AGROBACTERIUM TUMEFACIENSAgrobacterium tumefaciens es una alfa-proteobacteria Gram negativa, de la familia Rhizobiceae, que provoca tumores por transformacin en clulas vegetales; lo que se conoce como la enfermedad de la agalla. Normalmente los tumores se forman en la parte baja del tallo, sobre todo en plantas dicotiledneas. La capacidad infectiva de la bacteria se debe al plsmido Ti (tumor inducing), siendo completamente avirulentas las cepas que carecen del plsmido.PLSMIDO TiEl plsmido Ti es replicativo, de doble cadena, circular y de gran tamao; que oscila mucho de unas cepas a otras, pudiendo llegar a las 300Kb. Su tamao medio es cercano a las 200 kb. En l se encuentran genes de virulencia, de sntesis y catabolismo de opinas (como octopina o nopalina) y de sntesis de fitohormonas.La regin del plsmido que se transfiere a la a la clula husped, se denomina t-DNA. En ella, se encuentran genes para la sntesis de una o varias auxinas, de una o varias citoquininas y de opinas. Las auxinas y citoquininas son las responsables de la formacin del tumor, por proliferacin y crecimiento exacerbados de las clulas vegetales. Las opinas son derivados de aminocidos, que sirven de principal de nutriente de Agrobacterium tumefaciens, sirvindole a la bacteria de fuente de energa, por oxidacin aerobia. La regin t-DNA, se encuentra flaqueada por dos secuencias constituidas por repeticiones directas de 23 nucletidos, en alguna ocasin 25), que delimitan que zona del plsmido se va a movilizar. Estas secuencias se denominan borde derecho e izquierdo del t-DNA. Todo lo ubicado entre ambas, pasar a la clula vegetal.Los genes de virulencia son los encargados de transferir y proteger el t-DNA. Se encuentran como un opern.En la regin que no se transfiere quedan los genes para el catabolismo de opinas.Como todo plsmido, para poder permanecer en la bacteria sin perderse, porta el origen de replicacin de Agrobacterium tumefaciens.En conclusin, la funcin del plsmido es convertir a la planta en una factora productora de opinas, para satisfacer los requerimientos energticos de la bacteria.MECANISMO DE INFECCINAgrobacterium tumefaciens capta seales de tipo fenlico, por el receptor traducido a partir del gen de virulencia virA; lo que le indica a la bacteria que se encuentra frente a una planta susceptible a la transformacin.Vir A presenta actividad sern-kinasa y al unirse a su ligando, fosforila, con gasto de ATP a Vir G. Una vez fosforilado, Vir G acta como factor de transcripcin para el resto de genes de virulencia. Por accin conjunta de Vir D1 y Vir D2 se escinde el t-DNA del resto del plsmido de en la hebra que va de 5 a 3. Simultneamente, se transcribe una zona complementaria a la que se separa del plsmido. Vir D2 se coloca en el extremo derecho del t-DNA. El t-DNA sale de la bacteria a travs de un poro formado por Vir B. Mientras va saliendo, Vir D4 incorpora un complejo formado por Vir E1 y Vir E2, a lo largo del t-DNA. El complejo formando por Vir D2, VirE1-Vir E2 y t-DNA, entra en la clula vegetal, a travs de un mecanismo poco conocido, y acompaado por VirF.En el citoplasma vegetal, Vir E2 interacciona con VIP 1 y VIP2, lo que permite la unin de Vir F al complejo. Vir D2 presenta una secuencia NLS (secuencia de direccionamiento al ncleo), la cual es reconocida por importinas citoplasmtica, que dirigen al complejo al nucleoporo. El nucleoporo formado por distintas protenas Nup, que permiten el paso del complejo, gracias a que la importina establece uniones transitorias con las secuencias FG de las protenas Nup. Una vez en el ncleo Ran cambia su unin a GDP por GTP para inducir la liberacin de la importina y su liberacin al citoplasma. Una vez que el t-DNA se encuentra en el ncleo, se integra en dentro del genoma vegetal. La integracin no es al azar. Existen zonas de integracin preferencial.Cada clula vegetal infectada, incorpora de una a cuatro regiones de t-DNA de distintas bacterias. El t-DNA se mantiene estable une vez integrado en el cromosoma vegetal.

APLICACIONES DEL PLSMIDO TiEl plsmido Ti ha sido el principal impulsor de la ingeniera gentica en plantas. Gracias a su emple se ha conseguido multitud de variedades transgnicas. Continuamente, se han realizado modificaciones en el plsmido Ti con objeto de mejorar sus caractersticas como vector. Habitualmente se aade uno o ms genes resistencia a antibiticos, y se elimina el T-DNA no esencial, y los genes que codifican el desarrollo del tumor. Se mantienen genes necesarios para la infeccin de la clula vegetal. Tambin se ha insertado el T-DNA en el plsmido pBR32 de Escherichia coli y en otros plsmidos para producir vectores de clonacin capaces de desplazarse entre bacterias y plantas. El gen o los genes de inters se empalman en el t-DNA entre las repeticiones directas, mediante empleo de enzimas de restriccin y ligasas. A continuacin, se introduce el plsmido en Agrobacterium tumefaciens, se seleccionan por resistencia a antibiticos las bacterias que incorporan el plsmido, y se infectan con la bacteria clulas en cultivo de la planta a transformar. La bacteria se elimina empleando una mezcla de antibiticos y se seleccionan los transformantes en funcin de su resistencia a antibiticos o herbicidas (u otro rasgo codificado por el t-DNA). Finalmente, se regeneran plantas completas a partir de las clulas en cultivo, mediante la utilizacin de auxinas y citoquininas que estimulan la produccin de callos y brote. El motivo de eliminar el t-DNA no necesario, es porque las fitohormonas para las que codifica, pueden interferir en la regeneracin de plantas.Otra tcnica consiste en emplear un sistema binario con dos plsmidos. Uno de los plsmido porta las secuencias necesarias para la integracin al genoma se encuentran en los bordes del T-DNA, pudiendo ser reemplazado el resto de la secuencia del T-DNA. El otro plsmido. Denominado Helper, porta los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia del T-DNA, actan en trans, por lo que no tienen que estar situados en el mismo plsmido que el T-DNA, por lo que no es oncognico pero es capaz de transferir el T-DNA presente en otro plsmido.Un plsmido vector que contiene los bordes del T-DNA. Este plsmido es pequeo y de fcil manipulacin en E. coli para el clonado de secuencias. No presenta los genes para la produccin de fitohormonas ni opinas. Presenta sitios de restriccin mltiples dentro de los bordes del T-DNA para el clonado de secuencias. Contiene tambin un marcador para la seleccin de las clulas transformadas, como por ejemplo, resistencia a kanamicina, herbicida o marcador metablico.Independientemente de emplear uno o dos plsmidos, se suelen construir genes en tndem con la informacin deseada, precedidos de un promotor. Fraley y col, en 1993, trabajando para Monsanto, usaron como marcadores genes que otorgaban resistencias a determinadas sustancias. Estos genes se introducan en el ADN-T, junto con los genes deseados para la planta transgnica. As, podan ver cuales eran las clulas transformadas. Destacan los genes de resistencia a kanamicina, carbenicilina y a higromicina. Las clulas vegetales que sobrevivan al ataque de estas sustancias, eran en las que se confirmaba una transformacin.Uno de los marcadores ms usados hoy en da, es el gen -glucuronidasa (GUS). Se extrae de Escherichia coli. Dicho gen codifica para una enzima que, al degradar un galactsido, aporta pigmentacin azul. Las clulas que experimenten el cambio de color, sern las transformadas.Otro ejemplo de marcador que induce cambios de color, es la protena fluorescente verde. Se obtiene de la medusa Aequorea victoria. Esta protena se codifica en presencia de oxgeno, lo que hace bastante sencilla la identificacin de los vegetales transformados.El uso de discos foliares se volvera un mtodo estandarizado. Fue diseado en 1985, por Horsch, para la compaa Monsanto. Consiste en introducir discos de hojas de tabaco en un cultivo con Agrobacterium tumefaciens en un medio LB (caldo Luria Bertoni). Se agita para asegurar la infeccin. Despus los discos se colocan en medios de cultivo que sustancias que estimulan la aparicin de brotes. Luego se exponen los discos a un medio selectivo, para eliminar las plantas no transformadas.De todos modos, no se puede afirmar al 100% que todas las plantas resistentes, han sido transformadas. Cabe la posibilidad de que la planta ya fuese resistente per se al agente elegido como marcador. Las pruebas genticas sern las encargadas de desvelar cuales de las plantas resistentes son realmente transgnicas. Para confirmarlo, se emplean Southern, Northern y Western. As se confirma que hay ADN, ARN y protena, producto de la insercin. El uso de GUS como marcador, si garantiza que los discos que tornan su coloracin a azul, son realmente transgnicas.PROMOTORESSe encargan de asegurar la expresin del transgn. Se suelen extraer de virus, porque presentan una capacidad de expresin, debida a la naturaleza infectiva. Los del virus del mosaico de la coliflor son los ms usados, cabe destacar el promotor 35S, el cual es usado por Monsanto. Esto permite al transgn ser transcrito con prioridad ante el genoma celular; puede expresarse hasta 1000 veces consecutivas. El promotor, tambin indica el lugar de incorporacin del gen en el genoma vegetal. Toda la secuencia de ADN introducido se denomina casete de expresin, que se constituye de: Gen deseado

Promotor ADN-T Gen marcadorEl promotor provoca una situacin de estrs en la planta, ante el intento de sta para contrarrestar el efecto que tiene sobre ella.Los resultados han sido excelentes en dicotiledneas, pero en monocotiledneas, la infeccin no es tan efectiva. Ello ha llevado a disear nuevos mtodos para integrar el t-DNA en las clulas vegetales.No obstante, la infeccin por Agrobacterium tumefaciens suele ser el mtodo ms eficaz, adems de presentar patrones de herencia mendeliana y dar un alto porcentaje de plantas regeneradas frtiles.BIOLSTICASu nombre significa balstica biolgica. Consiste en un mtodo de transferencia directa, que es llevado a cabo por el bombardeo de microproyectiles. Fue introducido por Sanford en 1987. Se usan partculas pesadas, tales como oro o tungsteno, con dimetro de una micra, recubiertas de ADN. Estas partculas se disparan haca las clulas vegetales.En 1988, Klein us para acelerar partculas de tungsteno un mecanismo que funcionaba con plvora. Pero acarreaba daos celulares severos por la toxicidad del tungsteno, por contaminacin acstica y por el impacto mecnico. La tcnica ha sido perfeccionada por Russel, usando partculas de oro y un acelerador a base de helio.Las ventajas del uso de biolstica radican en: Facilidad de uso Alta velocidad. Hasta doce plsmidos integrados por disparo. Los genes que recubren la partcula recuperan su actividad biolgica Se puede aplicar a cualquier tejido de la planta Es capaz de alcanzar capas de clulas profundas Como problemas se pueden mencionar: El porcentaje de xito no es total y se pueden requerir varios intentos. Las partculas deben alcanzar clulas competentes, que por lo general son escasas, con la excepcin de tejidos embrionarios. En cereales es complicada su aplicacin. Es frecuente el insertado de varias copias del transgn, lo que supone un inconveniente a la trabajar con las plantas. Muchas veces no se consigue una introduccin estable. Otra aplicacin de esta tcnica es el producir daos mecnicos, disparando proyectiles sin ADN, para luego usar Agrobacterium tumefaciens como vector de transmisin gnica.VECTORES VIRALESSe ha usado como vector, el virus del mosaico de la coliflor, el virus del mosaico del tabaco y otros virus ARN. Una tcnica denominada ragroinfeccin consiste en introducir ADN vrico en el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, para provocar una infeccin sistmica y obtener as plantas transgnicas. Como ventajas, se pueden citar: Facilidad de infeccin. Afecta a un mayor nmero de hospedadores que Agrobacterium tumefaciens. Como desventajas, aparecen: Desarrollo de la enfermedad, la cual puede llegar a ser letal. Alto nmero de errores en la secuencia del gen introducido. No se suele transmitir a la descendencia, ya que para la transformacin no es necesario el engarzado del gen dentro del genoma de la planta.TRANSFERENCIA DIRECTASe introduce el ADN en el protoplasto, hacindole precipitar con fosfato clcico, se realiza una electroporacin o se elabora un tratamiento con polietilenglicol (PEG). Se usa cuando las dems tcnicas no ofrecen resultados positivos. Para fusionar protoplastos se utiliza polietilenglicol. Con esto se consiguen hbridos interespecficos.Otro mtodo, es el de fusionar liposomas a la clula o tejido que se quiere transformar. Se trabaja con Lipofectina, que es un compuesto comercial estable, a diferencia de los liposomas naturales. Los liposomas descargan ADN al medio intracelular, con la ventaja de tener una membrana que protege al ADN. Su eficacia aumenta al tratarlo con polietilenglicol o por electroporacin. Los resultados no han sido los esperados.MICROINYECCINDestaca por ser de las tcnicas ms precisas para incorporar ADN en compartimentos celulares. Se realiza mediante dispositivos microcapilares en conjunto a microscopa, para introducir el ADN sin causar daos.Las ventajas a destacar son: Se puede decidir la clula a transformar. Control visual Aplicable a pequeas estructuras (microsporas y zigotos). Al introducirlo en el ncleo, no se expone a agresiones propias del citoplasma (como degradacin por DNAasas).Desventajas: Es un proceso lento, en el que se tiene que aplicar el mtodo clula a clula. Requiere mayor habilidad e instrumental ms complejo.EXPRESINLas plantas que se transforman tendrn comnmente diferentes niveles de expresin. Un fenmeno que no siempre se correlaciona con el nmero de copias. La expresin diferencial de los transgenes ha sido atribuida a efectos posicionales, donde la posicin del sitio de integracin del ADN-T en el genoma receptor afecta el nivel de expresin del transgn.El ADN-T se puede integrar en el genoma receptor en patrones alternativos al de copia nica en un nico sitio. Tambin pueden ocurrir mltiples copias o repeticiones invertidas y otros patrones complejos. La presencia de insertos de ADN-T multimricos, especialmente estructuras repetidas invertidas, se correlaciona fuertemente con el fenmeno de silenciamiento del transgn.La expresin variable de los transgenes o el silenciamiento gnico es un fenmeno ubicuo en las plantas transgnicas. El silenciamiento gnico puede ser el resultado de las interacciones entre las mltiples copias del transgn y genes endgenos relacionados, y est asociado con mecanismos basados en homologa de secuencia que actan tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. El silenciamiento que es resultado del impedimento de la iniciacin de la transcripcin est usualmente asociado a la metilacin de las citosinas o a la condensacin de la cromatina, mientras que el silenciamiento post-transcripcional involucra una incrementada degradacin del ARN en el citoplasma.Adems, el ADN vegetal flanqueante y/o la localizacin cromosmica desfavorable ejercen, en ocasiones, un efecto de silenciamiento sobre el transgn.