Aislamiento e identificacin de microorganismos biofertilizantes a partir de muestras de suelo de cultivos de Vitis vinfera de la localidad de Moquegua

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS BIOFERTILIZANTES A PARTIR DE MUESTRAS DE SUELO DE CULTIVOS DE VITIS VINIFERA DE LA LOCALIDAD DE MOQUEGUA

INTRODUCCIN

En el Per, el cultivo de Vitis vinifera es sumamente importante para la fruticultura y la produccin de pisco y vino, tal importancia se puede explicar pues en el ao 2006 las uvas representaron la segunda fruta en valor de exportacin conun total de$ 48.6 millones. La vid es cultivada en toda la costa peruana y la regin Moquegua es uno de los lugares en donde este cultivo tan especial es cultivado con mucho esmero. Sin embargo el crecimiento y rendimiento de la vid, al igual que la mayora de plantas de inters agrcola, muestran gran dependencia del nitrgeno y el agua durante su ciclo vegetativo; por lo tanto el nitrgeno es un factor determinante en el plan de fertilizacin de sntesis en el cultivo de algodn. No obstante, el uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados genera problemas econmicos, sociales y ambientales, y como consecuencia se ocasionan prdidas significativas en trminos de produccin. El uso excesivo de agroqumicos constituye un contaminante perjudicial del suelo y de los organismos que habitan en l.El suelo es considerado un compuesto heterogneo definido por sus propiedades fsicas, qumicas y biolgicas, que en el medio mantiene la interaccin y equilibrio dinmico entre sus componentes. Se considera que los organismos del suelo, que estn conformados bsicamente por bacterias, hongos y artrpodos, desempean una participacin importante en el ciclaje de nutrientes. Los microorganismos del suelo tienen una importancia sobresaliente en condiciones naturales, por su cantidad y principalmente por su amplio espectro de actividades, que en muchos de los casos inciden en los seres superiores, compartiendo un hbitat determinado. Cuando al sistema se incorporan plantas, las circunstancias para los microorganismos cambian radicalmente, debido a que las plantas son las principales proveedoras de sustratos nutritivos para el suelo, siendo aprovechados por los microorganismos cuando estos se encuentran cerca a la raz y se desarrollan en ella. Por esta razn, la reduccin creciente del uso de fertilizantes de sntesis qumica, solamente es posible mediante el empleo de tecnologas limpias. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Este tipo de tecnologas nos permiten identificar bacterias tiles en la fertilizacin de los suelos, en especial del cultivo de Vitis vinfera.

CAPITULO I

ASPECTOS PRELIMINARES

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMALa contaminacin por fertilizantes se produce cuando stos se utilizan en mayor cantidad de la que pueden absorber los cultivos, o cuando se eliminan por accin del agua o del viento de la superficie del suelo antes de que puedan ser absorbidos. Los excesos de nitrgeno y fosfatos pueden infiltrarse en las aguas subterrneas o ser arrastrados a cursos de agua. Esta sobrecarga de nutrientes provoca la eutrofizacin de lagos, embalses y estanques y da lugar a una explosin de algas que suprimen otras plantas y animales acuticos.En el suelo encontramos gran variedad de microorganismos dependiendo de los materiales que lo compongan, de la textura del suelo, de la humedad de la profundidad. El estudio de la abundancia y diversidad de los microorganismos del suelo ha presentado un obstculo; los medios de cultivo adecuados. Muchos microorganismos no se pueden aislar en cultivos convencionales.Los microorganismos del suelo, son los componentes ms importantes de este. Constituyen su parte viva y son los responsables de la dinmica de transformacin y desarrollo. En un solo gramo de tierra, encontramos millones de microorganismos beneficiosos para los cultivos.Estos microorganismos beneficiosos que se encuentran en el suelo, son bacterias, actinomicetos, hongos, algas y protozoarios. Un suelo frtil es aquel que contiene una reserva adecuada de elementos nutritivos disponibles para la planta, o una poblacin microbiana que libere nutrientes que permitan un buen desarrollo vegetal.Si se utilizan ms mtodos de produccin sostenible, se podrn atenuar los efectos de la agricultura sobre el medio ambiente. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Este tipo de tecnologas nos permiten identificar bacterias tiles en la fertilizacin de los suelos, en especial del cultivo de Vitis vinfera. 2. JUSTIFICACION DEL PROBLEMA

En la actualidad se vienen usando los agroqumicos de manera un tanto irracional, esta situacin ha generado diversos problemas ambientales, relacionados con el suelo y los microorganismos que habitan en l. El uso indiscriminado de fertilizantes qumicos se ha incrementado notoriamente en todo el mundo. Sin embargo, cada vez se es mas consiente sobre los impactos que ocasiona este tipo de agricultura basada en el sistema actual. Muchos organismos benficos viven naturalmente en los suelos de los cultivos fijando sustancias que luego la planta toma para formar su alimento. entones el aislamiento de microorganismos biofertilizantes constituye una nueva tecnologa sostenible que busca no solo fertilizar los suelos de ciertos cultivos , si no tambin se busca que este tipo de mtodos ayuden a elevar los rendimientos y buscar de una vez la solucin a este problema sumamente complejo. 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo General

Aislar e identificar microorganismos biofertilizantes a partir de muestras de suelo de cultivos de Vitis vinfera de la localidad de Moquegua.3.2. Objetivos Especficos

Seleccionar un medio de cultivo adecuado para el aislamiento de bacterias fertilizantes. Determinar la poblacin y porcentaje de bacterias fertilizantes presentes en el suelo del cultivo de Vitis vinfera de la ciudad de Moquegua. Caracterizar microscpicamente las bacterias fertilizantes.4. MARCO TEORICO

4.1. CRECIMIENTO MICROBIOLOGICO

4.1.1 REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS

Los requerimientos para el crecimiento microbiano pueden dividirse en dos categoras: fsicos y qumicos.

4.1.2 REQUERIMIENTOS FSICOS

a) TemperaturaExisten organismos, como ciertas bacterias, que pueden desarrollarse en temperaturas extremas donde sera imposible la supervivencia de cualquier organismo eucarionte.Los microorganismos se clasifican en tres grupos principales sobre la base de sus lmites de temperatura preferidos: sicrfilos (microbios con afinidad con el fro), mesfilos (microbios con afinidad por la temperatura moderada) y termfilos (microbios por afinidad por el calor). Cada especie crece en temperaturas mnima, ptima y mxima particulares. La temperatura mnima de crecimiento es la temperatura ms baja a la cual crecer la especie. La temperatura ptima de crecimiento es la temperatura a la cual la especie crece mejor. La temperatura mxima de crecimiento es la temperatura ms elevada a la cual es posible el crecimiento. Los organismos sicrofilas pueden crecer a 0C pero tiene una temperatura ptima de 15C. Existe otro grupo de microorganismos que pueden proliferar a 0C pero tiene temperaturas ptimas ms elevadas (en general de 20 a 30C) y no crecen cuando la temperatura supera los 40C, son los organismos sicrotrofos. Los mesfilos crecen con una temperatura ptima de crecimiento de 25 a 40C, son los ms comunes. Los termfilos son microorganismos capaces de crecer a temperaturas elevadas. Muchos de ellos tienen temperaturas ptimas de crecimiento de 50 a 60C. Varios mesfilos no pueden crecer a temperaturas inferiores a 45 C. Existen organismos que se denominan hipertermfilos y en ocasiones termfilos extremos, viven en fuentes termales asociadas con la actividad volcnica.

b) Presin osmticaLos microorganismos requieren agua para crecer y estn constituidos por un 80-90 % de agua. La presin osmtica elevada tiene el efecto de eliminar el agua necesaria de una clula. Cuando un microorganismo se encuentra en una solucin que tiene una concentracin mayor de solutos que de la clula ( el ambiente hipertnico , respecto de la clula ), el agua celular atraviesa la membrana plasmtica y se difunde hacia una zona de mayor concentracin de soluto. Esta prdida osmtica de agua causa plasmlisis o reduccin del citoplasma de la clula. La importancia de este fenmeno radica en que el crecimiento de la clula se inhibe cuando la membrana plasmtica se separa de la pared celular. La mayora de microorganismos deben ser cultivados en un medio constituido, casi en su totalidad por agua. Por ejemplo, la concentracin de agar ( un complejo de polisacridos aislado de algas marinas) utilizado para solidificar los medios de cultivo microbiano suele ser de alrededor del 1.5 % . Si se utilizan concentraciones mucho ms elevadas, el aumento de la presin osmtica puede inhibir el crecimiento de algunas bacterias.c) pHLa mayora de bacterias crecen mejor en un rango de pH estrecho cercano a la neutralidad (de entre 6.5 y 7.5) y muy pocas bacterias crecen en un pH cido (por debajo de 4). Los hongos filamentosos y las levaduras crecen en valores de pH ms amplios que las bacterias, si bien su pH ptimo suele ser menor que el de las bacterias, por lo general de cerca de 5 a 6. La alcalinidad tambin inhibe el crecimiento microbiano. Cuando las bacterias se cultivan en el laboratorio a menudo producen cidos que al final interfieren sobre su propio crecimiento. Para neutralizar los cidos y mantener el pH adecuado se agregan al medio de cultivo sustancias qumicas que actan como tampones o buffers. 4.1.3 REQUERIMIENTOS QUMICOS

a) CarbonoAdems del agua, uno de los requerimientos ms importantes para el crecimiento microbiano es el carbono. Este elemento constituye la estructura bsica de la materia viva, es necesario para todos los compuestos orgnicos que forman una clula viva. La mitad del peso seco de una clula bacteriana tpica es carbono. Los quimiohetertrofos obtienen la mayor parte de su carbono de la fuente de su energa, materiales orgnicos como protenas y lpidos. Los quimioauttrofos y los fotoauttrofos obtienen su carbono del dixido de carbono.b) Nitrgeno, azufre y fosforoAdems del carbono los microorganismos necesitan otros elementos para la sntesis del material celular. EL nitrgeno constituye cerca del 14 % del peso seco de una clula bacteriana y el azufre y el fosforo juntos constituyen alrededor de otro 4 %. Algunas bacterias importantes, incluidas muchas de las cianobacterias fotosintetizadoras, utilizan nitrgeno gaseoso (N2) directamente de la atmosfera. Este proceso se denomina fijacin del nitrgeno. Algunos organismos que pueden utilizar este mtodo viven libremente, la mayora en el suelo, pero otros viven en forma cooperativa en simbiosis, con las races de legumbres como el trbol, la soja, la alfalfa, los frijoles y los guisantes. El nitrgeno fijado en la simbiosis es utilizado tanto por la planta como por las bacterias. El azufre se utiliza para sintetizar aminocidos que contienen azufre y vitaminas como la tiamina y la biotina. El fsforo es esencial para la sntesis de cidos nucleicos y los fosfolpidos de las membranas celulares. El potasio, el magnesio y el calcio tambin son elementos necesarios para los microorganismos, a menudo como cofactores para las enzimas.c) OligoelementosLos microorganismos requieren cantidades muy pequeas de otros elementos minerales, como hierro, cobre, molibdeno y zinc, estos se denominan oligoelementos. Casi todos son esenciales para las funciones de ciertas enzimas, por lo general como cofactores.d) OxigenoLos microorganismos que usan oxigeno molecular (aerobios) producen ms energa a partir de los nutrientes que los que no utilizan oxigeno (anaerobios). Los organismos que requieren oxgeno para vivir se denominan aerobios estrictos.Los aerobios estrictos estn en desventaja porque el oxgeno es poco soluble en el agua de su ambiente. Por ende, muchas de las bacterias aerobias han desarrollado o conservado la capacidad de continuar creciendo en ausencia de oxgeno. Estos organismos se denominan anaerobios facultativos, quienes pueden utilizar oxigeno cuando est presente pero pueden continuar creciendo mediante la fermentacin o la respiracin anaerbica o la respiracin anaerbica cuando no hay oxigeno disponible. Sin embargo, su eficiencia en la produccin de energa disminuye en ausencia de oxgeno.Los anaerobios estrictos son microorganismos que no pueden utilizar el oxgeno molecular en las reacciones que producen energa.e) Factores de crecimiento orgnicoLos compuestos orgnicos esenciales que un organismo no puede sintetizar se conocen como factores de crecimiento orgnicos; pueden obtenerse directamente del ambiente. Muchas bacterias pueden sintetizar la totalidad de sus propias vitaminas y no dependen de fuentes externas. En cambio algunas carecen de las enzimas necesarias para la sntesis de ciertas vitaminas y para ellas esas vitaminas constituyen factores de crecimiento orgnicos. Otros factores de crecimiento organices requeridos por algunas bacterias son los aminocidos, las purinas y las pirimidinas.

4.1.4 MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es aquel material nutritivo preparado para el crecimiento de microorganismos en un laboratorio. Algunas bacterias pueden crecer en cualquier medio de cultivo, otras requieren medios especiales y otras no pueden crecer en ninguno de los medios inertes existentes hasta ahora. Los microbios que se introducen en un medio de cultivo para que comiencen a crecer se denominan inculos. Los microbios que crecen y se multiplican en un medio de cultivo se denominan cultivo. El medio que se va a sembrar debe ser estril , es decir , en un principio no debe contener microorganismos viables , de modo que el cultivo contenga solo los microbios ( y su descendencia ) que se agreguen al medio. Por ltimo el medio de cultivo sembrado debe incubarse a la temperatura correcta.Cuando se desea que las bacterias se desarrollen sobre un medio solido se agrega un agente solidificante como el agar, que consiste en un polisacrido complejo proveniente de una alga marina que se utiliza desde hace mucho tiempo como espesante de alimentos como jaleas y helados.El agar posee algunas propiedades muy importantes que lo convierten en valioso para la microbiologa y nunca se encontr un sustituto satisfactorio. Pocos organismos pueden degradar el agar, de modo que permanece en estado slido. Adems, el agar se licua a una temperatura de alrededor de 100C y a nivel del mar permanece lquido hasta que la temperatura disminuye cerca de 40 C. Para el uso en el laboratorio el agar se mantiene en baos de agua a 50 C. A esta temperatura no altera a la mayor parte de las bacterias cuando se vierte sobre ellas. Una vez que el agar se solidifica puede incubarse a temperaturas que se aproximan a los 100C antes de que vuelva a licuarse, esta propiedad es particularmente til cuando se desea cultivar bacterias termfilas. Los medios de agar pueden usarse en tubos de ensayo o placas Petri. Los tubos de ensayo se denominan tubos en pico de flauta o inclinados cuando el medio se solidifica manteniendo el tubo en un ngulo adecuado para lograr una gran superficie para el crecimiento. Cuando el agar se solidifica en un tubo de posicin vertical, se denomina profundo. Los cultivos en placas Petri se realizan en placas poco profundas con una tapa que cubre perfectamente la base para evitar la contaminacin.

4.1.4.1 MEDIOS DE CULTIVO QUIMICAMENTE DEFINIDOSUn medio qumico definido es uno del que se conoce la composicin qumica exacta. En el caso de un organismo quimiohetertrofo, el medio qumicamente definido debe contener factores de crecimiento organices que acten como fuente de carbono y energa. Los organismos que requieren varios factores de crecimiento se describen como microorganismos con requerimientos especiales de crecimiento.4.1.4.2 MEDIOS COMPLEJOSLos medios qumicamente definidos suelen reservarse para el trabajo experimental del laboratorio o para el crecimiento de bacterias auttrofas. Casi todas las bacterias hetertrofas y los hongos, como aquellos con los que se trabaja en un curso de introduccin al laboratorio, se cultivan de modo sistemtico en medios complejos, compuestos por nutrientes como extractos de levaduras, carne o plantas o digeridos de protenas de estas y otras fuentes. Si un medio complejo se halla en una forma lquida se denomina caldo nutritivo. Cuando se agrega agar se denomina agar nutritivo.4.1.4.3 MEDIOS Y METODOS DE CRECIMIENTO PARA ANAEROBICOSEl cultivo de bacterias anaerobias plantea un problema especial. Dado que los anaerobios podran morir por exposicin al oxgeno, deben emplearse medios especiales denominados medios reductores. Estos medios contienen ingredientes como el tioglicolato de sodio, que se combinan qumicamente con el oxgeno en el medio de cultivo. Para lograr el desarrollo y el mantenimiento de cultivos puros de anaerobios estrictos los microbilogos utilizan medios reductores fraccionados en tubos de ensayo comunes con tapas bien ajustadas. Estos medios se calientan justo antes de su empleo para eliminar el oxgeno absorbido. Para los cultivos en placa Petri se utilizan jarras especiales para anaerobios, esta es una tcnica relativamente nueva que se utiliza para proporcionar un ambiente de anaerobiosis. Los investigadores utilizan cmaras transparentes para anaerobios equipadas con llaves para su llenado con gases inertes.

4.1.4.4 MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALESLos medios selectivos estn diseados para suprimir el crecimiento de bacterias no deseadas y favorecer el crecimiento de las deseadas. Por ejemplo el agar dextrozado de Sabouraud, con un pH de 5.6 se utiliza para aislar hongos que se desarrollan mejor que la mayor parte de las bacterias a este pH. Los medios diferenciales permiten distinguir con mayor facilidad las colonias del microorganismo deseado de otras colonias que crecen en la misma placa. De manera similar, los cultivos puros de microorganismos tienen reacciones identificables con los medios diferenciales, sean en tubos o en placas.4.1.4.5 CULTIVO DE ENREQUECIMIENTOEn ocasiones es necesario utilizar un cultivo de enriquecimiento porque las bacterias presentes en pequea cantidad pueden no detectarse, en especial si hay otras bacterias presentes en cantidades muchos mayores. Esto sucede con frecuencia en muestras de suelo o materia fecal. El medio de enriquecimiento para un cultivo suele ser lquido y proporciona nutrientes y condiciones ambientales que favorecen el desarrollo de un microbio particular pero no de otros. Es tambin un medio selectivo pero est destinado a aumentar las cantidades muy pequeas del microorganismo deseado hasta niveles detectables.4.1.5 OBTENCION DE CULTIVOS PUROSEn teora una colonia visible se origina en una nica espora o clula vegetativa o en un grupo de los mismos microorganismos adheridos entre s en agregados o cadenas. El mtodo de aislamiento empleado con ms frecuencia para obtener cultivos puros es el mtodo de siembra por estra en placa. Se introduce un ansa de inoculacin estril en un cultivo mixto que contenga ms de un tipo de microbio y se lo distribuye en forma estriada sobre la superficie del medio nutritivo; las bacterias se desprenden del ansa y pasan al medio. Las ltimas clulas que se desprenden del ansa estn bastante separadas como para crecer en colonias aisladas. Estas colonias pueden tomarse con un ansa de inoculacin y sembrarse en un tubo de ensayo que contenga el medio nutritivo para formar un cultivo puro de un solo tipo de bacteria.El mtodo por estra en placa funciona bien cuando el microorganismo que se desea aislar est presente en grandes cantidades en relacin con la poblacin total, en cambio cuando el microorganismo que se desea aislar est presente solo en cantidades muy pequeas estas deben incrementarse mediante el empleo de un enriquecimiento selectivo antes de que se lo pueda aislar con el mtodo de siembra por estra en placa.4.1.6.1. CRECIMIENTO DE CULTIVOS BACTERIANOS La capacidad de representar de modo grafico las poblaciones enormes que se producen como resultado del crecimiento de los cultivos bacterianos es una parte esencial de la microbiologa. 4.1.6.2. DIVISON BACTERIANAEl trmino crecimiento bacteriano se refiere a un aumento de la cantidad de bacterias, no a un aumento del tamao de las clulas individuales. Las bacterias suelen reproducirse por fisin binaria. Solo algunas especies bacterianas se reproducen por brotacion; forman una pequea protuberancia inicial (un brote) que se agranda hasta que su tamao se aproxima al de la clula parental y luego se separa. Algunas bacterias filamentosas (ciertos actomicetos) se reproducen por formacin de cadenas de conidiosporas situadas externamente en los extremos de los filamentos. Algunas especies simplemente se fragmentan y estos fragmentos inician el crecimiento de clulas nuevas.4.1.6.3 TIEMPO DE GENERACIONEl tiempo necesario para que una clula se divida y su poblacin se duplique se denomina tiempo de generacin. Este tiempo vara considerablemente entre los microorganismos y con las condiciones ambientales, como la temperatura.

4.1.6.4 FASES DE CRECIMIENTOCuando se inoculan lagunas bacterias en un medio de crecimiento lquido y se cuenta la poblacin con intervalos, es posible graficar la curva de crecimiento bacteriano que muestra el crecimiento de las clulas en funcin del tiempo.a) FASE DE RETRASODurante un tiempo el nmero de clulas cambia muy poco debido a que las clulas no se reproducen de inmediato en un medio nuevo. Este periodo de escasa o nula divisin celular se denomina fase de retraso y puede durar 1 hora o varios das. Sin embargo durante este tiempo las clulas no estn inactivas. La poblacin microbiana atraviesa un periodo de intensa actividad metablica que comprende sobre todo la sntesis de enzimas y diversas molculas.b) FASE LOGARITMICALas clulas comienzan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento o de incremento logartmico denominado fase logartmica o fase de crecimiento exponencial. La reproduccin celular alcanza una actividad mxima durante este periodo y su tiempo de generacin llega a un mnimo constante. Como el tiempo de generacin es constante, la representacin logartmica del crecimiento durante esta fase exponencial es una lnea recta. La fase logartmica tambin es el momento en que las clulas presentan mayor actividad metablica y es la preferida en la produccin industrial donde, por ejemplo, un producto debe ser producido de manera diferente. Sin embargo, durante en la fase logartmica de crecimiento los microorganismos son mucho ms sensibles a las condiciones adversas. La radiacin y muchos frmacos antimicrobianos ejercen su efecto al interferir en algunos pasos importantes del proceso de crecimiento por lo tanto son ms perjudiciales para las clulas durante esta fase.c) FASE ESTACIONARIASi el crecimiento exponencial continuo sin control puede dar lugar a un nmero de clulas extraordinariamente elevado. Pero en algn momento la tasa de crecimiento disminuye, el nmero de muertes microbianas compensa el de clulas nuevas y la poblacin se estabiliza. La actividad metablica de las clulas que sobreviven tambin se torna ms lenta en esta fase.d) FASE DE DECLINACION Al final el nmero de muertes supera el nmero de nuevas clulas formadas y la poblacin entra en la fase de declinacin o fase de declinacin logartmica. Esta fase contina hasta que la poblacin disminuye a una pequea fraccin de clulas ms resistentes o hasta que todas sus integrantes mueren. Muchas clulas bacterianas a menudo involucionan durante esta fase, lo que significa que su morfologa cambia de manera espectacular. Lo que dificulta su identificacin. Algunas especies atraviesan toda la serie de fases en solo unos pocos das, otras mantienen algunas clulas sobrevivientes casi indefinidamente.

4.2 LA POBLACIN MICROBIANA DEL SUELOLas propiedades ms evidentes de un suelo son las relacionadas con sus componentes fsicos: las proporciones de arena, arcilla y materia orgnica, especialmente. Cuando se analiza el perfil de un suelo con criterios biolgicos, las consideraciones no suelen ir ms all del nivel alcanzado por la actividad de las lombrices o de la intensidad con que las larvas de los insectos atacan a las races de las plantas. La naturaleza microscpica de la mayor parte de los habitantes edficos es la razn fundamental que explica la facilidad con que puede pasar inadvertida la variada, compleja y continua actividad de los organismos vivos presentes en el suelo. El pequeo tamao de los organismos edficos queda sin embargo, compensado por su presencia en un nmero muy elevado (son densidad normal bacterias por gramo de suelo), por lo que, en definitiva, el resultado de la actividad biolgica es fundamental en el comportamiento del suelo. Sin la actividad vital interrelacionada de las bacterias, actinomicetos, hongos, y algas (la microflora), de los protozoos y nematodos (microfauna) y de los colmbolos, caros y restantes componentes de la mesofauna, el suelo se convertira en un depsito en el que se acumularan las plantas muertas sin posibilidad de reciclar los elementos nutritivos, como carbono, nitrgeno y fosforo, necesarios para el crecimiento y desarrollo de la vegetacin.Las plantas pueden crecer en medios totalmente estriles, pero solamente cuando se adopten las medidas oportunas para reponer los elementos nutritivos a medida que se vayan agotando como consecuencia de su absorcin por las races. Un suelo naturalmente frtil es aquel en el que los organismos edficos van liberando nutrientes inorgnicos, a partir de las reservas orgnicas o minerales, con velocidad suficiente para mantener un crecimiento rpido en las plantas. Todos los organismos del suelo presentan los atributos biolgicos fundamentales de nutricin, crecimiento, reproduccin y muerte. La actividad biolgica de los suelos, resultante de estas funciones, proporciona a las plantas superiores un medio ambiente adecuado para su propio desarrollo.2.2 NUTRICION DE LA MICROFLORA: ORGANISMOS AUTOTROFOS Y HETEROTROFOSLos organismos necesitan alimentos o nutrientes para alcanzar dos objeticos diferentes: obtencin de energa para sus funciones fisiolgicas (catabolismo) y formacin de sus tejidos (anabolismo). Algunos componentes de la microflora pueden utilizar sustratos (alimentos) completamente diferentes para ambos objetivos mientras otros componentes, como ocurre en la mayor parte de los animales, se sirven del mismo material para ambos propsitos.De acuerdo con las fuentes utilizadas para suministro de energa y de carbono, los microorganismos pueden dividirse en cuatro categoras:1. Organismos quimiohetertrofos (o quimioorgantrofos) que necesitan nutrientes orgnicos preelaborados, como la glucosa.1. Organismos fotohetertrofos (o fotoorgantrofos) que utilizan sustratos orgnicos pero pueden obtener alguna energa a partir de la luz.1. Organismos fotoauttrofos (conocidos, tambin como fotosintticos o fotolittrofos) que obtienen toda su energa de la luz. 1. Organismos quimioauttrofos (o quimiolittrofos) que obtienen energa de la oxidacin de compuestos inorgnicos.Las dos categoras de organismos auttrofos obtienen el carbono que necesitan para la sntesis celular a partir del CO2 atmosfrico. Los hongos, la mayor parte de las bacterias, los protozoos y todos los animales son hetertrofos mientras que las algas, las plantas superiores y algunos grupos de bacterias son auttrofos. El quimioautotrofismo est limitado a unos pocos tipos de bacterias pero el significado agronmico de su actividad, como la oxidacin del amoniaco o nitrato, es de considerable importancia. Algunos organismos auttrofos, como los que realizan la oxidacin del amoniaco, pueden considerarse como estrictos u obligados pues son prcticamente incapaces de realizar cualquier otra forma de nutricin, mientras que otros se consideran auttrofos facultativos porque pueden cubrir, en determinadas circunstancias, todas o parte de sus necesidades a partir de sustratos orgnicos.Los organismos fotoauttrofos se presentan en el suelo en dos grupos diferentes. En uno, estn las algas y las cianobacterias (antiguamente denominadas algas verde-azuladas) que realizan fotosntesis mediante pigmentos relacionados con la clorofila de las plantas superiores y liberan oxgeno, en condiciones de adecuado suministro, a partir de la fotolisis del agua. El otro grupo incluye determinadas bacterias fotosintticas que no liberan oxgeno y actan sobre sustratos como el sulfhdrico (SH2), por lo que su actividad est limitada a los suelos encharcados. Muchas bacterias fotoauttrofos pueden fijar N2 atmosfrico mientras que los restantes fotoauttrofos necesitan compuestos amoniacales o ntricos para satisfacer sus exigencias en este elemento.Las exigencias nutritivas de los organismos hetertrofos varan desde condiciones sencillas a complejas. Organismos no especializados, como las bacterias pseudomonas sp. O los hongos Mucor sp., obtener toda la energa y el carbono a partir de azucares simples, como la glucosa, y el nitrogeno a partir de sales minerales, prefiriendo las amoniacales a los nitratos. Estos organismos pueden producir todas las enzimas y los constituyentes celulares a partir de nutrientes simples y, en consecuencia, poseen extraordinaria capacidad de sntesis. Se puede ir ascendiendo en una escala de complejidad creciente en la que, para asegurar el crecimiento, van siendo necesarios, cada vez, nutrientes ms especficos, como amoniocidos y vitaminas. Ya que el fundamento bioqumicos de la actividad de la mayor parte de los microorganismos es muy similar, el hecho de que una determinada bacteria y hongo pueda crecer sin el aporte de un compuesto especficos, por ejemplo la vitamina biotina, no debe interpretarse como que la biotina no interviene en su metabolismo sino que el organismo es capaz de autosintetizarla.La prdida de la capacidad para sintetizar algunos compuestos esenciales est dispersa entre muchos componentes de la microflora edfica en forma tan aleatoria que no presentan ningn inters desde el punto de vista sistemtico. En general, las exigencias de los diferentes organismos son una respuesta al suministro habitual del alimento: cuanto ms especializado el origen, como ocurre, por ejemplo., con un parasito bien adaptado o con un simbionte, ms probable es la prdida de capacidad para sintetizar algunas enzimas que son producidas, sin embargo, por organismos afines que usan fuentes trficas menos especializadas. Asimismo, entre los organismos vivos presentes en el suelo hay una cantidad sorprendentemente elevada que requiere vitaminas presintetizadas para su desarrollo. 2.3. BACTERIASLas bacterias son los organismos ms numerosos en el suelo (se estiman poblaciones viables de unos 200 millones de clulas por gramo de tierra) y son, asimismo, los organismos que presentan mayor diversidad en su fisiologa. El mtodo propuesto por Bergey en su Manual of determinative bacteriology es aceptado, generalmente, como base para la taxonoma e identificacin de las bacterias y actinomicetos. Desgraciadamente, la identificacin y clasificacin de una bacteria aislada requiere informacin basada en su morfologa, nutricin, fisiologa y, en algunos casos, en sus reacciones inmunolgicas o, incluso, en sus cidos nucleicos. Como consecuencia, la identificacin de todas las bacterias que pueden aislarse incluso de una pequea muestra de tierra, es una labor comparable a los trabajos de Hrcules. A pesar del tiempo que se lleva trabajando en la microbiolgica del suelo, puede afirmarse con absoluta certeza que no han sido aun totalmente caracterizados, en ningn suelo, los gneros y especies de todas las bacterias presentes. Aunque esta afirmacin pueda parecer una flagrante omisin, est plenamente justificada si se consideran los innumerables problemas que esta caracterizacin plantea y el tiempo que los especialistas habran de emplear para realizarla. Entre los problemas se presenta, primero la interrogante de si todas las bacterias del suelo son susceptibles de aislamiento, ya que sin este la identificacin es imposible, y ms tarde habr de tener en cuenta que las poblaciones edficas son muy variables, tanto en el espacio como en el tiempo. No existe, en consecuencia, gran interesa en dedicar demasiado tiempo, esfuerzo y recursos a la descripcin detallada de una poblacin si un cambio de unos pocos centmetros en su localizacin o ligeras diferencias en las fechas en que se toman las muestras, puede modificar ampliamente los resultados.Se estn desarrollado, constantemente, mtodos rpidos mejorados para la identificacin de bacterias incluyndose en ellos, desde procedimiento que permiten realizar veinte ensayos de nutricin a partir de una sola inoculacin hasta mtodos muy sofisticados de identificacin bacteriana basados en espectroscopa de masas por pirolisis, aunque estos mtodos estn, por el momento, reservados a centro mdicos e industriales de importancia.Dado que la identificacin total es impracticable, la mayor parte de los conocimiento disponibles es relacin con las bacterias del suelo proceden de investigaciones realizadas sobre amplias poblaciones de organismos utilizados medios de caracterizacin sencillos, como pueden ser los diferentes tipos de nutricin, o son el resultados del examen de muchos suelos estudiando un nmero limitado de organismos, como los anaerobios o los degradadores de la celulosa.Como ejemplo de aproximacin a una clasificacin nutricional, disponemos de la propuesta por lockhead y chase que utiliza siete medios nutritivos de complejidad creciente e inocula, en cada uno, una seleccin fe bacterias (normalmente, unas fluctuaciones ms importantes, dependiendo su nmero de sus estados de actividad o quiescencia: los Bacillus sp. Y los Pseudomonas sp. Son ejemplos caractersticos de esta categora. La agrupacin propuesta por winogradsky no queda claramente definida ya que, en funcin de las condiciones del suelo, puede considerarse frecuentemente a un microorganismo miembro de ambas categoras.Hay otros grupos importante de bacterias del suelo que no aparecen en los cultivos no selectivos sobre agar y de los que hemos obtenido conocimientos mediante su cultivo en medios especializados. Muchas de las bacterias auttrofas, como las que oxidan el amonio y los nitritos, Nitrosomonas sp., as como las que oxidan el azufre, thiobacillus sp., solo pueden desarrollarse cuando se cultivan en medios especializados.Hay, tambin, bacterias en el suelo que se alimentan de otras especies bacterianas comunes y, posiblemente, de otras clulas microbianas. Para ello, excretan enzimas extracelulares que disuelven, o lisan, las membranas bacterianas y, a continuacin, absorben los contenidos celulares. Algunas pertenecen a un grupo de organismos muy pequeos y mviles, conocidos como Bdellovibrio, y otras a las mixobacterias o bacterias mucosas tpicas de los gneros Myxococcus y Poliangium. Las myxobacterias se han aislado, frecuentemente, a partir de suelos cultivados y terrenos de praderas; conteos realizados por Singh proporcionaron cifras que, en las condiciones que realizo la determinacin, van desde 2.000 hasta 80.000 por gramo de suelo.Estas bacterias depredadoras no son las nicas especies de los myxobacteriales presentes en el suelo, ya que muchas de las que descomponen la celulosa y la quitina, como los Cytophaga sp., pertenecen a este grupo, aunque no ha podido demostrase aun que puedan formar los caractersticos cuerpos reproductores de las especies depredadoras.Un grupo importante de bacterias fotoauttrofas fijadoras de nitrgeno, las cianobacterias, se presentan tambin en el suelo aunque desde antiguo se las consideraba como algas (algas verde-azuladas). Por esta razn, a pesar de que deberan estudiarse con las restantes bacterias, se describirn con las algas verdaderas en una seccin prxima. 2.4. HONGOSLos hongos constituyen el segundo e los dos grandes grupo de microorganismo del suelo y el que predominen ellos o el grupo bacteria-actinomiceto, depende de las condiciones locales, especialmente del pH y del contenido de humedad. Los micelios de los hongos edficos no pueden verse, en los suelos normales de cultivo, ni por el ojo humano directamente ni con ayuda de lupas, pero en los suelos de bosques, pueden observarse, bajo las capas de hojarasca, trenzas de micelios blancos, denominados Risomorfos, formadas por masas de filamentos individuales (hifas) enmaraados. Preparaciones microscpicas del suelo suspendidas en un gel o en resina, ponen de manifiesto las hifas y esporas de los hongos edficos. 2.5. SISTEMATICA DE LA Vitis vinfera La clasificacin de la Vitis vinifera es la siguiente:Cuadro nro. 1: clasificacin taxonmica de Vitis vinferaTaxonoma de Vitis vinfera

REINOPlantae

DIVISIONmagnoliophyta

CLASEMagnoliopsida

ORDENRhamnales

FAMILIAAmpelidacea

GENEROVitis

ESPECIEVitis vinifera

Fuente: propia1. HIPTESIS

Los microorganismos fertilizantes pueden ser aislados de suelos cultivados con Vitis vinfera, localizados en el sector de Moquegua.

1. FORMULACIN

Es posible aislar microorganismos biofertilizadores de suelos cultivados con Vitis vinfera?

1. ANTECEDENTES

1. MATERIALES Y MTODOS

8.1. Participantes

La investigacin aqu detallada cuenta con la participacin de los estudiantes Nancy Castillo, Carmen Centeno y Milagros Soto. La fase de laboratorio se desarrollar en las instalaciones ubicadas en la universidad privada Jos Carlos Maritegui, Moquegua, y al mismo tiempo en las instalaciones de la Universidad Nacional de Moquegua, ubicada en Ilo. 8.2. Fase de campo

8.2.1 rea de MuestreoLas muestras fueron recolectadas de una plantacin de Vitis vinfera de la regin Moquegua, Provincia de Mariscal Nieto, la muestra fue extrada a unos 20 cm de profundidad del suelo perteneciente a la rizsfora del suelo, una vez recolectadas las muestras fueron trasladadas al laboratorio donde deben ser homogeneizadas para luego ser usadas para el aislamiento de las bacterias.8.3 Fase de Laboratorio

a) Materiales , equipos y reactivos

Tubos de ensayo Vasos de precipitado de 250 y 500 ml Matraces de 250 y 500 mL Probetas 10, 100 y 500 mL Cajas Petri de vidrios estriles Asas de siembra Gradilla Mechero Esptula Succionador para pipetas Autoclave Balanza Analtica Microscopio, Portaobjetos y cubreobjetos Agar Nutritivo y Agar nutritivo con 5% sucrosa Agar Czapeck y Agar para hongos y levaduras Agua destilada estril Solucin salina al 9% Papel para esterilizar (Kraft) Bote de aluminio para esterilizar pipetas

b) Aislamiento de Microorganismos fertilizantes a partir de las Muestras de Suelo por Dilucin SeriadaLa muestra de suelo es usada para preparar diluciones seriadas. Para ello, se pesan 10 gramos de la muestra de suelo, los que son colocados en una botella con 90 mililitros de agua de llave estril (dilucin 1/10). La suspensin de suelo se agita por 45 minutos. Una vez trascurrido ste tiempo, se preparan las diluciones hasta llegar a 1/106. Cien micros litros de las diluciones, 1/102, 1/103, 1/104, 1/105, y 1/106 se colocan y extienden por cuadruplicado, sobre la superficie de las cajas Petri que contienen los dos tipos diferentes de medio de cultivo (para hongos y bacterias). Los platos se incubaron por 15 das a 25C.

c) Preparacin de medios de cultivoPesar los gramos necesarios de acuerdo a las instrucciones del fabricante para preparar medios de Agar Nutritivo para bacterias y Agar para hongos y levaduras Adicionar el agua destilada y calentar a ebullicin para disolver con agitacin. Medir y ajustar el pH si es necesario. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min. Distribuir 20 mL de medio a cada caja de Petri, dejar solidificar y someter a prueba de esterilizacin a 37 Cd) Realizacin de la SiembraDividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inculo tomado de los cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma una gota de inculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag.

e) Incubacin De los medios sembrados a 37 C hasta que haya habido crecimiento bacteriano.

f) Observacin de los resultadosEn primer lugar, observar a simple vista diversas caractersticas como el color y el borde de las colonias crecidas en el agar as como el olor y la turbidez del medio ya que en algunos casos suelen ser tpicos de un determinado tipo de microorganismo y pueden servir de ayuda a la hora de su identificacin.

Aislamiento e identificacin de microorganismos biofertilizantes a partir de muestras de suelo de cultivos de Vitis vinfera de la localidad de Moquegua

1. Tecnologas limpiasPgina 22

1. CRONOGRAMACUADRO NRO. 2: CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DEL PROYECTOETAPASsemana 1semana 2semana 3semana 4semana 5semana 6semana 7semana 8Semana 9semana 10

Planteamiento del proyectoxxx

Recoleccin de muestrasx

Aislamiento de microorganismosx

Preparacin de medios de cultivox

Realizacin de siembrax

Crecimiento bacterianoxx

Seguimiento del crecimientoxx

Observacin en microoscopiox

Extraccin de ADNx

Identificacin de los organismosx

Inoculacin de bacterias a cultivo de vid x

RESULTADOSx

INFORME FINAL DEL PROYECTOx

Fuente: propia