ADN SATÉLITE EN Agave fequ/./ana Tesis que presenta · DIAGRAMA GENERAL DEL PROCESO DE CLONACIÓN...
84
POSGRAD0 EN CIENCIAS BloLÓGICAS Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C. Posgrado en Ciencias Biológicas lDENTIFICACIÓN Y LOCALIZACIÓN DE REGIONES ADN SATÉLITE EN Agave fequ/./ana Tesis que presenta LAURA ANGÉLICA ESPINOSA BARRERA En opción al título de MAESTRO EN CIENCIAS (Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología) Mérida, Yucatán, México Marzo 2014 JkvJ =i LiJ íJ 0¥??>:, €`_Ít3Y
Transcript of ADN SATÉLITE EN Agave fequ/./ana Tesis que presenta · DIAGRAMA GENERAL DEL PROCESO DE CLONACIÓN...
POSGRAD0 EN
CIENCIASBloLÓGICAS
Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
lDENTIFICACIÓN Y LOCALIZACIÓN DE REGIONES
ADN SATÉLITE EN Agave fequ/./ana
Tesis que presenta
LAURA ANGÉLICA ESPINOSA BARRERA
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)
Mérida, Yucatán, México
Marzo 2014JkvJ
=iLiJíJ0¥??>:,
€`_Ít3Y
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN, A. C.
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
POSGRAD0 EN
CIENCIASBloLÓGICAS
RECONOCIMIENTO
Pormediodelapresente,hagoconstarqueeltrabapdetesistituladoIDENTIFICACIÓN
Y LOCALIZACIÓN DE REGIONES ADN SATÉLITE EN Agave fequí/ana fue realizado en
los laboratorios de la Unidad de Biotecnología del Centro de lnvestigación Cientifica de
Yucatán, A C baio la dirección del Dr Lorenzo Felipe Sánchez Teyer y el Dr Luis Carlos
Rodriguez Zapata, dentro de la opción de Biotecnologia, perteneciente al Programa de
Dr. Felipe Augusto Vázquez Flota
Coordinador de Docencia
Mérida, Yucatán, México, a 26 de febrero de 2014.
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN, A. C.
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
RECONOCIMIENTO
Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado lDENTIFICACIÓN
Y LOCALIZACIÓN DE REGIONES ADN SATÉLITE EN Agave Íequ/./ana fue realizado en
los laboratorios de la Unidad de Recursos Naturales del Centro de lnvestigación Científica
de Yucatán, A.C. bajo la dirección del Dr. Lorenzo Felipe Sánchez Teyer, dentro de la
opción de Biotecnologia, perteneciente al Programa de Posgrado en Ciencias (Ciencias
Coordinador de Docencia
Mérida, Yucatán, México, a 26 de febrero de 2014.
DECLARACION DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de lnvestigación
Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los
servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos
de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad lndustrial, le pertenece
patrimonialmente a dicho Centro de lnvestigación. Por otra parte, en virtud de lo ya
manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le
pertenecen patrimonialmente al Centro de lnvestigación Científica. A.C., y en el mismo
tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley
Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad lndustrial, en el tenor de lo
expuesto en la presente Declaración.
Firma:
Nombre: lBQ. LAUFm ANGÉLICA ESPINOSA BARRERA
AGRADEcllv]lENTOS
AI CONAcyT por la beca otorgada No. 334651.
Al proyecto de ciencia básica, Rejuvenecimiento mediante cultivo /.n-v/.fm: Agave un
modelo, con el número de proyecto CB-2012-01000000000180757 CONAcyT, otorgado
al Dr. Lorenzo Felipe Sánchez Teyer.
AI Centro de lnvestigación Científica de Yucatán en especial a la unidad de biotecnología
por proporcionar los equipos necesarios para el desarrollo de este trabajo.
A mis asesores el Dr. Lorenzo Felipe Sánchez Teyer y el Dr. Luis Carlos Rodríguez
Zapata por la excelente formación académica brindada, gracias por su asesoría, ideas y
consejos para la realización de este proyecto.
A mi comité tutorial integrado por el Dr. Luis Carlos Rodríguez Zapata, Dr. Lorenzo Felipe
Sánchez Teyer, Dra. Clelia de la Peña Seaman y Dra. Elizabeth Ortíz Vázquez por sus
observaciones para mejorar este trabajo durante los cuatro exámenes tutoriales.
A mi comité rev.isor integrado por Dr. Luis Carlos Rodríguez Zapata, Dr. Lorenzo Felipe
Sánchez Teyer, Dra. Clelia de la Peña Seaman, Dra. Elizabeth Ortíz Vázquez y Dra. Rosa
María Escobedo Gracia-Medrano por sus valiosas observaciones para la redacción de
esta tesis.
A la M. en C. Adriana Quiroz Moreno por su apoyo técnico, consejos y observaciones
durante la realización de este proyecto.
A la técnica Q.F.B. Matilde Margarita Oníz García por el apoyo técnico en el laboratorio
durante la realización de la tesis.
A mis compañeros del Laboratorio de Marcadores Moleculares y Genómica funcional, a la
Dra. María Tamayo Ordoñez por su asesoramiento, apoyo técnico y sugerencias con la
finalidad de siempre mejorar la tesis; a la M. en C. Yahaira Tamayo Ordoñez por sus
consejos, sugerencias y conocimientos en el laboratorio y seminarios; al M. en C. Antonio
Rescalvo Morales por su apoyo en las técnicas de Southern Blot y FISH, sin su apoyo no
hubiera podido terminar a tiempo; al M. en C. Javier Huijara Vasconcelos por su apoyo en
conceptos básicos desde que ingrese a este grupo y por sus sugerencias en los
seminarios; a la M. en C. Adriana Quiroz y a la M. en C. Zamaria De la torre Espinosa por
su valioso apoyo en los momentos difíciles, por tus consejos y palabras de aliento; al
l.B.Q. Gerardo Campos Rivero, a la l.B.Q. María José García y a la estudiante Ana G.
Camacho Contreras por sus comentarios durante los seminarios.
A mis compañeros de la generación 2012-1 integrado por Teresita, Sara, lleana, Deysi,
Rosa María, Jorge, Rafael y Daniel por su valiosa amistad y apoyo durante los momentos
en los que nos desvelábamos para estudiar y sacar buenas notas, espero que esa unión
permanezca durante mucho tiempo.
A la M. en C. Nallely Cocom, a la M en C. Rosa Us Camas, a la M. en C. Fanny Cámara y
a la l.B.Q. Yahaira Cab Guillen por §u amistad y apoyo en esta nueva etapa de mi vida,
sin alguna de ustedes no hubiera sido lo mismo, que nuestra amistad perdure por
siempre.
DEDICATORIAS
A mis padres la Sra. Laura Barrera Medina y al Sr. José Alfredo Espinosa Pech por su
apoyo incondicional, cariño, comprensión y por siempre creer en mí.
A mis hermanos José Ernesto y Fernando Eduardo por su comprensión y cariño.
A Eduardo Chávez por su apoyo incondicional, por estar a mi lado motivándome a
continuar, haciendo este trabajo más agradable y emocionante.
A mis amigas Tere, Sara e lleana que me han acompañado y motivado a nunca
conformarme con menos.
INDICE
INTRODUCCIÓN
CAPÍTULO 1
ANTECEDENTES
1.1. REGIONES REPETIDAS
1.1.1 ADN SATÉLITE Y SUS APLICACIONES
1.1.2. AISLAMIENTO DE REGIONES ADN SATÉLITE
1.2.1. BIBLIOTECAS GENÓMICAS
1.2.2. AUTO PCR
1.2.3. RESTRICCIÓN ENZIMÁTICA
1.2. GENERALIDADES DE AGAVE
1.2.1. LA FAMILIA AGAVACEAE
1.2.2. CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS Y MORFOLÓGICAS DE AGAVE
1.2.3. lMPORTANCIA DEL GÉNERO AGAVE
1.2.4. CARIOTIPO DE AGAVE
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
JUSTIFICACIÓN
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
BIBLIOGRAFÍA
CAPÍTULO 11
.................. 1
.......,..... 3
10
il
13
13
14
15
16
........................ 23
CARACTERIZACIÓN DE REGIONES DE ADN SATÉLITE EN AGAVE 7-Eou/LAM ............ 23
2.1. lNTRODUCCIÓN
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1. 2.2.1. MATERiAL BioLÓGico
2.3. RESULTADOS
2.4. DISCUSIÓN
2.5. BIBLIOGRAFÍA
LOCALIZACIÓN DE ADN SATÉLITE EN A. rEQu/L,4wA
3.1. lNTRODUCCIÓN
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS
3.3. RESULTADOS
3.5. BIBLIOGRAFÍA
CAPÍTULO IV
4.1. DISCUSIÓN GENERAL
4.2. CONCLUSIONES
4.3. PERSPECTIVAS
4.4. BIBLIOGRAFIA
23
24
24
32
37
41
45
45
46
49
53
LISTADO DE FIGURAS
FIGURA 1. AGAVE rEou/LAWA
FIGURA 2. GIMA DE AGAVE 7EQU/LAWA
FIGURA 3. DIAGRAMA GENERAL DE LA ESTRATEGIA EXPEF`lMENTAL
FIGURA 4. CONDICIONES DE PCR TOUCHDOWN
FIGURA 5. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DEL VECTOR PGEM T-EASY ..... „ ...... 28
FIGURA 6. DIAGRAMA GENERAL DEL PROCESO DE CLONACIÓN
FIGURA 7. TRANSFERENCIA DE ADN
FIGURA 8. PRODUCTO DE DIGESTIONES PARCIALES
FIGURA 9. ELECTROFORESIS EN GEL DE ACRILAMIDA
FIGURA 10. SOUTHERN BLOT
28
31
32
33
35
FIGURA 11. HIBRIDACIÓN W S/TU FLUORESCENTE DE SECUENCIAS ADN SATÉLITE EN A.
TEQUILANA
FIGURA 12. HIBRIDACIÓN W S/TU FLUORESCENTE DE CÉLULAS EN METAFASE DE A.
TEQUILANA 50
ÍNDICE DE TABLAS
TABLA 1. LOCALIZACIÓN DE REGIONES REPETIDAS EN GENOMAS EUCARIOTAS .... „ ....... 5
TABLA 2. APLICACIÓN DEL ADN SATÉLITE
TABLA 3. EJEMPLOS DE LA APLICACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO AGAVE .... „ .... „ 11
TABLA 4. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
TABLA 5. CARACTERISTICAS DE LAS SECUENCIAS
TABLA 6. MOTIVOS EN SECUENCIAS ADN SATÉLITE DE ESPECIES PERTENECIENTES A LA
CLASE LILLIOPSIDE
'V
RESUMEN
EI ADN satélite es una secuencia repetida en tándem que se encuentra en la
heterocromatina. Se ha documentado que bloques del ADN satélite se localizan en el
centrómero, telómero o regíones intersticiales de los cromosomas, sugiriendo que
desempeñan un papel impohante en la estructura de la cromatina. Este tipo de regiones
muestra una alta divergencia en la secuencia de los monómeros y en algunas ocasiones
en el número de copias, indicando la presencia de regiones variantes en los cromosomas.
Se sugiere que los arreglos uniformes de regiones satélite centroméricas sufren una
rápida evolución debido a procesos moleculares que favorecen la aparición de nuevos
polimoriismos en periodos de tiempo cortos. Esta característica es útil para realizar
análísis filogenéticos y de diversidad entre especies de un mismo género o entre
variedades de una misma especie.
El género Agave está constituido por especies con diferente nivel de ploidía, cuya
información sobre la presencia de regiones de ADN satélite en el genoma es
desconocida, por lo que en este trabajo el objetivo fue el estudio del ADN satélite en A.
tequilana.
Para identificar el ADN satélite se aislaron fragmentos por AUTO PCR, obteniendo seis
secuencias que posteriormente fueron caracterizadas. Se realizaron alineamientos
múltiples y se encontró que son diferentes en tamaño y composición. Así mismo, se
encontró que companen motivos con otras secuencias de ADN satélite de especies
pertenecientes a la clase Lilliopside. Mediante la técnica de hibridación Í.n s/.Íu fluorescente
se localizó el ADN satélite en núcleos y células en metafase de A. fequí./ana que indican la
presencia de una señal, lo cual sugiere que estos se encuentran en una sola posición en
un solo cromosoma de A. Íequ/./ana.
ABSTRACT
Satellite DNA is a tandem repeated sequence which is found as a part of the
heterochromatin. Satellite DNA has been found on the centromer, telomere and interstitial
chromosomal regions, suggesting an important role in the heterochromatin's structure.
These regions show high divergence of the monomer sequence and sometimes in the
number of copies, which implies the presence of variable regions within the chromosomes.
lt has been suggested that the uniform arrangement of the centromeric satellite regions
evolve fast due to molecular processes which favors the formation of new polymorphisms
in short periods of time. This characteristic is useful when performing phylogenetic and
diversity analy§is between species of the same genus or among varieties of the same
species.
The Genus Agave is constituted by species with different ploidy levels, and these are used
on the production of natural fibers, steroidal sapogenins and as ornamental plants. Until
this moment, knowledge on the presence of satellite DNA regions on these plants
genomes has been unavailable, for that reason the main objective of this work was the
localization of satellite DN regions in A. Íequ7./ana.
For the satellite DNA identification, fragments were isolated using self-priming PCR, six
sequences were obtained and characterized. Multiple sequences were aligned and found
to have different sizes and compositions. lt was also found that motifs are shared with
other species within the Liliopsida class. The localization of those sequences within the
nucleus and metaphase cells indicates the presence of a single signal, suggesting that
they are found in one position on an individual chromosome of A. £equ/./ana.
lNTRODUCCIÓN
INTRODUCCION
EI ADN en los organismos eucariotas está compuesto de regiones repetidas, tales como
los retroelementos, transposones, ADN ribosomal, ADN telomérico y ADN satélite.
Estudios citogenéticos han demostrado que estas se pueden localizar a lo largo de los
cromosomas, específicamente en zonas pericentroméricas, subteloméricas y teloméricas
(Heslop-Harrison, 2000). En plantas se ha reportado que el ADN repetitívo representa
entre el 10-50% de su genoma, sin embargo, como A///.um oepa, estas regiones pueden
llegar a representar alrededor del 90-95% (Kubis eí a/.,1998; Flavell eí a/.,1974). Debido
a la alta representatividad de estas regiones se ha sugerido que desempeñan un papel
jmponante en la variabilidad, evolución y divergencia de las plantas, asociado a cambios
genéticos de estas regiones que contribuyen al tamaño y estructura de los cromosomas,
influyendo significatjvamente en la variación del genoma (Flavell,1986; Piegu eí a/., 2006;
Neumann eí a/„ 2006 y Hawkins eí a/., 2006).
De acuerdo a Kubis ef a/., (1998), estas regiones pueden ser divididas en dos grupos con
base a su localización, est᧠son: 1) regiones repetidas en tándem (ADN ribosomal, ADN
telomérico y ADN satélite), que son aquellas que se encuentran posicionadas una tras de
otra, y 2) las regiones repetidas dispersas (transposones y retroelementos) Ias cuales se
encuentran en todo el genoma. La región satélite son regiones de ADN que han utilizado
para el estudio del origen y evolución de poliploides y se clasifican como regiones
repetidas en tándem.
En el género Agave se han descrito especies poliploides; hasta el momento no se conoce
la relación filogenétíca entre estas especies, por lo que resulta interesante el desarrollo de
un marcador molecular que permita buscar una relacíón filogenética entre estas. AsÍ
mismo, se fundamente interesante el desarrollo de un marcador molecular que discrimínar
entre variedades pertenecientes a una especie.
Debido a lo mencionado anteriormente la identificación y caracterización de una región
satélite representatíva de una especie, en este caso Agave Íequ/./ana, está a la
expectativa. En este trabajo, a manera de contribuir con este aspecto, se aislaron e
identificaron secuencias de ADN satélite, que a futuro puedan ser un marcador molecular
entre las especies del género Agave.
CAPÍTULO 1
CApiTULO I
ANTECEDENTES
1.1. Regiones repetidas
La variabilidad genética es atribuida al ADN repetitivo, catalogado en dos categorías: las
secuencias repetidas en tándem, las cuales son copias adyacentes de secuencias en una
serie de varias decenas o incluso miles de copias; y las secuencias repetidas dispersas
que se encuentran dispersas a lo largo de todo el genoma (Heslop-Harrison, 2000).
Las secuencias repetidas en tándem se encuentran en posiciones específicas de los
cromosomas, como en las regiones pericentroméricas, las regiones subteloméricas,
teloméricas y regiones intersticiales. Los elementos de ADN dispuestos en tándem
incluyen diferentes tipos, entre estos destacan las secuencias repetidas: ADN telomérico,
ADN ribosomal y ADN satélite (Tabla 1). Estas regiones repetidas en tándem se
describen a continuación:
ADN repetido en tándem.
a) EI ADN telomérico es un tipo de secuencia repetida en tándem que se localiza
hacia las regiones terminales de los cromosomas. Estas regiones consisten en un
motivo repetido y se han descrito en plantas dos motivos (tipo Arab/`dops/.s y humano),
el cual es conservado en la mayoría de las plantas.
b) En eucariotas, los genes ribosomales (ADNr) se organizan en dos loci. El primero,
incluye los genes ADNr 18S, 5.8S y 28S (locus ADNr 45S), y el segundo locus
contiene solo el gen ADNr 5S (locus ADNr 5S) (Eickbush y Eickbush, 2007; Martins y
Wasko, 2004). Dentro de la unidad ADNr 45S se incluyen regiones promotoras, una
región intergénica (lGS), dos espaciadores transcritos internos (lTS) y dos
espaciadores transcritos extemos (ETS). En la unidad ADNr 5S, el gen ADNr 5S se
encuentran separado por una región intergénica o NTS. Los genes ADNr 5S y 18S al
ser transcritos a ARN ribosomal (ARNr) foman pahe del ribosoma, el cual está
compuesto de dos subunidades, una grande (60S) y una pequeña (40S). El gen ADNr
18S codifica para la subunidad 40S y los genes ADNr 5S, 5.8S, 28S codifican para la
subunidad 60S del ribosoma (Yusupov ef a/., 2001).
CAPITULO I
c) EI ADN satélite de acuerdo al número de nucleótidos repetidos se clasifican en:
microsatélites, minisatélites y satélites. Los dos primero comprenden de secuencias
repetidas más cortas, los microsatélites de 10pb y los mínisatélites de 10-50pb. La
longitud de las unidades monoméricas en las familias de ADN satélite varían en
tamaño pero preferencialmente se les encuentra entre 70pb-760pb, las cuales se
pueden encontrar en el genoma en cientos de copias (Appels ef a/.,1978, Grellet eí
a/„ 1986; Garrído-Ramos eí a/,1995; Heslop-Harrison eí a/., 2000).
Por otra parte dentro de las secuencias repetidas dispersas, se encuentran los elementos
móviles, estos a su vez se dividen en transposones y retrotransposones. Los últimos
incluyen a los retroelementos intercalados largos nucleares (LINEs contienen ~1000 pb) y
elementos intercalados cortos nucleares (SINEs miden ~100-500pb). La descripción de
los elementos de ADN disperso se comenta brevemente en las siguientes líneas.
ADN disperso.
a) Retroelementos son componentes del genoma que se replican y se vuelven a
insehar en sitios múltiples (Kumar y Bennetzen, 1999). Los retroelementos son
catalogados como los LTR y los non-LTR, ello depende de la presencia o ausencia
de una secuencia larga repetida invertida LTR (por sus siglas en ingles) que
flanquea la región codificante del retrotransposon (Kumar y Bennetzen, 1999).
Estos generalmente se encuentran dispersos a 1o largo de todos los cromosomas de
las plantas, en alguna§ e§pecies se ha reportado que se localizan hacia
determinadas regiones del genoma (Flavell eí a/.,1997).
b) Los transposones (elementos transponibles de ADN), a diferencia de los
retrotransposones incorporan un mecanismo de escisión/reparación y afectan §olo
ADN. Por 1o general, no influye en el aumento en el tamaño del genoma de la
planta (Kunze eí a/.,1997).
CAPÍTULO 1
Tabla 1. Localización de regiones repetidas en genomas de plantas.
Región repetida Organización Localización Especie Bibliografia
Retrotrasposon Dispersa Centrómero Tr/.Í/.oum aesí/.vum
ADN satélite En tándem Centrómero Befa w/gan.s
ADN ribosomal En tándem Telomérico Anab/.dops/.sthaliana
ADN satélite En tándem Centrómero So/anumbulboscastarum
ADN ribosomal En tándem
Ki§hii eí a/., 2001.
Schmidt eí a/„1996Mahinez-Zapatereía/.,1986
Jiang eí a/., 2005.
Telomérico V/.gna ungu/.cu/aía Galasso eí a/.,1995.
1.1.1 ADN satélite y sus aplicaciones.
Los estudios de ADN repetitivo se han centrado principalmente en la contribución en el
tamaño y evolución del genoma. Para el desarrollo de este tipo de estudios es necesario
realizar el aislamiento y caracterización de un pequeño grupo de regiones repetidas
(satélites, transposones, retrotransposones) (Macas ef a/., 2007), Específicamente las
regiones de ADN satélite se han utilizado para el análisis filogenético, como marcador
cromosomal y el análisis entre especies fl-abla 2). Debido a la rápida evolución de estas
regiones, como consecuencia de la acumulación de mutaciones a lo largo de la evolución,
se originan diferentes polimorfismos de utilidad para el análisis filogenético de diversidad y
especiación (Jiang eí a/„ 2003). El alto número de copias y el alto polimorfismo reportado
en estas regiones ha sido utilizado en el desarrollo de marcadores específicos de
cromosomas para diferentes especies de plantas (Sharma y Raina, 2005). Por ejemplo,
en V/.o/.a Íaba las repeticiones en tándem se utilizaron como sondas para la hibridación /.n
sÍ.fu fluore§cente generando señales especie-específico de utmdad como un marcador que
permite la identificación de cromosomas específicos del cariotipo de la especie, por lo que
pueden ser utilizados para estudios citogenéticos (Macas ef a/.,1995).
En Agave, modelo de estudio de este trabajo, el ADN satélite puede ser estudiado para la
determinación de especies ancestrales en poliploides, conocer los cambios evolutivos en
el genoma ocasionados por re-arreglo de los cromosomas, e incluso puede ser utilizados
para determinar la identidad de padres putativos en especies hibridas (Macas ef a/.,1995;
CAPÍTULO 1
Heslop-Harrison y Smith,1998; Jo eí a/., 2009 Kovarik e£ a/., 2010; Lysak eí a/., 2011;
Rosato ef a/., 2012).
Tabla 2. Aplicación del ADN satélite.
licación Es ecie Biblio
Análisis filogenético So/anum bu/cocasíarumNicotiana
Marcador cro mosom al 7"/.caceaFritillaria
Medica9OAnálisis entre especies Arab/.dops/.s íha//.ana
Vicia faba
Jiang eí a/., 2003.Kovarik eí a/., 2010
Shaima y Raina, 2005.Lysak et al., 2011Rosato ef a/., 2012Heslop-Harrison eí a/., 2003.Macas et al., 2000
1.1.2. Aislamiento de regiones ADN satélite.
En la actualidad, a pesar de la relevancia del ADN satélite para el estudio de origen y
evolución de las plantas, no se conoce el papel que desempeñan en el genoma.
Debido a la importancia de estas secuencias (ADN satélite) durante los últimos años se
han repohado diversos ADN satélites en una variedad reducida de especies de plantas.
En el año 2002, Macas ef a/., crean la base de datos Plantsat, en la cual se incluyen 154
familias de repetición, con un total de 979 monómeros. La información descrita para estas
familias de satélites incluye es el tamaño de la secuencia, su abundancia, localización
cromosómica, el número de accesión en el GenBank, la referencia de la cual proviene la
secuencia y las secuencias consenso (http://w3lamc.umbr.cas.cz/Plantsat/index.html).
DÍversos autores han indicado la importancia del aislamiento de nuevas regiones
repetidas en plantas para poder conocer la función que desempeñan en el genoma. El
aislamiento de nuevas regiones repetidas es importante para poder estudiar los
mecanismos que provocan un aumento en el tamaño del genoma y como contribuyen
estas diferencias en la evolución de las plantas.
1.2. Técnicas para el aislamiento de ADN satélite.
El aislamiento de estas regiones repetidas puede llevarse a cabo a partir de varias
CAPÍTULO 1
técnicas, qué se basan en las propiedades específicas de las secuencias (por ejemplo:
contenido en AT/CG). Estas técnicas incluyen al aislamiento por restricción enzimática de
ADN genómico (Kato ef a/„ 1984; Manínez-Zapater eí a/„ 1986: Nakajima ef a/., 1996;
Nouzova ef a/„ 1999; Benbrook eí a/.,1980; Maggini eí a/.,1991; Salina eí a/.,1998),
búsqueda en librerías de ADN genómico (Dong eí a/.,1998; Jiang ef a/., 2005) y la AUTO
PCR (Buntjer y Lenstra, 1998).
1.2.1. Bibliotecas genómicas.
Una biblioteca genómica consiste en la clonación de fragmentos de ADN en un vector.
Los vectores más utilizados para la creación de bibliotecas genómicas son los BAC
(Cavagnaro et al., 2009; Akhunov et al„ 2005). El límite de capacidad de clonación de los
BAC son 400Kb, haciéndolo ideal para generar bibliotecas genómicas de especies con
genomas grandes. El uso de bibliotecas genómicas en plantas proporciona información
para el establecimiento de nuevos marcadores, para identificar transposones, regiones
repetidas y genes relacionados con la resistencia a enfermedades, entre otros (Dong ef
a/„ 1998,. Dvorak eí a/., 2005; Naganowska ef a/., 2006; Jo eí a/., 2009).
Mediante el uso de bibliotecas genómicas se puede encontrar regiones de interés en el
genoma. La búsqueda se realiza utilizando una sonda específica que se une a la región
de interés y posteriormente esta puede ser observada mediante una señal empleando
técnicas de hibridación Í.n s/.íu o enzimas de restricción.
1.2.2. AUTO PCR
Esta técnica fue descrita por Buntjer y Lenstra (1998), se basa en las interacciones de
unidades de repetición en tándem con una modificación en la técnica de PCR. Para llevar
a cabo la AUTO PCR se utiliza la mezcla de reacción de PCR con ADN genómico
previamente fraccionado por calor. Estos son empleados como cebadores para la
amplificación del ADN genómico de la misma especie. Debido a su alta repetición, esto
conduce a una amplificación de fragmentos de manera concatenada y larga, las cuales
posteriormente son visualizados por electroforesis en geles de agarosa, como una banda
CAPITULO 1
de alto peso molecular de ADN. Posteriormente, se lleva a cabo una digestión de estos
productos con una endonucleasa de restrícción que corta dentro de estas secuencias de
repetición amplificadas, facilitando la clonación de fragmentos.
1.2.3. Restricción enzimática.
Dado que se ha repohado que en los genomas se encuentra una porción considerable de
regiones repetidas (Flavell ef a/„ 1984) y debido a la organización de las repeticiones en
tándem en el genoma, el empleo de enzimas de restricción, que tienen sus sitios de
reconocimiento dentro de estas regiones de ADN, generan fragmentos que se
representan como bandas en geles de agarosa en la electroforesis. Posterior a esto, los
fragmentos generados pueden clonarse con el fin de aislarlos para su posterior estudio
(Macas ef a/„ 1999).
1.2. Generalidades de Agave.
1.2.1. La familia Agavaceae.
Las especies de agaves pertenecen a la familia Agavaceae la cual se encuentra
distribuida principalmente en América hacia los ambientes áridos y semiáridos, consta de
9 géneros y 295 especies. Toda la familia exhibe una estructura básica similar de acuerdo
a su roseta, flores e inflorescencias (Rocha eí a/., 2006).
Agave es el género más grande de la familia Agavaceae en cuanto número de especies,
con aproximadamente 208 (Good-Ávila, 2006). En nuestro país se han reportado 186
taxa, de los cuales 129, es decir, el 69% es endémico, alcanzando su más alto nivel de
riqueza y diversidad de especies en México, por lo cual es considerado centro de origen y
diversificación del grupo (Rocha eí a/„ 2006). Esta riqueza de especies posiblemente se
deba a los hábitats heterogéneos que se presentan en nuestro país. Son abundantes en
las provincias de las serranías meridionales del centro de México, Sierra Madre
Occidental, Altiplano mexicano, península de Baja California y Sierra Madre Oriental
(García-Mendoza, 2007).
CAPÍTUL01
Figura 1. Agaye fequ/./ana. Representación de una planta de Agave íequ/./ana
adulta en los campos de ciiltivo.
1.2.2. Características fisiológicas y morfológicas de Agave
Debido a que son plantas xerófitas, presentan modificaciones o especializaciones
morfológicas como una estrategia para sobrevivir en ambientes desénicos. Son plantas
perennes, con hojas dispuestas en espiral y arregladas en rosetas en el ápice de un tallo,
el cual puede ser corto o largo y erecto. Las hojas por lo general son suculentas, fibrosas
y carnosas, su forma varía de lineal a lanceolada u ovalada, y los márgenes exhiben una
gran diversidad morfológica pero casi siempre tienen una espina al final del ápjce (Gentry,
1982; Eguiarte eí a/., 2000). Algunas especies son iteróparas (solo muere la roseta que
tiene la inflorescencia, pero no el indMduo), aunque la gran mayoría son semélparas (las
plantas mueren después de reproducírse). Presentan ciclos de vida largos que van desdelos 5 hasta los 20 años. La mayoría tiene reproducción asexual por medio de estolones o
bulbillos, los cuales se pueden formar en la base de la planta, así como a lo largo del
escapo floral, facilitando el rápido aumento en el tamaño de sus poblacionales (Gentry,
1982; Eguiarte ef a/., 2000, García-Mendoza, 2007). Su escapo floral puede llegar a medir
hasta 15 veces el tamaño de la planta, por lo que son fácilmente distinguibles por una
CAPÍTULO I
gran diversidad de polinizadores, como los murciélagos, polillas, abejas, colibríes, entre
otros, Io que permite mayor dispersión del polen para la reproducción sexual (Schaffer y
Schaffer,1979; Gentry,1982).
1.2.3. lmportancia del género Agaye.
El género Agave es considerado de importancia ecológica y económica ya que ha dado a
las personas ropa, sogas, alimentos, etc. Actualmente en México varias especies de este
género son aprovechadas como materia prima en procesos tradicionales yagroindustriales Uabla 4).
Figura 2. Gima de agave tequ/./ana. Las plantas de Agave Íequi./ana son
deshojadas para utilizar su piña y posteriormente se procesa en la producción
de tequila.
Por ejemplo, el subgénero Agave, en particular la sección RÍ.gí.dae y Si.sa/anae, fueron
seleccionadas para cultivarlas, ya que a partir de ellas se producía casi todo el suministro
de fibra, Ia cual se extraía del henequén y sisal. Esta fibra es empleada para la fabricación
de cordeles, tejidos, sacos, redes, muebles, sandalias, canastos, entre otros. En Yucatán,
el cultivo de Agave Íoummydes (henequén) fue una de las industrias mejor desarrolladas.
A partir de A. Íoumm}des, se obtienen productos naturales bioactivos de alto valor
agregado como sapogeninas esteroidales con propiedades antiinflamatorias,
antiparasitarias o hemolíticas aplicables en medicina tradicional (Castorena-Sánchez eí
10
CAPÍTULO 1
a/.,1991 ; Narváez-Zapata y Sánchez-Teyer, 2009).
En la Índustria tequilera, el Agave es utilizado para la producción de mezcal y el tequíla.
Con la especie Agave Íequ/./ana-variedad azul (NOM -006-SFcl-1994) (Fígura 1) se
produce el tequila, un producto de exponación con denominación de origen y de gran
importancia económica para México, además de los fermentos y destilados como el
pulque y el mezcal que son actividades con relativa importancia económica para distintas
regiones del pais (Figura 2) (Robert et al., 2008)
AsÍ mismo, las especies del género Agave también son utilizadas como plantas de ornato
(Eastmond y Robert, 2000).
Tabla 3. Ejemplos de la aplicación de las especies del género Agave.
ecie A licación BiblioAgave tequilana
Agave sisalanaAgave fourcroydesAgave angustifolia
Bebidasalcohólicas Valenzuela et al., 1997;
Fibra naturalFibra naturalPlanta omamental
Valenzuela eí a/„ 2003Banerje y Sharma,1988Boulanger ef a/„ 1985Banerje y Shama, 1988;Eastmond Robert, 2000.
1.2.4. Cariotipo de Agave.
En los agaves, el número de cromosoma básico (x) y el haploide (n) suman 30. En Agave
el nivel de ploidía reportado varía de 2x a sx (Banerjee y Sharma,1987). Se considera
que los procesos de hibridación, poliploidía y reproducción vegetativa son una estrategia
evolutiva importante en esta especie. Estos procesos implican cambios rápidos del
genoma debído a la hibridación y a la neoploidía (autopoliploidía y alopoliploidía).
Contiene un cariotipo bimodal que consta de cinco cromosomas grandes y veinticinco
cortos (Castorena-Sánchez eí a/„ 1991). En el 2008, Roben eí a/., determinaron la
cantidad de ADN en el genoma nuclear gamético no replicado de Agave, 1Cx es de-7.5pg.
Se ha reportado que las repeticiones de ADN satélite son empleadas para estudiar las
relaciones ancestrales entre especies de una misma especie, género, familia y orden
(Jiang eí a/., 2003; Saima y Raina, 2005; Macas eí a/., 2006); existen especies en las que
ií
CAPÍTULO 1
aún se desconocen dichas secuencias. Tal es el caso de A. fequi./ana, una especie de
interés comercial en México debido a que es empleada para la elaboración de tequila,
siendo esta característica la que lo hace un modelo de estudio que permita conocer como
las regiones repetidas, como el ADN satélite, se encuentra en su genoma, todo esto con
el único fin de indagar y generar información que a futuro permita el estudio de las
relaciones ancestrales con las especies del género Agave.
Tomando como base lo anterior, este trabajo se enfocó al aislamiento de regiones de
ADN satélite en A. fequ/./ana, como herramienta básica para diversos estudios futuros.
12
CAPÍTULO 1
OBJETIV0 GENERAL.
Estudiar regiones de ADN satélítes de Agave Íequi./ana.
OBJETIVOS ESPECIFICOS.
1. Desarrollar la metodología para el aislamiento y clonación de regíones de ADN
satélite en A. Íequí./ana.
2. Caracterizar las regiones de ADN satélite en A, íequ/'/ana por secuenciacíón.
3. Localizar regiones de ADN satélite por hibridación /n s/tu fluorescente (FISH)
en Agave tequilana.
13
CAPÍTULO I
JUSTIFICACION.
EI ADN satélite es una región repetida en cientos de copias, no codificante que se
encuentra en la heterocromatina. El estudio del ADN satélite permite elucidar procesos
relacionados con la evolución, ya que se conoce que estas secuencias son especificas
para cada especie (Rosato eí a/., 2012).
Se ha visto que la evolución de un ADN satélite es importante para la organización del
genoma en plantas, es por tal motivo que su aislamiento y caracterización ha podido
emplearse en especies de interés agronómico para observar la relación de parentesco
con otras especies (Macas eí a/., 2006; Hemleblen eí a/., 2007). Entre los usos que se le
ha conferido al ADN satélite se encuentran, como marcador molecular específico del
genoma, esto ha permitido la caracterización de especies híbridas, el estudio taxonómico
y evolutivo de plantas de interés comercial como banana, trigo, arroz y patata (Ananiev eí
a/., 1998; Salinas eí a/„ 2009; Choi eí a/., 2011 ; Cizkova ef a/., 2013).
Un modelo de estudio para la aplicación del ADN satélite es Agave. Este género está
constituido de cientos de especies distribuidos a lo largo de todo México. En Agave aún
se desconoce la organización y distribución de estas regiones en el genoma. Aunado a
esto también se desconoce el rol que pudieran estar desempeñando. La especie de A.
Íequ/./ana se ha planteado como un buen modelo de estudio debido a que es un diploide,
que presenta menor variabilidad genética (Gil-Vega eí a/., 2006) y es de importancia
económica, estas características permiten estudiar las relaciones ancestrales entre
especies pertenecientes al género Agave.
El estudio de una región de ADN satélite permitirá indagar en los aspectos anteriormente
mencionados y en un futuro nos permitirá desarrollar marcadores moleculares que nos
permitan conocer el origen y evolución de estas especies.
14
CApiTULO 1
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Colecta de material
vegetal de A. Íequí./ana
Figura 3. Diagrama general de la estrategia experimental general.
15
CAPÍTULO 1
BIBLIOGRAFIA
Akhunov E.D., Akhunova A.R. y Dvorak J. (2005). BAC libraries of Ín.í/.oum urariu,
Aegi./ops spe/foí.des and Ae. Tausc^Í./., the diploid ancestors of políplojd wheat.
Theoretícal and Applied Genetics, 111, 1617-1622.
Baneerje S. y Sharma A. K. (1987). Cytophotometric estimation of nuclear DNA indifferent species and varietíes of Agavo. Cytologia, 52, 85-90.
Bedbrook J.R., Jones J., O'Dell M., Thompson R.D., y Flavell R.B. (1980). A molecular
description of telomérico heterocromatin Ín Seca/e species. Cell,19, 545-560.
Buntjer J.B., y Lenstra J.A. (1998). Self-amplication of satellite DNA /.n v/.Íro. Genome, 41,
429-434.
Castorena-Sánchez 1„ Escobedo R.M., y Quíroz A. (1991). New cytotaxonomical
determinants recognized in six taxa of Agave Ín the sections R/.g/.dae and S/.sa/anae.
Canadian Journal of Botany, 69,1257-1264.
Cavagnaro P.F., Chun S.M., Szyklarczyk M., Grzebelus D., Senallk D., Atkins A.E y Simon
P.W. (2009). Characterizatíon of deep-coverage carrot (Daucos carota L.) BAClibrary and initial analysis of BAC-end sequences. Molecular genetics genomics.281 :273-288.
Dong F.G., Miller J.T., Jackson S.A., Wang G.L Ronald P.C., Jiang J.M. (1998). Rice
(Ovza saí/.va/ centromeric regions consjst of complex DNA. Proceeding of the
National Academy of Science USA, 95, 8135-8140.
Eastmond A, y Robert M.L. (2000). Henequen and the challenge of sustainable
development in Yucatan, Mexico. Biotechnology and development Monitor, 41,11-
15.
Eguiarte, F. L. E., Souza V., y Silva-Momellano A. (2000). Evolución de la familia
Agavacxgae: filogenia, ecología evolutiva de la reproducción y genética de
poblaciones. Boletín de la Sociedad Botánica de México, 66,131-150.
16
CAPÍTULO 1
Eguiahe, F. L. E. y Gonzáles G.A. (2007). De genes y magueyes: estudio y conservación
de los recursos genéticos del tequila y el mezcal. Ciencias, 87, 28-35.
Eickbush T.H. y Eickbush D.G. (2007). Finely orchestrated movements: Evolution of the
Ribosamal RNA genes. Genetic Society of America, 175c 477485.
Flavell R.B. (1986). Repetitive DNA and chromosome evolution in plants. Transactions of
The Royal Society; London, 312, 227-242.
Flavell A.J., Pearse S.R., Heslop-Harrison JS.P., Kumar A. (1997). The evolution of ry7-
cop/.a group retrotransposons in eukaryote genomes. Genetic, 100, 185-195.
Galasso 1., Schmidt T., Pignone D. y Heslop-Harrison J.S. (1995). The molecular
cytogenetics of vÍ'gna ungu/.cu/aía (L.) walp: the physical organization and
characterization of 18s-5.8s-25s rRNA genes, 5s rRNA. Theoretical and applied
genetics, 91, 928-935.
García Mendoza A.J. (2007). Los agaves de México. Redalyc; 87,14-23.
Garrido-Ramos M.A., Jamilena M., Lozano R„ Ruiz Rejón c. and Ruiz Rejón M. (1995).
The EcoRl centromeric DNA satellite of the sparí.dae family (PÍ.sces, pesc/'romes)
contains a sequence motive common to other vehebrate centromeric satellite DNAs.
Cytogenetic Cell Genetics, 71, 345-351.
Gentry H.S. (1982). Agaves of Continental Nohh America. The University of Arizona press,
Tucson.
Grellet F., Delcasso D., Panabieres F. y Delseny M. (1986). Organization and evolution of
a higher plant alphoid-like satellite DNA sequence. Journal Molecular Biology,187,
495-507.
Gindullis F., Desel C., Galasso 1., Schmidt T. (2001). The large-scale organization of the
centromeric region in Beía species. Genome Research, 11, 253-265.
Good-Avila S.V., Souza V„ Gaut 8. S., y Eguiahe L. E. (2006). Timing and rate of
speciation in Agave (Agavaceae). Proceedings of the National Academy of
Sciences,103, 9124-9129.
17
CAPÍTULO 1
Hemleben V, Kovarik A, Torres-Ruiz A, Volkov R, y Beridze T. (2007). Plam highly
repeated satellite DNA: molecular evolution, distribution and use for identification of
hybrids. Systematics and Biodiversjty, 5, 277-289.
Heslop-Harrison J.S. y Smith T„ (1998). Genomes, genes and junk: the large-scale
organizatíon of plant chromosomes. Elseriver Science, 3,195-198.
Heslop-Harríson J.S. (2000). Comparative genome organization in plants: from sequence
and markers to chromatin and chromosomes. Plant Cell,12, 617-635.
Jiang J. y Gill B.S. (2006). Current status and the future of fluorescence /.n s/.fu
hybridization (FISH) in plant genome research. Genome, 49,1057-1068.
Jiang J., Tek A.L., Song J., y Macas J. (2005). Sobo, a recently amplified satellite repeat of
potato, and its implications for the origin of tandemly repeated sequences. Genetics
society of America,170,1231-1238.
Jo S., Hoe Koo D., Kim J., Hur C., Lee S., Yang T.J., Kwon S. y Choi D. (2009). Evolution
of ribosomal DNA-derived satellite repeat in tomato genome. BMC Plant Biology, 9,
1-14.
Kato A., Yakura K„ y Tanifuji S. (1984). Sequence analysis of VÍ.cÍ.a Íaba repeated DNA,
the Fok/ repeat element. Nucleic Acids Research, 12, 6415-6426.
Kishii M., Nagaki K., y Tsujimoto H. (2001). A tándem repetitive sequence located in the
centromeric región of common wheat (Tn.Í/.cum aesí/.wm) chromosomes.
Chromosome Research, 9, 417-428.
Kovarik A., Koukalova 8., Morales A.P., Renny-Byfield S., Matyasek R., Leicht A. (2010).
Fall and rise of satellite repeats in allopolyploids of W/.cof/.ana over c. 5 million years.
New phytologist,186,148-160.
Kubis S.E., Heslop-Harrison J.S., Desel C. y Schimidt T. (1998a). The genomíc
organization of non-LTR retrotrasposons (LINEs) from three Beía species and five
other angiosperms. Plant Molecular Biology, 36, 821-831,
18
CAPÍTULO 1
Kubis S.E, Heslop-Harrison J.S„ Desel C„ y Schimidt T. (1998b). Repetitive AND
elements as a major component of plant genomes. Annals of Botany, 82, 45-55.
Kunze R., Seaedler H., Lonning W.E. (1997). Plant transposable elements. Advances in
Botanical Reserch, 27, 331-470.
Kumar A., Bennetzen JL. (1999). Plant retrotranposons. Annual Review of genetics, 33,
479-532.
Lewin Benjamin. (2001). Genes Vll. Oxford University Press and Cell Press. Edición en
Español. Marban Libros. España.
Lysak M.A., Ambrozova K., Mandakova T., Bures P., Neumann, Leitch 1., Koblizkova A.,
Macas J. (2011). Diverse retrotransposon families and an AT-rich satellite DNA
revealed in giant genomes of Frí.fí.//ar/.a lilies. Annals of Botany, 107, 255-268.
Macas J., Dolezel J., Gualberti G„ Pich U., Schubeh 1., Lucretti S. (1995). Primer induced
labeling of pea and field bean chromosomes in situ and in suspension.
Biotechniques,19, 402-408.
Macas J., Navrátilová A., y Koblízková A. (2006). Sequence homogenization and
chromosomal localization of VicTR-B satellites differ between closely related VÍ.c/.a
species. Chromosoma, 115, 437447.
Maggini F., Cremonini R., Zolphno C., Tucci GF., D'Ovidio R., Delre V., Depace P.G„
Scarascia Mugnozza G.T„ y Cionini P.G. (1991). Structure and chromosomal
localization of DNA sequences related to ribosomal subrepeats in V/.c/.a Íaba.
Chromosoma, 100, 222-234.
Mahins C. y Wasko A.P. (2004). Organization and evolution of 5S ribosomal DNA in the
fish genome. ln: Williams CR (ed) Focus on Genome Research. Nova Science
Publishers, Hauppauge, pp 289-318.
Martinez-Zapater J„ Estelle M.A. y Somerville C.R. (1986). A highly repeated DNA
sequence in Arab/.dopsí.s fha/Í.ana. Molecular Genetics and Genomics; 204, 417-
423.
19
CAPITULO 1
Meagher T.R., Gillies M., y Costich D.E. (2005). Genome size, quantitative genetics and
the genomics basis for flower size evolution in SÍ./ene /a£ffo/i.a. Annals of Botany, 95,
247-254.
Naganowska 8., Wolko 8., Sliwinska E., Kaczmarek Z. y Schifino-Wittmann M.T. (2006).
2C DNA variation and relationships among New World species of the genus Lup/.nus
(Fabaceae). Plant Systematics and Evolution, 256,147-157.
Nakajima R., Noma K., Ohtsubo E., Ohtsubo H. (1996). ldentification and characterization
of two tandem repeat sequences (7rsB and rrsc) and a retrotransposon (R/RE7) as
genome general sequences in rice. Genes and Genetics Systems, 71, 373-382.
Narváez-Zapata J. A., y Sánchez-Teyer F. L. (2009). Agaves as a raw material: recent
technologies and applications. Recent Patents on Biotechnology, 3,185-191.
Neumann P., Koblizkova A., Navratilova A. y Macas J. (2006). Significant expansion of
vÍ.cÍ.a pannoni.ca genome size mediated by amplification of a single type of giant
retroelement. Genetics,173,1047-1056.
NouzovaÁ M., KubalaÁkovaÁ M., DolezTelovaÁ M„ KoblóÁZTkovaÁ A„ Neumann P„
Dolez.l.el J., y Macas J. (1999). Cloning and characterization of new repetitive
sequences in field bean (V/.ci.a faba L.). Annals of Botany, 83, 535-541.
Robert M.L., Yoong L.K„ Hanson L., Sanchez-Teyer F., Bennett D. M., Leitch A.R. y
Leitch l.L (2008). Wild and agronomically important Agave species (Asparagaceae)
show proportional increases in chromosome number, genome size, and genetic
markers with increasing ploidy. Botanical Journal of the Linnean Society,158, 215-
222.
Rocha M., Good-Ávila S.V., Molina-Freaner F., Arita H.T., Castillo A„ Gargía-Mendoza A.,
Silva-Montellano A., Gaut B.S., Souza V., Eguiarte L.E. (2006). Pollination Biology
and adaptive radiation of Agavaceae, with special emphasis on the genus Agave.
Rancho Santa Ana Botanic Garden, 22, 329-344.
20
Rosato M, Galian J, and Rosello J, (2012). Amplification, contraction and genomic spread
of a satellite DNA family (E180) in Medí.cago (Fabaceae) and A llied genera. Annals
of Botany,109, 773-782.
Salina E.A., Pestsova E.G„ Adonina l.G., Vershinin A.V. (1998). ldentification of a new
family of tandem repeats in Tn.(/.ceae genomes. Euphytica,100, 231-237.
Sambrook J„ Russell D.W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring
Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA.
Schaffer W.M. y Schaffer M.V. (1979). The adaptive significance of variations in
reproductive habitat in the Agavaceae 11: Pollinator foraging behavior and selection
increased reproductive expenditure. Ecology, 60,1051-1069.
Sharma S., y Raina S.N. (2005). Organization and evolution of highly repeated satellite
DNA sequences in plant chromosomes. Cytogenetec Genome Research,109,15-
26.
Schmidt T. y Heslop-Harrison J.S. (1998). Genomes, genes and junk: the large-scale
organization of plant chromosomes. Trends in plant Science; 3,195-199.
Yusupov M.M., Yusupova G.Z., Cate G.H.D. y Noller H. (2001). The path of messenger
RNA through the ribosome. Cell; 106, 233-241.
21
CAPÍTULO 11
cApiTUL0 11
CARACTERIZACIÓN DE REGIONES DE ADN SATÉLITE EN Agave fequ/-/ana.
2.1. lNTRODUCCIÓN.
El aislamiento de regiones ADN satélite permite estudiar y deteminar la relación
filogenética de especies ancestrales y evaluar los cambios evolutivos en el genoma como
los rearreglos en los cromosomas (Jiang ef a/., 2003). Este tipo de regiones muestra una
alta divergencia en secuencia y en algunas ocasiones en el número de copias, indícando
la presencia de regíones variedades específicas en los cromosomas (Nagaki eí a/., 1998a;
Heslop-Harrison eí a/., 2003).
Los métodos más documentados para el aislamiento de regiones de ADN satélite son:
enzimas de restricción, búsqueda en bibliotecas genómicas, densidad de gradiente y
AUTO PCR. (Benbrook eí a/., 1980; Kato eí a/., 1984; Mariínez-Zapater eí a/., 1986;
Maggini eí a/.,1991; Nakajima eí a/.,1996; Buntjer y Lenstra,1998; Dong eí a/.,1998;
Salina ef a/,,1998 Nouzova ef a/.,1999; Jiang eí a/., 2005).
Entre las técnicas de aislamiento reportadas, la técnica de AUTO PCR ha demostrado ser
un método efectivo para la obtención de estas regiones ya que es una alternativa rápida,
menos costosa que las técnicas como enzimas de restricción y más fácil que la técnica de
densidad de gradiente. La técnica de AUTO PCR permíte el aislamiento de regiones
repetidas y su clonación para estudios posteriores (Buntjer y Lestra,1998).
Para el aislamiento de regiones de ADN satélite en A. Íequ/./ana se estandarizó la técnica
de AUTO PCR. Posterior a su aislamiento estas regiones fueron clonadas y
secuenciadas. Cabe mencionar que es el primer trabajo realizado para el aislamiento de
ADN satélite en A. íequ/./ana; a través de la presencia y distribución de estas regiones se
pretende aportar información para conocer acerca del origen y evolución de esta especie.
23
CAPÍTULO 11
2.2. lvIATERIALES Y METODOS.
2.2.1. 2.2.1. Material biológico.
En este estudio se empleo la especie Agave Íequ/./ar}a, que se encuentran en el jardín
botánico del Centro de lnvestigación Científica de Yucatán (CICY).
2.2.2. Extracción de ADN.
Para la extracción de ADN se utilizó tejido de las hojas maduras y se empleó el protocolo
repohado por Echevarría-Machado ef a/. (2005), en el que se adicionó 0.5 gr de tejido
fresco en un mortero para su maceración. Enseguida se agregó un ml de amoniguador de
extracción (100 mM de Tris, pH 8, 50 mM de EDTA, 500 mM Nacl) previamente
precalentado a 65°C. Posteriormente se añadieron 100 t.l de B-Mercaptoetanol (100 mM)
y 100 ul de SDS al 20% p~, seguido de agitación vigorosa.
La mezcla se incubó a 65° durante 10 min; después se adicionaron 500 Lil de acetato de
potasio 5M. Las muestras se centrifugaron a 16 200 x g durante 20 min. El sobrenadante
fue separado y posteriormente a éste se le adicionaron 300 tJl de sílica, se mezcló
manualmente por alrededor de 3 a 5 min. La muestra se centrifugó nuevamente a
13,400xg durante 5 min. Posteriormente se obtuvo la sílica precipitada y se agregaron 500
Lil de etanol al 70%, repitiendo este paso dos veces y posteriormente se dejo secar toda la
noche. La pastilla se resuspendió en 50 i]l de agua y se incubó en un baño maría a 55°C
de 3-5 min. Las muestras se centrifugaron 2 min a 16 200 x g y posteriormente
transferidas a un tubo nuevo. La integridad y calidad del ADN se verificó por electroforesis
en gel de agarosa al 0.8%; por otra parte, la concentración y pureza del ADN se realizó
mediante espectrofotometría con una relación de A26o/A28o de aproximadamentel.8,
utilizando el equipo NANODROP 1000 de la marca Thermo Scientific.
2.2.3. Restricción enzimática.
Las reacciones de digestión se realizaron en un volumen final de 10ul e incluyó de 500Lig
de ADN genómico, 5U de la enzima (tabla 4), 1X de amortiguador de la enzima y agua
24
CAPÍTULO 11
ultrapura estéril. Se realizó una digestión parcial por 1 hora 30 min y una digestión total
durante toda la noche, con las temperaturas de activación para cada enzima (Tabla 4).
Tabla 4. Enzimas de restricción.
Nombre Temperatura do Sitio de corteactivación
37°C 5'-G/GATC-3'
37°C 5 '-GAT/ATC-3 '
37oc 5'-TnM-3'
37°C 5`-GT/AC-3.
37 °C 5 '-R/AATT-3 '
37°C 5'-R/GATC-3'
5ooc 5'-GC/GGCCGC-3'
65°C 5'-T/CGA-3'
2.2.4. AUTO PCR.
Se digirió ADNg de A. Íequí./ana con la enzima de restricción Msel. Los fragmentos
generados por la digestión se emplearon para la mezcla de reacción de la PCR
touchdown. Esta mezcla contenía: 500ng de ADNg digerido como inicíador,100ng/i]l de
ADNg como molde,1X Buffer de PCR, 2.5mM Mgc12, 0.2mM dNTPs y 1.2 U de DNA 7aq
polimerasa (BIOLINE cat. 21083), ajustando con agua ultrapura a un volumen final de
25ul.
Las condicíones del primer paso de la PCR touchdown (Cox eí a/., 1991) fueron:
desnaturalización a 94°C durante 5 min y 10 ciclos de una desnaturalización a 94°C
durante 30 seg, un alineamiento a 70-55°C durante 45 seg y una extensión a 72°C
durante 2 min. Al finalizar se efectuó una última extensíón a 72°C durante 5 min.
Posteriormente, §e realizó un segundo paso de la PCR touchdown, con las condiciones
siguientes: desnaturalización inicial de 94°C, seguido de 40 ciclos de una
desnaturalización de 94°C por 30 seg, alineamiento a 55°C, extensión a 72°C durante 2
25
CAPITULO 11
min y una extensión final de 72°C por 5 min. Los productos de la reacción son
observados en una electroforesis en un gel al 1.5% de agarosa.
Estos productos de amplificación se sometieron a digestión. La mezcla de digestión
consistió en 500ng del amplicón, 5U de la enzima raql y lx regulador de la enzima.
Posterior a la digestión, las bandas generadas son visualizadas en un gel al 6% de
poliacrilamida.
Figura 4. Condiciones de PCR touchdown.
2.2.5. Geles de poliacrilamida.
Para observar el producto de la AUTO PCR fue necesario utilizar geles al 6% de
poliacrilamida (bis-acrilamida al 40%, TEMED al 40%, PSA al 10%), este gel fue
sumergido en lx TBE (40mM Tris, 40mM de ácido acético, lmM de EDTA; pH 7.4) a
20°C. El gel se §ometió a electroforesis por 24 hrs a 150V, posteriormente el gel fue
revelado con carbonato de sodio y teñido con nitrato de plata.
Al obtener el gel con los fragmentos de interés se realizó el corte y elusión de banda del
gel de poliacrilamida. El aislamiento del fragmento fue realizado de acuerdo al protocolo
descrito por Ke-Liping (2004), se inició con la limpieza de la superficie del gel de
poliacrilamida con etanol (95%), se seleccionó la banda y se hidrato con 7 Hl de agua.
Posteriormente, se cortó la banda de interés y se colocó en un tubo de 1.5ml estéril. La
banda se trituró en el tubo utilizando una punta de pipeta. Se eluyó en 30 ul de TE (10mM
Tris Hcl, lmM EDTA pH 8), durante 48 hrs. Posteriormente se calentó a 95°C durante 7
26
CAPÍTULO 11
min y se centrifugó a 13,400 g por 2 min para recuperar el sobrenadante. Una vez eluídos
los fragmentos se centrifugaron y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, por último
se almacenó a 4°C hasta su uso.
2.2.6. Clonación.
Los fragmentos de interés fueron clonados en el vector pGEM T-easy (Figura 5) y
transformados por choque térmico en células competentes de E. co//. lNvaDH10b. Las
transformantes fueron seleccionadas por resistencia a 50 ug/ml de ampicilina. Se realizó la
ligación del fragmento en el vector pGEM T-easy como indica el fabricante, la reacción
empelada fue de 2X buffer de DNA ligasa T4, 50ng de pGEM T-easy, lmg producto de
PCR,10U DNA ligasa T4 y se afora a 10 Lil con agua ultrapura.
Para la extracción de plásmidos se utilizó el método de lisis alcalina de Birnboim & Doly
(1979). Se dejó incubando las células transformadas en medio LB con antibiótico toda la
noche; transcurrido el tiempo se colectaron por centrifugación,16 200 x g a 4°C durante
5min, las células en un tubo eppendori de 2ml hasta obtener una pastilla blanca en el
fondo. Se adicionó 1 M amohiguador de re suspensión (500mM Tris-Hcl pH s y lomM
EDTA) para resuspender la pastilla; se agregó el amohiguador de lisis (0.2 M NaoH y
1%SDS) agitando por inversión y se dejó reposar en hielo durante 5 min. Posteriormente,
se adicionó el amohiguador de precipitación (3.1 M Acetato de potasio, pH 5.5) agitando
por inversión e incubación en hielo por 5 min. Transcurrido el tiempo se centrifugó a 16
200 x g a 4°C durante 20 min. Se recuperó el sobrenadante, se agregó Cloroformo-
Alcohol lsoamílico (24:1) y se dejo reposando a -20°C durante 3 horas. Se centrifugó a 16
200 x g a 4°C durante 20 min. El sobrenadante se recuperó y se dejó incubando con
etanol absoluto durante una hora para su posterior centrifugación a 16 200 x g a 4°C
durante 20 min. Se retiró el sobrenadante dejando secar la pastilla para su posterior
resuspensión con agua ultrapura.
La verificación de los insenos correctos de las transformantes se realizó mediante
amplificación del inseno usando oligonucleótidos M13 REV (-24) 5'-
27
CAPÍTULO 11
AACAGCTATGACCARG y M13 FWD (40) 5'-GllTTCCCAGTCACGAC, que se
posicionan en los extremos del sitio múltiple del vector.
Figura 5. Representación esquemática del
(Promega.com).
Figura 5. Diagrama general del pi.oceso de clonación.
28
CAP(TULO 11
2.2.7. Secuenciación.
Los fragmentos clonados se enviaron a secuenciar a MACROGEN (#60-24, Gasan-dong,
Geumchen-gu), en Seul, Corea. Los alineamientos para editar la secuencia del plásmido
pGEM-T easy Vector systems se realizaron con el programa Bioedit (Hall,1999) para la
caracterización de la secuencia interna de cada fragmento clonado.
2.2.8. Análisis bioinformático
Las secuencias de nucleótidos primeramente se compararon con la secuencia del vector
para eliminar cualquier residuo de los mismos y posterioemente fueron alineados y
comparados con la base de datos GenBank utilizando el programa BioEdit Sequence
Alignment Editor 5.0.6 (Hall, 1999). Para realizar el perfil de restricción teórico de las
secuencias, el contenido del porcentaje de AT y la determinación del tamaño de las
secuencias, se empleo el programa DNAMAN versión 3.0.
Las secuencias de nucleótidos fueron alineados en el GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y en la base de datos Plantsat
(http:M3lamc.umbr.cas.cz/Plantsat/blast.php) (Macas ef a/„ 2002) para deteminar los
motivos que presentan con otras secuencias de ADN satélite.
2.2.9. Southern Blot
2.2.9.1. Digestión del ADNg de A. fequ/./ana.
La digestión del ADNg de A. fequ/./ana se llevó a cabo con las enzimas Msel y raql. Se
tomo 20mg de ADNg y se colocó en un tubo eppendori de 1.5ml, se le adicionó 10 U de
cada enzima y lx regulador de enzima. Se dejó incubando a su temperatura de acción
37°C para las enzimas Msel, y 65°C para la enzima raql, durante toda la noche.
Posteriormente se realizó una electroforesis con un gel de agarosa al 1 % para observar el
perrH electroforético del ADNg fraccionado. La electroforesis se realizó durante 6 horas a
60V.
CAPÍTULO 11
2.2.9.2. Transferencia a membrana
Para realizar la transferencia del ADN a la membrana de nylon se empleó 20X SSC
(citrato sódico salino) (3 M Nacl, 0.3 M de citrato de sodio, pH 7). Se utilizó como mecha
tela absorbente, y sobre esta se colocó el gel y la membrana de nylon (Hybond N+), se
colocó sobre el gel. La transferencia se dejó toda la noche, ~15 horas (fígura 7).
Transcurrido el tiempo de transferencia, el ADN de la membrana fue fijado con rayos
ultravioleta y se almacenó a 4°C hasta su uso.
2.2.9.3. Hibridación de membranas con sondas marcadas con dioxigenina-11-duTP
La prehibridación de las membranas se realizó a 42 °C por 1 h, con agitación suave en un
recipiente con tapa que contenían 20 ml de solución de prehibridacíón (5X SSC, 0.02%
SDS,1% Reactivo bloqueante de RocheTM). Transcurrído el tiempo se eliminó la solución
de prembridación, se agregó 20 ml de solución de hibridación precalentada con la sonda
marcada y desnaturalizada anteriormente a 65°C durante 10 min. Las membranas se
incubaron toda la noche a 42°C con agitación suave en una estufa de híbridación
HybaidTM. Posteriormente, las membranas se lavaron dos veces con 4X SSC conteniendo
O.1°/o SDS y un lavado de astringencia con la mísma solución pero aumentando la
temperatura de incubación a 65°C durante 30 min.
2.2.9.4. Exposición de membranas y diferenciación de señales.
Para el revelado de las membranas se agregó una solución con 75 mu/ml de anticuerpo
Antitiigoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina (RocheTM) y se incubó por 30 min a
temperatura ambiente. Estas se lavaron dos veces por 15 min con solución de maleato y
0.3% Tween, y finalmente con 20 ml de Tris-Nacl pH 9.5 por 5 min. La detección
quimioluminiscente se realizó con CSPD (Disodium 3-(4-methoxyspíro {1,2-dioxetane-3,2'-
(5'-chloro) triciclo [3.3.1.13.7] decan}-4-yl) phenyl phosphate) (RocheTM) síguíendo el
protocolo del fabricante. Las membranas fueron expuestas a películas de rayos X por 5
min. Para el revelado de las películas se uso revelador y fijador Kodak®, por último se
lavaron con agua y se procedió a realizar el análisis de señales.
30
CAPÍTULO 11
Figura 6. Transferencia de ADN. En la imagen se ilustra el procedimiento de
transferencia de ADN de un gel de agarosa a una membrana de Nylon cargada
positivamente mediante capilaridad (Tomado de Encyclopedia of life Sciences
(2001 ). Nature Group.
31
CAPÍTULO 11
2.3. RESULTADOS.
2.3.1. Aislamiento de regiones ADN satélite en A. requi./ana.
Con la finalidad de estandarizar el protocolo para el aislamiento de regiones de ADN
satélite en A. Íequ/./ana, se realizaron digestiones del ADNg de dícha especie, con
enzimas de restricción para generar fragmentos que posteriormente se utilizaron en la
AUTO PCR. Los perfiles electroforéticos del ADNg de A. fequí./ana con las enzimas
indicaron que la enzima Msel generó fragmentos cuyo tamaño se encuentran entre 200
pb y 3000 pb (figura 8). La enzima Msel tiene un sítío de reconocimiento en 5' T|TAA 3' y
se ha documentado que las regjones ADN satélite se caracterizan por presentar un alto
porcentaje en AT, además de tener tamaños aproximados de entre 180-760pb, por lo cual
era probable encontrar esta región en los fragmentos generados por esta enzima de
restricción. A partir de este ADNg digerido se realizó la PCR touchdown con las
condicionas descritas anteriormente en materiales y métodos (inciso 2.2.4).
Figura 7. Producto de digestiones parciales. Electroforesis de digestiones de
ADNg de A, Íequí./ana, las enzimas Msel, BstYl y Taql indican una digestión
total del ADNg.
Una vez obtenido el amplicón de la PCR touchdown se realizó el último paso de la AUTO
PCR, el cual consiste en la digestión del mismo. La digestión fue visualizada en geles al
6% de poliacrilamida. Tal como se observa en la figura 9, los productos generados
32
CAPÍTULO 11
mediante la digestión del amplicón indican la presencia de dos bandas, 250 y 450 pb,
respectivamente. Estas bandas fueron escindidas del gel y clonadas en el vector pGEM-
Teasy y enviadas a secuenciar.
Figura 8. Electroforesis en gel de acrilamida. Gel de poliacrilamida al 6%
con el producto de amplificación de la AUTO PCR y su posterior digestión con
la enzima raql.
2.3.2. Caracterización de regiones ADN satélite.
Mediante la técnica de AUTO PCR se obtuvieron 6 secuencias. Estas secuencias fueron
denominadas como: Ateqsat 101, Ateqsat 102, Ateqsat 105, Ateqsat 109, Ateqsat 110 y
Ateqsat 113. Las características principales del ADN satélite son: los tamaños (pb), el
contenido de AT, y los sitios de restricción teóricos para las enzimas de restricción, por tal
motivo. Estas características se ilustran en la tabla 5:
33
CAPÍTULO 11
Tabla 5. Características de las secuencias de ADN satélite.
Secuencia Tamaño (pb) °/oAT Enzima de restricción
Ateqsat l 01 404
Ateqsat l 02 320
Ateqsat l 05 271
Ateqsat lo9 214
Ateqsat ll0 213
Ateqsat ll3 188
Hindlll , Bsh ,
Hind\ll, Bsin, Ncol
San, Xbal, raql, Msel
Bs/l, Smal, Xmal
Eco57l, Scal
Xbal, Asu/l Bcfl
De igual manera, se realizó el análisis por BLAST de estas secuencias en la base de datos
Plantsat (Macas ef a/., 2002). Los resultados revelaron que las secuencias aisladas
presentan motivos de repetición en secuencias ADN satélite en especies como: A///.um
ÍÍ.sfu/osum para las secuencias Ateqsat 101 y 113, He/Í.cfrofí.con para las secuencias
Ateqsat 105 y 110, Zea mays para la secuencia Ateqsat 102, y Leymus mcemosus para
la secuencia Ateqsat 109. Todas estas especies pertenecen a la clase Lilliopside, misma
clase a la que pertenece el género Agave (Tabla 6).
Tabla 6. Motivos en secuencias ADN satélite de especies pertenecientes a laclase Lilliopside.
Secuencia Especie Tamaño Motivo Referencias
Ateqsat 101 A///.t/m
fistolosum
11pb
Ateqsat l02 Zeo moys 13pb
Ateqsat l05 He//.ctotr/.chon 12pb
Ateqsat l09 £Éymus 16pbracemosus
Ateqsat ll0 A//Í.um 11pb
//.sto/osum 11 p bHelictrotrichon
Ateqsat ll3 Aveno 12pbA//Í.um 11 p b
5' CGTATAAAACG
5' CTGAITATCAT
Do ef cr/„ 1998
5' CATCTGTATGGTG Ananiev ef o/.,1998
5' CCGTCGCTCGGT Hemleben eí o/.,1996
5' AGCTGCGllTGTCCCT Nagaki eto/„ 1999
5' CTGAITATCAT5' CATG TTCCCAG
5' TGTGTAGmGT5; NÍSíT CAAA!BCÍ3A
Do eto/., 1998Hemleblen €f cr/., 1996
Ferrer et o/., 1995Do eí a/., 1998
34
CAPÍTULO 11
Los resultados de la caracterización de estas secuencias indican que la secuencia
Ateqsat 101 posee un 57% de AT y cabe mencionar que se logró aislar dos repeticiones
de la misma secuencia con un tamaño de 202 pb. Asi mísmo, la secuencia Ateqsat 105
cuenta con los sitios de reconocimiento para las enzimas raql y Msel en su secuencia,
enzimas que fueron las empleadas para el aislamiento. Por tales características, se
decidió continuar con ambas para la realización del Southern blot.
Una característica del ADN satélite es que se encuentran en tándem en el genoma. Para
conocer de qué manera se encuentra las secuencias aisladas se realizó el Southern Blot.
Los patrones de hibridación obtenidos de las sondas (secuencias Ateqsat 101 y Ateqsat
105) y el ADNg de A. Íequi./ana digerido con las enzimas Msel para la secuencia Ateqsat
101, y las enzimas Msel y raql para la secuencia Ateqsat 105, indican la presencia de
dos y tres señales, de un tamaño de ~200 pb para cada señal (figura 10). Al observar un
patrón de escalera, estos resultados sugieren que se encuentran en tándem.
Figura 9. Southern Blot. A) Las enzimas utilizadas para la digestión del ADNg
de A, Íequ/./ana fueron: Msel (M) y sonda hibridada Ateqsat 101. 8) Enzimas
utilizadas Msel (M), raql (T), sonda híbridada Ateqsat 105.
La ausencia y presencia de estas regiones en el genoma proporcionan una aproximación
de la composición del genoma de A. Íequi./ana. Las especies del género Agave debido a
35
CAPÍTULO 11
su amplia distribución por todo México, el número de especies pertenecientes en el
género, los diferentes niveles de ploidía y su cariotipo bimodal, son un modelo que resulta
interesante estudiar, además de que en la actualidad se tiene poca información de estas
especies. La especie A. fequ/./ana es de interés comercial, así que la información que
pueda ser generada para conocer el genoma y su comportamiento permiten crear
herramientas para aplicaciones biotecnológicas posteriores.
36
CAPITULO 11
2.4. DISCusloN.
Específicamente Agave Íequi./ana es utilizada para la elaboración de tequila (Narváez-
Zapata y Sánchez-Teyer, 2009). En la actualidad se desconoce la relación de parentesco
entre las especies de este género, por lo tanto se pretende indagar más al respecto. Tal
es el caso de las regiones repetidas que brindan información de la organización del
genoma.
Una región repetida se encuentra distribuida en el genoma de plantas en tándem y en la
heterocromatina es el ADN satélite. EI ADN satélite se considera una secuencia que
compone el genoma eucariota y consiste en repeticiones arregladas en tándem,
caracterizado por ser un componente especie-específico y género-específico (Hemleblen
eí a/., 2007; Phol ef a/., 2008).
2.4.1. Identificación de ADN satélite en Agave tequi./ana.
Si bien se ha documentado que las regiones repetidas en el genoma, entre estas el ADN
satélite, pueden emplearse como herramientas para determinar el parentesco y la relación
ancestral entre especies (Jiang eí a/., 2003; Shaima y Raima, 2005; Macas eí a/., 2006).
En el género Agave hasta el momento no ha sido reportada una región repetida de ADN
satélite, que permita la discriminación entre las especies de este género.
En el 2000, Macas eí a/., lograron obtener dos familias de ADN satélite del género V/.c/.a
con la técnica de AUTO PCR, estas se denominaron VicTR-A y VicTR-B de 186pb y
232pb respectivamente, con valores de AT en la secuencia de 74% para ambos casos.
Estos autores concluyen que la presencia de estas secuencias repetidas se encontró para
especies del género V/-o/.a y es probable que su cuantificación en los genomas de una
amplia variedad de especies de este género ayudara a evaluar las divergencias
filogenéticas de las distintas secciones de V/.cÍ.a. En Banano, Cyzkova eí a/,, (2013), se
centraron en dos grandes ADN satélites analizando su organización genómica y la
diversidad en 19 accesiones del género Musa, incluidos el genoma A y 8, así como sus
híbridos interespecíficos (M. scn/.zocapa). Comparando las secuencias del ADN satélite
entre especies de Musa, concluyen que estas regiones pueden ayudar a determinar la
37
CAPÍTULO 11
constitución genómica en híbridos Íntraespecificos de Banano.
El aislamiento de estos ADN satélites y su posterior estudio contribuyen al conocimiento
acerca de las relaciones ancestrales y filogenéticas, entre especies de un género y en
variedades de una misma especie, convirtiéndose en una valiosa herramienta para dichos
estudios.
2.4.2. Motivos de regiones satélite en Agave Íequ/./ana.
Como se mencionó anteriormente se obtuvieron seis secuencias de ADN satélite
diferentes de A. Íequ/./ana empleando la técnica de aislamiento de AUTO PCR. Después
de obtener las secuencias de estas regiones se realizó la búsqueda de motivos en otras
secuencias de ADN satélíte reportadas (Macas ef a/„ 2002). El resultado de esta
búsqueda sugiere que las especies de la misma clase Liliopside, como lo son
Helectrotrichon, Avena, AJlium fistulosom, Leymus racemosus y Zea mays, comparien
ciertos motivos con las secuencias de ADN satélite de A. fequ/./ana aquí repohadas.
Se encontraron resultados similares en varias especies del género rrt.ÍÍ.ceae. Un ADN
satélite de 350bp, que se encuentra en regiones subteloméricas de los cromosomas de
centeno (Bedbrock eí a/„ 1980a,1980b), se identificó en Agropyron (Xin y Appels,1988).
Particularmente una región de ADN satélite de 120 pb, pSC1192, se encontró en especíes
de los géneros Secale, Aegilops, Triticum, Hordeum, Elymus, Agropyron, Hystrk( y
Hayna/d/.a (Bedbrock eí a/.,1980a; Mclntyre eí a/.,1988; Gupta eí a/.,1989; Jouve ef a/.,
1991; Castilho y Heslop-Harrison,1995; Vershinin eí a/.,1995). Otra repeticiones en
tándem de ADN, Ia família Afa de 340 pb, fue detectado en rrt.ÍÍ.cum, Seoa/e, Hondeum, y
otras especie§ rrt.ÍÍ.oeae. lncluso en Bromus Í.ne/mí.s, que es un miembro de la tribu
Bnomeae, el grupo hermano de 7r/.Í/oeae Vershinin ef a/., 1994).
En el género de He//.círoír7.chon, Avenacea y especíes de las tribus Andropogenoeae y
O/)/zeae fueron detectadas regiones de ADN satélite, que se dístribuían de manera
diferente con cada grupo taxonómico (Hemleblen eí a/., 1996). Estas regiones de ADN
satélites se denominaron COM1, CONI COM2 y CON2 (de 346, 365, 476 y 562 pb,
respectivamente). En el caso pahicular de CONl mostro una similitud en la secuencia de
38
CAPÍTULO 11
O/yza saf/.va, mostrando una diversidad entre secuencias de familias de ADN satélites.
Las secuencias repetitivas exhiben diversas composiciones en diferentes genomas,
debido a un cambio rápido de las secuencias de codificación, y, por lo tanto. cambios en
las secuencias repetitivas pueden ser especialmente útiles en la comprensión de la
evolución del genoma. Un cambio que se produce en secuencias genómicas durante la
evolución es la aparición o desaparición de secuencias repetidas en tándem. Estas
secuencias se amplifican rápidamente y producen repeticiones específicas a un género,
especie o incluso un cromosoma indMdual (Kishii y Tsujimoto, 2002). Los satélites han
demostrado ser una de las pahes más intrigantes del genoma, debido a su gran
abundancia, el cambio evolutivo rápido y por evidencia que indica pueden tener un
impacto en la especiación (Ferre y Prasad, 2012). Varios mecanismos han sido
propuestos para explicar esta rápida expansión de ADN satélite, incluyendo el
mecanismo de entrecruzamiento desigual y duplicación segmental (Hourcade ef a/.,1973;
Smith, 1976; Ma y Jackson, 2006) pero hasta el momento se desconoce con claridad
dicho mecanismo.
Para las secuencias repetidas mayores, como los ADN satélite, las relaciones entre otros
grupos de plantas es más difícil debido a que estas secuencias son mas especificas para
cada grupo de especies (Navajas-Pérez ef a/., 2006) y también se someten a un rápido
cambio (Miklos,1985). Sin embargo, se ha reponado que estas regiones de repeticiones
en tándem son específicas para cada especie en particular (Hemleblen eí a/., 2007) pero
de igual manera puede encontrarse un motivo entre miembros de un género o familia en
particular.
Choi eí a/., (2011) sugieren que el ADN satélite específico de la familia de las solanáceas
se derivó del lGS (espaciador intergenómico) de cada especie, seguido de la formación
del lGS actual, en lugar de una gradual acumulación de mutaciones o reordenamientos
de un ADN satélite común. Los autores observaron que la repetición de ADN satélite de
cada género fue similar a sus propios lGS pero no se repiten a través de géneros,
demostrado que la repetición satélite en So/anaoeas se genera de la divergencia del lGS
del ADNr en lugar de la acumulación de mutaciones en el ADN satélite.
Para entender mejor la dinámica de la amplificación de ADN satélite Cento en Oryza
39
CAPÍTULO 11
saíí.va se realizó el análisis filogenético de monómeros identificado en CEN4. Analizando
estos monómeros se identificaron 50 pares adicionales de monómeros, sugiriendo una
reorganización de los satélites Cento. Los datos obtenidos demuestran que la región
centromérica se ha enriquecido de manera más significativa por las recientes rondas de
duplicación por segmentos, lo que sugiere que los segmentos duplicación es un proceso
importante para la acumulacíón de regiones repetidas en la región centromérica. Estos
resultados también indican que duplicación por segmentos de grandes series de
repeticiones por satélite es el principal responsable de la amplificación de la repetición del
ADN satélite, lo que contribuye a una rápida reorganización de los satélites de Cento (Ma
y Jackson, 2006).
El continuo e§tudio de estas regiones podría ayudar al desarrollo de un marcador
molecular que permita la discriminación de variedades en especies de A. Íequ/./ana.
40
CAPÍTULO 11
2.5. BIBLIOGFUFIA
Bedbrook J.R., Jones J, O'Dell M, Thompson RD, Flavell RB. 1980. A molecular
description of telomérico heterocromatin jn Seca/e species. Cell,19, 545-560.
Birnboim H.C. y Doly J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research; 7,1513-1523.
Buntjer J.B. y Lenstra J.A. (1998). Self-amplication of satellite DNA /.n v/.Íro. Genome, 41,
429434.
Castilho A., y Heslop-Harrison J.S. (1995). Physical mapping of 5s and 18s-25s rDNA and
repetitive DNA sequences in Aegi./ops L/mbe//u/aía. Genome, 38, 91 -96.
Choí D., Jo S., Park H.M., Kim S.M„ Kjm H.H. y Hur H.H. (2011). Unraveling the
sequence dynamics of the formation of genus-specific satellite DNAs in the family
Solanaceae. Herediv,106, 876Ú85.
Colunga-García Marin R., Coello-Coello J., Eguiarte L. y Pjñero D. (1999). lsoenzymatic
variation and phylogenetic relationship between Henequen (Agave Íuommydes) and
its wjld ancestor A. angusíffo//.a íAgavaceae). American journal of botany, 86,115-
123.
Cizkova J., Hribova E., Humplikova L., Chrístelova P., Suchankova P. y Dolozel J. (2013).
Molecular Analysis and Genomic Organization of Major DNA Satellites in Banana
(Musa spp.). PLoS ONE; 8,1-14.
Dong F.G., Miller J.T., Jackson S.A., Wang G.L., Ronald P.C. y Jiang J.M. (1998). Rice
(Oryza saíí.va/ centromeric regions consist of complex DNA. Proceeding of the
National Academy of Sciences of the United State of America, 95, 8135-8140.
Echevarría-Machado 1., Sánchez-Cach L.A., Hernández-Zepeda C., Rivera-Madrid R., y
Moreno-Valenzuela O.A. (2005). A simple and efficient method for isolation of DNA
in high mucilaginous plant tíssues. Molecular Bjotechnology, 31,129-135,
41
CAPÍTULO 11
Ferre P.M., y Prasad S. (2012). How can satellite DNA divergence cause reproductive
isolation? Let us count the chromosomal ways. Genetic Research lnternational,
430136,1-11.
Flavell R.B, Bennet M.D, Smith J.B. y Smith D.B. (1974). Genome size and the proportion
of repeated nucleotide sequence DNA in plants. Biochemical Genetics,12, 257-269.
Gupta P.K., Fedak G., Molnar S.J. y Wheatcroft R. (1989). Distribution of a Secale cereale
DNA repeat sequence among 25 Hordeum species. Genome, 32, 383-388.
Hemleben V„ Grebenstein 0., Grebenstein 8. y Saue W. (1996). Distribution and complex
organization of satellite DNA sequences in Aveneae species. Genome, 39, 1045-
1050
Hemleben V., Kovarik A., Torres R.A., Volkov R.A. y Beridze T. (2007). Plant high
repeated satellite DNA: molecular evolution, distribution and use for identification of
hybrids. Systematic and biodiversity, 5, 277-289.
Hourcade D., Dressler D. y Wolfson J. (1973). Amplification of ribosomal RNA genes
involves a rolling circle intermediate. Proceeding of the National Academy of
Sciences of the Unites Stated of America, 70, 2926-2930.
Jouve N., Mclntyre C.L. y Gustafson J.P. (1991). Chromosome preparations from
protoplasts: in situ hybridization banding pattern of a dispersed DNA sequence in rye
(Seca/e cerea/e L.). Genome, 34, 524-527
Kato A., Yakura K. y Tanifuji S.1984. Sequence analysis of VÍ.cÍ.a faba repeated DNA, the
Fok/ repeat element. Nucleic Acids Research, 12, 6415-6426.
Ke-Liping, Yuqiang S., Pingwu L. y Guangsheng Y. (2004). ldentification of AFLP
fragments linked to one recessive genic male sterility (RGMS) in rapeseed (Bffiss/.ca
napus L.) and conversion to SCAR markers for marker-aided selection. Euphytica,
138,163-168.
Kishii M. y Tsujimoto H. (2002). Genus-specific localization of the Tail family of tandem-
repetitive sequences in either the centromeric or subtelomeric regions in Triticeae
species (Poaceae) and its evolution in wheat. Genome 45, 946-955.
42
CAPITULO 11
Ma J. y Jackson S.A. (2006). Retrotransposon accumulation and satellite amplification
mediated by segmental duplication facilite centrómero expansion in rice. Genome
Res,16, 251-259.
Macas J., Meszaros T. y Nouzová M. (2002). Plantsat: a specialized database for plant
satellite repeats. Bioinformatics,18, 28-35.
Maggini F., Cremonini R., Zolphno C., Tucci G.F., D'Ovidio R., Delre V., Depace P.G.,
Scarascia Mugnozza G.T. y Cionini P.G. (1991). Structure and chromosomal
localization of DNA sequences related to ribosomal subrepeats in V/-cÍ.a Íaba.
Chromosoma,100, 229-234.
Martínez-Zapater J., Estelle M.A. y Somerville C.R. (1986). A highly repeated DNA
sequence in Arabí.dops/.s Íha/Í.ana. Molecular Genome and Genetics, 204, 417423.
Mclntyre C.L., Clarke B.C. y Appels R. (1988). Amplification and dispersion of repeated
DNA sequences in the Triticeae. Plant Systematics and Evolution. 160, 39-59.
Miklos G.L.G. (1985). Localized highly repetitive DNA sequences in vertebrates and
invertebrates genomes. ln: Maclntyre R.J, ed. Molecular Evolutionary Genetics. New
York, Plenum Press, 241-321.
Nakajima R., Noma K., Ohtsubo E. y Ohtsubo H. (1996). Identification and
characterization of two tandem repeat sequences (TrsB and Trsc) and a
retrotransposon (R/RE1) as genome general sequences in rice. Genes and Genetic
Systems, 71, 373-382.
Navajas-Pérez R., Quesada del Bosque M.E., y Garrido Ramos M.A. (2009). Effect of
localization, organization, and repeat-copy number in satellite-DNA evolution.
Molecular and Genetics Genomics, 282, 395-406.
NouzovaÁ M., KubalaÁkovaÁ M., Dolezl.elovaÁ M., KoblóÁZTkovaÁ A., Neumann P.,
DolezTel J. y Macas J. (1999). Cloning and characterization of new repetitive
sequences in field bean (V/.c/.a Íaba L). Annals of Botany, 83, 535-541.
43
CAPÍTULO 11
Plohl M., Luchettí A„ Mestrovic N. y Mantovani 8. (2008). Satellite DNAs between
selfishness and functionality: structure, genomics and evolution of tandem repeats in
centromeric (hetero) chromatin. Gene, 409, 72-82.
Rosato M., Galian J. y Rosello J. (2012). Amplífication, contraction and genomic spread of
a satellite DNA family (E180) in Med/.oago (Fabaceae) and allied genera. Annals of
Botany,109, 773-782.
Salina E.A., Pestsova E.G., Adonina l.G. y Vershinin A.V. (1998). ldentífication of a new
family of tandem repeats Ín rn.Í/.ceae genomes. Euphytica,100, 231-237.
Sambrook J. y Russell D.W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. 3th Ed. Cold
Spring Laboratory Press. Cold Spríng Harbor, New York, USA.
Smith P.G. (1976). Evolution of repeated sequence§ by unequal crossover. Science,191,
528-535.
Vandemark G.J. (1998). lnterspecífic and intraspecific relationships among Agave spp
based on RAPD and AFLP. Resumen. Memorias del Vlll Congreso Nacional de de
Bioquímíca y Biología Molecular de Plantas, Guanajuato México, p. 30.
Vershinin A.V., Svitashev S., Gummes§on P.O., Solomon 8„ Von-Bothmer R. y
Brynglesson T. (1994). Characterisation of a family of tandemly repeated DNA
sequences in Triticeae. Theoretical and Applied Genetics. 89, 217-225.
Vershinin A.V., Schwarzacher T. y Heslop-Harrison J.S. (1995). The large-scale genomjc
organisation of repetitive DNA families at the telomeres of rye chromosomes. Plant
Cell, 7,1823-1833.
44
CAPÍTULO 111
CAPITULO 111
LOCALIZACIÓN DE ADN SATÉLITE EN A. tequ/./ana.
3.1. lNTRODUcclóN.EI ADN satélite constituye parte impohante de los genomas eucariotas, sin embargo, es
relativamente poco caracterizado, incluso en especies extensamente secuenciadas. Se ha
observado que los ADN satélite tienen un cambio rápido, que se le atribuye como una
evolución rápida en una porción del genoma eucariota. A pesar de eso también se ha
observado que son preservados en periodos evolutivos y tienen una secuencia
conservada (Mravinac e£ a/„ 2002). Esta conservación de secuencias y una amplia
distribución entre genomas ha interesado para poder identificar cual es la función
biológica de estas regiones, si es que la tiene. EI ADN satélite representa una pahe rápida
de la evolución de genomas eucariotas, es por lo que se ha utilizado para la identificación
entre especies y análisis filogenéticos (Jiang eí a/., 2003).
La información proporcionada por la hibridación /.n s/.íu es amplia y variada, que tiene
relación con el numero de señales en núcleo o cromosoma, la intensidad de la señal de
hibridación, la distancia entre señales de hibridación y moriología de la señal (García
lsidoro eí a/.,1996). Una variante de la hibridación /.n s/`Íu es la técnica de hibridación /.n
s/`íu fluorescente (FISH), es un método efectivo para el mapeo físico de genes y regiones
repetidas en las secuencias de secuencias en cromosomas. La sensibilidad de la técnica
permite la detección de pequeñas secuencias de ADN. Estas secuencias se denominan
sondas especificas de secuencias de ADN y brindan información para el análisis de
genomas (García lsidoro eí a/., 1996; Kinoshita ef a/., 2010).
Con el empleo de técnicas de hibridación i.n s/'Íu se tiene como objetivo localizar a la
región de ADN satélite en Agave íequ/./ana.
45
CAPÍTULO 111
3.2. MATERIALES Y METODOS
3.2.1 lvletodología para la hibridación /.n s/-fu fluorescente (FISH).
3.2.1.1. Obtención de células en metafase.
Se realizó la colecta de raíces de aproximadamente 15 días después de haber sembrado
las plantas. Los cromosomas en metafase se obtienen a partir de ápices de la raíz, estas
se colectaron a las 7 de la mañana. Estas se colocaron en un frasco que contenía una
solución saturada de Paradiclorobenceno (PDB) por 3 horas a temperatura ambiente y
oscuridad. Transcurrido el tiempo las raíces se lavaron para eliminar residuos del agente
mitostático. Después se procedió a fijar las raíces en una solución de alcohol absoluto y
acido acético glacial (3:1) durante 24 horas.
Para degradar la pared celular de las células de las raíces se uso Viscozyma (SIGMA cat.
V2010), un coctel enzimático, y se incubó a 37°C durante 25 minutos a baño maría. Una
vez que paso el tiempo se realizaron dos lavados en dos ocasiones con acido acético al
45% y se realizó el "squash", presionando con el pulgar la preparación. Después del"squash" se realizó el análisis de preparaciones en el microscopio de contraste de fases
para identificar las células en metafase. Al término del análisis de las preparaciones se
retiró el cubreobjetos utilizando nitrógeno líquido y con una navaja fina se deslizo sobre la
preparación para separar el cubreobjetos del portaobjetos. Una vez retirado el
cubreobjetos de las preparaciones, se dejaron secando en la estufa a 37°C durante 24
horas. Las preparaciones se almacenaron a -20°C hasta su uso.
3.2.1.2. Marcajedesonda.
El marcaje de sondas se realizó por PCR utilizando digoxigenina (DIG) con 'DIG DNA
Labeling Kit', (RocheTM), de acuerdo al protocolo del fabricante. Se utilizaron 100 ng de
ADN plásmidico como molde,10 mM de cebadores, 2 mM nucleótidos dATP, dcTP y
dGTP (en 100 mM de Tris-Hcl, pH 8.3), 0.5 mM dTTP,1 mM digoxigenina-11-duTP, 50
mM MgcL2, 1X Regulador de PCR y O.5U de rag polimerasa. Las condiciones de PCR
fueron las siguientes: desnaturalización a 94°C durante 5 min y 30 ciclos de una
desnaturalización a 94°C durante 2 min, un alineamiento a 50°C durante 1.5 min y una
46
CAPÍTULO 111
extensión a 72°C durante 1 min, posteriormente una extensión final a 72°C durante 10
min. La verificación de la sonda marcada se realizó por electroforesis en un gel al 0.8% de
agarosa, a 70 V durante 40 min.
3.2.1.3. Hibridación i.n si.fu fluorescente (FISH)
Una vez obtenidas las preparaciones se adicionaron 100 ug/ml de RNasa A (79U/ml),
posteriormente se cubrió con un cuadro a medida de parafilm y se incubaron durante 1
hora a 37°C en una cámara húmeda.
Después de la incubación se removió el parafilm y se lavaron las preparaciones dos veces
con 2X SSC durante 5 min. Estas preparaciones se incubaron en 10mM de HCL por 5
min. Posteriormente, se eliminó el exceso del fluido, evitando que las preparaciones se
sequen en este paso. Se adicionó 10Lil/ml de pepsina (SIGMA cat. P6887) y fueron
cubienas con otro cuadro a medida de parafilm. Las preparaciones se incubaron 15 min a
37°C y se lavaron dos veces en 2X SSC por 5 min.
Las preparaciones se colocaron en una caja Coplin que contenia paraformalehido 4%
(p/v) en agua estéríl (disuelto previamente a 65°C y puesto a enfriar a temperatura
ambiente antes de usar) (SIGMA cat. P6148) durante 10 min. Transcurrido el tiempo las
preparaciones se lavaron dos veces en 2X SSC por 5 min y se deshidrataron con etanol a
diferentes concentraciones 70°/o, 90% y 100% v/v, por 3 min en cada uno. Se dejaron
secar durante varias horas a temperatura ambiente. Una vez secas las preparaciones se
procedió a la desnaturalización para lo cual las preparaciones se colocaron en una caja
Coplin con 70% de formamida (v/v) (SIGMA cat. F5786), diluida en agua estéril
previamente atemperada en baño maría a 75°C. lnmediatamente fueron deshidratadas
durante 5 min en una serie de etanol al 70%, 90% y 100%, respectivamente y se dejaron
secar a temperatura ambiente.
Al término de la deshidratación se realizó la hibridación de la sonda. Se aplicó a cada
preparación la mezcla de hibridación compuesta de 50% de formamida (v/v) (SIGMA cat.
F5786) 2X SSC, 10% de Sulfato de Dextrano (p/v) (SIGMA cat. D8906), 0.17% de SDS y
100ng de sonda (previamente desnaturalizada a 75°C durante 10 min y mantenida en
47
CAPÍTULO 111
hielo hasta su aplicación). Se cubrió el área con parafilm y se incubó toda la noche a 42°C
a baño maría.
Posterior a la hibridación, se procedió a la detección de la sonda. Se retiraron las
preparaciones del baño maría y a continuación fueron lavadas dos veces en 2X SSC por
5 min. Fueron colocadas inmediatamente por 5 min (una preparación a la vez) en una caja
Coplin con 20°/o de formamida (v/v), diluida en agua estéril, previamente incubado a baño
maría a 42°C. Después las preparaciones se lavaron dos veces en 2X SSC por 5min,
colocado en un baño maría a 42°C. Enseguida, las preparaciones fueron lavadas dos
veces por 5 min en 4X SSC y 0.2% (v/v) de tween 20 (SIGMA cat. P1379). Transcurrido el
tiempo de lavados astringentes, se escurrieron las preparaciones y se aplicó 5% BSA
(p/v) (SIGMA cat. A2153). Posteriormente, se cubrieron las preparaciones con parafilm y
se dejaron incubar 20 min a 37°C. Se retiró la cubieha de parafilm y se aplícaron 5 ul
(0.75U/Ltl) de Antidigoxigenina conjugada con Fluoresceína (ROCHE cat.11207741),
incubando a 37°C durante una hora. Pasado el tiempo de detección, las preparaciones
fueron lavadas dos veces en 4x SSC y 0.2% de tween 20 (v/v) (SIGMA cat. P1379). A
continuación, se escurrieron las preparaciones y se aplicaron 30 ul (1.5Lig/ml) del medio
de montaje Vectashield con DApl (VECTOR cat. H-1200), se colocó un cubreobjetos y se
posteriormente se mantuvieron en oscuridad por 10 min. Posteriormente, las
preparaciones fueron analizadas con el juego de filtros 09 (BP 450-490 nm excitación, FT
510 filtro divisor de haz, y LP 515 nm emisión) para detectar la señal de la fluorescencia
en verde, y el juego de filtros 01 (BP 365/12; FT 395 y LP 397 nm) para la emisión en azul
del complejo DApl-ADN, en un microscopio de de Carl Zeíss Axioplan, equipado con un
sistema de Epifluorescencia para su análisis. Las imágenes se capturaron mediante una
cámara Axiocam MRm y el software Axiovision de Carl Zeiss.
48
CAPÍTULO 111
3.3. RESULTADOS
3.3.1. Localización de ADN satélite en A. fequ/./ana por FISH.
En cuanto a la hibridación i.n sfft/, se marcó una sonda de aproximadamente 263 pb e
hibridó en núcleos en interfase y células en metafase de A. fequi./ana. En la hibridación de
esta sonda se observaron núcleos en interfase, los cuales mostraron una señal, esto
puede ser debido al número de copias dispuestas en tándem en una sola región del
núcleo observado (Figura 11).
EEIIBEEFigura 10. Hibridación /.n si.Íu fluorescente de secuencias ADN satélite en
A. fequ/./ana. A y C) Núcleo interfásico de Agave feqL//./ana teñido con DApl
(azul). 8) Señales de la sonda hibridada en color verde. Escala 40LLm.
AsÍ mismo, se realizó la hibridación para la sonda Ateqsat 105, el cual indicó la presencia
de una única señal en un sólo cromosoma de A. íequi./ana (figura 12). Esta única señal
sugiere que el tándem de estas región se encuentra en un locus, proporcionando
información acerca de cómo se encuentra físicamente un ADN satélite en los
cromosomas de A. fequi`/ana.
49
CAPÍTULO 111
Figura 11. Hibridación i.n s/fu fluorescente de células en metafase de A.
tequ/./ana. A) Células en metafase de A. Íequ/./ana, teñido con DApl (azul), 8)
Señal de sonda 105 hibridada en color verde, C) Sobre posición de las
imágenes A y 8. Escala 40 um.
En el genoma de Agave se desconoce la distribución del ADN satélite, por lo tanto, este
trabajo es el primero en el que se presenta evidencia de la presencia física del ADN
satélite. Generar infomación acerca de la distribucjón y posición.del ADN satélite en el
genoma de especies en plantas puede proporcionar una aproximación a las relacionesancestrales con otras especies de los grupos taxonómicos.
50
CAPÍTULO 111
3.4. DISCusloN.
La técnica de hibridación i.r} sffu fluorescente (FISH) se emplea para el estudio en detalle
la estructura y dinámica de los cromosomas, utilizando secuencias repetidas especfficas,
tales como los telómeros, el ADN ribosomal, el ADN satélite o secuencias únicas (lrifune
ef a/.,1995; Do eí a/.,1999). En especies de Agave hasta el momento se han realizado
tres trabajos de FISH de diferentes regiones como: los telómeros para A. bfflcíeosa
(Syrokova eí a/„ 2003), los ADN ribosomal 5S, 45S y telómeros en A. íequ/./ana Weber y
el hibrido H11648 (Robert ef a/., 2008) y ADN ribosomal en A. Íequí./ana, A. cupreaía, A.
angusíffo//.a (Gómez-Rodríguez eí a/., 2013).
Cabe mencionar que hasta el momento en A. íequ/./ana no se ha reportado la hibridación
Í.n sÍ.Íu fluorescente de ADN satélite, siendo este el primer trabajo realizado para la
localización de esta secuencia. Mediante la técnica de hibridación Í.n s/.íu fluorescente se
logró observar la presencia de una señal de la sonda Ateqsat 105 hibridada en el núcleo y
en las células en metafase de Agave fequí./ana, lo que sugiere que se encuentra en un
locus de un sólo cromosoma.
Una sola señal se identificó en el núcleo interfásico de un ADN satélite, Sobo, en la
especie de So/anum bu/bocasíortjm, y al compararse con tomate se determinó que eran
especificas para S. bu/booasforum (Jiang eí a/„ 2005). La presencia de estas regiones en
un solo locus, sugiere que se debe a un evento de amplificación derivado de un
retroelemento, Sore7, al presentar similitud cuando se compararon las secuencias de
ambas regiones. Los retrotransposones parecen ser una región repetida importante para
el origen de nuevas repeticiones de ADN satélite en el centrómero de la papa, ya que al
hacer la comparación entre estos dos tipos de regiones repetidas, se encontró que tres
satélites (St3-58, St3-238 y St3-294) presentaban un alto porcentaje de similitud con
retrotransposones (Gong ef a/., 2012).
En diversos trabajos realizados para la localización de ADN satélite mediante FISH, se
obtuvieron múltiples señales; entre las especies que mostraron un mayor número de
señales para estas repeticiones se encuentran, A///.um cepa (Do ef a/., 2001), A///.um
fistolosum (lr.ilune et al.,1995), Vicia faba (Macas et al„ 2006), Triricum aestivous (Satiirias
et al., 2009), Phaseolus vulgaris (Ftiichard et al., 2013) y Zea mays Wollgruber et al.,
51
CAPÍTULO 111
2012), estos hallazgos llevaron a la conclusión de que la secuencia de ADN satélite varia
rápídamente, en eventos de conversión e inserción de estas, debido a los mecanismos
sugeridos para el origen del ADN satélite y la presencia de varias repeticiones de ADN
satélite en el genoma por recombinación, indica que se encuentra una mayor variabilidad
genétíca de estas repeticiones en el centrómero y telómero de los cromosomas de dichas
especies (March, 2012).
Palomino eí a/., (2008) realizó un estudio en los cariotipos de cultivares de A. Íequ/./ana
Weber, en la cual observó que las variedades diploides de esta especíe presentan una
constricción secundaria en un par de cromosomas grandes; se encontró una variación
entre cultivares cariotipos de los cultivares de A. íequí./ana, sugiriendo que es debido los
re-arreglos en los cromosomas grandes y pequeños.
La presencia de una única señal en un solo cromosoma de A. Íequ/./ana, puede ser
empleado como marcador especifico para los cromosomas de A. Íequ/./ana. Sin embargo,
estos resultados realizados con FISH necesitan ser probados en diferentes varíedades de
A. fequ/-/ana y así como en otras especies del género Agave, esperando encontrar un
comportamiento diferente de estas regiones repetidas en cada especie.
La información generada para entender el comportamiento de los ADN satélites en A.
Íequí./ana es de importancia, ya que si bien se ha documentado que estas repeticiones
tienen una función estructural en el cromosoma, resulta muy interesante saber cómo se
encuentran distribuidas en el cariotipo bimodal de esta especie.
52
CAPÍTULO 111
3.5. BIBLIOGRAFÍA
Brown T. 2001. Southern Blotting and related DNA detection techniques. Encyclopedia
of lífe sciences. p 1-5.
Do G. S., Seo 8. 8., Ko J. M„ Lee S.H., Pak J.H., Kim l.S„ y Song S.D. (1999). Analysis
of somaclonal variation through tissue culture and chromosomal localjzation of rDNA
sites by fluorescent /.n sÍ.Íu hybridizatjon in wild A///`um ÍL/bemsum and a regenerated
variant. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 57,113-119.
Do G.S., Seo 8.8., Yamamoto M., Suzuki G. y Mukai Y. (2001). ldentification and
Chromosomal Location of Tandemly Repeated DNA Sequences in A//Í'um cepa.
Genes and Genetics System; 76, 53ú0.
García lsidoro M., Tabernero M.D., Nájera M.L., Durán A., San Miguel J. y Gonzales
Buítrago J.M. 1996. Hibridacíón /.n s/.íu. Química Clpinica; 15 (6) 395-399.
Gómez -Rodríguez V.M„ Rodríguez-Garay 8., Palomino G., Mahínez J. y Barba-
González R. (2013). Physícal mapping of 5S and 18S ribosomal DNA in three
species of Agave (Asparagales, Asparagaceae). Comparative Cytogenetics; 7,191-
203.
Gong Z., Wu Y„ Koblí-Zková A., Torres G.A., Wang K., lovene A., Neumann P„ Zhang
W„ Novák P., Buell C.R., Macas J. y Jjang J. (2013). Repeatless and Repeat-Based
Centromeres in Potato: lmplicatíons for Centromere Evolution. The Plant Cell; 24:
3559-3574.
Heslop-Harrjson J.S., Brandes A. y Schwarzacher T. 2003. Tandemly repeated DNA
sequences and centromeric chromosomal regions of Amb/.dops/.s species.
Chromosome Research,11, 241-253.
Irifune K., Hirai K., Zheng J., Tanaka R., y Morikawa H. (1995). Nucleotide sequence of
a mghly repeated DNA sequence and its chromosomal localization jn A//Í.um
ffsfu/osum. Theoritical and Applied Genetics. 90, 312-316.
Jiang J., Bircheler J.A., Parrott W.A. y Dawe R.K. 2003. A molecular view of plant
53
CAPITULO 111
centromeres. Trent in plant science, 8, 570-575.
Jiang J„ Tek A.L., Song J., Macas J. 2005. Sobo, a recently amplified satellite repeat of
potato, and its implications for the origin of tandemly repeated sequences. Genetics
Society of America. 170, 1231 -1238.
Jiang J. y Gm B.S. 2006. Current status and the future of fluorescence /.n s/"
hybridization (FISH) in plant genome research. Genome.49,1057-1068.
Maca§ J., Navrátilová A. y Koblízková A. (2006). Sequence homogenization and
chromosomal localization of VicTR-B satemtes differ between closely related V/.c/.a
species. Chromosoma; 115, 437447.
March J. (2012). Rapid Centromere Evolution in Potato: lnvasion of the Satellite
Repeats. The Plant Cell; 24, 3487.
Mravinac 8., Plohl M., Mestrovic N. y Ugarkovic D. (2002). Sequence of PRAT Sate"
DNA "Frozen.' in Some Coleopteran Species. Journal of Molecular Evolution, 54,
774-783.
Palomino G., Martínez J. y Méndez 1. (2008). Karyotipe studies cultivars of Agave
íequ/./ana Weber. Caryologia; 61,144-153.
Richard N., Geffroy V., Manon M. S., Chen W. G., Thareau V., Pflieger S, Blanchet S.,
Pedrosa-Harand A., lwata A., Chavarro C. y Jackson S. (2012). The subtelomeric
khí.pu satellite repeat from Phaseo/us w/gan.s: lessons learned from the genome
analysisoftheAndeangenotypeG19833.PlantGeneticsandGenomics;4,1-14.
Robeh M.L., Yoong L.K., Hanson L., Sanchez-Teyer F., Bennett D. M., Leitch A.R. y
Leitch LL (2008). " and agronomically imponant Agave species (Asparagaceae)
show propohional increases in chromosome number, genome size, and genetic
markers with increasing ploidy. Botanical Journal of the Linnean Society,158, 215-
222.
Salina E.A., Sergeeva E.M., Adonina l.G., ShcherbanA.B., Afonnikov D., Belcram H.,
Huneau C. y Chalhoub 8. (2009). lsolation and sequence analysis of the wheat 8
54
CAPÍTULO 111
genome subtelomeric DNA. BioMed Central; 414.1-14.
Sykorová E„ Lim K.Y„ Kunjcká Z., Chase M.W., Bennett M.D., Fajkus J. y Leitch A.R.
(2003). Telomere variabílity in the monocotyledonous plant order Asparagales.
Proccedings of the Royal Society, Biology; 270,1893-1904.
Wolfgruber T.K., Sharma A., Schneider K., Albert P.S., Koo D.H., Shi J., Gao Z., Han
F., Lee H., Xu R., Allison J., Bírchlerv J.A., JiangJ„ Dawe R.K., Presting G. Maíze
Centromere Structure and Evolution: Sequence analysis of centromeres 2 and 5
reveals dynamic Loci shaped primarily by Retrotransposons. PLoS Genetics; 5, 1-
13.
Zakrzewski F., Wenke T., Holtgráwe D., Weisshaar 8., y Schmidt T. 2010. Analysis of a
cotl library enables the targeted identification of minisatellite and satellite families in
Beía vtt/gar/.s. Plant Biology; 10,1-14.
55
CAPÍTULO 111
CAPÍTULO IV
CAPITUL0 lv.
4.1. DISCUSIÓN GENERAL.
EI ADN satélite es un componente de los eucaríotas, que contiene en su secuencia sitios
de restricción para endonucleasas. Este tipo de ADN se encuentra en regiones
centroméricas, subtelomericas y pericentromericas de los cromosomas, en la
heterocromatina constítutjva (Flavell,1986). Se ha descrito que el ADN satélite, ayuda al
mantenimiento de la estructura individual del cromosoma (Schmídt y Heslop-Harrison,
1998; Hemleblen eí a/., 2000). Para estudios taxonómicos, el estudio del ADN satéljte
puede ayudar a trazar la relación entre especjes y la hibridación de e§pecies m᧠Iejanas;
la pérdida y amplíficación de ADN satélite en híbridos puede ocurrír rápidamente por
rearreglos y recombinación, por lo cual este puede ser empleado como una herramienta
para díscriminar entre parentales (Hemleblen ef a/,, 2007). Se han descrito 154 familias
repetidas en la base de datos gratuita Plantsat (Macas eí a/., 2002).
El género Agave consta de 208 especies descritas en México (Rocha ef a/., 2006), se ha
descrito que presenta especies con diferentes niveles de ploidía, que tiene un cariotipo
bimodal (Castorena-Sánchez ef a/„ 1991), y su uso para la obtención de fibras, bebídas y
productos naturales bioactivos (Narváez-Zapata y Sánchez-Teyer, 2009).
Entre algunos estudios realizados con marcadores moleculares para las especies del
genero Agave, se encuentran izoenzimas, RAPDs y AFLPs (Colunga-García Marín eí a/.,
1999; Vandermark, 1998). Estos estudios fueron para las especíes A. Íequ/./ana, A.
fuomnoydes y A. angusíí.Ío//.a, en los que presentaron niveles de variación genética bajos
entre variedades de la misma especie (A. Íwommydes) y se observó que para A.
angustffio//'a se presentaba alta varíabílidad genética (Colunga-García Marín eí a/.,1999).
Ahora bien, con respecto a la genética de poblaciones del genero Agave, se ha observado
que los niveles de variación son elevados, sin embargo, las especíes cultivadas
prácticamente no presentan variación genética, seguramente resultado de las prácticas de
propagacíón vegetativa empleadas (Colunga-García Marín eí a/.,1999).
Es importante mencionar que hasta el momento no se encuentra reportado algún trabajo
en el que se haya aislado y caracterizado el ADN satélite en especies del genero Agave,
57
CAPÍTULO IV.
motú por el cual se llevó a cabo este trabajo y dadas las características de esta región
que permiten que sea empleado como marcador molecular.
En este trabajo se aislaron seis secuencias de ADN satélite en la especie de A. íequi./ana,
con características diferentes, en tamaño de composición, en porcentaje de contenido en
AT y en sitios teóricos para reconocimiento de enzimas de estricción.
En otros trabajos se ha descrito diferentes familias de ADN satélite; tal es el caso del
género Cucum/fa, en el que se reportaron dos familias de ADN satélite, de 170pb y
350pb; para conocer su componamiento se estudio la relación con otras especies
pertenecientes a este género y encontraron que el número de copias de estas, varía
dependiendo de la especie, incluso no fueron detectadas en algunas de estas especies
(King eí a/.,1995). Que diferentes ADN satélites puedas co-existir en la misma especie
puede variar significativamente en su homogeneidad de secuencias (King ef a/., 1995;
Vershinin eí a/., 1996) indicando que cada ADN satélite puede ser considerado una
unidad que evoluciona de manera independiente, difiriendo en el número de copias y la
relación con la evolución de otras secuencias (Ugarkovic y Plohl, 2002).
Un alineamiento en la base de datos Plantsat (Macas eí a/., 2002) indica que estas seis
secuencias tienen un motivo conservado con otros ADN satélites de especies
(mencionadas en el apartado de resultados) pehenecientes a la clase Lilliopside.
La comparación de secuencias de ADN satélite en genomas de especies, indica que
conservan monómeros y es debido a que presentan una larga cadena repetida (Navajas-
Pérez y Paterson, 2009); las características estructurales del ADN satélite, tales como la
longm del monómero, el contenido de AT, motivos de secuencias cortas, pueden ser
factores impohantes para la preservación y evolución de las repeticiones en tándem
(Fitzgerald eí a/.,1994; Plohl eí a/.,1998; Ugarkovic y Plohl, 2002).
Una característica de las repeticiones en tándem es el peffil de escalera generado cuando
el ADN genómico es digerido con enzimas de restricción, que tienen su sitio de
reconocimiento en la secuencia de ADN satélite. Las técnicas de hibridación para su
detección como el Southern Blot, indican la presencia o ausencia de este ADN satélite
proporcionando una aproximación a la organización que estas presentan en el genoma de
CAPÍTULO IV
la especie estudiada; se encontró dos bandas (~200y 400pb) para Ateqsat 101, en la
digestión de ADNg de A. íequí./ana con la enzima Msel y para Ateqsat 105 se encontró
múltiples señales pero en un rango de tamaño de entre 200pb-1000pb. La detección de
un número bajo de bandas se relaciona con el número de copias de la sonda de interés
que se encuentran en el genoma del organismo estudiado, tal fue el caso de Musa
acum/.naía y Musa b/ab/.s/.ar}a en el cual se probó el ADN satélite CL18 y CL33,
observando que el número de copias de CL18 era menor, motivo por el cual no pudo ser
detectado en Musa ba/b/.sÍ.ana (Cizkova eí a/„ 2013).
Para complementar la información acerca del comportamiento de estas secuencias` se
utiliza la técnica de hibridación Í.n sffu fluorescente, indicando la posición en las que se
encuentran en los cromosomas. La secuencia Ateqsat 105 fue hibridada en el núcleo y
células en metafase de A. fequ/./ana y el resultado de esto indica una sola señal. La
presencía de una sola señal en un solo cromosoma indica que es específico para ese
locus, esta característica puede ser empleada como un marcador cromosomal para A.
tequilana.
En diferentes especies de plantas monocotiledoneas la presencia del ADN satélite se ha
visto, mediante hibridación /.n s#u fluorescente, preferentemente en múltiples locus de los
cromosomas en la región de la heterocromatina, entre estas especies se encuentran,
A//Í.um cepa (lrifune eí a/., 1995) Musa acum/.nafa (Cizkova eí a/., 2013), Ooíza saíí.va
(Ananiev eí a/„ 1998), especíes del género Frt.fí.//ar7.a (Ambrozova eí a/., 2011) y especies
de la familía Aeveae (Winterfeld ef a/., 2009),
El empleo del ADN satélite como marcador molecular para diferentes especies incluídas
en un mismo género o familia debida a su característica especie-especifico, tal fue el caso
del ADN satélite para especies pertenecientes a Triticeae y se observó que era específica
para A. spe/ío/'des, ya que no fue detectada en otras especies. Estos autores concluyen
que Spe/Í-í es un ADN satélite e§pecie específico para A. spe/fo/.des y puede ser utilizado
como marcador molecular en esta especie (Salinas eí a/.,1998). Posteriores estudios de
este ADN satélite demuestran que utilizando una clona de la biblioteca BAC de 7r/t/.cum
aesf/.wm, que contiene esta región repetida, pudo ser identificado en una variedad de T.
aesí/.vum hexaploide (Salinas eí a/., 2009).
59
CAPÍTULO IV.
Actualmente existe una biblioteca BIBAC parcial del genoma de A. Íequ/./ana (Tamayo-
Ordoñez ef a/., 2012) en la que la búsqueda de estos ADN satélite resulta interesante, así
como determinar la presencia y distribución de las mismas en otras especies del género
Agave.
El aislamiento y la identificación del ADN satélite brindan la información necesaria para
conocer las relaciones evolutivas con otras variedades de la especie A. íequ/./ana y otras
especies del género Agave. Sin embargo, el estudio y caracterización realizados en este
estudio deben ser complementados con posteriores análisis en los que se involucre una
localización precisa de este tipo de ADN repetido.
60
CAPÍTULO IV
4.2. CONCLUSIONES
v' Se lograron aislar seis secuencia de ADN satélite en A. íequ/./ana mediante la
técnica de AUTO PCR
v' Estas secuencias presentan características del ADN satélite, también presentan
motivos conservados con otras secuencias de ADN satélite pertenecíentes a
especies de la clase Lilliopsíde, misma clase a la que pertenece el género Agave.
v' EI Southern blot indica que la secuencias 101 y 105 muestra la presencia de dos y
tres bandas, re§pectivamente; en ambos casos estas bandas tiene un tamaño~200pb y se encuentran en un perfil de escalera.
/ La hibridacíón /.n sÍ.Íu fluorescente indica la presencía de una sola señal de las
sondas (secuencias 101 y 105), en núcleos y células en metafase de A. íeqwí./ana.
4.3. PERSPECTIVAS
v' Determinar el número de copias del ADN satélite en el genoma de A. Íequ/./ana.
v' Determinar la pre§encia de estas secuencias en otras especies del genero Agave.
v' Localizar de manera física por FISH la presencia en otras especies como A.
Íouncroydes y A. angusíoío/Í.a con diferente número de ploidía.
CAPÍTULO IV.
4.4. BIBLIOGRAFIAAmbrozova K., Mandakova T., Bures P., Neumam P., Leitch 1., Koblizkova A.. Macas J. y
Lysak M.A. (2011). Diverse retrotransposon families and an AT-rich satellite DNA
revealed in giant genomes of Fn.Í/.//ar/.a lilies. Annals of Botany; 107, 255-268.
Ananiev E.V., Phillips R.L. y Rines H.W. (1998). Chromosome-specific molecular
organization of maize (Zea mays L.) centromeric regions. Proccedings National
Academic of Sciences. USA,. 95, 13073-13078.
Castorena-Sánchez 1„ Escobedo R.M„ y Quiroz A. (1991). New cytotaxonomical
determinants recognized in six taxa of Agave in the sections R/.g/.dae and S/.sa/anae.
Canadian Journal of Botany, 69,1257-1264.
Colunga-García Marín R., Coello-Coello J., Eguiarte L. y Piñero D. (1999). lsoenzymatic
variation and phylogenetic relationship between Henequen (Agave fuon3roydes) and
m wm ancestor A. angt/sfffo/í.a ÍAgavaceae). American journal of botany, 86,115-
123.
Cizkova J„ Hribova E., Humplikova L., Christelova P. y Suchankova P. (2013). Molecular
Analysis and Genomic Organization of Major DNA Satellites in Banana (M" spp.).
PLoS ONE; 8,1-14.
Flavell R.B. (1986). Repetitive DNA and chromosome evolution in plants. Transactions of
The Royal Society; London, 312, 227-242.
Fitzgerald D.J., Dryden G.L„ Bronson E.C., William J.S. y Anderson J.N. (1994).
Conserved patterns of bending in satellite and nucleosome positioning DNA. The
Journal of Biological and Chemistry; 269, 21303-21314.
Hemleben V„ Torres-Ruiz R.A., Schmith T. y Zentgraf U. (2000). Molecular cell biology:
roleofrepetitiveDNAinnucleararchitectureandchromosomestructure.Progressin
Botany; 61, 91-117.
Hemleben V., Kovarik A., Torres R.A., Volkov R.A. y Beridze T. (2007). Plant high
repeated satellite DNA: molecular evolution distribution and use for identification of
hybrids. Systematic and biodiversity, 5, 277-289.
62
CAPÍTULO IV
lrifune K., Hirai K., Zheng J., Tanaka R„ y Morikawa H. (1995). Nucleotide sequence of a
highly repeated DNA sequence and its chromosomal localjzation in A///.t/m
Í/.sÍu/osum. Theoritical and Applied Genetics. 90, 312-316.
Kíng K., Jobst J. y Hemleben V. (1995). Differential Homogenization and Amplification of
Two Satellite DNAs in the Genus Cucuti/.Ía (Cucurbitaceae). Joumal or Molecular
Evolution; 41, 996-1005.
Macas J., Meszaros T. y Nouzová M. (2002). Plantsat: a specialized database for plant
satellite repeats. Bioínformatics,18, 28-35.
Narváez-Zapata J. A., y Sánchez-Teyer F. L. (2009). Agaves as a raw material: recent
technologies and applícations. Recent Patents on Biotechnology, 3,185-191.
Navajas-Pérez R., Quesada del Bosque M.E., y Garrido Ramos M.A. (2009). Effect of
localization, organization, and repeat-copy number in satellite-DNA evolution.
Molecular and Genetics Genomics, 282, 395-406.
Plohl M., Luchetti A., Mestrovic N. y Mantovani 8. (2008). Satellite DNAs between
selfishness and functionality: structure, genomics and evolution of tandem repeats in
centromeric (hetero) chromatin. Gene, 409, 72-82.
Salinas E.A., Pestovs l.G. y Vershinin A.V. (1998). ldemfication of a new family of tándem
repeats in rrttí.ceae genomes. Euphytica; 100, 231-237.
Salina E.A., Sergeeva E.M., Adonina l.G., Shcherban A.B., Afonnikov D.A., Belcram H.,
Huneau C. y Chalhoub 8. (2009). lsolation and sequence analysis of the wheat 8
genome subtelomeric DNA. BioMed Central; 10,1-14.
Schmidt T. y Heslop-Harríson J.S. (1998). Genomes, genes and junk: the large-scale
organization of plant chromosomes. Trends in plant Science; 3,195-199.
Tamayo-Ordoñez M., Rodríguez-Zapata L.C. y Sánchez-Teyer L.F. (2012). Construction
and characterization of a partial binary bacterial artificial chromosome (BIBAC) of
Agave Íequ/./ana var. azul (2X) and its application for gene identification. African
Journal of Biotechnology; 11,15950-15958.
63
CAPÍTULO IV.
Ugarkovic D. y Plohl M. (2002). Variation in satellite DNA profiles-causes and effects. The
European Molecular Biology Organization Journal; 21, 5955-5959.
Vandemark G.J. (1998). lnterspecific and intraspecific relationships among Agave spp
based on RAPD and AFLP. Resumen. Memorias del Vlll Congreso Nacional de de
Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Guanajuato México, p. 30.
Winterield G„ Dóring E. y RÓser M. (2009). Chromosome evolution in wild oat grasses
(Aveneae) reveales by molecular Phylogeny. Genome; 52, 361-380.
64
