrango experimentaldehospederosdePLVselimitaaPassifloraspp.,Chenopodiummurale, C. amaranticolor y C. quinoa (Spiegel et al., 2007). En todas las especies de Passiflora el virus causa un mosaico foliar sistmico; en C.amaranticolor las lesiones locales son clorticas, y enC. quinoa las lesiones locales son clorticas y se presenta clorosis sistmica (St Hill et al., 1992; Hicks et al., 1996). 3.2.4. Passion fruit yellow mosaic virus (PFYMV) PassionfruityellowmosaicviruspertenecealgneroTymovirus.Laspartculasviralesson isomtricas de ~30 nm en dimetro. La infeccin de Passiflora spp. con PFYMV slo ha sido reportada en cultivos de maracuy de Brasil y Colombia (Crestani etal., 1986; Morales etal., 2002).LossntomascausadosporPFYMVsonmosaicosyamarillamientodenervaduras (Morales et al., 2001), las plantas infectadas exhiben un caracterstico mosaico amarillo brillante. AislamientosdeBrasilhansidotransmitidosmecnicamentesoloaespeciesdePassiflora (Crestani et al., 1986), mientras que aislamientos colombianos se han transmitido a tres especies de Physalis (Morales etal., 2002). El coleptero Diabroticaspeciosa experimentalmente solo transmiti con baja eficiencia el aislamiento brasileo de PFYMV (Crestani et al., 1986). 15 4.OBJETIVOS 4.1. Objetivo general -Detectar e identificar los virus asociados a enfermedades de gulupa (PassifloraedulisSims) en cultivos de las regiones Sumapaz y Tequendama del departamento de Cundinamarca. 4.2. Objetivos especficos -Describir los sntomas asociados a enfermedades virales que presenten las plantas de gulupa en campo, mediante la observacin directa y registro fotogrfico de las plantas muestreadas en los sitios de evaluacin. -Detectar los virus presentes en el cultivo de gulupa mediante RT-PCR y/o ELISA, y definir su identidad mediante secuenciacin. -Confirmarqueelvirusidentificadoesunodelosagentesetiolgicosdelaenfermedad observada en campo, mediante la inoculacin de plantas sanas y evaluacin de expresin de sntomas en invernadero. 16 5.MATERIALES Y MTODOS 5.1. Muestreo y recoleccin de material vegetal El muestreo se realiz en cultivos de gulupa ubicados en diferentes veredas de los municipios Granada, San Bernardo, Tibacuy y Venecia del departamento de Cundinamarca (Anexo 1). En las unidades productivas visitadas se realiz un recorrido para detectar aquellas plantas con sntomas asociados a infeccin viral, tales como manchas verdes en frutos inmaduros, manchas anulares en frutos maduros, deformacin en las puntas terminales de las ramas, deformacin foliar, mosaicos foliares y clorosis. A las plantas con posibles sntomas de infeccin viral se les realiz registro fotogrfico, descripcin de sntomas y recoleccin de tejidos sintomticos. El material vegetal recolectado fue macerado con nitrgeno lquido y almacenado a -80C hasta su procesamiento. 5.2. Extraccin de RNA DebidoaquenoexisteunprotocoloestablecidoparaextraccindeRNAviral enplantasde gulupa, se ensayaron tres procedimientos de extraccin de RNA. Se evaluaron los procedimientos de extraccin de RNA con cromatografa en columna de celulosa Whatman CF-11 (Moreno et al., 1990), TRIzol (Invitrogen) y el protocolo de extraccin de RNA para pino (Chang etal., 1993). El mtodo ms eficiente fue el tercero, al que se le hicieron las siguientes modificaciones: En un tubo Falcon con capacidad mnima de 15 ml conteniendo 2 g del tejido pulverizado, se adicionaron 3 ml de buffer de extraccin (2% CTAB, 100mM Tris HCl pH 8.0, 20mM EDTA, 1,4M NaCl, 1% Na2SO3, 2% PVP-40 y 2% -mercaptoetanol) y se llev a incubacin a 65C por 15minutos.Luego,seextrajodosveceslafaseacuosaagregandounvolumenigualde cloroformo-isoamilalcohol(24:1),ylasfasessesepararoncentrifugandoa12000rpmpor 17 15minutos.Lafaseacuosaobtenida(1ml)fuetransferidaauntuboeppendorfde2ml,se adicion un volumen igual de 4M LiCl2 y se incub a 4C toda la noche para precipitar el RNA. Posteriormente, se centrifug a 12000 rpm por 30 minutos, y el pellet obtenido fue resuspendido en 500 l de buffer TE-SDS (100mM Tris HCl pH 8.0, 1mM EDTA y 1% SDS). A la solucin homogenizadaseleadicionaron700ldeisopropanoly200lde5MNaCl,semezcl invirtiendoeltuboyseincuba-20Cpor30minutos.Finalmente,seprecipitpor centrifugacin a 12000 rpm por 15 minutos, el pellet se lav con etanol al 70%, centrifugando a 12000 rpm por 2 minutos. El pellet obtenido se sec a 40C por 15 minutos y fue resuspendido en 50 l de agua libre de RNasas, finalmente se almacen a -20C (Anexo 2). 5.3. Diseo de primers Los primers empleados en este estudio son listados en la Tabla 2. Los primers para amplificacin por RT-PCR de Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), Passion fruit yellow mosaic virus (PFYMV)ySoybeanmosaicvirus(SMV)fuerondiseadosapartirdelalineamientode secuenciasdepositadasydisponiblesenelGenBank.LosprimersespecficosparaCucumber mosaicvirus(CMV)yTomatoringspotvirus(ToRSV),ylosprimersuniversalesparalos gnerosPotyvirusyCarlavirusfueronpreviamentereportadosyevaluadosenotrosestudios (Cuspoca, 2007; Gaspar et al., 2008; Ha et al., 2008). Los primers PWV-R y PWV-F fueron diseados inicialmente para amplificacin por RT-PCR de Passionfruitwoodinessvirus(PWV)basadosensecuenciasbrasileasdepositadasenel GenBank;sinembargo,elanlisisfilogenticodelassecuenciascompletasdeprotenade cpside (CP) indic una relacin cercana entre los aislamientos brasileros de PWV y CABMV. 18 Por lo cual, todos los aislamientos caracterizados en Brasil fueron clasificados como CABMV, y aquellos designados como PWV en el GenBank fueron reasignados a CABMV (Nascimento et al., 2004; Alfenas et al., 2005; Nascimento et al., 2006). Tabla 2. Primers evaluados para la identificacin de virus en gulupa. VIRUS1PRIMERSSECUENCIA (5 3)PRODUCTO ESPERADO REFERENCIA CABMVPWV-RCAggTgAAgTTCCATTTTCAATgCAC397 pbEste estudio PWV-FgATggAAAggACAAAggATTAgATgC CABMV-RAATgCACCAAACCATgAACCCATTC381 pbEste estudio CABMV-FTCTgATggAAAggACAAAgAATTgg PFYMVPFYMV-RAggAATggAgTCAgATTTggTgTTg326 pbEste estudio PFYMV-FgCgCATgCTTCgATTTCTTTTgCAg CMVCMV-RCgACTTCAACAggCgAgC559 pbCuspoca, 2007 CMV-FCTgAgTgTgACCTAgg ToRSVToRSV-RgCCAAAATgTAATggggc364 pbCuspoca, 2007 ToRSV-FCCTgCAgAAgCAgATTgg SMVCISMV-RCgACTATgAAgTgCggTTTC638 pbEste estudio CISMV-FCAACAggTTTACCACACCAC SMVCPSMV-RgCTgCATCTgAgAAATggTg465 pbEste estudio CPSMV-FgATgCAggTAAggATTCAAg PotyvirusCI-RACICCRTTYTCDATDATRTTIgTIgC~700 pbHa et al., 2008 CI-FggIVVIgTIggIWSIggIAARTCIAC CarlavirusCarlaCP-RggBYTNggBgTNCCNACNgA940 pbGaspar et al., 2008 Carla-FOligo d(T21) 1.CABMV:Cowpeaaphid-bornemosaicvirus.PFYMV:Passionfruityellowmosaicvirus. CMV: Cucumber mosaic virus. ToRSV: Tomato ringspot virus. SMV: Soybean mosaic virus. 19 En este estudio se emplearon primers degenerados debido a que permiten tanto la deteccin de especies conocidas como la de virus desconocidos pertenecientes a un mismo gnero. El diseo delosprimersdegeneradosdependedelassecuenciasdisponibles,porlocualeldiseode primers usando un nmero pequeo de secuencias podra no cubrir las variaciones de especies desconocidas en el respectivo gnero de virus (Langeveld et al., 2001; Zheng et al, 2010). 5.4. Retrotranscripcin (RT) y Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) A partir del RNA obtenido de cada uno de los aislamientos, se sintetiz DNA copia (cDNA) empleandolosdiferentesprimersdiseados(Tabla2)ytranscriptasareversaM-MLV (Invitrogen)(Anexo3).AlRNA(5l)previamentedenaturadoa95Cpor5minutos,sele adicion la mezcla de reaccin (20 l) de RT, que contena una concentracin final de 1X Buffer RT,10mMDTT,0,5mMdNTPs,0,5Mprimerreverso,0,4U/linhibidordeRNasa (RNaseOUT Invitrogen) y 4 U/l transcriptasa reversa M-MLV (Invitrogen). Se realiz un ciclo de retrotranscripcin de 90 minutos a 37C, finalmente la retrotranscriptasa se inactiv a 70C por 10 minutos. Lareaccinencadenadelapolimerasa(PCR)serealizusandoTaqDNApolimerasa (Invitrogen) (Anexo 4). Al cDNA (5l)seleadicion la mezcla de reaccin PCR (20l), que contena una concentracin final de 1X Buffer PCR, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM dNTPs, 0,5 M primer sentido, 0,5 M primer antisentido y 0,04 U/l Taq DNA polimerasa (Invitrogen). Segn los primers empleados, las condiciones de PCR variaron en el nmero de ciclos y la temperatura de alineamiento. Las condiciones generales de PCR fueron: 1 ciclo de 94C por 5 minutos, 30 a 40 ciclos de cada paso de 94C por 30 segundos, 40C a 68C por 1 minuto y 72C por 1 minuto, 20 y un ciclo de extensin final a 72C por 10 minutos (los respectivos programas de amplificacin para la deteccin de cada virus son presentados en el Anexo 4). Los productos de PCR fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, teidos con bromuro de etidio y visualizadosusandoeldocumentadorGelDocTMXR(Bio-Rad).Eltamaodelproductofue determinado usando los marcadores de peso 1 Kb DNA ladder 100 bp DNA ladder (Invitrogen) (Anexo 5). 5.5. Clonacin y secuenciacin Los productos de PCR del tamao esperado para cada virus evaluado, fueron purificados de gel usandoelkitGENECLEAN (Biomedicals)yfueronligadosalplsmidopCR 2.1. Posteriormente, el plsmido ligado fue usado para transformar clulas de Escherichia coli DH5 qumicamente competentes empleando el kit TOPO TA Cloning (Invitrogen). Se recolectaron 10 colonias transformadas y el DNA plsmidico fue extrado por el mtodo ebullicin miniprep (Sambrook et al., 1989). La presencia del inserto se verific mediante PCR. Tres clones de cada producto purificado fueron secuenciados en direccin sentido y antisentido usando los primers universales T7 y M13. 5.6. Anlisis de secuencias Lassecuenciasobtenidasfueroneditadas,ensambladasyalineadasempleandolosprogramas CLC DNA Workbench (CLC Bio) y ClustalW2. La identidad de las secuencias obtenidas se definiusandoelprogramaBLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)quepermitela comparacin con secuencias depositadas en el GenBank. El anlisis filogentico se evalu con el 21 programa MEGA4.1 usando el algoritmo de mxima parsimonia con bootstrap de 1000 rplicas (Tamuraetal,2007),lasdistanciasevolutivasseevaluaronporelmtododeKimura-2 parmetros. En la construccin de los rboles filogenticos se eliminaron las secuencias idnticas. EnelanlisisfilogenticoseincluyeronsecuenciasdelgenCIdeSoybeanmosaicvirus depositadasenelGenBankprovenientesdeCanad(EU871724.1,EU871725.1),Corea (FJ 640955.1, FJ 640966.1, FJ 640975.1, FJ 640976.1) y Estados Unidos (D00507.2, FJ 640979.1) (Seoetal.,2009).TambinseincluycomogrupoexternolasecuenciadelgenCIdeun aislamiento de Cowpea aphid-borne mosaic virus (NC_004013.1). 5.7. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) La deteccin mediante ELISA se realiz para CMV usando un kit ADGENsuministrado por la Dra.AdrianaCastaeda(InstitutoColombianoAgropecuario),paraSMVusandounkit AGDIAy para Potyvirus usando un kit BIOREBA. Tambin se realiz ELISA empleando un anticuerpoparaCABMVsuministradoporelDr.J orgeRezende(UniversidaddeSaoPaulo, Brasil).Seprocesaronalgunasdelasmuestrasrecolectadasencampo,ascomomuestrasde plantas de gulupa inoculadas mecnicamente. Las pruebas ELISA se realizaron siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante de cada kit ELISA. Los resultados se registraron mediante la medicin de la absorbancia a 405 nm, se consideraronmuestraspositivasaaquellasqueduplicaranlamediadelalecturadelcontrol negativo. 22 5.8. Inoculacin mecnica en plntulas Paraconfirmarqueelvirusidentificadoesunodelosagentesetiolgicosdelaenfermedad observada en campo, se realiz inoculacin de plantas sanas de gulupa, las cuales se mantuvieron enuncuartodecrecimiento.Lasplantassanasseobtuvierondeviverosyfueronevaluadas mediante RT-PCR para determinar ausencia de infeccin por SMV y/o CMV. El inculo viral fue tomado de las plantas muestreadas y codificadas como 37, 40 y 50 para inocular mecnicamente plntulas de gulupa. Las muestras seleccionadas se maceraron en un mortero agregando buffer de fosfato salino (PBS) pH 7.2. Antes de ser inoculadas, las hojas jvenes de las plntulas de gulupa se frotaron con carbodorum. Inmediatamente, el extracto obtenido de la maceracin del tejido de plantas infectadas se frot con una gasa estril. Posteriormente se evalu la expresin de sntomas ysedetectlapresenciadelvirusinoculadomedianteRT-PCRalos15despusdela inoculacin. 23 6.RESULTADOS Y DISCUSIN 6.1. Sntomas asociados a infeccin viral en gulupa Untotalde58muestrasdecampofueronrecolectadas:7provienendeGranada,13deSan Bernardo, 4 de Tibacuy, 32 de Venecia y 2 de Ibagu. Adicionalmente, se evaluaron 45 plantas procedentesdeviverosdepropagacin(Anexo1).Comocontrolespositivos,seincluyeron 2 muestras de soya y 2 muestras de maracuy que exhiban sntomas asociados a infeccin viral. Las plantas de gulupa recolectadas presentaban sntomas de infeccin viral en frutos y hojas. Los sntomas caractersticos en frutos fueron diferentes de acuerdo al estado de desarrollo del fruto, siendo manchas verdes en estados inmaduros y manchas anulares en estados maduros (Figura 4). En la parte area de la planta se presentaba deformacin en las puntas terminales de las ramas, deformacin foliar, mosaicos foliares y clorosis (Figura 5).

Figura 4. Sntomas asociados ainfeccin viral en frutos de gulupa. (a) Manchas verdes en frutos inmaduros. (b) Manchas anulares en frutos maduros. (a)(b) 24 Figura 5. Sntomas asociados ainfeccin viral en rea foliar de gulupa. (a) Deformacin en las puntas terminales de las ramas. (b) Deformacin foliar. (c) Mosaicos foliares y clorosis. Losmosaicosyladeformacinfoliarfueronlossntomasqueseobservaronconmayor frecuencia en gulupa. Los sntomas asociados a enfermedades virales en maracuy con mayor frecuencia son vejigas, deformacin foliar, hojas coriceas y mosaicos (Chvez et al., 1999). La presencia de partculas filamentosas de Soybeanmosaicvirus en tejidos de maracuy ha sido asociadaasntomasdedeformacinfoliar,mosaicosymanchasanularesenfrutos(Morales et al., 2001). (a)(b) (c)(c) 25 6.2. Extraccin de RNA SeevaluarontresmtodosdeextraccindeRNAapartirdetejidofoliar:Cromatografaen columna de celulosa Whatman CF11 (Moreno etal., 1990), TRIzol (Invitrogen) y protocolo de extraccinparapino(Changetal.,1993),siendoesteltimomtodoelquepresentmayor eficiencia.LospatroneselectroforticosRNAobtenidosenalgunosextractosdeplantas procedentes de San Bernardo y Venecia correspondieron a fragmentos de 10.000 pb (Figura 6). Figura6.PatroneselectroforticosdeRNAdeplantasdegulupaqueexhibensntomas sugestivosdeinfeccinviral,obtenidosmediantedosprocedimientosdeextraccindeRNA.MP:Marcadordepesomolecular1Kb(Invitrogen).Carril:2y8aislamiento19.3y10 aislamiento 30. 4 aislamiento 33. 5 y 13 aislamiento 40. 6 y 14 aislamiento 42. 9 aislamiento 20. 11 aislamiento 36. 12 aislamiento 39. 15 aislamiento 43. Los productos de cada procedimiento de extraccin de RNA fueron evaluados mediante RT-PCR usandoprimersdegeneradosparaPotyvirus(Anexo3).ApartirdelosextractosdeRNA obtenidos empleando columnas de celulosa Whatman CF-11 y el protocolo modificado de Chang etal.,1993seobtuvo amplificacindeproductosconeltamaoesperado(Figura7).Enlos extractos de RNA obtenidos a partir de TRIzol no se obtuvo producto de PCR. 26 Debido a que el mtodo de Chang et al., 1993 permiti el procesamiento de un mayor nmero de muestrasenunmenortiempo,estefueseleccionadoparacontinuarrealizandoelanlisis mediante RT-PCR de las muestras colectadas en campo. Figura7. Anlisis RT-PCR empleando primers degenerados para Potyvirus en extractos RNA obtenidospordosprocedimientosdeextraccin.LasflechasindicanelproductodePCR esperado (~700 bp). MP: Marcador de peso molecular 1 Kb (Invitrogen). Carril: 1 aislamiento 6. 2aislamiento13.3aislamiento16.4aislamiento27.5aislamiento27.6aislamiento28.7aislamiento31.8aislamiento34.9aislamiento48.10y18aislamiento50.11y19 aislamiento51.13aislamiento30.14aislamiento36.15aislamiento39.16aislamiento40. 17 aislamiento 42. 20 control negativo. Aunque en algunas muestras procesadas no se observ la presencia de patrones electroforticos de RNA que sugieren la presencia de RNA viral, todas las muestras fueron evaluadas mediante RT-PCR usando los diferentes primers diseados. Debido a que el objetivo del presente trabajo esdetectarespeciesviralesqueinfectangulupamedianteprocedimientosserolgicosy/o moleculares, los patrones dsRNA fueron evaluados como fuente de RNA viral ms que como mtodo para definir un patrn electrofortico asociado a una especie viral. En total se obtuvieron 89 aislamientos, de los cuales: 7 provienen de Granada, 10 de San Bernardo, 4 de Tibacuy, 21 de Venecia, 2 de Ibagu y 45 de viveros de propagacin. 27 6.3. Deteccin de virus de gulupa mediante RT-PCR La Tabla 3 presenta los resultados de la deteccin de virus que infectan gulupa, para lo cual se evaluaronprimersespecficosdeseisespeciesviralesyprimersdegeneradosdelosgneros PotyvirusyCarlavirus.LasespeciesevaluadasfueronCowpeaaphid-bornemosaicvirus (CABMV), Passionfruit yellow mosaic virus (PFYMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tomato ringspot virus (ToRSV) y Soybean mosaic virus (SMV). Tabla 3. Deteccin mediante RT-PCR de virus que infectan gulupa. Origen geogrfico Primers especficosPrimers degenerados CABMV PFYMVCMVToRSV SMV PotyvirusCarlavirus PWVCABMVCICP Ibagu0/2b0/2-0/10/10/1-0/20/1 Tibacuy---0/4-1/41/11/4- Granada0/70/20/25/50/50/5-0/50/5 San Bernardo1/90/90/84/100/95/103/65/100/9 Venecia0/150/130/411/190/109/183/55/210/15 Palmiraa---0/4-3/41/33/4- TOTAL Aislamientos campo 1/33 0/26 0/1420/43 0/2518/428/15 14/46 0/30 Viveros---3/45-36/450/81/9- TOTAL1/330/260/1423/880/2554/878/2315/550/30 a: Muestras de plantas de soya y maracuy con sntomas asociados a virus, fueron incluidas como controles positivos. b: Productos positivos de PCR sobre el total de muestras analizadas. AtravsdelaevaluacinporRT-PCRnosedetectinfeccinporPFYMV,ToRSVo Carlavirus. Una muestra proveniente de San Bernardo result positiva para CABMV (Anexo 1). 28 La amplificacin con primers especficos para CMV permiti la deteccin de 20 aislamientos de campo sobre un total de 43 muestras analizadas. El producto de PCR esperado de 559 pb con primers especficos para CMV se muestra en la Figura 8. Los aislamientos de CMV detectados provienen de Granada, San Bernardo y Venecia. Los aislamientos de Granada corresponden a muestrasdecultivoslocalizadosenlasveredasSanRaimundoAlto,La22yGuasimal.Los aislamientos detectados en San Bernardo provienen de cultivos de las veredas San Miguel, Santa Helena y Buenos Aires. Los aislamientos de Venecia son originarios de cultivos de las veredas Aposentos Doa, Aposentos Centro, La Chorrera y El Diamante. En la evaluacin de plntulas de vivero de propagacin, se encontraron 3 plantas infectadas por CMV en una muestra de 45. Figura 8. Deteccin de Cucumber mosaic virus en plantas de gulupa mediante RT-PCR usando primers especficos. La flecha indica el producto de PCR esperado (559 pb). MP: Marcador de peso molecular 1 Kb (Invitrogen). Carril 2 a 13: Aislamientos 19, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 29, 32, 37, 38, 39. Carril 14: Control negativo. La amplificacin con primers degenerados para Potyvirus permiti la deteccin de 11 muestras positivas sobre un total de 42 plantas procedentes de San Bernardo, Venecia y Tibacuy. Tambin se obtuvo amplificacin en 3 de 4 muestras de maracuy y soya provenientes de Palmira, las cuales fueron incluidas como controles positivos. El producto de PCR esperado de ~700 pb con 559 pb 29 primers degenerados de Potyvirus se presenta en las Figuras 7 y 9. La evaluacin de 9 plntulas deviverodepropagacinmostrunamuestrapositiva.LosaislamientosdetectadosenSan BernardoprovienendecultivosdelasveredasSanMiguel,AlejandrayBuenosAires.Los aislamientos de Venecia son originarios de cultivos de las veredas Aposentos Doa, Aposentos Centro y El Diamante. Figura9.DeteccindePotyvirusmedianteRT-PCRusandoprimersdegenerados.Laflecha indicaelproductodePCResperado(~700pb).MP:Marcadordepesomolecular1Kb (Invitrogen). Carriles 2 a 5: Aislamientos 36, 39, 40, 42. Carril 6: Control negativo. Teniendoencuentalosresultadosobtenidos,sedeterminquede83muestrasanalizadas11 presentan infeccin mixta por Soybean mosaic virus y Cucumber mosaic virus (Tabla 4). Las muestras con infeccin mixta provienen de los municipios de San Bernardo y Venecia, tambin se encontr presencia de estos virus en muestras provenientes de viveros. Lo anterior es similar a loreportadoenAustralia,dondeenunamismaplantasehaencontradoinfeccinviralpor Cucumber mosaic virus y Passionfruit woodiness virus, el cual es otro virus del gnero Potyvirus (Gioria et al., 2002; Ridgen & Newett, 2005). ~700 pb 30 Tabla 4. Deteccin mediante RT-PCR de infecciones mixtas por Soybean mosaic virus y Cucumber mosaic virus en plantas de gulupa. Origen geogrfico SMVCMVSMV/CMV CICP Tibacuy1/41/10/40 San Bernardo5/103/64/101 Venecia9/183/511/197 Granada0/5-5/50 Viveros36/450/83/453 TOTAL51/826/2023/8311 a: Productos positivos de PCR sobre el total de muestras analizadas. Lasplantasmuestreadasquepresentaroninfeccinmixtaexhibanclorosis,deformaciny mosaicos foliares. Debido a que dichos sntomas son similares a los exhibidos por plantas con infeccinviralporSoybeanmosaicvirusCucumbermosaicvirus,y/ocondeficiencias nutricionales,esimportantequeeldiagnsticoesteacompaadodeotrosprocedimientosde deteccin.Asmismo,algunasplantasinfectadasconSMV,CMVinfeccinmixtapueden volverse asintomticas dependiendo de las condiciones climticas, el mecanismos por el cual ese fenmeno sucede an es desconocido (Ridgen & Newett, 2005). 6.4. Anlisis de secuencias Los productos de PCR obtenidos con primers degenerados para Potyvirus fueron purificados de gelconelkitGENECLEAN(Biomedicals).Posteriormente,fueronclonadosusandoelkit TOPO TA 2.1 (Invitrogen) con el propsito de secuenciarlos con los primers universales T7 y M13.Antesdesecuenciar,losclonesseleccionadosfueronevaluadosmediantePCRpara confirmar la presencia del respectivo inserto (Figura 10). 31 Figura 10. Anlisis PCR empleando primers degenerados de Potyvirus para verificar la presencia del inserto (producto PCR Potyvirus) en los clones seleccionados. La flecha indica el producto de PCR esperado (~700 pb). MP: Marcador de peso molecular 1 Kb (Invitrogen). A partir de las secuencias obtenidas se realiz anlisis de BLAST con el propsito de definir la identidaddelPotyvirusqueinfectagulupa.Losaislamientoscolombianos30y50mostraron valores de identidad nucleotdica de 95 a 98% con secuencias de aislamientos de Soybean mosaic virus provenientes de Canad, Corea y Estados Unidos (Seo et al., 2009). El producto de PCR del aislamiento 30 present homologa con el gen de la protena de cpside (CP), mientras que el del aislamiento 50 mostr complementariedad con el gen de los cuerpos de inclusin cilndrica (CI). Se disearon dos pares de primers especficos a partir de las secuencias obtenidas de los genes CP y CI, con el propsito de confirmar y ampliar la deteccin mediante RT-PCR de Soybean mosaic virus infectando plantas de gulupa (Tabla 2). Los productos de PCR esperados con los primers especficos para CI (638 pb) y CP (465 pb) se muestran en las Figuras 11 y 12. En la Tabla 5 se describen las muestras evaluadas para cada primer. Se encontr amplificacin en plantas provenientes de Tibacuy, San Bernardo, Venecia y ~700 pb 32 Palmira. Algunas de estas muestras haban sido previamente evaluadas con primers degenerados para Potyvirus. Tambin se evaluaron extractos de RNA de plntulas provenientes de diferentes viveros mediante RT-PCR con los primers CI y CP. Tabla 5. Descripcin de los aislamientos evaluados mediante RT-PCR usando los primers CI y CP para Soybean mosaic virus. CARRILa N MUESTRA ORIGEN GEOGRFICO MUESTRA SMV CICP 131San BernardoHojas gulupa+ - 236San BernardoHojas gulupa+ - 339San BernardoHojas gulupa+ +440San BernardoHojas gulupa+ - 542VeneciaHojas gulupa+ - 648VeneciaHojas gulupa+ +750VeneciaHojas gulupa+ +851VeneciaHojas gulupa+ +956ATibacuyHojas gulupa+ +1056BTibacuyFrutos gulupa+ - 1157APalmiraHojas maracuy+ +1257BPalmiraFrutos maracuy+ - 1358PalmiraHojas soya+ - 1459APalmiraHojas maracuy+ - 1559BPalmiraFrutos maracuy+ - 1661AVeneciaHojas gulupa+ +1761BVeneciaFrutos gulupa+ - 1862Vivero FusagasugHojas gulupa+ - 1963Vivero FusagasugHojas gulupa+ - 2064Vivero FusagasugHojas gulupa+ - 2165Vivero FusagasugHojas gulupa+ - 2266Vivero FusagasugHojas gulupa+ - 2367Vivero FusagasugHojas gulupa+ - 2468Vivero FusagasugHojas gulupa+ - 2569Vivero FusagasugHojas gulupa+ - 2670San BernardoHojas gulupa-- 2771VeneciaHojas gulupa-- 28-Control negativoAgua-- 2930San BernardoHojas gulupa+ - a: El carril corresponde a la posicin de la muestra en los geles de agarosa de las Figuras 8 y 9. 33 Figura 11. Deteccin de Soybean mosaic virus mediante RT-PCR usando primers especficos del genCI.LasflechasindicanelproductodePCResperado(638pb).MP:Marcadordepeso molecular 1 Kb (Invitrogen). Ver descripcin de cada carril en la Tabla 4. Figura 12. Deteccin de Soybean mosaic virus mediante RT-PCR usando primers especficos del genCP.LaflechaindicaelproductodePCResperado(465pb).MP:Marcadordepeso molecular 1 Kb (Invitrogen). Ver descripcin de cada carril en la Tabla 4. 465 pb 638 pb 34 La identidad de los productos de PCR se obtuvo mediante secuenciamiento de nucletidos, y comparacinmedianteBLASTconlassecuenciasdepositadasenelGenBank.Antesde secuenciar, los clones seleccionados fueron evaluados mediante PCR para confirmar la presencia del respectivo inserto (Figura 13). Figura 13. Anlisis PCR empleando primers del gen CI de Soybean mosaic virus para verificar la presenciadelinserto(productoPCRSMV)enlosclonesseleccionados.Laflechaindicael producto de PCR esperado (638 pb). MP: Marcador de peso molecular 1 Kb (Invitrogen). Lassecuenciasobtenidasfueroneditadas,ensambladasyalineadasempleandolosprogramas CLC DNA Workbench (CLC Bio) y ClustalW2 (www.ebi.ac.uk). Al realizar los alineamientos con las secuencias depositadas en el GenBank, las secuencias obtenidas mostraron entre un 95% y 98% de identidad nucleotdica con secuencias de Soybean mosaic virus (Seo et al., 2009). Estos aislamientos provenan de Canad, Corea y Estados Unidos y corresponden a muestras colectadas en soya cultivada (Glycine max) y soya silvestre (Glycine soja), el cual es el principal hospedero de SMV. 638 pb 35 Las secuencias analizadas en el presente estudio mostraron mayor identidad con las secuencias de los aislamientos L y L-RB provenientes de Canad, G5H, G6H, G7H, WS37, WS109, WS128, WS144, WS145, WS149, WS160, WS200, WS202, WS205 y WS209 provenientes de Corea, y N, G1, G2, G3 y G4 provenientes de Estados Unidos. Se realiz la comparacin entre cada una de las secuencias con relacin a porcentaje de identidad y diferencias nucleotdicas para eliminar lassecuenciasidnticasenlaconstruccindelosrbolesfilogenticos.Adicionalmente,se incluycomogrupoexternolasecuenciahomlogadeunaislamientodelpotyvirusCowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV-Z). Para el anlisis filogentico de las secuencias del gen CI de Soybean mosaic virus se incluyeron las secuencias de aislamientos Colombianos obtenidas en el presente trabajo y las secuencias de aislamientosdeCanad,CoreayEstadosUnidosdepositadasenelGenBank.Elanlisisse realiz mediante mxima parsimonia y mxima verosimilitud, encontrndose topologas similares enlosdosalgoritmos.Porloanterior,soloseilustranlosrbolesdemximaparsimonia (Figura14),enlosqueseevidenciandosgruposconunsoportemayoral75%:unode aislamientos de Colombia que infectan pasifloras (P. edulis y P. edulis f. flavicarpa) y soya, y un segundo grupo que infecta soya cultivada y silvestre en Canad, Corea y Estados Unidos. Lo anterior sugiere una estructura de poblacin dependiente del origen geogrfico e independiente del hospedero, lo cual es evidente en los aislamientos SMV de Colombia que se agrupan a pesar de que provienen de diferentes especies (gulupa, maracuy y soya). En el presente trabajo se obtuvieron pocas secuencias del gen de la protena de cpside de SMV, por lo cual no fue posible realizar un anlisis amplio respecto a este gen. 36 61.1|P.edulis|Venecia 58.3|Soya|Palmira 57/59|P.flavicarpa|Palmira 56.3|P.edulis|Tibacuy 58.1|Soya|Palmira 50.3|P.edulis|Venecia 50.2|P.edulis|Venecia WS205|G.soja|Corea WS144|G.soja|Corea WS209|G.soja|Corea N|G.max|EU WS37|G.soja|Corea G4|G.max|EU L|G.max|Canada L-RB|G.max|Canada88967899991 57/59|P.flavicarpa|Palmira 58.1|Soya|Palmira 58.3|Soya|Palmira 61.1|P.edulis|Venecia 56.3|P.edulis|Tibacuy 50.3|P.edulis|Venecia 50.2|P.edulis|Venecia WS205|G.soja|Corea WS209|G.soja|Corea WS144|G.soja|Corea L-RB|G.max|Canada WS37|G.soja|Corea L|G.max|Canada G4|G.max|EU N|G.max|EU CABMV-Z|Zimbabwe8895959420 Figura14. rboles de mxima parsimonia de relaciones filogenticas en el gen CI de Soybean mosaic virus. Los rboles fueron construidos con boostrap de 1000 rplicas. (a) rbol sin raz de las secuencias de SMV. (b) rbol filogentico incluyendo como grupo externo un aislamiento de Cowpea aphid-borne mosaic virus. (a) (b) 37 ElvalordelamediageneraldediversidadnucleotdicaparalareginCIdeSMVes 0,01390,0029 (error estndar). La Tabla 6 presenta los valores de distancias genticas entre pares de secuencias del gen CI en aislamientos SMV que infectan pasifloras y soya en Colombia, respectoaaislamientosqueinfectansoyaenotrospases.Comogrupoexternoseincluyla secuencia del gen CI del aislamiento CABMV-Z de Zimbabwe. Las distancias genticas dentro del grupo de aislamientos colombianos se encuentran en un rango de 0,0016 a 0,0128, y con respectoalgrupodeaislamientosqueinfectansoyaenCoreasepresentandistancias nucleotdicas en un rango de 0,0145 a 0,0259. Tabla 6. Distancias genticas del gen CI en aislamientos de Soybean mosaic virus. AISLAMIENTO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1650.2|P.edulis|Venecia 0,0036 0,0039 0,0039 0,0041 0,0039 0,0039 0,0049 0,0048 0,0045 0,0052 0,0045 0,0054 0,0052 0,0052 0,0269 150.3|P.edulis|Venecia 0,0096 0,0026 0,0026 0,0031 0,0026 0,0026 0,0054 0,0053 0,0051 0,0057 0,0051 0,0060 0,0057 0,0057 0,0273 256.3|P.edulis|Tibacuy 0,0112 0,0048 0,0000 0,0015 0,0000 0,0000 0,0056 0,0055 0,0053 0,0058 0,0053 0,0061 0,0058 0,0058 0,0271 357/59|P.flavicarpa|Palmira 0,0112 0,0048 0,0000 0,0015 0,0000 0,0000 0,0056 0,0055 0,0053 0,0058 0,0053 0,0061 0,0058 0,0058 0,0271 458.1|Soya|Palmira 0,0128 0,0064 0,0016 0,0016 0,0015 0,0015 0,0057 0,0056 0,0054 0,0060 0,0054 0,0061 0,0059 0,0059 0,0271 558.3|Soya|Palmira 0,0112 0,0048 0,0000 0,0000 0,0016 0,0000 0,0056 0,0055 0,0053 0,0058 0,0053 0,0061 0,0058 0,0058 0,0271 661.1|P.edulis|Venecia 0,0112 0,0048 0,0000 0,0000 0,0016 0,0000 0,0056 0,0055 0,0053 0,0058 0,0053 0,0061 0,0058 0,0058 0,0271 7L-RB|G.max|Canada 0,0161 0,0194 0,0210 0,0210 0,0226 0,0210 0,0210 0,0022 0,0015 0,0027 0,0015 0,0040 0,0036 0,0036 0,0263 8L|G.max|Canada 0,0161 0,0194 0,0210 0,0210 0,0226 0,0210 0,0210 0,0032 0,0015 0,0027 0,0015 0,0041 0,0037 0,0037 0,0264 9G4|G.max|EU 0,0145 0,0177 0,0193 0,0193 0,0210 0,0193 0,0193 0,0016 0,0016 0,0022 0,0000 0,0038 0,0034 0,0034 0,0264 10N|G.max|EU 0,0177 0,0210 0,0226 0,0226 0,0243 0,0226 0,0226 0,0048 0,0048 0,0032 0,0022 0,0043 0,0040 0,0040 0,0261 11WS37|G.soja|Corea 0,0145 0,0177 0,0193 0,0193 0,0210 0,0193 0,0193 0,0016 0,0016 0,0000 0,0032 0,0038 0,0034 0,0034 0,0264 12WS209|G.soja|Corea 0,0210 0,0243 0,0259 0,0259 0,0276 0,0259 0,0259 0,0112 0,0112 0,0096 0,0128 0,0096 0,0016 0,0016 0,0266 13WS144|G.soja|Corea 0,0194 0,0226 0,0243 0,0243 0,0259 0,0243 0,0243 0,0096 0,0096 0,0080 0,0112 0,0080 0,0016 0,0000 0,0266 14WS205|G.soja|Corea 0,0194 0,0226 0,0243 0,0243 0,0259 0,0243 0,0243 0,0096 0,0096 0,0080 0,0112 0,0080 0,0016 0,0000 0,0266 15CABMV-Z|Zimbabwe 0,3530 0,3555 0,3557 0,3557 0,3585 0,3557 0,3557 0,3395 0,3422 0,3422 0,3393 0,3422 0,3473 0,3446 0,3446 16 ValoresdedistanciasgenticasestimadasporelmtodoKimura-2parmetrossepresentan debajo de la diagonal y los valores de error estndar se muestran arriba de la diagonal. Columna 16, aislamiento de Cowpea aphid-borne mosaic virus como grupo externo. Un estudio reciente basado en las secuencias completas del genoma de 44 aislamientos de SMV infectando soya, mostr que la estructura de la poblacin de SMV es genticamente conservada, y las protenas P1 y P3 fueron ms variables que otras protenas (Seo et al., 2009). Lo anterior, es similar a lo reportado para secuencias completas del genoma de Cowpeaaphid-bornemosaic virus,dondeP1yP3sonlasprotenasmsvariables,yCI,NIbyCPsonlasprotenasms 38 conservadas(Mlotshwaetal.,2006).LaexistenciadedosgruposdeSMVrelacionadoscon origen geogrfico y que se evidencia a partir del anlisis del gen CI, constituye una observacin original del presente trabajo. Por lo anterior, se recomienda ampliar la evaluacin de secuencias gnicas variables (P1 y/o P3) en un mayor nmero de aislamientos SMV. 6.5. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) LadeteccinmediantePTA-ELISAserealizparaCucumbermosaicvirususandounkit ADGEN. El resultado mostr 7 muestras positivas sobre un total de 24 muestras analizadas. LosaislamientospositivosprovienendeGranadayVenecia(Anexo6).EnlaTabla7se presentanlosresultadosdedeteccindeCMVobtenidosmedianteELISAyRT-PCR.Estos resultados indican que la deteccin de CMV mediante RT-PCR tiene mayor sensibilidad que la evaluacin mediante ELISA. Tabla 7. Comparacin de procedimientos de deteccin de Cucumber mosaic virus. ORIGEN GEOGRFICO DETECCIN CMVa ELISART-PCR Granada San Bernardo Venecia 3/5 0/5 4/14 5/5 4/5 10/14 a: Nmero de plantas positivas / Nmero de plantas evaluadas. 39 La deteccin de Potyvirus se realiz mediante PTA-ELISA usando un kit BIOREBAy para la deteccin de Cowpeaaphid-bornemosaic virus se utiliz un anticuerpo policlonal obtenido por el grupo de investigacin de J . Rezende (Universidad de Sao Paulo, Brasil). Para Potyvirus se encontraron25muestraspositivassobreuntotalde42muestrasanalizadas,losaislamientos positivosprovienendeGranada,Tibacuy,Venecia,SanBernardo,Palmirayviveros.Para CABMVseencontraron11muestraspositivassobreuntotalde42muestrasanalizadas,losaislamientospositivosprovienendeGranada,Venecia,SanBernardo,Palmirayviveros (Anexo 7). La deteccin mediante DAS-ELISA se realiz para Soybean mosaic virus usando un kit AGDIA, se encontraron 17 muestras positivas sobre un total de 42 muestras analizadas, los aislamientos positivos provienen de Venecia, San Bernardo y Palmira (Anexo 7). En la Tabla 8 sepresentanlosresultadosdedeteccindePotyvirus,CABMVySMVobtenidosmediante ELISAyRT-PCR.EstosresultadosindicanqueladeteccinmedianteELISAtienemayor sensibilidad que la evaluacin mediante RT-PCR. Tabla 8. Comparacin de procedimientos de deteccin de Potyvirus, Soybean mosaic virus y Cowpea aphid-borne mosaic virus. ORIGEN GEOGRFICO PotyvirusSMVCABMV RT-PCRELISART-PCRELISART-PCRELISA Granada Tibacuy Venecia San Bernardo Palmira Viveros 0/5a 1/1 5/17 3/8 3/4 - 2/5 1/1 12/17 5/8 3/4 2/7 0/5 1/1 9/17 3/8 3/4 4/7 0/5 0/1 11/17 4/8 2/4 0/7 0/5 - 0/12 1/7 - - 1/5 0/1 3/17 5/8 1/4 1/7 a: Nmero de plantas positivas / Nmero de plantas evaluadas. 40 LapresentedeteccinmedianteELISAdeCowpeaaphid-bornemosaicvirus,eselprimer reporte de infeccin por este virus en pasifloras de Colombia. Sin embargo, para confirmar la presencia de este virus en el pas, es necesario complementar las pruebas serolgicas con anlisis de secuencias y de relaciones evolutivas. 6.6. Inoculacin mecnica en plntulas Con el finde comprobar la transmisin de SMV y CMV en plantas de gulupa se inocularon mecnicamenteplntulassanas.Lasplantasseleccionadasfueronpreviamenteevaluadas medianteRT-PCRparadeterminarausenciadeinfeccinporSMVyCMV,ylasplantas enfermas fueron separadas para hacer seguimiento de expresin de sntomas. Debido a que en las primerasplntulasevaluadassedetectinfeccinviral,seprocediaevaluarplntulasde diferentes viveros, encontrndose la presencia de SMV en el 80% de plntulas evaluadas y CMV en el 8,9% de plntulas evaluadas (Figura 15). Figura15. Deteccin de Soybeanmosaicvirus mediante RT-PCR en muestras de plntulas de gulupa provenientes de diferentes viveros de propagacin. Las flechas indican el producto de PCR esperado (638 pb). Marcador de peso molecular 100 pb (Invitrogen). 638 pb 41 En las plntulas sanas se inocularon los aislamientos 37CMV, 40SMV y 50 que corresponde a un inculodeinfeccinmixtaSMV/CMV(Anexo1).Despusdelainoculacin,serealiz seguimiento para observar la expresin de sntomas. Las plntulas infectadas fueron evaluadas mediante RT-PCR, y las positivas se mantuvieron en un cuarto de crecimiento para evaluar la expresin de sntomas. Aproximadamente a los 3 meses, despu0sdelainoculacin,algunas de las plntulas presentaron mosaicos y deformacin foliar (Figura 16). Los sntomas son similares a los observados en campo, lo cual podra indicar que la sintomatologaquesepresentaenloscultivosdegulupaprovienedelasiembradematerial infectado, por lo tanto es importante al momento de establecer un cultivo garantizar la sanidad del material de propagacin. En un estudio donde se evaluaba la transmisin de aislamientos colombianos de Soybean mosaic virus en plantas de maracuy y granadilla, se concluy que no hay transmisin por semillas y que los fidos Aphis gossypii y Toxoptera citricida pueden transmitir el virus (Benscher et al., 1996). Sinembargo,losfidosenelcultivodemaracuyseencuentranreportadoscomoplagas secundarias, debido a que directamente no ocasionan grandes daos en los cultivos, sino que su importanciaescomovectoresdeenfermedadesvirales;porejemplo,Myzuspersicaey A.gossypiihansidoasociadosconelendurecimientodelosfrutoscausadoporPassionfruit woodinessvirus(Aguiar-Menezesetal.,2002).Porlotanto,engeneralseconsideraquela transmisinmecnicaeselprincipalmecanismodedifusindeenfermedadesviralesenlos cultivosdemaracuy(Fischer&Rezende,2008).Enelcultivodegulupaanfaltamayor discernimiento sobre los mecanismos de transmisin de virus, aunque al igual que en el cultivo de maracuy la presencia de fidos es ocasional. 42 Figura 16. Sntomas asociados a infeccin viral en plntulas de gulupa. (a) Mosaicos foliares. (b) Deformacin foliar (plegamientos de lmina foliar). (c) Plantas control no inoculadas. (a) (b) (c) 43 7.CONCLUSIONES -LadeteccinmedianteRT-PCRyELISApermitiencontrarinfeccinviralporSoybean mosaic virus y Cucumber mosaic virus en los cultivos de gulupa de Cundinamarca. Soybean mosaic virus est presente en los municipios de Tibacuy, San Bernardo y Venecia. Cucumber mosaic virus se encuentra distribuido en los municipios de Granada, San Bernardo y Venecia. La infeccin por Cowpea aphid-borne mosaic virus fue detectada mediante ELISA. -Los sntomas encontrados en campo asociados a infeccin viral en plantas de gulupa son: Manchas verdes en frutos inmaduros, manchas anulares en frutos maduros, deformacin en las puntas terminales de las ramas, deformacin foliar, mosaicos foliares y clorosis. -LassecuenciasdelosproductosdePCRdePotyvirusmostraronvaloresdeidentidad nucleotdica de 95 a 98% con secuencias de aislamientos de Soybean mosaic virus. -La deteccin de Soybean mosaic virus mediante RT-PCR usando primers especficos para CP y CI, permiti obtener secuencias de estos dos genes. El anlisis de relaciones evolutivas de secuencias CI mostr la existencia de dos grupos SMV relacionados con origen geogrfico. -Las plntulas de gulupa provenientes de viveros de propagacin que presentaron infeccin por Soybeanmosaicvirus, exhibieron mosaicosy deformacinfoliar, sntomassimilaresalos observados en campo. Lo anterior indica que la sintomatologa que se presenta en los cultivos de gulupa proviene de la siembra de material infectado, por lo tanto es importante al momento de establecer un cultivo garantizar la sanidad del material de propagacin. 44 8.AGRADECIMIENTOS Agradezco a las entidades financiadoras que me proporcionaron los recursos para llevar a cabo mi investigacin, especialmente al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, Asohofrucol y la Universidad Nacional de Colombia. Mis sinceros agradecimientos a mi director scar Oliveros porsuexcelenteyacertadaorientacin,algrupodeinvestigacinengulupaespecialmentea Ricardo Mora por su constante apoyo, a mis compaeros de laboratorio especialmente a Angela Vargas por sus consejos, y a todos los productores de gulupa que nos permitieron entrar en sus cultivos. De igual forma doy gracias a mi familia por su apoyo incondicional, y a todas aquellas personas que de una u otra forma hicieron posible la realizacin de mi investigacin. 45 9.LITERATURA CITADA 1.Aguiar-Menezes,E.L.,E.B.Menezes,P.C.R.Cassino&M.A.Soares.2002. Passion fruit. pp 361-390. En: Pea, J . E., J . L. Sharp & M. Wysoki (eds.). Tropical fruit pests and pollinators: biology, economic importance, natural enemies and control. CAB International. 2.Alfenas, P. F., A.S.K. Braz, L.B. Torres, E.N. Santana, A.V.S. Nascimento, M. Carvalho, W. C. OtonI & F. M. Zerbini. 2005. 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Partial characterization of a tymovirus infecting passion fruit in Colombia, South America. J ournal of phytopathology 150, 292-296. 34. Moreno, P., J. Guerri & N. Muoz. 1990. Identication of Spanish strains of Citrus tristeza virus by analysis of double-stranded RNA. Phytopathology 80, 477-482. 35. Morton, J. 1987. Fruits of warm climates. Florida Flair Books, Miami. 505p. 49 36. Nascimento,A.,A.Souza,P.Alfenas,G.Andrade,M.Carvalho,G.Pio-Ribeiro&F. Murilo Zerbini. 2004. Anlise filogentica de potyvrus causando endurecimento dos frutos do maracujazeiro no Nordeste do Brasil. Fitopatologa brasileira 29, 378-383. 37. Nascimento,A.,E.Santana,A.Braz,P.Alfenas,G.Pio-Ribeiro,G.Andrade,M.de Carvalho&F.MuriloZerbini.2006.Cowpeaaphid-bornemosaicvirus(CABMV)is widespread in passionfruit in Brazil and causes passionfruit woodiness disease. Archives of virology 151, 1797-1809. 38. Naqvi,S.A.M.H.2004.Diseasesoffruitsandvegetables.VolumeII:Diagnosisand management. Springer 1ra edition. 704p. 39. 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Primer simposio internacional de Passifloras - Memorias, Colombia. 276p. 50. Zheng,L.,B.C.Rodoni,M.J.Gibbs&A.J.Gibbs.2010.Anovelpairofuniversal primers for the detection of potyviruses. Plant pathology 59, 211-220. 51 Anexo1.Origengeogrficodelmaterialvegetalrecolectadoyresultadosdelaevaluacin mediante RT-PCR para deteccin de virus en gulupa. N ORIGEN GEOGRFICOPRIMERS ESPECFICOSPRIMERS DEGENERADOS MUNICIPIOVEREDA PWVCABMVPFYMVCMVToRSVCISMVCPSMVPotyvirusCarlavirus 1VeneciaQuebrada Grande AltaNEc-NENENENENENENE 2VeneciaQuebrada Grande AltaNENENENENENENENENE 3VeneciaQuebrada Grande AltaNENENENENENENENENE 4VeneciaQuebrada Grande AltaNENENENENENENENENE 5VeneciaQuebrada Grande AltaNENENENENENENENENE 6VeneciaAposentos Doa-NENENENENENE-- 7VeneciaAposentos DoaNENENENENENENENENE 8VeneciaAposentos DoaNENENENENENENENENE 9San BernardoAlejandraNENENENENENENENENE 10San BernardoDiamanteNENENENENENENENENE 11San BernardoDiamanteNENENENENENENENENE 12VeneciaLa Chorrera--NENENENENENENE 13VeneciaLa Chorrera-NENENENENENE-NE 14VeneciaLa Chorrera-NE-NENENENENENE 15VeneciaLa Chorrera-NE--NENENENENE 16VeneciaLa Chorrera-NENENENENENE-NE 17GranadaLa 22/Recreo--NENENENENENENE 18GranadaLa 22/Recreo-NENENENENENENENE 19GranadaSan Raimundo Alto-NENE+--NE-- 20GranadaSan Raimundo Alto-NENE+--NE-- 21GranadaLa 22-NE-+--NE-- 22GranadaLa 22-NE-+--NE-- 23GranadaGuasimal--NE+--NE-- 24VeneciaLa Chorrera-NENE---NE-- 25VeneciaLa Chorrera-NENE---NE-- 26VeneciaAposentos Doa-NENE+--NE-- 27VeneciaAposentos Doa--NE+NE-NE-- 28VeneciaEl Diamante--NENENENENE-NE 29VeneciaEl Diamante--NE+NE-NENENE 30San BernardoSan Miguel+----+-+- 31San BernardoSan Miguel--NE--+-+- 32San BernardoSan Miguel---+--NE-- 33IbaguLa Maria--NE---NE-- 34IbaguLa Maria--NENENENENE-NE 35San BernardoAlejandra------NE-- 36San BernardoAlejandra-----+-+- 37San BernardoSanta Helena---+--NE-- 38San BernardoSanta Helena---+--NE-- 39San BernardoBuenos Aires---+-+++- 40San BernardoBuenos Aires-----+++- 41VeneciaAposentos Doa------NE-- 42VeneciaAposentos Doa---+-+-+- 43VeneciaAposentos Doa--NE+--NE-- 44VeneciaAposentos CentroNENENE+-+NE-- 45VeneciaLa ChorreraNENENE+-+NE-- 46VeneciaLa ChorreraNENENE+-+NE-- 47VeneciaLa ChorreraNE-NE--+NE-- 48VeneciaEl DiamanteNE-NE-NE+++- 49VeneciaEl DiamanteNE-NE+NE-NE-NE 50VeneciaEl DiamanteNE-NE+NE+++- 51VeneciaEl DiamanteNE-NE+NE+++- 52Vivero Fusagasuga-NENENE-NE-NE-NE 53Tibacuy-NENENE-NE-NE-NE 54Tibacuy-NENENE-NE-NE-NE 55Tibacuy-NENENE-NE-NE-NE 56Tibacuy -NENENE-NE+++NE 57Palmira (Maracuy)b-NENENE-NE+++NE 58Palmira (Soya)b-NENENE-NE+-+NE 59Palmira (Maracuy)b-NENENE-NE+-+NE 60Palmira (Soya)b-NENENE-NE-NE-NE 61VeneciaAposentos CentroNENENE-NE+++NE 62Vivero Fusagasuga-NENENE-NE+--NE 63Vivero Fusagasuga-NENENE+NE+-+NE 64Vivero Fusagasuga-NENENE-NE+--NE 65Vivero Fusagasuga-NENENE-NE+--NE 52 N ORIGEN GEOGRFICOPRIMERS ESPECFICOSPRIMERS DEGENERADOS MUNICIPIOVEREDA PWVCABMVPFYMVCMVToRSVCISMVCPSMVPotyvirusCarlavirus 66Vivero Fusagasuga-NENENE-NE+--NE 67Vivero Fusagasuga-NENENE-NE+--NE 68Vivero Fusagasuga-NENENE-NE+--NE 69Vivero Fusagasuga-NENENE-NE+--NE 70San Bernardo-NENENE-NE---NE 71Venecia-NENENE-NE---NE 72Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 73Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 74Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 75Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 76Vivero Cotaa-NENENE-NE-NENENE 77Vivero Cotaa-NENENE-NE-NENENE 78Vivero Cotaa-NENENE-NE-NENENE 79Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 80Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 81Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 82Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 83Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 84Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 85Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 86Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 87Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 88Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 89Vivero Cotaa-NENENE+NE+NENENE 90Vivero Cotaa-NENENE+NE+NENENE 91Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 92Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 93Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 94Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 95Vivero Cotaa-NENENE-NE+NENENE 96San Bernardoa-NENENE-NE+NENENE 97San Bernardoa-NENENE-NE+NENENE 98San Bernardoa-NENENE-NE-NENENE 99San Bernardoa-NENENE-NE+NENENE 100Veneciaa-NENENE-NE+NENENE 101Veneciaa-NENENE+NE+NENENE 102Veneciaa-NENENE-NE-NENENE 103Veneciaa-NENENE-NE-NENENE 104In vitro - Corpoicaa-NENENE-NE+NENENE 105In vitro - viveroa-NENENE-NE+NENENE 106Vivero Fusagasuga-NENENE-NE-NENENE 107Vivero Fusagasuga-NENENE-NE-NENENE a:Plntulasdediferenteprocedencia.b:Muestrasdeplantasdesoyaymaracuyconsntomas asociados a virus, incluidas como controles positivos. c. No evaluado. 53 Anexo 2. Protocolo de extraccin de RNA protocolo modificado de Chang et al., 1993. 1.Agregar en un tubo Falcon con capacidad mnima de 15 ml, aproximadamente 2 g de tejido vegetal infectado, previamente macerado en nitrgeno lquido. 2.Calentar en un bao mara el buffer de extraccin a 65C. Adicionar al tubo 3 ml de buffer deextraccin.Mezclarinvirtiendoeltuboydarvrtexpor10segundos.Posteriormente, llevar a bao mara por 15 minutos a 65C. 3.Retirar del baomarayagregar 3 ml de cloroformo - isoamil alcohol (24:1), para mezclar dar vrtex por 10 segundos. Llevar a centrifugacin a 8000 rpm por 15 minutos a 15C. 4.Transferirlafaseacuosaaunnuevotubofalcn,aproximadamente2mlparaevitartomar elementosdelafaseorgnica.Agregar2mldecloroformo-isoamilalcohol(24:1),para mezclardarvrtexpor10segundos.Llevaracentrifugacina8000rpmpor15minutosa 15C. S las fases no se separan, volver a centrifugar. 5.Transferirlafaseacuosaauntuboeppendorfde2ml,aproximadamente1mlparaevitar tomar elementos de la fase orgnica. Agregar 1 ml de LiCl2 4M. Llevar a incubacin toda la noche a 4C para precipitar el RNA. 6.Centrifugara12000rpmpor30minutosa4C.Descartarelsobrenadanteyresuspenderel pellet en 500 l de buffer TE-SDS. 7.Adicionar 700 l de isopropanol y 200 l de NaCl 5M. Mezclar invirtiendo el tubo y llevar a incubacin por 30 minutos a -20C. 8.Centrifugara12000rpmpor10minutosa4C.Descartarelsobrenadanteylavarelpellet con 500 l de etanol al 70%. Centrifugar a 12000 rpm por 2 minutos a 4C. 9.Descartar el sobrenadante y secar el pellet a 40C por 30 minutos. Resuspender en 50l de agua libre de RNasas. Almacenar a -20C. 54 Preparacin de soluciones para la extraccin de RNA: a.Tris HCl pH 8.0 1M -Tris base121,1 g -H2O800 ml Disolver, ajustar el pH a 8.0 adicionando HCl y llevar a 1000 ml. Esterilizar. b.EDTA pH 8.0 0,5M -EDTA186,1 g -H2O800 ml Disolver, ajustar el pH a 8.0 con lentejas de NaOH y llevar a 1000 ml. La disolucin del EDTA se produce cuando el pH es cercano o igual a 8.0. c.NaCl 5M -NaCl292 g -H2O800 ml Llevar a 1000 ml y esterilizar. d.Agua libre de RNasas DisolverDEPCal0,2%enaguaMQyllevaraagitacintodalanoche.Posteriormente esterilizar. 55 e.Buffer de extraccinPara 1000 ml -CTAB2%2 g -Tris HCl pH 8.0100 mM10 ml de Tris HCl pH 8.0 1 mM -EDTA20 mM5 ml de EDTA pH 8.0 0,5 M -NaCl1,4 M40 ml de NaCl 5M -Na2SO31%1 g -PVP- 402%2 g CompletarelvolumenrestanteconagualibredeRNasas,agitarfuertementeycalentarhasta disolver. Esterilizar y posteriormente agregar 2% de -mercaptoetanol. f.Cloroformo - isoamil alcohol (24:1) Para 100 ml -Cloroformo96 ml -Isoamil alcohol4 ml g.Buffer TE- SDS -Tris HCl pH 8.0 1M1 ml -EDTA pH 8.0 0,5M0,2 ml -SDS1% Llevar a 100 ml con agua libre de RNasas y esterilizar. 56 Anexo 3. Protocolo de retrotanscripcin (RT). Concentracin de los reactivos ReactivoCiCfVf = 25 l Buffer5x1x5 l DTT0,1 M10 mM2,5 l Primer reverse25 M 0,5 M0,5 l dNTPs 25 mM0,5 mM0,5 l RNaseOUT40 U/l0,4 U/l0,25 l M-MLV200 U/l4 U/l0,5 l H2O--10,75 l RNA--5 l Procedimiento 1.Agregar en un tubo eppendorf de 200 l, 5 l de RNA. Denaturar a 95C por 5 minutos. 2.Llevar inmediatamente a hielo por 3 minutos. 3.Agregar 20 l de la mezcla de reaccin RT (preparada de acuerdo a la tabla anterior). 4.Ejecutar en el termociclador el siguiente programa: -90 minutos a 37C -10 minutos a 70C - a 4C 5.Diluir las muestras adicionando el doble del volumen de la reaccin (25 l de agua MQ). 57 Anexo 4. Protocolo de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Concentracin de los reactivos ReactivoCiCfVf = 25 l Buffer10x1x2,5 l MgCl2 50 mM2,5 mM1,25 l Primer reverse25 M 0,5 M0,5 l Primer forward25 M 0,5 M0,5 l dNTPs 25 mM0,5 mM0,5 l Taq DNA polimerasa 5 U/l0,04 U/l0,2 l H2O--14,55 l cDNA--5 l Procedimiento 1.Agregar en un tubo eppendorf de 200 l, 5 l de cDNA. 2.Agregar 20 l de la mezcla de reaccin PCR (preparada de acuerdo a la tabla anterior). 3.Segn los primers empleados, seleccionar en el termociclador el programa de PCR. PWVCABMVPFYMV 5 minutos a 94C5 minutos a 94C5 minutos a 94C 35x30 a 94C35x30 a 94C35x30 a 94C 30 a 65C30 a 60C30 a 60C 45 a 72C45 a 72C45 a 72C 10 minutos a 72C10 minutos a 72C10 minutos a 72C 58 CMVToRSVCISMV 5 minutos a 94C5 minutos a 94C5 minutos a 94C 30x30 a 94C35x45 a 94C35x30 a 94C 1 a 48C45 a 58,3C1 a 57,5C 1 a 72C90 a 72C1 a 72C 10 minutos a 72C10 minutos a 72C10 minutos a 72C CPSMVPotyvirusCarlavirus 5 minutos a 94C5 minutos a 94C5 minutos a 94C 35x30 a 94C40x30 a 94C35x1 a 94C 1 a 57,5C30 a 40C1 a 50C 1 a 72C1 a 72C2 a 72C 10 minutos a 72C10 minutos a 72C10 minutos a 72C 59 Anexo 5. Protocolo de electroforesis en gel de agarosa 1,5%. 1.Agregar en un erlenmeyer, 1,5 g de agarosa y 80 ml de TAE 1X. Disolver calentando. 2.Adicionar 3,2 l de bromuro de etidio (0,5 mg/ml) y homogenizar la mezcla. 3.Servir en la mezcla y dejar que gelifique. 4.Sembrar las muestras dentro de los pozos, mezclando ~5 l de los productos de PCR con ~5 ldebuffercarga2X.Enelprimerpozosembrar1ldelmarcadordepeso(1KbDNA ladder o 100 bp DNA ladder (Invitrogen).) 5.CorrerelgelenlacmaradeelectroforesishorizontalconTAE1X,a80Vdurante60 minutos. 6.Alfinalizareltiempodecorrido,retirarelgelyvisualizareneldocumentadorGelDocTM XR (Bio-Rad) con luz ultravioleta. 7.Fotografiar y guardar la imagen en el equipo. 60 Anexo 6. Deteccin mediante ELISA de Cucumber mosaic virus infectando gulupa. N MUESTRA ORIGEN GEOGRFICO RT-PCR ELISAMUNICIPIOVEREDA 19GranadaSan Raimundo Alto+- 20GranadaSan Raimundo Alto+- 21GranadaLa 22++ 22GranadaLa 22++ 23GranadaGuasimal++ 24VeneciaLa Chorrera-- 25VeneciaLa Chorrera-- 26VeneciaAposentos Doa+- 27VeneciaAposentos Doa++ 29VeneciaEl Diamante+- 32San BernardoSan Miguel+- 35San BernardoAlejandra-- 37San BernardoSanta Helena+- 38San BernardoBuenos Aires+- 39San BernardoBuenos Aires+- 43VeneciaAposentos Doa+- 44VeneciaAposentos Centro+- 45VeneciaLa Chorrera+- 46VeneciaLa Chorrera++ 47VeneciaLa Chorrera-+ 48VeneciaEl Diamante-+ 49VeneciaEl Diamante+- 50VeneciaEl Diamante+- 51VeneciaEl Diamante+- 60 Anexo 7. Deteccin mediante RT-PCR y ELISA de Potyvirus, Soybean mosaic virus y Cowpea aphid-borne mosaic virus infectando gulupa. N MUESTRA POTYVIRUSSMVCABMV RT-PCRELISART-PCRELISART-PCRELISA MUESTRAS GRANADA 19------ 20-----+ 21-+---- 22------ 23-+---- MUESTRAS TIBACUY 56+++-NE- MUESTRAS VENECIA 25------ 26------ 27------ 41-+-+-- 42++++-- 43-+-+-- 44-+++-- 45--+-NE- 46-++-NE- 47-+++-- 48++++-- 49-+-+-+ 50++++-- 51++++-+ 52----NE+ 61++++NE- 71-+-+NE- MUESTRAS SAN BERNARDO 32-+-+-+ 35-+---+ 36+-+--+ 37-----+ 38-----+ 39++++-- 40++++-- 70-+-+NE- MUESTRAS PALMIRA 57++++NE- 58+-+-NE- 59++++NE- 60-+--NE+ MUESTRAS VVEROS 96NE-+-NE- 97NE-+-NE- 100NE++-NE- 101NE-+-NE- 102NE+--NE+ 103NE---NE- 106NE---NE-