Pontificia Universidad Católica de Chile

Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal

Postgrado en Ciencias de la Agricultura

Algas como Inmunoestimulantes en Acuicultura

Estudio Dirigido II

Alumno: Luis Molina Abarzúa Profesor: Dr. Fernando Bas

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Índice

Tablas y Figuras

Tabla 1. Tipos de Inmunoestimulantes para peces…………………………………………4

Tabla 2. Vías de suplementación de inmunoestimulantes ………………………………..5

Tabla 3. Distintas algas, sus posibles compuestos Inmunoestimulantes………………...7

y resultados en su suplementación

Fig. 1. Análisis RT-PCR para la expresión de citoquinas en leucocitos,peces

inyectados con Ergosan y PBS. ……………………………………………………………..8

Objetivo General………………………………………....................................................... 2

Objetivos Específicos……………………………………………………………………...... 2

Introducción………………………………………………………………………………....... 2

¿Qué son los Inmunoestimulantes?.............................................................................. 4

Formas de administración………………………………………………………………...... 4

Características generales de Algas y Microalgas……………………………………… 5

¿Como actuarían los Inmunoestimulantes?................................................................ 8

Discusión………………………………………………………………………………………

Conclusión………………………………………………………………………………….....

Bibliografía…………………………………………………………………………………….

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Objetivo general

Presentar efectos inmunoestimulantes de las algas en especies de acuicultura

Objetivos específicos

-Descripción de Inmunoestimulante

-Identificar posibles compuestos inmunoestimulantes presentes en algas.

-Proponer mecanismo de acción de los Inmunoestimulantes

Introducción

La Acuicultura últimamente se ha caracterizado por incrementar su productividad,

sin embargo esto se traduce en individuos cultivados a altas densidades, tendiendo a

afectar negativamente su salud y predisponiéndolos a sufrir enfermedades infecciosas

(Galindo-Villegas & Hosokawa, 2004). Además, los distintos manejos realizados en los

sistemas productivos a menudo generan estrés sobre los animales, lo que puede resultar

en inmunosupresión, derivando en menores tasas de crecimiento y en un incremento en

la susceptibilidad para contraer cuadros infecciosos (Anderson, 1996).

Unos de los principales problemas en acuicultura es la pérdida asociada con

enfermedades. Las cuales pueden llegar a representar el 50% de la producción (Simon

Mackenzie Noviembre 2009, Comunicación personal). Varias técnicas han sido utilizadas

para tratar de manejar este problema, incluyendo: Profilaxis, Desinfección, Uso de

antibióticos y Vacunación contra enfermedades específicas (Chevassus & Dorson,1990).

El uso de Inmunoestimulantes (IE) en cultivo de peces últimamente ha recibido

mayor atención debido al descubrimiento de los “Toll-like receptors” (TLRs) y los “Pattern

recognition receptors” (PRRs) (Hølvold tesis 2007). Estos receptores reaccionarían frente

a los PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) generando señales de

advertencia para el individuo, a través de sustancias químicas, y gatillando una respuesta

Inmunoestimulante (Hølvold tesis 2007; Dalmo & Bøgwald, 2008)

Sin embargo, poco es conocido respecto de las consecuencias de los

Inmunoestimulantes en peces de cultivo marinos no salmónidos. Esto debido

probablemente a la falta de desarrollo comercial en varias de estas especies, y junto a un

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limitado entendimiento de los mecanismos de defensa específicos del hospedero (Galeotti

1998).

La inmunidad está definida como la capacidad de resistir una infección (Sakai

1999). A su vez, la inmunidad de los peces está mediada principalmente por mecanismos

innatos o inespecíficos, representando cerca de un 80% del total de inmunidad (Anderson

1992). Diversas sustancias serían capaces de estimular al sistema inmune innato, tanto

humoral como celular. Entre ellos destacan: agentes químicos, componentes de bacterias,

polisacáridos, extractos animales, factores nutricionales y algas entre otros (Sakai 1999,

Raa 2000, Gil 2002, Galindo-Villegas & Hosokawa, 2004).

Los Inmunoestimulantes presentarían diversas ventajas por las cuales merecen

atención, entre ellas destacan: pueden ser producidas y administradas al pez en forma

económica; existen IE desde fuentes naturales, por tanto no dañarían al medio ambiente

como los antibióticos; Permiten tratar brotes de enfermedades predecibles; Podrían tener

efecto antiparasitario además de incrementar la resistencia y sobrevivencia contra

enfermedades bacterianas y virales; Incrementarían actividad de Macrófagos; Mejorarían

crecimiento del pez; Incrementarían la eficacia de vacunación; No presentarían efectos

secundarios ni problemas de residuos en carne; Serían fáciles de administrar y no

tendrían período de carencia (Anderson et al., 1997; Raa 2000; Galindo-Villegas y

Hosokawa, 2004; Bricknell & Dalmo, 2005).

A su vez, los inmunoestimulantes pueden actuar sinérgicamente con antibióticos y

por lo tanto mejorar los efectos de este tipo de medicación. Sin embargo, los IE

corresponderían principalmente agentes profilácticos que deberían ser usados para elevar

las barreras generales, no como elementos curativos (Raa 2000).

En este sentido, las Algas, ya sea como extracto, enteras o como compuestos

purificados surgen como una opción para la suplementación de dietas en especies de

acuicultura para debido a que son accesibles, pequeñas, dispersas en un amplio rango y

variadas y contendrían una amplia gama de compuestos inmunoestimulantes.

Los efectos Inmunoestimulantes de las algas han sido estudiados por diversos

investigadores en variadas especies (Nussler & Thompson, 1992; Dalmo & Seljelid, 1995;

Fujiki & Jano, 1997; Miles et al., 2001; Ahmadifar et al., 2009, entre otros).

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¿Qué son los Inmunoestimulantes?

Éstos han sido descritos como sustancias de variados orígenes que tienen la

capacidad de regular o modificar la respuesta inmune. También son conocidos como

Inmunomoduladores o Inmunopotenciadores. Bricknell & Dalmo (2005) las describen

como componentes naturales que modulan el sistema inmune, reflejándose en un

incremento de la resistencia del individuo contra alguna enfermedad causada por un

patógeno. Sin embargo, compuestos sintéticos también han sido categorizados por otros

autores como IE (Hemmi et al., 2002; Gorden et al., 2005). En tanto Sakai (1999) define a

los IE como extractos biológicos y químicos sintéticos los cuales generan una respuesta

inmune, mediante el mejoramiento de la actividad fagocítica, incremento de la actividad

bactericida y producción de anticuerpos. A su vez, dice que cantidades supraóptimas de

IE podrían generar una supresión del sistema inmune. Los distintos tipos de

Inmunoestimulantes agrupados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Tipos de Inmunoestimulantes para peces.

Grupo Sustancia activa

Extracto Animal EF-203 (Pollo), Hde (Abalón)

Extracto Vegetal Quillaja saponaria, Laminaran, Spirulina, Kelp pulverizado

Derivados de Bacterias Beta-glucanos, lipopolisacaridos

Factores nutricionales Vitaminas, Nucleótidos, Elemntos traza

Polisacáridos Quitina, Sclerotium, Quitosan, Lentinian

Otros Hormona de crecimiento, Prolactina, IL, IFN, TNF

Sintéticos Avridina, Bestatin, Freud’s adjuvant, Levamisol

Fuente: Adaptado de Galindo-Villegas & Hokasawa 2004

Formas de administración

Para los Inmunoestimulantes, existirían 3 posibles formas de administrarlos;

Inyección, Inmersión y vía Oral, cada uno presenta ventajas y desventajas (Tabla 2). Los

estudios al respecto son escasos y generalmente incluyen sólo extractos de algas en vez

Biológicos

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de células completas (Amar et al. 2004). Sin embargo en Europa se preferirían los

extractos ante los compuestos purificados, ya que éstos últimos necesitarían de una

licencia legal y por tanto su precio es muy superior (Simon Mackenzie noviembre 2009,

comunicación personal)

Tabla 2. Vías de suplementación de Inmunoestimulantes

Método Característica

Inyección Ruta mas potente de inmunización, pero más cara y estresante

Inmersión Causa menos estrés y permite trabajar con peces pequeños

Oral No estresante, menor capacidad de inmunización, requiere mayor cantidad de Inmunoestimulante, no importaría el tamaño del pez.

Fuente: Adaptado de Esteban et al., 2001, Galindo-Villegas & Hokasawa 2004, Huang et al., 2005

Características generales de Algas y Microalgas

Las algas y microalgas presentan una gran variación dentro de sus grupos, sin

embargo, como otras plantas, producen una variedad de componentes, que en su

conjunto son denominados como metabolitos secundarios. Éstos son sintetizados por el

alga al final de la primera etapa de crecimiento y dentro de la fase estacionaria. Todas

estas sustancias son diversas en su estructura química y función fisiológica (Skulberg

2000)

Estos metabolitos secundarios también son llamados “Moléculas bioactivas”,

término que incluye sustancias las cuales a bajas concentraciones podrían afectar

procesos de la vida de un organismo, ya sea en beneficio o perjuicio (Singh et al., 2005).

Microalgas pertenecen al subgrupo de algas, son fotosintéticas y comprenden

varios miles de especies. Han sido clasificadas como: Cianobacterias (algas verde-

azuladas), Rodófitas (algas rojas), Clorófitas (algas verdes) y Cromófitas (todas las otras)

(Singh et al., 2005).

Dentro de las algas verdes se encuentran Dunaliella salina y Ulva spp. La primera

es capaz de acumular más de un 14% de su peso seco como β-caroteno (Olaizola, 2003;

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Singh et al., 2005). Ulva se destaca por su riqueza en polisacáridos de pared celular, los

cuales pueden ser usados por su importancia biológica y/o funcional (Ray 1995).

Cianobacterias por otro lado producen complejos polisacáridos compuestos al

menos por 10 diferentes monosacáridos y están caracterizados por la presencia de

pentosas (Geresh et al., 2002).

Porphyridium sp, la especie más abundante de la división Rodófita, está

encapsulada por un polisacárido sulfurado, el cual tiene un futuro promisorio en el ámbito

industrial y aplicaciones medicinales (Geresh et al., 2009). El alga roja Chondrus crispus

tiene alta concentración de carragenanos, los cuales actuarían como Inmunoestimulantes

(Tabla 3)

Las algas café genetalmente contienen abundantes carbohidratos, como celulosa,

laminaran lichenan, fucoidan y alginatos. Permitiendo la creación de Ergosan, un producto

que contiene 1% de extracto algal (ácido algínico), el que tendría un efecto en trucha

arcoíris y otras especies (Tabla 3) (Peddie et al., 2002).

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Tabla 3. Distintas algas, sus posibles compuestos Inmunoestimulantes y resultados en su

suplementación

Organismo Componente Efecto Referencia

Spirulina maximus β-caroteno, tiamina riboflavina Sobrevivencia en Cyprinus carpio

Ramakrishnan et al., 2008

Macrocystis, Laminaria, Lessonia

Ácido algínico, Laminarian Estallido respiratorio y Citoquinas en C. carpio y O. mykiss Actividad fagocítica en C. carpio

Sobrevivencia de juveniles deS. Maximus

Actividad de macrófagos en S. salar

Peddie et al., 2002

Fujiki & Yano, 1997

Skjermo et al., 1995

Dalmo & Seljelid, 1995

Dunaliella salina β-caroteno Lisozimas séricas y tasa fagocítica en O. mykiss

Amar et al., 2004

Sargassum fusiforme Polisacáridos Actividad de lisozima y SOD y sobrevivencia en Fenneropenaeus chinensis

Huang et al, 2006

Chondrus crispus Polisacáridos Estallido respiratorio en Scopthalmus maximus

Actividad fagocítica de macrófagos en C. carpio

Castro et al., 2004

Fujiki et al., 1997

Ulva rigida Elementos traza, Polisacáridos Estallido respiratorio y expresión de IL-1b en Scopthalmus maximus

Castro et al., 2006

Porphyridium cruentum

Carbohidratos, Lípidos, Carotenos, Vitaminas

Estallido respiratorio en Solea senegalensis

Díaz-Rosales et al., 2008

Fuente: Rebolloso et al. 2000; Koven et al. 2001; Huang et al., 2005; Ahmadifar et al., 2009; Harel et al., 2002

A su vez, Peddie et al., 2002 evaluaron la Inmunoestimulación de O. Mykiss a

nivel de expresión génica. Ellos inyectaron las truchas con Ergosan versus PBS

(Phosphate buffered saline, control) y encontraron expresión de IL-1b e IL-8 en leucocitos

(Fig. 1).

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Fig. 1. Análisis RT-PCR para la expresión de citoquinas en leucocitos, Peces inyectados con Ergosan (1 mg

inyectado intraperitonealmente) y PBS. Leucocitos fueron colectados 1 día post inyección.

¿Como actuarían los Inmunoestimulantes?

En los peces con mandíbula existen 2 t ipos de mecanismos de defensa: innata y

adaptativa. La principal diferencia entre estos es el tipo de receptor utilizado para

reconocer a los patógenos. Según Medzhitov 2007, la respuesta inmune innata, principal

objetivo de los Inmunoestimulantes, estaría mediada por los Pattern recognition receptors

(PRRs), los cuales corresponden a líneas germinales codificadas, donde cada receptor

tiene una amplia especificidad por ciertas características conservadas e invariantes de un

organismo. Sin embargo, los PRRs podrían potencialmente unirse a una gran cantidad de

moléculas que tengan la misma estructura o patrón, sean estos de origen patogénico o

no, generalmente denominados PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns).

Los PAMPs están bien adaptados para el reconocimiento por la inmunidad innata,

debido a tres razones: 1) PAMPs son invariantes entre los organismos de una misma

clase; 2) Son productos desde vías únicas en el organismo, por tanto permite la

discriminación entre moléculas propias y no propias; 3) Tienen un rol esencial en la

fisiología del microbio, limitando así la habilidad de los microorganismos para evadir el

reconocimiento por la inmunidad innata.

Los PAMPs Bacterianos son a menudo componentes de la pared celular, como

Lipopolisacaridos (LPS), Peptidoglicanos (PG) y Lipoproteínas de la pared celular.

La detección de estas estructuras por el sistema inmune innato puede modular una

señal de presencia o advertencia en el organismo, señal conocida como Danger

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Associated Molecular Pattern (DAMPs), la cual da cuenta al sistema inmune de la

presencia de algún microorganismo. El reconocimiento de virus parcialmente también

sigue este principio. Sin embargo como los componentes virales son sintetizados dentro

de las células, los componentes a reconocer corresponden principalmente a ácidos

nucleicos virales.

Existen muchas clases de PRRs, pero la clase mejor caracterizada es la de los

Toll Like Receptor (TLR). TLRs corresponden a receptores transmembrana que

reconocen ácidos nucleicos virales y variados productos bacterianos. El completo rango

de acción de los TLRs no ha sido aun determinado, pero son conocidos por provocar

respuestas inflamatorias y antimicrobianas una vez que han sido activados por un

PAMPs.

En términos de la respuesta inflamatoria, TLRs activan macrófagos para la

producción de citoquinas pro-inflamatorias, que incluyen Tumoral Necrosis Factor (TNF),

Interleukinas-1β (IL-1β) e IL-6, las cuales coordinan una respuesta inflamatoria local y

sistémica. TNF e IL-1β activarán el endotelio local induciendo una vasodilatación e

incrementando la permeabilidad de los vasos sanguíneos, permitiendo así a las proteínas

séricas y leucocitos ser reclutados en el sitio de la infección. También, IL-1β en conjunto

con IL-6 activan a los hepatocitos para producir proteínas de fase aguda, que incluyen

Collentinas y Pentraxinas. Estas proteínas a su vez activarán el sistema Complemento y

preparan a los patógenos para su fagocitosis por los Macrófagos y Neutrófilos. Los TLRs

también inducen a los Macrófagos para que produzcan proteínas antimicrobianas. De

esta forma los TLRs provocarían una respuesta antimicrobiana indirecta (Medzhitov

2007).

Otra forma en la que podrían actuar los IE provenientes de algas sería la

propuesta por Witvrouw & De Clercq (1997). Ellos proponen un mecanismo de inhibición

viral por los sulfato galactános (polisacáridos presentes en Rodófitas) en virus del VIH: la

carga negativa del grupo sulfato presente en el polisacárido se une con las cargas

positivas del aminoácido en el giro V3 de la glicoproteína en la envoltura vírica (gp120). El

giro V3 es esencial para que el virus se fije a la superficie celular de sulfato heparin, un

enlace primario. Por tanto, el virus no podría invadir las células huésped, debido a que

tiene ocupada su zona de enlace.

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Discusión

Las algas parecieran funcionar como inmunoestimulantes, sin embargo muchos

puntos son necesarios a considerar antes de su inclusión en la formulación de dietas.

Actualmente la tecnología para cultivar algas podría estar no bien desarrollada como para

generar los volúmenes necesarios que requieren las industrias acuícolas (Jonas Collen

2009, comunicación personal). Por otro lado, la captura y extracción en medio natural

puede conllevar problemas de conservación y/o sustentabilidad de ciertas especies.

El método de extracción por el cual se obtiene el inmunoestimulante debe tomarse

en consideración, soluble en agua, en medio alcalino, con solvente especiales u otros

implicarán distintos costos, efectividades y purezas.

Luego, cómo será suplementada dicha alga, como extracto, compuesto purificado

o entera en el caso de microalgas. La efectividad de los compuestos para generar la

inmunoestimulación puede verse comprometida. Además el costo que tendrá cada

compuesto será distinto.

La vía de suplementación también determinará la efectividad del compuesto e irá

en relación a la especie, tamaño del individuo y capital disponible. Una determinada vía

de suplementación podría requerir de mayores concentraciones del IE en cuestión y por

tanto repercutir negativamente en los costos de la empresa. El método más efectivo

descrito hasta el momento sería la inyección, sin embargo es un proceso sumamente

estresante para el animal y lo más importante, aun no se conoce con exactitud el tiempo

durante el cual el animal mantiene la inmunoestimulación. Este último punto es

determinante para realizar una eventual re-inmunización.

Además se debe considerar el tamaño del animal y correlacionarlo con la dosis a

incluir del IE, debido a que dosis muy pequeñas podrían no generar una respuesta

inmunoestimulante.

Por otro lado, la duración de la dosis, esto es, cuánto tiempo de suplementación

requiere el organismo para generar una respuesta IE debe ser también estudiada, ya que

en algunos estudios que bajo distintas duraciones de suplementación no se genera la

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misma respuesta (Díaz-Rosales et al., 2008). Esto inclusive podría variar entre distintas

especies y para distintos patógenos.

Dentro de los distintos grupos de algas, incluso dentro de un mismo grupo, es

posible encontrar gran variación con respecto a sus compuestos o metabolitos

secundarios, por lo tanto con especies filogenéticamente cercanas es posible no obtener

las mismas respuestas inmunoestimulantes. Además cada compuesto puede ir dirigido

hacia diferentes tipos de patógenos, por lo tanto la composición química de cada alga

debiera ser bien conocida antes de incluirla como suplemento en alguna dieta. Sin

embargo, pareciera que los componentes estructurales, como polisacáridos, serían los

principales responsables de la Inmunomodulación.

Varios estudios trabajan con extractos vegetales y atribuyen una respuesta

inmunoestimulante a algún componente de ésta, pero quizás el efecto no es debido al

alga per se, sino más bien a un aumento en la cantidad de vitaminas entregadas u otro

componente entregado junto al extracto.

Una de las principales metas de la acuicultura de peces es encontrar rápidamente

un sustituto efectivo a los antibióticos. En este sentido, poco se sabe y poco se ha hecho

respecto al efecto de los Inmunoestimulantes en peces inmunocomprometidos, es decir

en animales que ya presentan un cuadro infeccioso. Los resultados de algunos estudios

son contradictorios (Sahoo et al., 2003 vs Kumari et al., 2006), donde unos afirman

inmunosupresión del sistema inmune innato y otros estimulación. Sin embargo las

especies de estudio son diferentes.

Conclusión

Las Algas, ya sean Macro o Micro, efectivamente generarían una respuesta

inmunoestimulante en distintas especies y de variadas formas (Lisozimas, Actividad y

cantidad de Fagocitos, Producción de Interleuquinas y sobrevivencia). Sin embargo la

respuesta IE podría ser especie-específica.

Las diferentes algas aportan principalmente una gama amplia de polisacáridos, por

tanto la ruta de activación del sistema inmune vía los TLR sería la forma como éstos

compuestos generan una respuesta inmunológica.

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Estudios que relacionen Especie de cultivo – Patógeno - Alga son determinantes,

ya que la mayoría de los estudios relacionados con la inmunidad de peces se encuentran

enfocados en salmónidos y por tanto estos resultados no serían extrapolables a otras

especies.