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  • UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELADEPARTAMENTO DE GENTICA

    DESARROLLO DE UN MAPA GENTICO CON

    MARCADORES AFLP Y MICROSATLITE EN

    RODABALLO (Scophthalmus maximus L.)

    Memoria presentada por:

    Gloria M Gonzlez Fortespara optar al grado de Doctora en Ciencias Biolgicas

    Lugo, Mayo 2008

  • CARMEN BOUZA FERNNDEZ, PAULINO MARTNEZ PORTELA y LAURA

    SNCHEZ PIN, Profesores Titulares y Catedrtica del Departamento de

    Gentica de la Universidad de Santiago de Compostela

    CERTIFICAN

    Que el trabajo titulado Desarrollo de un mapa gentico con marcadores AFLP

    y microsatlite en rodaballo (Scophthalmus maximus L.), que presenta Gloria

    M Gonzlez Fortes para optar al Grado de Doctora en Ciencias Biolgicas, ha

    sido realizado bajo su direccin, que lo consideran concludo y autorizan su

    presentacin al tribunal calificador.

    Y para que as conste, firman la presente en Lugo, a 26 de Mayo de 2008.

    Dra. Carmen Bouza Fernndez Dr. Paulino Martnez Portela

    Dra. Laura Snchez Pin

    Gloria M Gonzlez Fortes

  • Este trabajo ha sido financiado mediante el Proyecto de Investigacin

    Desarrollo de un mapa gentico de ligamiento con marcadores microsatlite

    en rodaballo (Scophthalmus maximus L.), (PGIDT01MAR26101PR),

    concedido por la Xunta de Galicia. As mismo, su realizacin se ha visto

    facilitada gracias al disfrute de una Bolsa de Tercer Ciclo y una Bolsa

    Predoctoral concedidas por la Consellera de Educacin y Ordenacin

    Universitaria (Direccin Xeral de Universidades e Investigacin) de la Xunta de

    Galicia.

  • AGRADECIMIENTOS

    Terminado el trabajo, queda mirar atrs, hacer un repaso e intentar no olvidar a ninguno de los que de una manera u otra me han ayudado a iniciar, desarrollar y concluir esta tesis.

    En primer lugar, mi agradecimiento a mis directores de tesis, Carmen Bouza, Paulino Martnez y Laura Sanchez. Laura y Carmen confiaron en que podra llevar a cabo este proyecto y a ellas debo agradecerles el haberme iniciado en el mundo de la investigacin. Especialmente, a Paulino y Carmen, les agradezco que hayan seguido este trabajo durante los ltimos aos, que han sido duros y a veces parecieron interminables.

    A Francesco Nonnis-Marzano y Gilberto Gandolfi, de la Universit degli Studi di Parma, debo agradecerles todo el trabajo relacionado con el desarrollo de marcadores AFLP, que fueron fundamentales para la elaboracin de este mapa. Les debo mucho a nivel profesional, pero ms an a nivel personal. En su laboratorio comprob que se puede disfrutar trabajando.

    Gracias al Dr. Paolo Ajmone-Marsan della Universit del Sacro Coure decubr el GenomiPhi, que sirvi para rectificar los errores de principiante.

    A Ania, Maria Peque y Mara Portela quiero agradecerles su compaa, los ratos de chchara y de trabajo en equipo...de ellas me llevo los mejores recuerdos del laboratorio en Lugo. Tambin a Beln y Sonia, les agradezco su profesionalidad y que en los momentos peores hayan tenido siempre una palabra de nimo. Gracias tambin a Miguel por su ayuda con el misterioso mundo de los sofwares estadsticos.

    A mis compaeros en Italia tengo mucho que agradecerles. Marta Scalfi me mostr los secretos del Mapmaker, recordar siempre la tarde que pasamos a los pies de los Alpes, portatil en mano, descifrando el lenguaje de Lander et al., 1987. A Andrea y Pio, gracias por esos cafs que nos reunan a la comunidad de becarios para fregarsene di tutto. A Milena, Riccardo y Marina, siempre les agradecer el haberme recibido como una ms en su laboratorio, sin mostrar un mnimo de recelo ante la espaola que monopolizaba sus pipetas.

    A mi familia le agradezco su apoyo, el que siempre estn ah y me valoren igual con tesis que sin ella. A Marco, que comenz conmigo la aventura lucense y que ha vivido de cerca los alti-bajos de estos aos, gracias por tu confianza y apoyo incondicional.

    No quiero cerrar estos agradecimientos sin mencionar a mis amigas ngeles, Amalia, Eda ..., gracias a ellas los largos inviernos lucenses fueron menos fros.

    vii

  • RESUMEN

  • Resumen

    RESUMEN

    A lo largo de esta memoria se presenta la construccin de un mapa

    gentico en una de las especies marinas de mayor inters en la acuicultura

    gallega, el rodaballo (Scophthalmus maximus). En especies de inters

    comercial, la disponibilidad de un mapa gentico supone una herramienta

    fundamental en la mejora de los stocks de cultivo, ya que son el primer paso en

    la identificacin de QTLs (Quantitative Trait Loci) para caracteres de inters

    como la resistencia a enfermedades, crecimiento o determinacin sexual. El

    desarrollo de estos mapas genticos exige disponer de familias adecuadas

    para el seguimiento de la segregacin gnica y de un nmero de marcadores

    relativamente elevado que permitan cubrir el genoma en estudio. En el caso de

    rodaballo, una especie de domesticacin relativamente reciente y poco

    conocida a nivel genmico, cuando se emprendi este proyecto de mapeo, no

    se dispona de familias seleccionadas y el nmero de marcadores

    desarrollados era escaso. As, la seleccin de la familia de referencia para el

    mapeo y la identificacin de marcadores de ADN que cubrieran

    adecuadamente el genoma, marcaron gran parte del desarrollo de este trabajo

    de Tesis.

    En rodaballo se dispona de la tecnologa para la induccin de

    ginognesis, por lo que se seleccion como familia de mapeo una hembra de

    rodaballo procedente de una poblacin natural y 50 de sus embriones

    ginogenticos haploides, considerando las ventajas de los individuos haploides

    en cuanto al genotipado de marcadores dominantes. En una muestra de estos

    embriones haploides se puso a punto, por primera vez en esta especie, la

    tecnologa AFLP. A partir de la combinacin de endonucleasas EcoRI/TaqI y

    de diecisiete parejas de cebadores, se identificaron 186 fragmentos

    polimrficos en la familia de mapeo. Setenta y cuatro polimorfismos fueron

    descartados atendiendo a criterios de calidad de la amplificacin y de ajuste a

    la ratio de segregacin mendeliana 1:1 (P

  • Resumen

    AFLP se utilizaron en el anlisis de ligamiento. Entre las bandas con ratios

    distorsionadas y las descartadas por su escasa calidad, se estudi el efecto de

    posibles amplificaciones inespecficas y la presencia de bandas complejas en

    la induccin de errores de genotipado.

    Adems de los marcadores AFLP se incluyeron en la construccin del

    mapa 24 marcadores microsatlite: 22 procedentes de la literatura y 2 puestos

    a punto en este trabajo a partir de una genoteca de rodaballo enriquecida en

    secuencias microsatlite. El mapa resultante incluye 111 marcadores (91

    AFLPs y 20 microsatlites) distribuidos en 23 grupos de ligamiento (LG) -uno

    ms que el nmero de cromosomas de la especie- que abarcan un total de

    1040 cM, siendo la distancia media entre marcadores adyacentes de 14,6 cM.

    Los marcadores se distribuyeron aleatoriamente en el mapa, sin que pudieran

    identificarse agrupaciones significativas. A partir de los marcadores framework

    se obtuvo una primera estima del tamao genmico total de rodaballo, que

    sera de 1150 cM.

    A pesar de las limitaciones de un mapa de moderada densidad como el

    presentado en este estudio, sus grupos de ligamiento proporcionan un primer

    marco de organizacin del genoma de rodaballo, dibujando los primeros

    bocetos de los cromosomas fsicos subyacentes al mapa gentico. La

    amplificacin de los marcadores AFLP y microsatlite de este estudio en

    nuevas familias segregantes junto con nuevos marcadores permitir el anclaje

    a grupos de ligamiento de mapas genticos futuros hasta consolidar un mapa

    genmico de referencia en esta especie.

    xii

  • Resumen

    SUMMARY

    This work reports the construction of the genetic map for one of the

    most important marine species in the Galician aquaculture, the turbot

    (Scophthalmus maximus). In species with commercial value, the availability of a

    genetic maps is an important tool for breeding, as it is the first sptep for QTL

    (Quantitative Trait Loci) identification of traits of productive interest, such as

    disease resistant loci. The construction of genetics maps needs appropriate

    families to follow the genetic marker segregation, and a relative high number of

    markers to cover the genome under study. In the case of turbot, a species of

    recent domestication and with a low knowledge about its genome, at the

    beginning of the present mapping project, there was a lack of selected families

    for linkage analysis and the number of available markers was low. Thus, the

    selection of the reference family for mapping and the identification of DNA

    markers for an appropriate coverage of the turbot genome were major

    underlying specific objectives to the development of this PhD work.

    Using the available technology for gynogenesis induction in this species,

    a turbot female from a wild population and its progeny of 50 gynogenetic

    embryos were selected as family mapping, taking into account the advantages

    of the haploid individuals for dominant markers genotyping. In a sample of

    these embryos, the AFLP technology was applied for the first ti