Aislamiento de hongos anaerobios - Universidad Nacional De …. 2005 Parte5.pdf · 2013-04-04 ·...
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Figura 16. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 Y 40°C en los diferentes sustratos evaluados.
Actividad de Glucosidasa
En todos los tratamientos analizados se observó actividad ~ - glucosidasa cuyos
valores presentaron una distribución normal. La máxima actividad ~ - glucosidasas
se registró a pH = 6.0 Y temperatura de 50 oC. A pH 6 Y 40°C, se observaron
actividades enzimáticas similares entre paja y celulosa las cuales fueron
significativamente mayores que las de Bagazo mientras que a 50°C y pH 6.5, la
celulosa cristalina presentó mayor actividad enzimática que paja y esta a su vez
fue mayor que las de Bagazo. Estas diferencias fueron corroboradas por el
análisis estadístico.
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I 12
10
8 /\:J 6 , \
E
4 ~---+----. 2
o +-----.-----.-----.-----.-----,,----~ 4 5 6 7 8 9 10
-+-- Celulosa p~ Bagazo 1 I Paja cascaU
Figura 17. Efecto del pH sobre la actividad f3,-glucosidasa detectada en filtrados del hongo E1 cultivado en
celulosa cristalina y tres residuos de cosecha .
=
j• j
Figura 18. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH 6.0 y 40°C en los diferentes sustratos evaluados.
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12 ~---------------
10
8
~~ 20 30 40 50 60 70
Temperatura - oc
-+-- Celulosa - Bagazo Paja ~ Cascarilla ~==~---~-----=~
Figura 19. Efecto de la temperatura sobre la actividad ~-glucosidasa detectada en filtrados del hongo E1 cultivado en celulosa cristalina y tres residuos de cosecha.
no
70
~.o
s......
Figura 20. Box plot de las mayores actividades enzimáticas detectadas a pH ..6-.(acri ba} V. 50°C oc (aba~ en los diferentes sustratos evaluados.
55
5.4. Estabilidad de extracto enzimático con la temperatura
Las tres actividades enzimáticas se conservaron a temperatura entre O-5°C, sin
embargo, a 40°C, el 50% de las actividades enzimáticas disminuyó
aproximadamente a las 48 horas (exoglucanasa) y 50 horas (endoglucanasa y
B-glucosidasa) y en solo 12 horas a 50°C.
Endoglucanasa
20
15 E
10 :::l
E 5
O
O 24 48 72 96
Horas
-+- Celulasa-:')O°C _ Celulasa-4Q°C Celulasa 0-5°C
Exoglucanasa
0,2
0,15
E- 0,1
:::l 0.05
O
O 24 48 72 96
Horas
[-+-CMc-asa 50°C _ CMC-asa 4Q°C I CMC-asa 0-5°C
B-Glucanasa
12
10 E 8
::::1 4E 2 o
o 24 48 72 96
Horas
-+- b-Glucosi.50°C - b-GIUCOS_i. 4Q°C J b-Glucosi. 0-5°C
Figura Estabilidad de los extractos enzimáticos celulolíticos con la temperatura.
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DISCUSiÓN
Aislamiento de hongos anaerobios
Las metodologías previamente descritas resultaron útiles para el aislamiento,
purificación y mantenimiento de cultivos de hongos anaerobios de ganado
criollo BON , con pocas modificaciones.
La inspección visual de la masa fúngica , mostró que los repiques de los
cultivos deben hacerse entre el cuarto y sexto día, además de la toma de
porciones de la periferia, porque son más jóvenes y viables . Los repiques
que se realizaron a partir de medios de cultivo más viejos perdieron
viabilidad o simplemente no crecieron. Estas observaciones están apoyados
por los datos derivados de las curvas de crecimiento en los diferentes
sustratos en donde se evidenció que la fase estacionaria se alcanzó entre el
tercer y cuarto días, excepto en el caso de la celulosa cristalina en donde la
fase estacionaria se alcanzó al quinto día .
Estos resultados son congruentes con los trabajos de Bauchop 1991;
Teunissen M.J . et al 1992; Lowe S. E. Et al 1987 quienes reportan repiques
entre 3-6 días, para diferentes hongos ruminales cultivados en medios
suplementados con salvado de trigo, fibras de sisal , tiras de papel, entre
otros.
En este trabajo también se encontró que la agitación en algunos periodos del
día estimuló el crecimiento fúngico tal vez porque la agitación puede generar
disrupción de la masa fúngica y facilitar la reproducción por fragmentación
miceliar. Resultados similares fueron reportados por Ha Y. W. y Bauchop T.
(1991).
Los aislados mantenidos por repiques sucesivos entre 5 y 6 días
conservaron su viabilidad durante un año, tiempo tras el cual se observó una
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pérdida de su capacidad para realizar esporangiogénesis y
zoosporogénesis. Esto sugiere la necesidad de utilizar métodos tales como
criopreservación, para mantener intactas las características fisiológicas del
hongo incluyendo la capacidad celulolítica .
Los aislamientos de hongos mostraron no solo variaciones morfológicas
marcadas sino también un comportamiento replicativo diferente en el medio
de mantenimiento utilizado en este trabajo. Solo cinco colonias fueron
analizadas para evaluar su capacidad de hacer esporangiogénesis y
zoosporogénesis en medios suplementados en residuos de cosecha y solo a
uno de ellos se les evaluó la capacidad celulolítica en estos medios.
Esporangiogénesis
De los cinco hongos utilizados para la inducción de esporangiogénesis en
diferentes sustratos, solo tres desarrollaron esporangios después de una
preincubación de 4 o 5 días en el medio de mantenimiento (paja o glucosa) y
repique en medio fresco. Debido a que la esporangiogénesis no se presentó
en cultivos que no fueron repicados a medio fresco, es probable que los
nutrientes del medio se hayan agotado durante este período de incubación.
Otra explicación probable es que se acumulen productos 'flnales de la
fermentación, reprimiéndose el desarrollo del microorganismo, de tal manera
que la transferencia a un medio fresco facilita el desarrollo de esporangios.
Ambas ideas están apoyadas por la observación de que el hongo HAR
HARBR-1 alcanza la fase estacionaria hacia el cuarto día cuando se cultiva
en medio suplementado con glucosa/celobiosa (figura 7) .
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En este trabajo, la glucosa resultó ser un buen inductor de
esporangiogénesis en contraste con la Celobiosa. Esto puede deberse a la
biodisponibilidad de este azúcar soluble, el cual puede ser utilizado
rápidamente en la glicólisis, mientras que el disacárido celobiosa debe
hidrolizar su enlace ~1-4 antes de ingresar a las vías metabólicas.
Sin embargo, teniendo en cuenta que en la mezcla Glucosa/Celobiosa, la
esporangiogénesis es también menor que en el medio suplementado
únicamente con Glucosa, es posible que la glucosa juegue un papel inductor
más que nutricional en la esporangiogénesis, aún cuando no puede
descartarse la posibilidad de que haya competencia en el transporte
intracelular de estos dos metabolitos.
El hongo HARBR-1 tiene la habilidad de realizar esporangiogénesis y
zoosporogénesis en los medios de Paja de Arroz y Bagazo de Caña . Estos
resultados sugieren que la composición química de estos dos residuos de
cosecha debe jugar un papel importante en el desarrollo de esporangios y la
liberación de zoosporas. Algunos reportes han propuesto que la sílice, el cual
es un componente común en estos dos sustratos, incrementa la digestibilidad
de los tejidos lignificados y probablemente esto explica la habilidad de los
hongos estudiados para crecer en estos medios de cultivo. Además ambos
sustratos presentan un contenido de proteínas que serían una de las fuentes
de compuestos nitrogenados, requeridos para la síntesis proteica del hongo.
A pesar de lo anterior, el bagazo de caña no resulta ser un buen medio para
inducir esporangiogénesis en 4 de los hongos evaluados, mientas que en la
Paja de Arroz, fue posible lograr la esporangiogénesis en 3 de los
aislamientos analizados cuando los hongos venían creciendo en paja de
Arroz y solo en dos cuando crecieron previamente en Glucosa.
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La composición de los medios de cultivos, no parece ser el único factor
importante en la inducción de la esporangiogénesis y la zoosporogénesis,
sino también la capacidad del hongo para responder a sus componentes.
Esta idea está apoyada por la observación de que algunos hongos fueron
incapaces de liberar zoosporas en medios que contenían hemina, la cual es
considerada como un potente inductor de zoosporogénesis.
La implicación de la biología del hongo en la inducción de la zoosporogénesis
también fue encontrada por Ho y Bauchop en 1991, quienes observaron que
los hongos policéntricos pueden propagarse principalmente por hifas, en
ausencia de zoosporas, a diferencia de las especies monocéntricas.
En relación con la morfología de los esporangios, el aislamiento HARBR-2
presenta formas características de la especie Piromyces communis mientras
que los aislamientos HARBR-1 y HARBR-3 son más compatibles con la
especie monocéntrica Neocalimasfix fronfalis. Sin embargo, la ausencia de
zoosporogénesis de HARBR-3 en los medios hasta ahora evaluados no
descartan la posibilidad de que pueda corresponder a otro género.
En efecto, se requieren estudios morfológicos adicionales con microscopia
electrónica que permitan analizar la presencia de otras características
morfológicas de interés taxonómico y establecer sus relaciones filogenéticas
con otros hongos ruminales mediante el análisis de secuencias de DNA.
A pesar de lo anterior, algunas observaciones como la formación regular y
abundante de esporangios, la existencia de varios flagelos en las zoosporas
de HARBR-1, la zoosporogenesis regular, la forma y tamaño de las
zoosporas, la forma y tamaño de las colonias fúngicas y el aspecto
filamentoso de sus rizoides, sugieren que el aislado HARBR-1 pertenece al
género Neocallimastix, especie frontalis (Ho Y. W . and Bauchop T. 1991; Ho
y. W. and Barr S. J. 1995). Desafortunadamente, en el presente trabajo, no
60
61
se obtuvo DNA fúngico con los protocolos de extracción utilizados y por tal
razón no fue posible hacer una aproximación desde la identificación
molecular.
Aislamiento de DNA, diseño y evaluación de cebadores
Ninguno de los protocolos evaluados fue realmente efectivo para el
aislamiento de DNA. La mayoría de trabajos desarrollados hasta la fecha
utilizan protocolos que incluyen bolitas de zirconio para la extracción de DNA.
En este trabajo se ensayaron metodologías alternativas para el rompimiento
de pared celular pero ninguno de los 9 protocolos (y sus modificaciones)
evaluados para la extracción de DNA (Anexo), resultaron útiles en nuestros
aislados nativos. De hecho, de los protocolos analizados, solo uno permitió la
obtención no reproducible de DNA, el cual no resultó útil para la obtención de
amplificados por peR.
Al parecer, el carácter refractario de estos microorganismos no solo dependel¡ de la habilidad de los protocolos para romper la pared celular, sino también
de una gran cantidad de polisacáridos presentes en estos organismos. Lo
anterior sugiere el uso de protocolos de extracción que tengan en cuenta
estos dos aspectos en estudios posteriores.
Una dificultad adicional en la parte experimental, es que no logramos (.
encontrar cepas de referencia de estos hongos en diferentes casas
comerciales, lo cual limitó seriamente la estandarización de técnicas de
aislamiento de DNA y los ensayos de amplificación.
En cuanto al diseño de cebadores, se encontró que de los géneros
analizados, solo Piromyces presenta una región diagnóstica en la secuencia
bajo estudio. Este resultado contrasta con el trabajo de Brookman et al.,
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2000, en el que se publicó una región diagnóstica para Neocallimastix en la
secuencia ITS 1.
Los análisis Blast realizados en este trabajo, demostraron que la secuencia J de Brookman et al., en el 2000, estaba también presente en secuencias ITS1
de los géneros ruminales Anaeromyces y Caecomyces (Fliegerova, et al
2003), las cuales fueron incluidas en la base de datos en los últimos tres
años (Anexo 4). Estos resultados indican que la secuencia de Brookman et
al., 2000, no constituye en la actualidad una región diagnóstica para el
género Neocallimastix y sugiere la revisión constante de secuencias que
están continuamente actualizándose en las bases de datos.
Teniendo en cuenta lo anterior, la mejor manera de establecer la identidad
de aislamientos nativos de hongos anaerobios ruminales probablemente sea
a través del secuenciamiento de la región ITS-1, 5.8S e ITS-2 y posterior
determinación de su relación filogenética con las secuencias previamente
reportadas en las bases de datos. La secuenciación de los fragmentos de
interés puede realizarse con los cebadores (5«-TGTACACACCGCCCGTC
3« y GM2: 5«-CTGCGTTCTTCATCGAT-3«) y condiciones de amplificación
reportados por Li y Heath (1992).
Método de evaluación de la cinética proliferativa del hongo HAR
HARBR-1
Entre los métodos evaluados para medir el crecimiento fúngico, el que
presentó mayor sensibilidad y exactitud fue la cuanti'ficación de la
concentración de formiato. Aun cuando, la medición del gas total formado, es
también una excelente forma de evaluar el crecimiento fúngico, la utilización
de una jeringa para la medición del volumen, no es recomendable, por
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constituirse en un procedimiento semicuantitativo muy susceptible de errores
especialmente en las primeras horas del crecimiento.
Sin embargo, el uso de un dispositivo medidor de presión (paralelo a la
medición del volumen desalojado), genera resultados cuantitativos en un
tiempo mínimo y reproducibles, además que es de bajo costo y puede ser
adquirido por laboratorios microbiológicos, que en general no cuentan con el
recurso de la cromatografía (Theodorou M. K. et al 1995).
A pesar de que el método de medición de la masa fúngica mostró cambios
en la cinética de crecimiento, no resultó ser tan preciso debido a las
dificultades para discriminar entre la pérdida aparente de sustrato complejo y
el pequeño aumento de la masa fúngica. Este método probablemente es
más útil en experimentos realizados en volúmenes mayores en donde los
cambios de peso en la masa fúngica son también mayores.
Cinética de crecimiento del hongo HARBR-1 en diferentes sustratos
El mayor crecimiento de HARBR-1 se alcanzó en la celulosa cristalina,
seguida de bagazo de caña y paja de arroz, mientras que en la cascarilla de
café la cinética de crecimiento fue bastante lenta. Es importante anotar que
en ninguno de los medios ensayados hubo degradación significativa del
sustrato, excepto en el caso de tirillas de papel Whatman utilizadas en las
primeras etapas de la investigación como sustratos de mantenimiento, las
cuales no son tan recalcitrantes como los otros sustratos evaluados.
Tres situaciones podrían explicar los resultados anteriores:
(1) La accesibilidad de estos sustratos a los complejos enzimáticos. A pesar
de su carácter refractario, la celulosa cristalina presenta una estructura
relativamente homogénea en comparación con los sustratos complejos en
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donde los componentes de las paredes celulares están imbricados en redes
tridimensionales de menor accesibilidad a la hidrólisis enzimática. Esta idea
fue sugerida previamente por Percival Zhang Yi-Heng and Lynd Lee R.,
(2004).
(2) Presencia de sustancias inhibitorias del crecimiento en los sustratos
complejos evaluados. A diferencia de la celulosa cristalina, los sustratos
complejos poseen además de la celulosa nativa, sustancias fenólicas u otras
sustancias cuyo metabolismo puede dar lugar a compuestos fenólicos las
cuales presentan efecto inhibitorio del crecimiento fúngico (Fujii Simone, et
al. 2004; Weimer Paul J. et al. 1993; Palmqvist E. and Han-hagerdal B.
2000). Esta situación es especialmente importante para la cascarilla de café,
un sustrato en el cual se ha reportado la presencia de compuestos
polifenólicos como los taninos.
(3) Concentración de celulosa en el sustrato complejo. Para hacer
comparables los tratamientos, en el presente trabajo se utilizaron las mismas
concentraciones de los residuos de cosecha que de celulosa cristalina. Sin
embargo, considerando que las paredes celulares son matrices complejas
en donde la celulosa es solo un componente, es factible pensar que su
concentración en las paredes es menor que la de la celulosa cristalina pura.
Actividad enzimática
Las actividades exoglucanasa y endoglucanasa no presentaron diferencias
estadísticamente significativas entre los filtrados del hongo cultivado en paja
de arroz, bagazo de caña y celulosa cristalina. Estos resultados sugieren
que la paja de arroz y el bagazo de caña son buenos inductores de las
actividades enzimáticas evaluadas, las cuales se requieren para que el
~---.
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microorganismo pueda utilizar estos sustratos complejos como fuentes de
carbono.
Las actividades p-glucosidasa por el contrario, presentaron diferencias
significativas dependiendo de la temperatura y el pH. Por ejemplo, a 40°C y
pH 6.0, las actividades enzimáticas de la p-glucosidasa detectadas en la
paja de arroz, fueron similares a las encontradas en celulosa cristalina,
mientras que a 50°C y pH 6.5, se encontraron diferencias significativas entre
estos dos sustratos siendo mayor en celulosa cristalina. Estos resultados
reflejan la necesidad de adelantar estudios de optimización de medios de
cultivo.
Tanto en paja de arroz como en celulosa cristalina se presentaron
actividades p-glucosidasa mayores que en bagazo de caña. Las diferencias
en estas actividades podrían marcar diferencias en la escogencia de medios
de cultivo económicos.; sin embargo, es importante resaltar que el medio de
mantenimiento del aislado HARBR-1 estaba suplementado con paja de
arroz, lo que podría conferirle ventajas como consecuencia de su adaptación
a este medio de cultivo. En tal sentido es necesario ensayar la actividad
celulolítica a partir de zoosporas liberadas por el hongo cultivado y adaptado
a cada sustrato de ensayo.
En paja de arroz, la actividad exoglucanasa obtenida en el presente estudio
(0.025 Ullml) fue mayor que la reportada por Lowe en 1997 para
Neocallimastix cultivado en paja de trigo (0.01 Ullml). Sin embargo, la
actividad endoglucanasa fue ligeramente menor y la p-glucosidasa bastante
menor, en comparación con el mismo trabajo. Un comportamiento similar se
observó en bagazo de caña, aun cuando en este caso los valores de
actividad enzimática fueron ligeramente menores excepto en el caso de la p