ANTICUERPOS MONOCLONALESHEMOCLASIFICADORESLic. Ren A. Rivero Jimnez, MSc.INSTITUTO DE HEMATOLOGIA E INMUNOLOGIA

SISTEMAS DE GRUPOS SANGUNEOS DE MAYOR IMPORTANCIA CLNICAABORH

Sistema ABO1901: Primer sistema descubierto por Karl LandsteinerSolo dos antgenos, A y B podan explicar la existencia de 4 grupos: A, B, AB, OPero los antgenos A y B son el resultado del funcionamiento sinergstico de dos sistemas genticos independientes:El Hh, donde el gen activo H (cromosoma 19) crea una enzima que funciona aadiendo azcares a un substrato precursor, antes de la accin de los genes A y B (cromosama 9)

Sistema ABOAntgeno HAntgeno AAntgeno BCeramidaFucosaGalactosaGlucosaN-acetilglucosaminaN-acetilgalactosamina

Sistema ABOEritrocitos SueroGenotipos Fenotiposa Anticuerpos GlucosiltransferasasA1A1, A1A2, A1OA1Anti-B -3-N-acetilgalactosaminilA2A2, A2OA2Anti-Bb -3-N-acetilgalactosaminilcBB, BOBAnti-A -3-galactosilA1BA1B--- -3-N-acetilgalactosaminil y -3-galactosilA2BA2B---b -3-N-acetilgalactosaminil y -3-galactosilOOOAnti-A y Anti-B----Leyenda: aDefinido por antisueros anti-A, anti-B, y anti-A1. bAnti-A1 algunas veces presente en el suero de individuos de los grupos A2 y A2B. cN-acetilgalactosaminiltransferasas en sueros del grupo A2 difieren en las propiedades cinticas de las enzimas en sueros del grupo A1.

Fenotipo A1Fenotipo A2AHSistema ABO

Sistema ABOExpresin antignica:Forma soluble (secretores)Saliva y todos los lquidos corporales, excepto el LCROtras clulas sanguneasLinfocitos, plaquetas (adsobidos del plasma).TejidosEn casi todas la cel epiteliales (epitelio glandular) y sobre clulas endoteliales. Amplia distribucin en tejidos (Histo-sanguneos)

Los heterocigotos no se distinguen de los homocigotos: A1A1, A1A2 y A1O: todos reaccionan igual con Anti-A.Frecuencia de los grupos ABO en Cuba:Grupo% AA127,67A28,26variantes dbiles0,75B11,2ABA1B2,28A2B0,81O49,03Becomo AA et al. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1997; 13(2): 124-131. 3,0936,68Sistema ABO

Caractersticas Generales de los Anticuerpos ABO:Alta importancia clnica.Normalmente aparecen anticuerpos naturales en los individuos que no portan el antgeno en sus eritrocitos (evento nico en la serologa de los grupos sanguneos).Se usan de forma habitual para la determinacin de los grupos sanguneos (grupo reverso).Son aglutininas fras usualmente clase IgM.Activan el Complemento.Causan hemlisis cuando son activos a 37 C (calientes).

Sistema ABO

Sistema ABOAnticuerpos ABO:Desarrollo con la edad: En sangre de cordn umbilical Anti-A y Anti-B clase IgG de origen materno. Se detectan en lactantes entre 3-6 meses de nacidos (clase IgM). Mayor titulo se alcanza entre 5 y 10 aos de edad.

exterior

interior

membrana

Banda 3 transportador de aniones

Banda 4 transportador de glucosa

Cadena lateral

Cadena lateral

Protena Rh

Epitopo D

Se descubri en 1940 por Weiner y Landsteiner.Despus del ABO, el ms importante en la clnica:Anti-Rh causa reaccin transfusional hemolticaIncompatibilidad madre-hijo: enfermedad hemoltica del feto y del recien nacido.Se han descrito hasta 52 antgenos.Antgeno D: define condicin de POSITIVO. Otros antgenos: C,c,E,e,d. Antgeno D: mosaico antignico, determinado por epitopos.Sistema Rh

Sistema RhExpresin:Eritrocitos de sangre de cordn.No formas solubles.Tejidos: Especficos de la lnea eritroide.Cromosoma: 1p36.13-p34.3Nombre de genes: RHD, RHCENombre del producto de los genes: polipptido RhD, polipptido RhCE.No. de exones: RHD 10, RHCE 10.

Sistema RhEl polimorfismo del RhD es nico.La mayora de los que portan el gen D, tienen un polipptido D completo.Pero existen variantes dbiles, por expresin disminuda o incompleta.Anticuerpos vs. Rh(D):. Los aloanticuerpos anti-Rh(D) son inmunes por su origen (no naturales).Clase IgG, usualmente IgG1 y o IgG3.Pocas veces fijan ComplementoAparecen en individuos D negativos o en D parciales

Produccin de reactivos hemoclasificadores basados en sueros humanos policlonales:Cada lote es una mezcla diferente de molculas obtenidas de distintos donantes.Cada lote se comporta de forma diferente frente a las expresiones dbiles del Ag. Hay diferente avidez.Pueden presentar poli aglutinacin frente al antgeno crptico Tn. Se requiere obtener un policlonal anti A,B, para corroborar la reactividad del Anti-A y del Anti-B.Se requieren tcnicas manuales bien realizadas.

Generacin de hibridomas:

Ventajas de los Reactivos basados en AcM:

Cada reactivo monoclonal es:Una aglutinina directa.Slo una clase de Inmunoglobulina (IgM, IgA o IgG).De slo una especificidad epitpica.De slo una avidezNo contiene Ac contaminantes.

Produccin de los AcM:Altamente laboriosa e intensiva en la etapa de generacin de hibridomas, clonajes y caracterizacin de las lneas clulares.Ms simple en la etapa de produccin a gran escala.Cada reactivo puede ser:Un nico AcMUna mezcla de AcMGeneralmente, los anti-A, anti-B y anti A,B son mezclas., para que funcionen mejor en los distintos mtodos de hemaglutinacin.

Especificaciones para garantizar la calidad de los reactivos hemoclasificadores basados en AcM:Establecer la concentracin o titulo de AcM y condiciones de la solucin amortiguadora (pH, conc. Salina).Clonaje celular por 3 veces, garanta de la monoclonalidad.Crear bancos de clulas semilla Maestros y de Trabajo.Cada lote se debe generar a partir de un criotubo del hibridoma congelado. Cultivar y expandir las clulas mediante pases seriados por no mas de 3 meses. Despus de este tiempo: desechar los cultivos.

Errores que se deben evitar:AcM de alta afinidad: pueden detectar los fenmenos B(A) o A(B): cantidades muy pequeas del antgeno contrario presentes normalmente en algunos individuos. Solucin: diluir los AcM.Algunos AcM anti-B detectan el Ag B adquirido (no el B real sino una estructura estrica muy similar, que produce alta reaccin). Se adquiere por infecciones de algunas bacterias, enfermedades reumticas, etc. Solucin: formular el reactivo en pH alcalino.Algunos AcM producen reaccin en monocapa en tubos y microplacas. Solucin: Tratar microplacas y tubos con Tween. Aadir albmina o gelatina a la formulacin en un bajo % (albmina como mximo 3%, gelatina como mximo 1%). Mejor: albmina 2-3%, gelatina 0.05%. Ayuda a la estabilidad del reactivo.

Problemas para la obtencin del anti-D monoclonal:Mosaico D:Ag D es un mosaico de mas de 30 eptopos.Cada AcM detecta un solo eptopo.No todas las clulas D+ expresan todos los eptopos de D.Du= D normal pero con bajo numero de sitios en eritrocitos. Cada Anti-D monoclonal es diferente. Ningn AcM Anti-D detecta a todas las variantes, todos dejan algo.El problema es escoger al que detecta a los mas importantes eptopos para una correcta clasificacin.Prueba de Anti-Globulina (Coombs): algunas variantes raras de D pueden dar FALSO POSITIVAS. En realidad no se deben transfundir con SANGRE Rh+, ya que D completo inmuniza.

Ag D no es inmunognico para ratones BALB/c: imposible obtener monoclonales murinos anti-D.Si se inmunizan humanos, se obtienen AcM clase IgG (poco aglutinantes): se debe seleccionar molculas IgG3: molcula mas abierta mejor aglutinante.Produccin de AcM anti-D humanos:Sangre de donantes inmunizadosLeucocitos + VEBLnea celular B transformada + / -fusinClonajesAcM Anti-D IgG - IgM

Reglas de Oro de la Calidad en reactivos hemoclasificadores:Nivel seguro en el titulo de anticuerpos.La especificidad, potencia, y avidez dependen de la concentracin.Medicin de la concentracin de Ac por ELISA. Ej. Uso de conjugado anti-IgM o IgG de ratn.Garanta del pH final del producto: rango general 6.5-7.2.Se adiciona HEPES cuando se cosechan los sobrenadantes.Fortaleza inica elevada, incrementa la actividad del reactivo.

ADITIVOS:EDTA: previene la lisis, especialmente en eritrocitos no lavados. Tambin previene la degradacin por proteolisisGelatina: mejora la avidez, evita que los Ac formen monocapa con eritrocitos.Colorantes: Coloracin intensa puede afectar resultados en microplacas.

Control de Calidad:Chequeo sistemtico para demostrar que todo se hizo correctamente en la produccin:Pruebas:EspecificidadReaccin completa: 4+Potencia: A o B1/64 con fenotipos fuertes A1 o BTitulacin con 2% de SAB1/8-16 con fenotipos dbiles: A2B o A1Bpara mantener la conc. deprotenas mientras se diluye.Avidez: segn protocolo 5-10 segundos.Adicional: medir concentracin de azida, conc. protenas, pH y fuerza inica.

Mtodos de Produccin:En animales de experimentacin: Liquido asctico murino (LAM).Ej. Anti-A, Anti-B.En biorreactores de fibra hueca: Todos, pero en particular el anti-D.(Mejores que los tanques agitados para la concentracin de Ac).Chequear niveles de glucosa en el medio.Comenzar con SFB 5% y disminuir hasta 1% en el espacio extracapilar (las clulas y el SBF deben estar en el EE, mientras el medio se bombea al espacio intracapilar.La estabilidad de las lneas celulares mejora con los reclonajes.NUEVAS TECNOLOGIAS:Bibliotecas de fagos. Fragmentos de anticuerpos. Ingeniera de anticuerpos.

Nos vemos en Hematologa Habana 2005!!Mayo 16-20, 20054to Congreso de la Sociedad Cubana de Hematologa