Alexandra Lucía González Esparza
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Diseño de un Medio de Cultivo Económico y Alternativo para la Producción de una Sustancia tipo Bacteriocina Inhibitoria de Listeria monocytogenes. Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Ciencia de los Alimentos Alexandra Lucía González Esparza VALDIVIA-CHILE 2009
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Diseño de un Medio de Cultivo Económico y Alternativo para la Producción de una Sustancia tipo Bacteriocina
Inhibitoria de Listeria monocytogenes.
Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Ciencia de los Alimentos
Alexandra Lucía González Esparza
VALDIVIA-CHILE 2009
PROFESOR PATROCINANTE: Sra. Marcia Costa Lobo Ingeniero Civil Bioquímico Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos PROFESORES INFORMANTES: Sra. Renate Schöbitz Twele Tecnólogo Médico, MSc. Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos María Adela Martínez Sanguinetti Bioquímico Master en Nutrición y Dietética Instituto de Farmacia
Esta Tesis fue financiada y forma parte del proyecto FONDEF D04l 1153 titulado “Desarrollo de biocontroladores de Listeria monocytogenes para su incorporación al procesamiento industrial del salmón”. De acuerdo a lo informado por el honorable consejo universitario sobre los derechos de propiedad intelectual, los resultados de esta tesis están encriptados para no interferir y alterar procesos de obtención de patentes y otros derechos.
Agradecimientos.
Agradezco: A mi mamá y a mi familia en general por su comprensión, cariño y apoyo que me entregaron en cada momento de mi vida. A mis amigas por su amistad que dura hasta el día de hoy y porque siempre han estado ahí cuando las he necesitado. A mi profesora patrocinante Sra. Marcia Costa por incentivarme a seguir adelante. Y a las personas que me acogieron de buena manera en los Institutos Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Farmacia y Producción y Sanidad Vegetal.
Muchas Gracias.
i
INDICE DE MATERIAS
Capítulo Página
1 INTRODUCCIÓN 1
2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3
2.1 Bacterias ácido lácticas 3
2.2 Carnobacterium piscicola 3
2.3 Bacteriocina 4
2.4 Listeria monocytogenes 5
2.5 Cultivos de microorganismos 6
2.6 Factores ambientales 7
2.7 Medio de cultivo 8
2.8 Nutrientes 8
2.8.1 Macronutrientes 9
2.8.2 Micronutrientes 10
2.9 Fuentes proteicas 10
3 MATERIAL Y MÉTODO 12
3.1 Ubicación parte experimental 12
3.2 Cepas bacterianas 12
3.3 Medio de cultivo 12
3.4 Proteínas 12
3.4.1 Preparación de muestras 12
3.4.2 Determinación del contenido proteico 13
3.4.3 Análisis estadístico 14
ii
INDICE DE MATERIAS
Capítulo Página
3.5 Formulación del medio de cultivo alternativo 14
3.6 Producción de la sustancia tipo bacteriocina (STB) 15
3.7 Determinación de la actividad de la STB 17
3.7.1 Obtención del sobrenadante con la STB 17
3.7.2 Ensayo de actividad de la STB 17
3.7.3 Interpretación de las placas resultantes 17
3.7.4 Análisis estadístico 17
3.8 Aplicación del medio de cultivo alternativo a nivel de un mini-fermentador
17
4 PRESENTACIÓN DE RESULTADOS 22
4.1 Contenido proteína soluble 22
4.1.1 Fuentes proteicas del caldo D-MRS 22
4.1.2 Muestras de extractos de harinas de origen vegetal y animal 22
4.1.3 Determinación de las formulaciones del medio de cultivo alternativo
24
4.2 Resultados a nivel de matraces de la actividad de la STB 24
4.3 Resultados a nivel de mini-fermentador 26
4.3.1 Crecimiento de Bacteria Ácido Láctica 26
4.3.2 Actividad de la STB 28
4.3.3 Contenido de proteína soluble 31
5 DISCUSIÓN 32
6 CONCLUSIÓN 36
iii
7 RESUMEN-SUMMARY 37
8 BIBLIOGRAFÍA 39
9 ANEXOS 44
iv
INDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1 Composición del medio de cultivo, D-MRS, utilizado para C. piscicola
13
2 Fórmulas para el medio de cultivo alternativo 15
3 Composición de las fórmulas del medio cultivo alternativo 24
v
INDICE DE FIGURAS
Figura Página
1 Imagen de Listeria 5
2 Curva de crecimiento batch para una población bacteriana 6
3 Imagen de la harina de lupino y de pescado 11
4 Diagrama de la preparación muestras para determinar contenido de proteína soluble
14
5 Diagrama de propagación de la cepa láctica para trabajar a nivel de matraces
16
6 Diagrama de la Técnica de la “Gota sobre Césped” 18
7 Diagrama de propagación de la cepa láctica para trabajar a nivel de matraces
19
8 Modificación de las condiciones del volumen empacado de células
20
9 Fotografía del sistema de cultivo de batch utilizando el mini- fermentador
21
10 Contenido de proteína soluble de fuentes proteicas del caldo D-MRS
22
11 Contenido de proteína soluble de las muestras de extractos de harinas de origen vegetal para cada tiempo de extracción
23
12 Contenido de proteína soluble de las muestras de extractos de harinas de origen animal para cada tiempo de extracción
23
13 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para cada formulación del medio de cultivo alternativo y caldo D-MRS
25
14 Halos de inhibición en césped de Listeria monocytogenes generados en el transcurso de la producción de la STB a nivel de matraces a partir de la fórmula 3 correspondientes a los tiempos 0, 12 y 48 horas
25
vi
INDICE DE FIGURAS
Figura Página
15 Consumo de NaOH y contenido residual de glucosa en las muestras tomadas durante el crecimiento de C. piscicola
26
16 Consumo de NaOH y recuento en placa durante el crecimiento de C. piscicola
27
17 Volumen empacado de células para cada muestra extraída a diferentes tiempos durante el crecimiento de C. piscicola
28
18 Actividad de la STB, contenido residual de glucosa de las muestras extraídas y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola
29
19 Recuento en placa y actividad de STB de las muestras extraídas durante el crecimiento de C. piscicola
29
20 Halos de inhibición en césped de Listeria monocytogenes formados durante la producción de STB en el mini-fermentador a partir de la fórmula 3, correspondientes a los tiempos 0, 12 y 26 horas
30
21 Contenido de proteína soluble, contenido de glucosa de las muestras extraídas y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola
31
vii
INDICE DE ANEXOS
Anexo Página
1 Determinación de proteínas de acuerdo al método de LOWRY et al. (1951)
45
2 Curva de calibración para determinación proteica de acuerdo a método propuesto por LOWRY et al. (1951)
46
3 Diagrama del método para determinar contenido de glucosa 47
4 Análisis de varianza y test de rangos múltiples para muestras de extractos de origen vegetal
48
5 Análisis de varianza y test de rangos múltiples para muestras de extractos de origen animal
49
6 Cálculo de la concentración de las soluciones de harinas 50
7 Preparación de formulaciones 51
8 Prueba de Friedman 52
9 Tabla de comparación de costos entre los componentes reemplazados del caldo D-MRS y los alternativos
53
1
1. INTRODUCCIÓN
Debido al aumento de las exportaciones hacia mercados más exigentes, un área de interés biotecnológico para la industria de los alimentos, dice relación con las investigaciones basadas en la capacidad de ciertas Bacterias Ácido Lácticas (BAL) para producir bacteriocinas, sustancias antibacterianas, que inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos indeseables en alimentos.
Según diversos estudios indican que la producción de bacteriocina a partir de una determinada BAL depende de diferentes factores entre los cuales se encuentra la temperatura, pH, composición nutricional del medio de cultivo, entre otros.
La composición nutricional de un medio de cultivo es un factor importante de analizar bajo dos puntos vista; que sea capaz de cumplir con los requerimientos nutricionales de una BAL y los costos que conlleva la producción de la bacteriocina.
Carnobacterium piscicola CEPA BAL B es una cepa láctica aislada de carne envasada al vacío, que produce una sustancia tipo bacteriocina (STB) que inhibe el crecimiento de Listeria monocytogenes, patógeno que genera inconvenientes en la industria del salmón.
Las investigaciones llevadas a cabo a la fecha a nivel de laboratorio, indican que para la producción de la STB desde C. piscicola CEPA BAL B, el medio de cultivo más adecuado es D-MRS (MRS, DE MAN-ROGOSA-SHARPE modificado), donde se observan los mayores niveles de crecimiento de la cepa láctica y, a la vez, de producción de la STB. Para la producción a mayor escala de la STB, el medio D-MRS posee la desventaja de ser muy costoso, debido principalmente a la presencia en su composición de fuentes proteicas de elevado costo.
Hipótesis Si la cepa de C. piscicola produce una STB, en el medio de cultivo D-MRS, entonces, también producirá una STB en el medio cultivo alternativo generado por el reemplazo, en la composición del D-MRS, de las fuentes proteicas, por otras de menos costo.
Por la razón indicada anteriormente, el objetivo general y los objetivos específicos de esta Tesis son los que se mencionan a continuación:
Objetivo General Diseñar y aplicar un medio de cultivo económico y alternativo para la producción de una STB inhibitoria frente a L. monocytogenes, a partir de C. piscicola CEPA BAL B.
2
Objetivos Específicos
• Seleccionar fuentes proteicas alternativas de origen animal (harina de pescado, de carne y hueso y de sangre) y vegetal (harina de lupino y de algarrobo), de acuerdo, al contenido de proteínas solubles.
• Formular y reemplazar las fuentes proteicas de origen animal y vegetal escogidas, por el extracto de carne y proteosa peptona respectivamente componentes del medio de cultivo, caldo D-MRS, utilizado comúnmente para el crecimiento de la cepa láctica.
• Comprobar la producción de la STB, mediante un cultivo batch a nivel de matraces, usando las diversas fórmulas del medio de cultivo alternativo.
• Verificar la eficiencia de las diferentes probables mezclas del medio de cultivo alternativo, a través de la Técnica de la Gota sobre Césped, que determina la actividad de la STB.
• Experimentar a nivel de un mini-fermentador, el medio de cultivo alternativo preseleccionado y comparar costos de materias primas con el D-MRS.
3
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Bacterias Ácido Lácticas Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) se caracterizan por ser: bacilos o cocos no formadores de esporas, Gram positivos, la mayoría son anaerobios aerotolerantes, resultando las pruebas de catalasa y oxidasa negativas, además como consecuencia de la fermentación de carbohidratos producen como mayor producto final ácido láctico y también energía celular (AXELSSON, 1998; ADAMS y MOSS, 2000). La clasificación de las BAL entre los diferentes géneros se basa en una serie de aspectos dentro de los cuales se encuentran: morfología, modo de fermentación de la glucosa, crecimiento a diversas temperaturas, capacidad para crecer a altas concentraciones de sal y tolerancia a pH ácidos o alcalinos (AXELSSON, 1998).
De acuerdo, a las vías de fermentación de los carbohidratos, se distinguen dos tipos de BAL homofermentativas y heterofermentativas, lo que en definitiva conduce a una clasificación primaria de las BAL. Las homofermentativas producen como único producto ácido láctico a partir de la glucosa. Mientras, que las heterofermentativas producen aproximadamente cantidades equimolares de ácido láctico, etanol, acetato, y dióxido de carbono, a partir de la glucosa (AXELSSON, 1998; ADAMS y MOSS, 2000, JAY, 2000).
En relación, al metabolismo del nitrógeno, se indica que las BAL poseen una muy limitada habilidad para sintetizar aminoácidos usando nitrógeno inorgánico (AXELSSON, 1998). Por lo tanto, las fuentes de nitrógeno en su medio de crecimiento deberán ser aminoácidos preformados (AXELSSON, 1998; JAY, 2000). Además, las BAL requieren para su crecimiento vitamina B y bases purínicas y pirimídicas (JAY, 2000)
El crecimiento de las BAL en un medio químicamente definido es generalmente menor, por lo cual, se encuentran adaptadas a ambientes enriquecidos con el propósito de aprovechar más eficientemente las fuentes de nitrógeno (AXELSSON, 1998).
El grupo de las BAL está conformado por 12 géneros de bacterias gram positivas (BGP): Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella (JAY, 2000).
2.2 Carnobacterium piscicola El género Carnobacterium agrupa a BAL, tipo bacilos y que son heterofermentativas, crecen a pH relativamente altos, alrededor de 9,0 y se caracterizan por la presencia del ácido meso-diaminopimélico en la composición de la pared celular (MORA et al., 2003).
4
De acuerdo a lo citado por MORA et al., (2003), el género Carnobacterium está comprendido por siete especies: Carnobacterium alterfunditum, Carnobacterium funditum (Franzmann et al., 1991), Carnobacterium divergens (Holzapfel y Gerber, 1983; Collins et al.,1987), Carnobacterium gallinarum, Carnobacterium mobile (Collins et al.,1987), Carnobacterium inhibens (Jöborn et al., 1999) y Carnobacterium piscicola (Hiu et al., 1984; Shaw y Harding, 1985), pero además los investigadores SCARPELLINI, FRANZETTI, COLOMBO, GALLI incluido MORA, según estudios realizados propusieron reclasificar cepas de Lactobacillus maltaromicus y Carnobacterium piscicola e incorporar una nueva especie denominada Carnobacterium maltaromaticum.
SCHÖBITZ et. al., 1999 señala que una cepa de C. piscicola produce una sustancia tipo bacteriocina (STB) que inhibe completamente durante 14 días a L. monocytogenes en carne envasada al vacío almacenada a 4ºC. Además SCHÖBITZ et. al., (2003) observó que la STB producida por la misma cepa de C. piscicola presenta un efecto inhibitorio inicial contra varias cepas de L. monocytogenes, seguido por un recrecimiento de células resistentes.
De acuerdo a lo citado por CHEN y HOOVER (2003), indica que la inhibición del crecimiento de L. monocytogenes por parte de C. piscicola, probablemente se debe al consumo competitivo de los nutrientes esenciales.
Otro estudio, señala que el inóculo inicial de la cepa CS526 de C. piscicola, identificada como productora de bacteriocina, influye en la inhibición de la L. monocytogenes en salmón ahumado en frío almacenado a 4 y 12°C (YAMAZAKI et al., 2003).
En medio líquido, el nivel de inoculación afecta a la producción de bacteriocina por C. piscicola LV17, manifestándose la producción de ésta durante la fase exponencial con un inoculo de 106 (ufc/mL) (SAUCIER et al., 1997).
2.3 Bacteriocina Las bacteriocinas son péptidos antibacterianos sintetizados a nivel de los ribosomas y producidas por bacterias (JACK et al., 1995; OSCARIZ Y PISABARRO, 2001; CHEN Y HOOVER, 2003).
Estos péptidos antibacterianos conforman un grupo heterogéneo debido a que difieren ampliamente en su peso molecular, propiedades bioquímicas, rango de sensibilidad y modo de acción (SOOMRO et al., 2002).
Las bacteriocinas producidas por BAL son activas contra Bacterias Gram Positivas (BGP) y también pueden inhibir a algunas Bacterias Gram Negativas (JACK et. al., 1995).
De acuerdo a lo citado por OSCARIZ y PISABARRO (2001) y CHEN y HOOVER (2003) se distinguen cuatro grupos de bacteriocinas entre las cuales se encuentran:
Clase I: son péptidos pequeños, lantibióticos, con una masa molecular menor a 5 kDa, que presentan aminoácidos inusuales tales como: lantionina, entre otros.
Clase II: corresponde a péptidos pequeños con una masa molecular menor a 10 kDa, estables al calor, no contienen lantionina. Dentro de este grupo existe la subclase IIa que son péptidos anti-listeriales que tienen una secuencia de aminoácidos consecutiva N-terminal que son Tir-Gli-Asn-Gli-Val-Xaa-Cis.
5
Clase III: son proteínas con una masa molecular mayor a 30 kDa, lábiles al calor.
Clase IV: son bacteriocinas complejas que requieren de una parte glicoproteica o lipoproteica para su actividad.
En relación al modo de acción de las bacteriocinas de la clase IIa, se describe que debido a la permeabilización de la membrana de los microorganismos sensibles, se permite la interacción electrostática entre el péptido antibacterial y la membrana citoplasmática, que provoca la formación de poros en ella originada por el desbalance iónico de la membrana causada por el flujo de potasio, pérdida del fosfato inorgánico y disipación de la fuerza protón motriz de la células susceptibles, lo cual conduce finalmente a la muerte celular de estas últimas. (ENNAHAR et al., 2000; OSCARIZ y PISABARRO, 2001; SUZUKI et. al., 2005).
Dentro de los microorganismos que producen y liberan bacteriocinas de la clase IIa, existen varias cepas lácticas que pertenecen al género Carnobacterium y que han sido estudiadas por diferentes investigadores como son: Carnobacterium piscicola A9b (HIMELBLOOM et al., 2001), C. piscicola CS526 (SUZUKI et al., 2005), C. divergens V41 y C. piscicola V1 (BRILLET et al., 2004), C. piscicola CEPA BAL B (SCHÖBITZ et al., 1999) entre otras, consideras activas contra la especie Listeria monocytogenes.
2.4 Listeria monocytogenes El género Listeria esta constituido por seis especies: L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii, L. grayi y L. monocytogenes (ver FIGURA 1), siendo está última la principal especie patógena humana del género (ADAMS Y MOSS, 2000; JAY, 2000; BLACKBURN y MCCLURE, 2002). Estas especies de Listeria pueden crecer tanto en amplios rangos de temperatura entre 1ºC a 45ºC como de pH entre 4,1 a 9,6 (JAY, 2000).
FIGURA 1 Imagen de Listeria monocytogenes. FUENTE: <http://www.ehagroup.com/epidemiology/illnesses/listeria-monocytogenes.asp>1
1 EHA Consulting Group, Inc. 2004. Listeria monocytogenes.
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Con respecto a Listeria monocytogenes se señala que corresponde a un bacilo gram positivo no formador de esporas, anaerobio facultativo, catalasa positiva y oxidasa negativa (FABER Y PETERKIN, 1991; ADAMS Y MOSS, 2000; JAY, 2000), que provoca una enfermedad transmitida por los alimentos denominada listeriosis y que afecta principalmente a mujeres embrazadas, recién nacidos y personas de avanzada edad (JAY, 2000).
Listeria monocytogenes se puede encontrar en la materia prima tal como: carne, leche, vegetales, entre otras utilizadas en las industrias alimentarias, debido a que está distribuida en una amplia variedad de ambientes, por esta razón el control de este patógeno alcanza relevancia durante los procesos de elaboración de los productos alimenticios (BLACKBURN y MCCLURE, 2002).
2.5 Cultivo de Microorganismos En un cultivo de microorganismos, la interacción con el medio se ve influenciada por el tiempo de alimentación y la remoción del medio del fermentador, en relación a lo señalado, se pueden diferenciar diversos modos de operación, entre los cuales se encuentra el cultivo continuo y el cultivo batch o discontinuo (SAHM, 1993).
El cultivo batch o discontinuo ocurre cuando al ser inoculado un cultivo de microorganismos en un medio, los nutrientes se convierten en biomasa y en el instante que el sustrato se agota, el batch finaliza. Por lo tanto, no existe renovación de los nutrientes (SHULER y KARGI, 2002).
La curva de crecimiento batch se caracteriza por dividirse en las siguientes etapas (ver FIGURA 2): (1) fase lag o de latencia, (2) fase de crecimiento exponencial o logarítmica, (3) fase de desaceleración, (4) fase estacionaria y (5) fase de muerte (SAHM, 1993; SHULER y KARGI, 2002).
Cre
cim
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4 2
3 1 5
Tiempo (h)
FIGURA 2 Curva de crecimiento batch para una población bacteriana. FUENTE: SHULER y KARGI, 2002.
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La fase lag (1), consiste en un período de adaptación del funcionamiento de las células de los microorganismos a las condiciones del medio de crecimiento, iniciándose en el instante que se efectúa la inoculación. Dependiendo de la concentración de algunos nutrientes y de los factores de crecimiento, la fase lag puede ser corta o larga. Una manera de minimizar la fase lag, es adaptar las células de los microorganismos a las condiciones del medio de cultivo con que se trabajará previo a la inoculación, además el tamaño del inoculo debiera ser grande (5 a 10% por volumen) (SHULER y KARGI, 2002).
La fase exponencial o logarítmica (2), es consecuencia de una división continua de las células y la velocidad de crecimiento se ve afectada por las condiciones del medio como son: temperatura, composición del medio de cultivo, entre otras (BROCK, 1998). Corresponde a un período de crecimiento balanceado, en el cual, todos los componentes de una célula crecen con una misma velocidad específica.
En la fase de desaceleración (3), el agotamiento de uno o mas nutrientes esenciales o la acumulación de los productos tóxicos provoca que el crecimiento comience a detenerse (SAHM, 1993; SHULER y KARGI, 2002).
Por lo tanto, la fase estacionaria (4) se inicia cuando la división celular finaliza, aunque todavía siguen sucediendo muchas funciones celulares, como el metabolismo energético y algunos procesos biosintéticos (BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002). Es durante esta fase donde se producen los metabolitos secundarios (SHULER y KARGI, 2002).
Finalmente, la fase de muerte (5) es la que sigue a la fase estacionaria y donde ya no se mantienen las actividades metabólicas (SAHM, 1993), esta comúnmente va acompañada de lisis celular (SAHM, 1993; BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002).
2.6 Factores ambientales Las respuestas a las condiciones ambientales son el crecimiento de los microorganismos y la formación de productos (SAHM, 1993). Dependiendo del microorganismo, ambas respuestas pueden verse afectadas o favorecidas por determinados factores ambientales entre los cuales se encuentra: la temperatura, pH, actividad de agua y disponibilidad de oxígeno (SAHM, 1993; BROCK, 1998).
La temperatura es uno de los factores más importantes que afecta el crecimiento (BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002). Existe una temperatura óptima de crecimiento para cada microorganismo donde las reacciones enzimáticas y el crecimiento son más rápidos (BROCK, 1998).
En relación a la temperatura óptima los microorganismos se clasifican: (a) psicrófilos: microorganismos que se reproducen a temperaturas menores a 20ºC; (b) Mesófilos: a temperaturas entre 20 y 50ºC; (c) Termófilos: a temperaturas mayores a 50ºC. La temperatura óptima de crecimiento no necesariamente es igual a la de formación de productos (SHULER y KARGI, 2002).
El pH se considera un factor que altera la actividad enzimática y por ende el crecimiento de los microorganismos (SHULER y KARGI, 2002). En el caso de las bacterias existe un pH óptimo donde se alcanza el crecimiento máximo, este fluctúa entre 6,5 y 7,5 (SAHM, 1993; STEPHANOPOULOS, 1993).
8
Otro factor del cual depende el crecimiento microbiano corresponde a la actividad de agua (SAHM, 1993; BROCK, 1998), cuando está es muy baja en el ambiente, muchos de los microorganismos son incapaces de crecer (BROCK, 1998).
La disponibilidad de oxígeno también afecta el crecimiento de los microorganismos, principalmente a los aerobios que crecen en presencia de oxígeno, mientras que los anaerobios estrictos no se ven afectados, ya que no lo requieren (SAHM, 1993; BROCK, 1998).
2.7 Medio de Cultivo El crecimiento de los microorganismos corresponde a un proceso autocatalítico, ya que depende de la presencia de una sola célula viable para que este suceda y en consecuencia, la razón de crecimiento aumente con la cantidad de biomasa disponible (ADAMS y MOSS, 2000).
Para cumplir con el propósito descrito anteriormente debe ser necesario utilizar un medio de cultivo adecuado con respecto a los requerimientos nutricionales y ambientales que aseguren el crecimiento celular y biosíntesis de metabolitos a partir de un microorganismo en particular (SAHM, 1993).
En los medios de crecimiento se diferencian dos tipos, estos serán: medio definido y complejo.
El medio definido contiene cantidades específicas de compuestos químicos puros con composiciones químicas conocidas y exactas (BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002). Este tipo de medio es utilizado a nivel de laboratorio para estudiar como afectan los nutrientes al crecimiento celular y a la producción de metabolitos de interés (STEPHANOPOULOS, 1993).
En cambio, el medio complejo, contiene compuestos naturales cuya composición química no es exactamente conocida (BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002), además proporciona factores de crecimiento tales como vitaminas, hormonas y elementos trazas, con lo cual genera normalmente niveles altos de rendimiento celular, en comparación al medio definido (SHULER y KARGI, 2002). Los medios complejos son utilizados más frecuentemente en fermentaciones industriales, debido a que usualmente usan materias primas de bajo costo (STEPHANOPOULOS, 1993).
La producción de estos metabolitos activos extracelulares se llevan a cabo en fermentadores, cultivando las bacterias en medios adecuados. Es importante producir altos niveles de bacteriocina a bajo costo utilizando medio de cultivos alternativos (GUERRA y PASTRANA, 2002).
2.8 Nutrientes La tasa de crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, se ve afectada por la concentración de nutrientes importantes en el medio de cultivo (INGRAHAM, 1998; ADAMS y MOSS, 2000).
Los requerimientos de energía y de los nutrientes indispensables para el crecimiento y la formación de productos de los microorganismos, en general, son proporcionados por compuestos orgánicos (BLANCH, 1996).
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Existen factores de los cuales depende la composición intracelular de los microorganismos, estos serán el tipo y edad de las células y en especial la composición nutricional del medio, en el cual se desarrolla (SHULER y KARGI, 2002).
La calidad y cantidad de los nutrientes requeridos por las células varían de un microorganismo a otro (SAHM, 1993) y corresponden a factores relevantes a determinar para optimizar el crecimiento y la formación de productos (SHULER y KARGI, 2002)
Se distinguen dos categorías de nutrientes necesarios por los microorganismos, estos son los macronutrientes y los micronutrientes (SHULER y KARGI, 2002).
2.8.1 Macronutrientes. Son necesarios en grandes concentraciones (BROCK, 1998) por sobre 104 M (SHULER Y KARGI; 2002). El carbono es el principal macronutriente, ya que representa el 50% del peso seco de las células de los microorganismos (SAHM, 1993; BROCK, 1998), transformándose así los compuestos que lo contienen en las mayores fuentes de carbono celular y energía para los microorganismos (SAHM, 1993; STEPHANOPOULOS, 1993; SHULER y KARGI, 2002).
Las fuentes de carbono más habitualmente utilizadas a nivel industrial son las melazas, suero, entre otras (STEPHANOPOULOS, 1993; SHULER y KARGI, 2002). En cambio, en el laboratorio la glucosa, sacarosa y fructosa son las más utilizadas (SHULER y KARGI, 2002).
El nitrógeno constituye entre el 10% al 14% del peso seco de las células de los microorganismos (INGRAHAM, 1998; SHULER Y KARGI, 2002). Las fuentes de nitrógeno utilizadas son: amonio (SAHM, 1993; STEPHANOPOULOS, 1993; BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002), sales de amonio (SAHM, 1993; SHULER y KARGI, 2002), nitrato (BROCK, 1998; SAHM, 1993), proteínas (STEPHANOPOULOS, 1993; SHULER y KARGI, 2002), péptidos y aminoácidos (SAHM, 1993; STEPHANOPOULOS, 1993; SHULER y KARGI, 2002), purinas y pirimidinas (SAHM, 1993; STEPHANOPOULOS, 1993).
Con respecto, al oxígeno, se indica que está presente en todos los componentes orgánicos y agua celular; y corresponde a un 20% del peso seco de las células de los microorganismos (SHULER y KARGI, 2002). Es importante señalar que, el oxígeno no constituye un nutriente propiamente tal, sino su función es la de ser receptor final de electrones en los procesos de oxidación de los nutrientes (materia orgánica) para generar la energía necesaria a las distintas funciones celulares (SAHM, 1993; INGRAHAM, 1998; SHULER Y KARGI, 2002).
El hidrogeno constituye cerca del 8% del peso seco de las células de los microorganismos y es obtenido principalmente de componentes carbonados tal como los carbohidratos (SHULER y KARGI, 2002).
Otros macronutrientes que son esenciales para el crecimiento de los microorganismos en un medio corresponden al azufre, fósforo, magnesio y potasio (SAHM, 1993; BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002).
El fósforo es utilizado para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos (BROCK, 1998).
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El azufre está presente en proteínas como componentes de aminoácidos tal como la cisteína y metionina y en algunas coenzimas (BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002).
2.8.2 Micronutrientes. La falta de los elementos trazas esenciales en la nutrición microbiana incrementa la fase de crecimiento lag y puede provocar el descenso de la velocidad específica de crecimiento y el rendimiento.
Por lo tanto, los micronutrientes son indispensables en la nutrición de los microorganismos y requeridos en concentraciones menores que 104 M (SHULER y KARGI, 2002).
Entre los micronutrientes se encuentran: Fe, Mn, Zn, Cu, Co, entre otros (SAHM, 1993; STEPHANOPOULOS, 1993; BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002). La mayoría de los micronutrientes se consideran cofactores de las enzimas (SAHM, 1993; BROCK, 1998; SHULER y KARGI, 2002) y muchos de ellos participan en la regulación del metabolismo secundario (SAHM, 1993; SHULER y KARGI, 2002).
Los elementos trazas más comúnmente necesarios corresponden al Fe, Zn y Mn tanto el hierro como el zinc poseen la función de regular los procesos de fermentación, mientras que el manganeso participa en la excreción de los metabolitos primarios (SHULER y KARGI, 2002)
Otros micronutrientes serán las vitaminas que usualmente funcionan como coenzimas. Algunas vitaminas normalmente empleadas son las tiamina, riboflavina, biotina, entre otras (SAHM, 1993; STEPHANOPOULOS, 1993; SHULER y KARGI, 2002).
2.9 Fuentes Proteicas La disponibilidad de los nutrientes requeridos por los microorganismos influye sobre el inicio y la mantención de las actividades metabólicas. Siendo las fuentes de nitrógeno proporcionado por las proteínas, la segunda en términos de cantidad e importancia económica dentro de un medio de cultivo, en el siguiente balance de materia se observa la posición de las fuentes proteicas y lo que se debe considerar cuando se diseña un medio:
Fuente C + Fuente N + O2 + Minerales + Nutrientes Masa + Producto + CO2 + H2O Específicos Celular
Las fuentes de nitrógeno en un medio de cultivo pueden ser licor de macerado de almidón de maíz, harina de soya, extracto de levadura, proteína hidrolizada, entre otras (STEPHANOPOULOS, 1993).
Existen fuentes proteicas de origen animal que han sido estudiadas por su alta concentración en aminoácidos de alta calidad y bajo costo estas son: harina de sangre2, harina de carne y hueso 2 y harina de pescado (STEPHANOPOULOS, 1993),
2 Los subproductos de origen animal: fuentes de energía y proteína. (sin fecha). Alberto Celis. Director National Renderers Association América Latina. http://hnos.abreu.com/Doc/los_subprod uctos_de_origen_anima.htm
11
estas son comúnmente utilizadas en formulaciones de alimentos acuícolas, según lo indicado por Akiyama y Polanco (1995) citado por STANGE (2004).
La harina de sangre presenta una muy elevada concentración de aminoácidos tales como: valina, lisina, leucina y treonina, mientras que es deficiente en arginina, metionina e isoleucina (FEDNA, 2003).
En relación a lo señalado por Borquéz y Zúñiga (1995), citados por SERRANO (2004) la harina de pescado (FIGURA 3) es obtenida a partir de anchoveta y jurel, además posee una gran concentración de aminoácidos esenciales tales como: lisina3, leucina3 y arginina3.
También existen fuentes proteicas vegetales tales como: harina de lupino según lo señalado por Perterson (1997) citado por SERRANO (2004) al igual que la harina de algarrobo (SAEZ, 2006).
De acuerdo a Yáñez et al. (1983), citado por SERRANO (2004) la harina de lupino (FIGURA 3) posee alto contenido de aminoácidos esenciales entre los cuales se encuentran: arginina, leucina, lisina.
FIGURA 3 Imagen de la harina de lupino4 y de pescado5. FUENTE: http://www.avelup.cl/web/lupinos.htm4
http://www.ventus-aliance.cz/es_va05_grub.htm5
3 Harina de Pescado. En Sistema de información de los recursos del pienso. (sin fecha). Food and Agriculture Organization of the United Nations. http://www.fao.org/ag/AGA/AGAP/FRG/afris/ espanol/Document/tfeed8/Data/19.HTM 4 AVELUP, Ltda. Harina de lupino. 5 VENTUS. Harina de pescado.
12
3. MATERIAL Y MÉTODO 3.1 Ubicación de Parte Experimental La parte experimental se desarrolló en las instalaciones del Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos; en el Instituto de Farmacia, Edificio Emilio Pugín y en el Instituto de Producción y Sanidad Vegetal, de la Universidad Austral de Chile.
3.2 Cepas Bacterianas Carnobacterium piscicola CEPA BAL B, es la cepa productora de la STB, para la cual se diseñó el medio de cultivo alternativo. Como se indicó esta cepa láctica, fue aislada de carne envasada al vacío (SCHÖBITZ, 19896).
Listeria monocytogenes Lsa 4/00, corresponde a la cepa indicadora que se utilizó para determinar la actividad de la STB, fue aislada de salmón y es cultivada en Caldo Soya Tripticasa (CST).
Ambas cepas se mantienen congeladas a –18 ºC en CST, adicionando glicerol al 1% como crioprotector.
3.3 Medio de Cultivo D-MRS (MRS, DE MAN-ROGOSA-SHARPE modificado) es el medio de cultivo que se usó como referencia para el crecimiento de Carnobacterium piscicola y producción de la STB y al cual se le sustituyeron las fuentes proteicas. Los componentes del caldo D-MRS se pueden ver en el CUADRO 1.
3.4 Proteínas Los extractos proteicos, se obtuvieron y se seleccionaron a partir de diversos tipos de harinas tanto de origen animal (Harina de Carne y Hueso7, Sangre7 y Pescado8) como de origen vegetal (Harina de Lupino9 y Algarrobo10). Preparación de Muestras. Los extractos proteicos de origen animal y vegetal, se obtuvieron a partir de una solución al 2,5%, es decir, 2,5 g de harina en 100 mL de agua destilada.
6 Schöbitz, 1989. Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Universidad Austral de Chile. Valdivia. 7 Frival, Frigorífica Valdivia, Valdivia. 8 SPK, South Pacific Korp, Talcahuano. 9 AVELUP Ltda., Freire. 10 Laboratorio del Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Universidad Austral de Chile. Valdivia.
13
El pH de las diversas muestras de extractos proteicos se ajustó considerando los siguientes criterios para:
• La solución de harina de algarrobo se decidió probar a tres diferentes pHs (5, 7 y 9) y determinar cual muestra presentaba mayor contenido de proteína soluble.
• La solución de harina de lupino se había determinado con anterioridad que a pH 8 se extraía proteína soluble (CARTAGENA, 1988).
• Las soluciones de harina de carne y hueso, sangre y pescado, en cambio se decidió arbitrariamente trabajar a pH 6,5, donde BAL B produce mayor actividad de la STB (LAMA, 2002)
Posteriormente, para las extracciones, cada muestra se dispuso a agitar en un agitador magnético a 200 rpm, para luego extraer el sobrenadante a los 30 y 60 min de extracción y hacerlo pasar por un portafiltro con un papel filtro Grado 23211, con el fin, de generar la muestra de proteína soluble a analizar.
En la FIGURA 4 se puede ver un diagrama de las preparaciones de las muestras de extractos proteicos y las condiciones de trabajo para cada una de ellas.
3.4.2 Determinación del Contenido Proteico. El contenido de proteína soluble de cada una de las muestras de los extractos de origen animal y vegetal a analizar, se determinó mediante el Método de Lowry (ANEXOS 1 y 2).
CUADRO 1 Composición del medio de cultivo, D-MRS, utilizado para C. piscicola.
COMPONENTES g/100 mL
Proteosa peptona 1
Extracto de Carne 1
Extracto de Levadura 0,5
Tween 80 0,1
Citrato de Amonio 0,2
Sulfato de Magnesio 0,01
Sulfato de Manganeso 0,005
Fosfato de Potasio 0,2
Sacarosa 2
FUENTE: SCHILLINGER y STILES (1993).
11 Advantec MFS Inc.
14
3.4.3 Análisis estadístico. Basándose en el contenido de proteína soluble de las muestras se seleccionaron las fuentes proteicas de origen vegetal y animal que fueron empleadas en las formulaciones, para ello se aplicó un análisis de varianza para ver si existían diferencias significativas entre ellas y el test de rangos múltiples para determinar cuál muestra es la mejor, ambos análisis se ejecutaron en el software estadístico Statgraphics.
3.5 Formulación del Medio de Cultivo. Las fórmulas del medio de cultivo se establecieron sobre los valores del contenido proteína soluble de las fuentes proteicas del caldo D-MRS, proteosa peptona y extracto de carne.
A partir de los valores del contenido de proteína soluble de la proteosa peptona y del extracto de carne, se determinaron las concentraciones de las soluciones de las muestras con que se trabajó para definir las diferentes mezclas del medio de cultivo, estas muestras son los extractos de origen vegetal y animal seleccionados en la etapa anterior. Cada una de las formulaciones mantuvo los demás componentes del caldo D-MRS, por esta razón en el CUADRO 2, se observan sólo las combinaciones de los componentes que se modificaron en cada una de las fórmulas.
Preparación solución a la concentración deseada
Sol. de harina de origen vegetal y animal a 2,5 %
FIGURA 4 Diagrama de la preparación muestras para determinar contenido de proteína soluble
Ajustar pH a 25 ºC pH Muestra 8 H. de lupino 5
Agitar a 200 rpm por 30 y 60 min
Extraer sobrenadante
Muestra para Método de Lowry
7 H. de algarrobo 9
H. de pescado H. de sangre 6,5 H. de carne y hueso
Filtrar sobrenadante
15
CUADRO 2 Fórmulas para el medio de cultivo alternativo.
FORMULAS COMPONENTE
Extracto de Origen Vegetal Fórmula 1
Extracto de Carne
Proteosa Peptona Fórmula 2
Extracto de Origen Animal
Extracto de Origen Vegetal Fórmula 3
Extracto de Origen Animal
3.6 Producción de la STB Para la producción de la STB se requirió previamente propagar la cepa láctica que se utilizó, el proceso a seguir puede ser observado en el diagrama que se muestra en la FIGURA 5.
El crecimiento de la cepa láctica se desarrolló mediante un cultivo batch (a nivel de matraces) que se efectuó en un agitador orbital durante un período de tiempo de 48 horas a 150 rpm, donde se mantuvo constante la temperatura a 25 ºC y el pH se ajustó a 6,5, condiciones adecuadas para la producción de la STB.
Con el fin de probar las diversas fórmulas de los medios de cultivos, se extrajeron muestras del caldo con el cultivo cada 4 horas durante las primeras 12 horas y posteriormente, cada 12 y 24 horas hasta cumplir las 48 horas de muestreo, para determinar la actividad de la STB, con la cual se demostraría la eficiencia de las formulaciones del medio de cultivo.
16
FIGURA 5 Diagrama de propagación de la cepa láctica para trabajar a nivel de
matraces.
Inoculación al 1 % 25 º C por 24 h
Inoculación al 1% 25 º C por 24 h
Inoculación al 5 % 25 º C por 24 h
a 150 rpm.
Cepa congelada a -18 ºC con glicerol al 1%
10 mL Caldo CST
5 mL Caldo D-MRS
100 mL Caldo D-MRS y otros
17
3.7 Determinación de la actividad de la STB 3.7.1 Obtención del Sobrenadante con la STB. El sobrenadante con la STB, se obtuvo como consecuencia de la centrifugación a 3000 rpm por 15 min de las muestras extraídas durante el cultivo batch de C. piscicola. Al sobrenadante resultante se ajustó el pH a 6,5 con NaOH 0,1N y se filtró, a través de un filtro de 0,22 µ, con el fin de
se desarrolló, por medio de la técnica de la “Gota sobre césped”
pana de flujo
des limitados de las gotas ubicadas sobre el césped que contiene la cepa
ositiva y el resultado de la
ico SPSS. Además se les efectuó un
nes de un cultivo batch y con la cepa láctica ya mencionada nteriormente.
descartar la presencia de cualquier células viable.
3.7.2 Ensayo de Actividad de la STB. La determinación de la actividad de la STB producida por la BAL (TAGG et al., 1976).
Esta técnica consiste en la preparación de un césped, a partir de un cultivo de 18 h en CST de L. monocytogenes, el cual, se diluyó 100 veces en buffer fosfato, para luego traspasar 700 µL a 7mL de agar D-MRS semisólido (0,5% de agar). Este césped con la cepa indicadora, se adicionó sobre una placa de Petri que contiene Agar Soya Tripticasa (AST), para finalmente distribuir sobre él cada una de las gotas de 20 µL a diferentes diluciones seriadas del sobrenadante con la STB, como control se usó el sobrenadante con la STB obtenido a partir de caldo D-MRS. Las gotas sobre el césped en la placa de Petri, se dejaron secar por 30 minutos bajo una camlaminar y posteriormente se incubaron a 25 ºC por 18 horas (FIGURA 6).
3.7.3 Interpretación de las Placas Resultantes. La prueba de actividad, se consideró positiva cuando, se observaron halos de inhibición nítidos, transparentes, sin desarrollo interior y borindicadora.
Para cuantificar la actividad de la STB por mL (UA / mL), fue la mayor dilución en que se observó un halo de inhibición la que se consideró como pactividad fue el recíproco de esa dilución expresada por mL.
3.7.4 Análisis Estadístico. A los datos obtenidos, se les aplicó un Análisis de Varianza para datos no paramétricos entre: fórmulas y tiempos, mediante el uso de la Dócima de Friedman en el software estadístanálisis de series de tiempos en forma gráfica.
3.8 Aplicación del medio de cultivo alternativo a nivel de un mini-fermentador El medio de cultivo alternativo preseleccionado, se probó en un mini–fermentador (1 L), en las condicioa
18
FIGURA 6 Diagrama de la Técnica de la “Gota sobre Césped”.
Gotas de 20 µL
Sobrenadante con la STB
Diluciones en 1 mL de buffer PO4
10 mL de Caldo ST con Listeria monocytogenes por 18 horas, 108 ufc/mL
10 ml de Buffer PO4
0,05 M, 6
7 mL agar D-MRS
Semisólido, 105 ufc/mL
Agar ST
Césped de D-MRS semisólido con
Listeria
100 µL 700 µL
1 mL
1:1 1:2 1:4 1:8 1:16
1:1
1:2
1:4
1:8
1:16
Control
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL
Muestra
Centrifugar
Ajustar pH 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Filtrar
Sobrenadante
Sobrenadante con la STB en caldo D-MRS
Césped con Listeria monocytogenes 105 ufc/mL
19
Previo al cultivo batch en el mini-fermentador, se debió realizar la propagación del C. piscicola cuyo diagrama difiere en la parte final al utilizado a nivel de matraces; éste se presenta en la FIGURA 7.
FIGURA 7 Diagrama de propagación de la cepa láctica para trabajar a nivel del
mini-fermentador.
Inoculación al 1 % 25 º C por 24 h
Inoculación al 1% 25 º C por 24 h
Inoculación al 10 % 25 º C por 24 h
a 150 rpm.
Cepa congelada a -18 ºC con glicerol al
1%
10 mL Caldo CST
6 mL Caldo D-MRS
60 mL Caldo
F3
Inoculación al 10 % 25 º C por 26 h
a 150 rpm.
600 mL Caldo
F3
20
El crecimiento de la cepa láctica y producción simultánea de la STB en un cultivo batch en el mini-fermentador se efectuó durante un período de 26 horas a 25 ºC y 150 rpm.
Durante el experimento se sacaron muestras cada 3 horas durante las 15 horas iniciales, para finalmente tomar la última muestra a las 26 horas.
En el transcurso del cultivo batch se monitoreó (CUADRO 3):
• crecimiento de la BAL, mediante recuento en placa por el método en superficie utilizando agar MRS e incubando a 25 ºC por 72 horas.
• crecimiento de la BAL, utilizando el volumen empacado de células.
• crecimiento de la BAL, por medio del consumo de NaOH.
• producción de la STB, determinando actividad a través de la técnica de la “Gota sobre Césped”.
• contenido de proteína soluble en el medio de cultivo utilizando el método de Lowry.
• contenido de glucosa como una medida indirecta de la sacarosa remanente del medio de cultivo (ANEXO 3).
El volumen empacado de células, se utilizó con el propósito de determinar la concentración celular del caldo con el cultivo. Para lo cual, este último se centrifugó en un tubo graduado a 9.000 rpm por 1 min Es importante mencionar que el tubo de centrifugación que se utilizó no fue el apropiado, adecuándose el análisis como se muestra en la FIGURA 8.
FIGURA 8 Modificación de las condiciones del volumen empacado de células.
10.000 rpm por 1 min 9.000 rpm por 1 min
Muestra 2 mLMuestra 1 mL
21
Concrecimi de C. piscicola en el mini-fermentador se usó s
• delo 1471H202), para
• 60061) y adición manual de NaOH a 1N
• Agitador magnético (THERMOLYNE, Nuova Stir Plate), para asegurar la agitación durante el cultivo batch (3).
• Aparato adicionador (bomba de acuario) constante de aire (4).
el objetivo de verificar que se cumplieran las condiciones necesarias para el ento y producción de la STB a partir
el istema que se aprecia en la FIGURA 9, y que dispuso de:
Circulador termostatado (AKO Electromecánica, Momantener la temperatura a 25 ºC (1).
pH-metro (VERNON HILLS, ILLINOISusando jeringa de 60 ml, para controlar el pH a 6,5 (2).
FIGURA 9 Fotografía del sistema de cultivo de batch utilizando el mini- fermentador.
22
4 PRESENTACION DE RESULTADOS
oteína soluble (µg/mL), en comparación al extracto de carne. El contenido de proteína soluble de ambos componentes sirvió como referencia para estimar la concentración de las soluciones de extractos proteicos de origen vegetal y animal (ANEXO 6).
4.1 Contenido de Proteína Soluble Se presentan los resultados obtenidos por el método de Lowry para las fuentes proteicas tanto del caldo D-MRS (MRS, DE MAN-ROGOSA-SHARPE modificado), así como también para las muestras de extractos de harinas de origen vegetal y animal.
4.1.1 Fuentes Proteicas del Caldo D-MRS. Las fuentes proteicas que se reemplazaron en el caldo D-MRS se muestran en la FIGURA 10, donde la proteosa peptona es la que presenta un mayor contenido de pr
7078,6
5746,5
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Proteosa Peptona Extracto de Carne
Extractos Proteicos de Medio Cultivo D-MRS
Con
teni
do d
e pr
oteí
na s
olub
le (µ
g/m
L) Contenido de proteína soluble (µg/mL)
FIGURA 10 Contenido de proteína soluble de fuentes proteicas del caldo D-MRS. 4.1.2 Muestras de Extractos de Harinas de Origen Vegetal y Animal. Los contenidos de proteína soluble de los diferentes extractos obtenidos, tanto de extractos vegetales como animales, se presentan en las FIGURAS 11 y 12.
23
En las FIGURAS 11 y 12 se presentan los diferentes extractos, la nomenclatura usada, corresponde a: tipo de muestra y tiempo de extracción, por ejemplo: HL 8 Harina de Lupino, pH 8; 30’ Tiempo de extracción 30 min.
12460,7
10019,5
1148,4 1042,1996,8 1169,5
5676,9
7601,7
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
30' 60'Tiempo de Extracción (min)
Con
teni
do d
e pr
oteí
na s
olub
le (µ
g/m
L)
HL8: Harina de Lupino; pH 8HA5: Harina de Algarrobo; pH 5HA7: Harina de Algarrobo; pH 7HA9: Harina de Algarrobo; pH 9
FIGURA 11 Contenido de proteína soluble de las muestras de extractos de
harinas de origen vegetal para cada tiempo de extracción.
429,0 477,2
1873,0 1780,31612,6 1697,5
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
30' 60'Tiempo de Extracción (min)
Con
teni
do d
e pr
oteí
na s
olub
le (µ
g/m
L)
HS6,5: Harina de Sangre; pH 6,5HP6,5: Harina de Pescado; pH6,5HC6,5: Harina de Carne y Hueso; pH 6,5
FIGURA 12 Contenido de proteína soluble de las muestras de extractos de
harinas de origen animal para cada tiempo de extracción.
24
En las FIGURAS 11 y 12 se visualiza el contenido de proteína soluble (µg/mL), para las muestras de extractos de harinas de origen vegetal y animal respectivamente. En relación al ANEXO 4, se puede señalar que existen diferencias significativas (p<0,05) entre los tipos de muestras de extractos de harinas de origen vegetal, siendo
muestra de
n el CUADRO 3, donde el extracto de harina de lupino y na de las
formulaciones (ANEXO 7).
ición de las dio cultivo alterna
FORMULACIONES COMPONENTE g/100mL
la muestra de harina de lupino a pH 8 y 30 minutos de extracción la que presenta el más alto contenido en proteína soluble, como se observa en la FIGURA 11.
En tanto el ANEXO 5, indica que los tipos de muestras de extractos de harinas de origen animal son significativamente diferentes (p<0,05), en este caso la harina de pescado a pH 6,5 y 30 minutos de extracción es la que tiene el mayor contenido de proteína soluble, lo cual se puede apreciar en la FIGURA 12.
4.1.3 Determinación de las formulaciones del medio de cultivo alternativo. El contenido de proteína soluble para las fuentes proteicas del caldo D-MRS (proteosa peptona y extracto de carne) y las muestras de extracto de harina de origen vegetal (extracto de harina de lupino) y animal (extracto de harina de pescado) se utilizaron para estimar la concentración de estas últimas (ANEXO 6), los resultados obtenidos son los que se resumen eharina de pescado se trabajaron a 1,25 % y 7,5 % respectivamente en cada u
CUADRO 3 Compos fórmulas del me tivo.
Extracto de Harina de Lupino 1,25 Fórmula 1 Extracto de Carne 1
Proteosa Peptona 1 Fórmula 2 Extracto de Harina de Pescado 7,5
Extracto de Harina de Lupino 1,25 Fórmula 3 Extracto de Harina de Pescado 7,5
Posteriormente, las tres formulaciones más la del caldo D-MRS se utilizaron a nivel de
que se ente sección 4.2.
las
48 horas, no obstante uno de los objetivos de esta tesis es reemplazar dos de las fuentes proteicas del caldo D-MRS, es por esta razón que la fórmula 3 fue la seleccionada.
matraces para producir y determinar la actividad de la STB, estos resultados son los presentan en la sigui
4.2 Resultados a Nivel de Matraces de la Actividad de la Sustancia Tipo Bacteriocina (STB).
La actividad de la sustancia tipo bacteriocina (STB) producida por las muestras extraídas a diferentes tiempos durante el crecimiento de C. piscicola en condiciones óptimas a nivel de matraces para las diversas formulaciones, se aprecian enFIGURAS 13. Cabe destacar que estas muestras fueron incubadas directamente en una estufa a 25 ºC por 18 h, no habiendo sido expuestas al pretratamiento a 4 ºC.
Las fórmulas son estadísticamente diferentes según lo señala el ANEXO 8, siendo las fórmulas 2 y 3 las que presentan los más altos rangos promedios, lo que se comprueba en la FIGURA 13, debido a que presentan las mayores actividades entre las 4 y
25
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
4 8 12 24 48Tiempo (h)
Act
ivid
ad S
TB (U
A/m
L) F1F2F3FD-MRS
FIGURA 13 Actividad de STB en cada tiempo de muestreo para cada formulación
del medio de cultivo alternativo y caldo D-MRS. Los halos de inhibición de algunos de los tiempos de la fórmula 3, a manera de ejemplo, se observan en la FIGURA 14.
FIGURA 14 Halos de inhibición en césped de Listeria monocytogenes generados
en el transcurso de la producción de la STB a nivel de matraces a partir de la fórmula 3 correspondiente a los tiempos 0, 12 y 48 horas.
26
Luego, en la sección 4.3 se muestran los resultados obtenidos a nivel de mini-fermentador a partir de la fórmula seleccionada para el crecimiento de la BAL y la actividad de la STB.
4.3 Resultados a Nivel de Mini-fermentador 4.3.1 Crecimiento de Bacteria Ácido Láctica. El crecimiento de la cepa láctica C. piscicola se da a conocer a través de métodos directos e indirectos; dentro del primero se encuentra: recuento en placa por el método en superficie y en los indirectos: consumo de neutralizante (NaOH), glucosa remanente y volumen empacado de células.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Tiempo (h)
Con
teni
do R
esid
ual d
e G
luco
sa(g
/L)
0
20
40
60
80
100
120
Con
sum
o N
aOH
(mL)
Contenido Residual de Glucosa (g/L) Consumo NaOH (mL)
FIGURA 15 Consumo de NaOH y contenido residual de glucosa en las muestras
tomadas durante el crecimiento de C. piscicola. El consumo de NaOH es una manera objetiva y representativa de constatar el crecimiento de C. piscicola, se da como consecuencia de la formación de ácido (láctico y otros) a partir del consumo de la fuente de carbono (sacarosa en este caso) por parte de la cepa láctica, haciendo que el pH del medio de cultivo disminuya por debajo de 6,5, pH donde se detecta los mayores niveles de liberación de STB por parte de C. piscicola (LAMA, 2002). Por lo tanto, la adición de NaOH al medio de cultivo se efectuó con el fin de mantener constante el pH en tanto se llevó a cabo el cultivo batch.
En la FIGURA 15, se observa que mientras aumenta el consumo de NaOH, disminuye el contenido de glucosa en las muestras extraídas durante el crecimiento de C. piscicola, alcanzándose a las 12 h el inicio de la fase estacionaria para ambas gráficas. En las 26 horas de cultivo batch se consumieron 116 mL de NaOH y se llegó a un contenido final de glucosa de 0,04 g/L.
27
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
11,5
12,0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Tiempo (h)
Rec
uent
o en
pla
ca d
e C
. pis
cico
la (l
og u
fc/m
L)
0
20
40
60
80
100
120
Con
sum
o N
aoH
(mL)
Recuento microbiológico (log ufc/mL)
Consumo NaOH (mL)
FIGURA 16 Consumo de NaOH y recuento en placa durante el crecimiento de C.
piscicola. Como se indicó el crecimiento de C. piscicola se verificó también mediante recuento en placa por el método en superficie (FIGURA 16). En la gráfica de consumo de NaOH se visualiza que la fase de crecimiento exponencial se presenta aproximadamente entre las 6 y 12 horas de cultivo batch a 25 ºC y pH 6,5; distinguiéndose el término de la misma y el comienzo de la fase estacionaria alrededor de las 12 horas, no siendo tan diferenciable en la curva de recuento bacteriano pero si suponiendo que la fase estacionaria se inicia a las 12 h ya que se confirma en las gráficas de consumo de NaOH y glucosa (FIGURA 15).
El recuento bacteriano de C. piscicola alcanza su valor máximo (log 11,54 ± 0,18 ufc/mL) a las 12 horas.
A pesar de que la fase estacionaria en la gráfica que representa el crecimiento de C. piscicola mediante el recuento en placa por el método en superficie no se manifiesta con notoriedad porque no se extrajeron muestras durante este período, si se puede señalar que a las 26 horas se confirma un descenso en el recuento de células.
En cambio, a partir de la gráfica de consumo de NaOH y glucosa si se diferencia el inicio fase estacionaria, pero no el comienzo de la fase de desaceleración (FIGURA 15).
Otra manera que se utilizó para representar el comportamiento de C. piscicola mientras se realizó el cultivo batch, fue el volumen empacado de células que se muestra en la FIGURA 17, en los tiempos en que se tomaron muestras no se distingue a simple vista una diferencia notoria entre una y otra.
28
FIGURA 17 Volumen empacado de células para cada muestra extraída a
diferentes tiempos durante el crecimiento de C. piscicola. 4.3.2 Actividad de la STB. La actividad de la STB también se evaluó y se considera el análisis más importante que se efectuó a las muestras tomadas en los diversos tiempos en el transcurso del crecimiento de la BAL.
De acuerdo a la FIGURAS 18 y 19 se detecta la mayor producción de la STB por C. piscicola a las 12 horas tanto para las muestras que se incubaron a 4 ºC por 48 horas y posteriormente a 25 ºC por 18 horas, así como también para las que se incubaron directamente a 25 ºC por 18 horas, coincidiendo con el fin de la fase exponencial e inicio de la fase estacionaria en las gráficas de consumo de NaOH, consumo de glucosa y recuento en placa por el método en superficie. Además, es evidente que para ambos casos descritos anteriormente, existe una diferencia en cuanto a la producción de actividad de la STB, obteniéndose mayores resultados en aquellas muestras que fueron incubadas previamente a temperatura de refrigeración con el fin de aumentar la sensibilidad de la L. monocytogenes.
Respecto de la FIGURA 18, se puede indicar que la mayor producción de la STB se genera desde las 9 horas hasta las 15 horas para las muestras que fueron incubadas previamente a 4 ºC por 48 horas y luego a 25 ºC por 18 horas, pero para las muestras puestas directamente a 25 ºC por 18 horas esto se da entre 12 y 15 horas.
En la FIGURA 20 se muestra como ejemplo los halos de inhibición obtenidos en el período de producción de la STB por C. piscicola para las muestras tomadas a las 0, 12 y 26 horas del cultivo batch.
29
016,5
4070
103 110,5 116
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27Tiempo (h)
Act
ivid
ad d
e la
STB
(UA
/mL)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Con
teni
do R
esid
ual d
e G
luco
sa (g
/L)
Actividad STB (UA/ml) 25ºC Actividad STB (UA/ml) 4ºC-25ºC
Consumo de NaOH (mL) Cont. Residual de Glucosa (g/L)
FIGURA 18 Actividad de la STB, contenido residual de glucosa de las muestras
extraídas y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola.
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
11,5
12,0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Tiempo (h)
Rec
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ca d
e C
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cico
la (l
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L)
0
50
100150200
250300350
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450
Act
ivid
ad d
e la
STB
(U
A/m
L)
Recuento microbiológico (log ufc/mL)
Actividad STB (UA/ml) 25ºCActividad STB (UA/ml) 4ºC-25ºC
FIGURA 19 Recuento en placa y actividad de STB de las muestras extraídas
durante el crecimiento de C. piscicola.
30
IGURA 20 Halos de inhibición en césped de Listeria monocytogenes formados durante la producción de STB en el mini-fermentador a partir de la fórmula 3, correspondientes a los tiempos 0, 12 y 26 horas.
F
31
4.3.3 Contenido de Proteína Soluble. En la FIGURA 21, se puede observar el proteína soluble de las diversas muestras extraídas durante el período a cabo el cultivo batch, contrastándolo con gráficas que compr
contenido de que se llevó ueban el
Lowry
crecimiento de C. piscicola, estos son: consumo de NaOH y consumo glucosa.
Por lo que indican las gráficas no se registra tendencia alguna en cuanto al contenido de proteína soluble entre todas las muestras analizadas, debido principalmente a que el contenido de proteína soluble que se estimó mediante el método decorresponde al contenido total de proteína soluble y no a un aminoácido en específico.
Los resultados obtenidos, como se observa, se encuentran por sobre 5290 µg/mL y por debajo de 6760 µg/mL de proteína soluble para todas las muestras.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27Tiempo (h)
C. R
esid
ual d
e G
luco
sa (g
/L) y
C
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a So
lubl
e (1
03 µg/
mL)
0
20
40
60
80
100
120
Con
sum
o N
aOH
(mL)
Cont. proteina soluble (10³ µg/mL)Cont. Residual de Glucosa (g/L)Consumo NaOH (mL)
FIGURA 21 Contenido de proteína soluble, contenido de glucosa de las muestras
extraídas y consumo de NaOH durante el crecimiento de C. piscicola.
32
5. DISCUSIÓN
Para mejorar los niveles de producción de bacteriocina a partir de una cepa láctica se requiere tener presente diversos factores entre los cuales se han estudiado el efecto de la temperatura y concentración de glucosa en el medio de cultivo (LEJEUNE et al.,
de Carnobacterium piscicola LV61. A partir de
xtracto de carne) y
, para ello se probaron 3 formulaciones y se
r de 1
das con las usadas en el caldo
1998); la temperatura de crecimiento, tamaño del inóculo, aireación del cultivo, concentraciones de glucosa y NaCl en el medio cultivo (LEAL-SANCHEZ et al., 2002) y el pH (GUERRA y PASTRANA, 2003).
Es así como, las fuentes proteicas del caldo D-MRS peptona, extracto de carne y extracto de levadura fueron probadas en diversas combinaciones para analizar su efecto en la producción de bacteriocina los resultados obtenidos en ese estudio se dedujo que tanto el extracto de carne como el extracto de levaduras no influyen en la producción de la bacteriocina, en cambio la peptona la promueve de manera favorable (SCHILLINGER, 1993).
BORQUEZ (2000) detectó que durante el crecimiento de Carnobacterium piscicola en diferentes medios de cultivos entre los cuales se trabajó con D-MRS, D-MRS modificado (que contiene 20 g de proteasa peptona y no contiene eAPT, no es necesaria la presencia del extracto de carne, pero si la de la proteasa peptona para la producción de la STB.
En la primera etapa del presente trabajo se reemplazaron las fuentes proteicas del caldo D-MRS (proteasa peptona y extracto de carne), por extracto de harina de lupino y de harina de pescado respectivamenteobservó que al igual que la proteasa peptona, el extracto de harina de lupino y de harina de pescado (en mayor grado) tuvieron un efecto positivo en la producción de la STB por la BAL B, no ocurriendo lo mismo con el extracto de carne. Por lo tanto, ambas fuentes proteicas alternativas, resultan ser una opción para ser utilizadas en la modificación del caldo D-MRS para la producción de la STB por parte de BAL B.
BORQUEZ (2000) determinó que al trabajar con caldo D-MRS a 25 ºC, con agitación a 150 rpm, pH 6,5 y flujo de aire a 550 mL aire/min. (lo que equivale a 1vvm) en un cultivo batch para la producción de la STB por C. piscicola en un mini-fermentadoL, la mayor actividad de la sustancia antimicrobiana se obtiene entre las 12 y 16 horas de cultivo de la BAL (800 UA/mL), esto es al final de la fase de crecimiento exponencial y al inicio de la fase estacionaria, siendo a las 12 horas en donde se alcanzo el máximo valor de recuento bacteriano log (9,78 ± 0,01 ufc/mL).
En el presente estudio en una primera instancia cuando se seleccionó la formulación en que se reemplazaron 2 de las 3 fuentes proteicas del caldo D-MRS por extracto de harina de lupino y de pescado (de bajo costo comparaD-MRS) para la producción de la STB de C. piscicola a nivel de matraces con un inoculo del 5 % de la cepa láctica, se consiguió una máxima actividad de 800 UA/mL.
33
En cambio, cuando se probó posteriormente la formulación seleccionada a nivel de un mini-fermentador artesanal de 1 L con un inóculo del 10% de la cepa láctica, la mayor actividad de la STB obtenida fue 400 UA/mL entre las 9 y 12 horas, esto es al final de la fase exponencial e inicio de la fase estacionaria de crecimiento de la BAL, siendo a las 12 horas cuando se logró el mayor recuento bacteriano esto fue 3,5 x 1011 ufc/mL lo que equivale a log (11,54 ± 0,18 ufc/mL).
Este estudio se puede contrastar con lo efectuado por BORQUEZ (2000) debido a la similitud de las condiciones en que se trabajaron, a partir de esto se observa una
trabajaron en la producción de la STB de C. piscicola no son
rpm obteniendo la mayor
• icola en el caldo D-MRS a la misma
Se puela STB te de crecimiento durante el cultivo batch
vorin L471 por Lactobacillus
cterium
diferencia en el máximo de actividad de la STB alcanzada, lo que pudo deberse a que se privilegió el crecimiento de la cepa BAL B por sobre la producción de la STB durante el cultivo batch.
Por otro lado, los resultados obtenidos por LAMA (2002) y ZUÑIGA (2002) que en sus investigaciones comparables a lo efectuado en este estudio debido a que:
• LAMA (2002) trabajó con 2 L de medio de cultivo D-MRS inoculando al 0,1% Carnobacterium piscicola a 25 ºC, pH 6,5 y 100actividad de la STB entre las 24 y 38 horas (1600 UA/mL) esto es durante la fase estacionaria siendo a las 24 horas cuando se consiguió el máximo recuento bacteriano de 7,6 x 109 ufc/mL.
Y ZUÑIGA (2002) combinó cultivo batch y continuo en un fermentador de 10 L para la producción de la STB de C. pisctemperatura y pH indicados previamente, pero con una agitación de 250 rpm y un flujo de aire 12 L/min. lo que corresponde a 1,2 vvm, obteniendo 1600 UA/mL en la fase final del cultivo batch, eso si que la máxima actividad de la sustancia antimicrobiana se consiguió en el transcurso de la fase inicial del cultivo continuo esto fue 3200 UA/mL.
de considerar que para que ocurra la diferencia detectada en la producción de por parte de la cepa BAL B, el ambien
no estuvo estresado, lo que se verifica con el análisis de contenido residual de proteína soluble en el medio de cultivo al finalizar las 26 horas del batch (5290 ug/mL), por lo que aún quedaba proteína soluble para ser consumida.
Por el contrario, según lo investigado por DE VUYST et. al., (1996) en la optimización del proceso de producción de la bacteriocina Amyloamylovorus DCE471 se observó que los factores de estrés, es decir, condiciones desfavorables para el crecimiento de la BAL estimulan la producción de la bacteriocina.
Además, VERLUYTEN et. al., (2004) para Lactobacillus curvatus LTH 1174 obtiene una baja razón de crecimiento especifico como resultado del estrés ambiental, debido a la limitación de nutrientes, lo que indujo a una alta producción de bacteriocina.
Otro aspecto importante que puede haber afectado en la baja de la producción de la STB de la cepa BAL B, cepa láctica que pertenece a la especie Carnobapiscicola que se considera anaerobia facultativa (BARAKAT et. al., 2000), durante el cultivo batch en el mini-fermentador es que el flujo de aire adicionado no fue el adecuado por lo que no se obtuvieron los resultados esperados.
34
Según VASQUEZ et. al., (2005) indica la existencia de diferentes patrones de respuestas para el crecimiento bacteriano y producción de bacteriocina en los cultivos de diversas cepas de BAL considerando la disponibilidad de oxigeno, en el caso de las cepas de BALS heterofermentativas señala que cuando aumenta la disponibilidad de oxígeno también se ve incrementada la producción de bacteriocina.
También hay investigaciones como la efectuada por CABO et. al., (2001) en que la producción de nisina por Lactococcus lactis se cuadriplica en el punto máximo crecimiento celular cuando el porcentaje de saturación de oxígeno aumenta de 50 a 100 %
Y por otra parte, lo estudiado por LEAL-SANCHEZ et. al., (2002) para Lactobacillus plantarum LPCO10 cepa láctica que se clasifica dentro de la especie Lactobacillus plantarum heterofermentativas facultativa (AXELSSON, 1998) que demostró que no se requiere aireación en el cultivo batch para una mayor producción de bacteriocina.
Si se puede descartar un aumento de la resistencia de la Listeria monocytogenes 4/00, para explicar la baja de la producción de la STB por parte de C. piscicola BAL B cuando se trabajo a nivel de un mini-fermentador, ya que los halos de inhibición del control (STB producida en Caldo D-MRS) fueron nítidos, transparentes y limitados.
Como sugerencia para investigaciones posteriores es disminuir la concentración de proteína soluble total en la preparación de la solución final del medio de cultivo alternativo de manera de estresar el ambiente de crecimiento y realizar la hidrólisis de los extractos proteicos para facilitar el consumo de aminoácidos libres por parte de la BAL, esto último se basa en lo realizado por DE VUYST et. al., (1995) que observa que aminoácidos como serina, treonina y cisteína activan fuertemente la producción de nisina sin afectar el crecimiento celular final, al igual que VASQUEZ et. al., (2004) que advierten que cisteína y triptófano estimulan la producción de nisina por Lactococcus lactis, en cambio otros como prolina la reducen.
Respecto de los parámetros medidos para monitorear el crecimiento, LEJUENE et. al., (1998), utilizaron tanto el consumo de NaOH acumulativo, así como también el contenido residual de glucosa en el medio de cultivo como una forma de determinación indirecta del aumento de la biomasa bacteriana con el fin de modelar el crecimiento y producción de bacteriocina por parte de Lactobacillus amylovorus DCE471 en un cultivo batch, por ende en este estudio también es válido usar ambas maneras indirectas de determinar el crecimiento de la cepa láctica BAL B, pero con otro propósito, éste es ser una vía alternativa al recuento microbiano por medio del método en superficie, debido principalmente a que el medio de cultivo alternativo que se obtiene luego del reemplazo de las fuentes proteicas en el caldo D-MRS es más bien turbio.
El volumen empacado de células en micro-tubos de centrifugación es un método rápido para determinar el crecimiento celular, de donde se obtienen resultados exactos y reproducibles, para lo cual se requieren ciertas condiciones, estas son: muestras hasta 1ml para ser centrifugadas a 10000 rpm12. En el presente estudio este método también se usó con el propósito descrito anteriormente, pero las condiciones ya mencionadas
12 A novel disposable microtube for rapid assessment of biomasa in cell cultures. (sin fecha). Martin Jordan. Swiss Federal Institute of Technology Lausanne, Faculty of Basic Sciences, Institute of Biological and Chemical Process Sciences
35
debieron ser modificadas y adecuadas, debido a que se utilizaron otro tipo de tubos. Por lo tanto, los resultados obtenidos no fueron, los esperados.
Las formas indirectas de medición del crecimiento celular alternativas al recuento microbiológico que resultan ser factibles de utilizar son el consumo de NaOH y el contenido residual de glucosa en el medio de cultivo, no así el volumen empacado de células, debido a que las condiciones para su aplicación no fueron las adecuadas.
Con respecto a los costos de las fuentes proteicas alternativas (ver ANEXO 9) estos resultan ser bastante inferiores a los costos de las fuentes proteicas usadas comúnmente en el caldo D-MRS, siendo siempre este un aspecto importante de tener en cuenta cuando se diseña un medio de cultivo extrapolable a una futura producción industrial.
36
6. CONCLUSION
• Las fuentes proteicas de menos costo que pueden ser utilizadas como una opción a las del caldo D-MRS (MRS, DE MAN ROGOSA SHARPE modificado), proteosa peptona y extracto de carne, son: la harina de lupino y de pescado respectivamente.
• La mayor producción de la sustancia tipo bacteriocina (STB) a nivel de matraces 800 UA/mL disminuye a nivel del mini-fermentador 400 UA/mL, debido posiblemente al exceso de crecimiento celular.
• A nivel del mini-fermentador la mayor producción de la STB alcanzada fue al final de la fase exponencial y al inicio de la fase estacionaria con 400 UA/mL.
37
7. RESUMEN
El propósito de este estudio fue producir una sustancia tipo bacteriocina (STB) a partir de Carnobacterium piscicola inhibitoria contra Listeria monocytogenes en un medio de cultivo que utiliza como base el caldo D-MRS (MRS, DE MAN ROGOSA SHARPE modificado), pero en el que se reemplazan las fuentes proteicas por otras más baratas.
En la primera etapa de esta investigación, se determinó el contenido de proteína soluble mediante el método de Lowry de las fuentes proteicas del caldo D-MRS (proteosa peptona y extracto de carne) y de las fuentes proteicas más económicas de origen vegetal (extracto de harina de lupino y de algarrobo) y animal (extracto de harina de pescado, de carne y hueso y de sangre) que son analizadas con el fin de seleccionar uno de cada tipo. Estos fueron el extracto de harina de lupino y de pescado respectivamente.
Posteriormente, se probaron las tres formulaciones basadas en los resultados de la primera etapa más la formulación del caldo D-MRS que se usa como control, cultivando C. piscicola a nivel de matraces a pH 6,5 y 25 ºC, luego se evaluó su eficiencia mediante la técnica de la “Gota sobre Césped“ que determina la actividad de la STB producida.
Finalmente, la formulación seleccionada F3 (extracto harina de lupino y de pescado) que alcanzó 800 UA/mL se trabajó en un cultivo batch a pH 6,5 y 25 ºC durante 26 horas en un mini-fermentador y se monitoreó el recuento bacteriano haciendo uso del método en superficie, además se determinó el consumo NaOH, el contenido residual de glucosa y de proteína soluble en el medio de cultivo alternativo y la actividad de la STB producida.
En esta última etapa se alcanzó un nivel cercano de 1012 ufc/mL de crecimiento celular y actividades de solo 400 UA/mL al final de la fase exponencial e inicio de la fase estacionaria.
38
SUMMARY
The purpose of this study was to produce a bacteriocin like substance (BLIS) antagonic against Listeria monocytogenes from Carnobacterium piscicola in culture medium broth similar to D-MRS (MAN ROGOSA SHARPE modified) where the protein components were replaced by other cheaper.
In the first stage of this investigation, the Lowry method was used to determine the soluble protein content of the protein sources of the D-MRS broth (peptone proteose and beef extract) and that of the more economical protein sources of vegetable (extract of lupine and locust meal) and of animal origin (extract fish, meat and bone, bloom meal), that were also analyzed so as to select one of each type. Thus, extract of lupine flour and fish meal were chosen.
Afterwards three formulations were tested based on the results of the first stage, together with the formulation of the D-MRS broth that was used as a control, by cultivating C. piscicola in flasks at pH 6.5 and 25 ºC. Thereafter the efficiency of the formulations was evaluated by means of the technique “ spot-on-lawn” that determined the activity of the produced BLIS.
Finally, the selected formulation F3 (extract of lupine and fish meal) that achieved 800 UA/mL was used in a laboratory fermenter for a culture batch at pH 6.5 y 25 ºC during 26 hours. Bacterial count was monitored making use of surface method. Moreover, the consumption of NaOH, the residual concentration of glucose and soluble protein in the alternative culture medium as well as the activity of the BLIS produced were also determined.
In the last stage a bacterial count at a level near to 1012 ufc/mL of cellular growth was reached, but at the end of the exponential phase and beginning of the stationary phase only activities of 400 UA/mL was achieved.
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43
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44
ANEXOS
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ANEXO 1 Determinación de proteínas de acuerdo al método de LOWRY et al. (1951)
Principio. La determinación se basa en el desarrollo de color debido a la reacción de los enlaces peptídicos de las proteínas y cobre alcalino del reactivo y la reducción del fosfomolibdato – fosfotungsteno del reactivo Folin - Ciocalteau, por los aminoácidos aromáticos.
Equipos y materiales.
• Espectrofotómetro (Spectronic, Genesys 5)
• Pipetas 0,5 y 1,0 mL
• Jeringa Hamilton 100 µL
• Solución A: Na2 CO3 2% P/V disuelto en NaOH 0,1 N
• Solución B: CuSO4 x 5 H2O al 1% P/V y Tartrato de Na y K al 2% P/V.
• Solución C: mezclar solución A y B en proporción 50:1
• Solución E: reactivo Folin – Ciocalteau 1N
A una cantidad de ĸ-caseína, se le adiciona solución A y B las cuales reaccionan con los enlaces peptídicos. Al agregar reactivo Folin – Ciocalteau se desarrolla color azul al reaccionar con los aminoácidos aromáticos. La intensidad del color se mide en un espectrofotómetro a 750 nm.
Determinación.
• Se mide 0,6 mL de ĸ- caseína diluida en agua (1 mL en 3 mL)
REFERENCIA: CASANOVA (2001)
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ANEXO 2 Curva de calibración para determinación proteica de acuerdo a método
propuesto por LOWRY et al. (1951) Curva estándar.
• Solución patrón: seroalbúmina de bovino (BSA) 2 mg/mL.
• Medir de la solución BSA 10, 20, 30, 40, 50 y 60 µL (20, 40, 60, 80, 100 y 120 µg de proteína) en tubos de ensayo, agregar agua hasta completar 0,6 mL.
• Se agrega a cada tubo 3 mL de solución C y se deja a temperatura ambiente
10 min
• Se agrega 0,3 mL de reactivo Folin – Ciocalteau 1N.
• Se deja 30 min a temperatura ambiente.
• Se mide la absorbancia a 750 nm.
REFERENCIA: CASANOVA (2001)
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ANEXO 3 Diagrama del método para determinar contenido de glucosa
La medición indirecta del contenido de sacarosa remanente en el medio del cultivo, se basa en la hidrólisis ácida del disacárido para posteriormente determinar la glucosa generada con el kit enzimático Merck Test Glucosa con glucosa oxidasa
[ ] ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛=
dLmgx
AAaGlu
ST
S 100cos [ ] ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛=
Lgx
AAaGlu
ST
Scos
Filtrar 1 ml de muestra
Agregar 2 gotas de HCl esfumante
Hervir por 10 min
Dejar enfriar
Preparar diferentes diluciones
20 µL 2 mL
Dilución Muestra, Muestra, Solución Reactivadora Blanco (agua) o
Estándar Blanco (agua) o
Estándar
Muestras, Blanco (agua) y Glucosa
Baño termorregulador por 20 min a 37ºC
Medir Absorbancia a 510 nm
As: Absorbancia solución. AST: Absorbancia estándar.
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ANEXO 4 Análisis de varianza y test de rangos múltiples para muestras de extractos de
origen vegetal
49
ANEXO 5 Análisis de varianza y test de rangos múltiples para muestras de extractos de
origen animal
50
ANEXO 6 Cálculo de la concentración de las soluciones de harinas
Factor para extracto proteico de origen vegetal.
LupinoHarinaleSooteinaContenidoPeptonaoteosaleSooteinaContenidoFactorFPOV
__lub_Pr__Pr_lub_Pr_
=
)/(7,12460)/(6,7078
mLugmLugFactorFPOV =
5,057,0 ⇒=FactorFPOV
Concentración de la solución de harina de lupino.
)100/(5,25,0 mLgxCantidadHL =
)100/(25,1 mLgCantidadHL =
Factor para extracto proteico de origen animal.
PescadoHarinaleSooteinaContenidoCarneExtractoleSooteinaContenidoFactorFPOA
__lub_Pr___lub_Pr_
=
)/(0,1873)/(5,5746
mLugmLugFactorFPOA =
306,3 ⇒=FactorFPOA
Concentración de la solución de harina pescado.
)100/(5,23 mLgxCantidadHP =
)100/(5,7 mLgCantidadHP =
51
ANEXO 7 Preparación de formulaciones
Con el propósito de lograr la concentración final de las soluciones de harina de lupino y de pescado, se debe llevar ambas preparaciones a una concentración superior.
Por tanto para cada fórmula, la solución base se prepara de diferente manera, solo con el fin de alcanzar la concentración final deseada de los extractos proteicos.
En el caso de la fórmula 3 la preparación se observa en el siguiente diagrama:
500 mL
500 mL
Solución Base del medio de cultivo alternativo al: 1,25 % de EHL 7,5 % de EHP
1000 mL
Adición de los demás componentes del caldo D-MRS
Sobrenadante de solución Harina de Pescado al 15 %
Sobrenadante de solución Harina de Lupino al 2,5 %
Las fórmulas 1 y 2 se diferencian de la 3 en que para cada una sólo se encuentra uno de los dos extractos proteicos, por lo tanto los restantes 500 ml de la solución se completan con buffer fosfato a 6,5.
Finalmente, es importante señalar que el sobrenandante de la harina de lupino se prepara a partir de una solución en agua destilada con el pH ajustado a 8, en cambio el sobrenadante de la harina de pescado se prepara en una solución de buffer fosfato a 6,5.
52
ANEXO 8 Prueba de Friedman
Rangos
1,403,603,201,80
F1F2F3FDMRS
Rangopromedio
Estadísticos de contrastea
512,750
3,005
NChi-cuadradoglSig. asintót.
Prueba de Friedmana.
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ANEXO 9 Tabla de comparación de costos entre los componentes reemplazados del caldo
D-MRS y los alternativos
COMPONENTE CONCENTRACIÓN 1 (g/L) 10 (g/L) 12,5 (g/L) 75 (g/L)
Proteosa peptona13 ($) 144,56 1445,6 Harina de lupino14 ($) 0,22 2,75 Extracto de Carne13 ($) 160,06 1600,6 Harina de pescado15 ($) 0,50 37,5
Los costos de la proteosa peptona se comparan con el de la harina de lupino, mientras que para el extracto de carne se comparan con la harina de pescado.
13 Cotización Winkler Ltda. 14 Avelup Ltda. Freire. 15 ChileAlimentos. Asociación de empresas de alimentos de Chile.
