“Algoritmos diagnósticos del status de Her2 en cáncer de ...

““Algoritmos diagnAlgoritmos diagnóósticos sticos del status de Her2 en del status de Her2 en

ccááncer de mama como ncer de mama como factor predictivo de factor predictivo de

respuesta a Herceptinrespuesta a Herceptin””

José Antonio López García-AsenjoSusana Hernández Prieto

Hospital Universitario San CarlosMadrid

Reconocimiento de dianas terapéuticas• La mejor comprensión de los procesos que participan en el crecimiento

tumoral ha propiciado la búsqueda e identificación de dianas

• La familia HER es uno de los primeros grupos de dianas biológicas para las que se han desarrollado nuevos fármacos

• Herceptin® sienta un precedente al proporcionar una terapia específica para el tratamiento de pacientes HER2-positivos

HER1EGFR HER2 HER3 HER4

La familia de receptores HER y sus ligandos

EGFTGF-?

AnfiregulinaBetacelulina

HB-EGF Heregulinas

NRG2NRG3

HeregulinasBetacelulina

Dominio de latirosina-quinasa (TK)

HER1EGFR

HER2 HER3HER4

Ligandos

xx

Dominio de uniónal ligando

xx

José Baselga

Terapias anti- HER: uso de la biología tumoral para dirigir el desarrollo de fármacos

Estructura transmembrana del monómerodel receptor HER2

Dominio extracelular(632 aminoácidos)Lugar de unión al ligando

Dominio intracelular(580 aminoácidos)Actividad de tirosinaquinasa

Dominio transmembrana(22 aminoácidos)

Citoplasma

Membranaplasmática

Terminología relacionada con HER2

? Human Epidermal growth factor Receptor-2 (Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano)

? También se conoce como p185HER2

? HER2/neu = oncogen que codifica la producción del receptor HER2

? También se conoce como

– neu (gen de rata)

– c-erbB-2

SrcCbl

PLC? PI3KShp2 GAP

AktBad S6KPKC

Sos

Grb2 Nck

Ras-GTP

Ras-GDP

MAPKMEK

RAF

JNKJNKK

PAKAbl

Rac

VavShc

Grb7 CrkJak

ElkJun

FosMycSp1 Egr1 Stat

Apoptosis

Factores detranscripción

Ligandos

1 31

122 2

124 1 4 3 2

4 4 433 3

Yarden Y, Sliwkowski M. Nat Rev Mol Cell Biol 2001;2:127–37

Cascadas

Adaptadoresy enzimas

Dímeros del

receptor

Cito-quinas

NRG4(4)

NRG3(4)

NRG2(4)

NRG1(3,4)

Anfi-regulina

(1)

HB-EGF(1,4)

Epiregulina(1,4)

EGF(1)

TGF?(1)

LPA,trombinaET, etc.

? -celulina(1)

Migración Crecimiento Adhesión Diferenciación

Formación de dímeros del receptor

Homodímeros HeterodímerosAsociación

rápidaDisociaciónrápida

Asociaciónrápida

Disociación lenta

Señales efímerasy débiles

Señales duraderasy ampliadas

HER1 HER1 HER1 HER2

El dímero HER2-3 activa dos vías principales de génesis tumoral

HER2 HER3

PLC g PI3K

Shc

SosRas

Raf

Mek

PKC

AKT

CiclinaD1Elk1

MycSp1

PDK-1

p70S6K

PTEN

FKHR-L1

JAK

STAT

Grb2

p27KIP1Jun/Fos E2F

PEA3

Bad/Bcl2

GSK3

Erk

Citri A, et al. Exp Cell Res 2003

El dímero HER2-3 activa dos víasprincipales de génesis tumoral

HER2 HER3

PLC g PI3K

Shc

SosRas

Raf

Mek

PKC

AKT

Ciclina D1Elk1

MycSp1

PDK-1

p70S6K

PTEN

FKHR-L1

JAK

STAT

Grb2

p27KIP1Jun/Fos E2F

PEA3

Bad/Bcl2

GSK3

Erk

MAPK AKT

Provocación dela muerte celular

Proliferación celular

Her2 en cáncer de mama (1)

• Sobreexpresado en el 21,4% de 22.616 cánceres de mama (Revillion et al)

• Sobreexpresión inversamente relacionada con la de Receptores de Estrógenos y Progestágenos

• Sobreexpresión relacionada con el tipo histológico (ductal, especialmente CDIS) y clínico (inflamatorio)

• Sobreexpresión relacionada con alto grado (N e H), aneuploidíay proliferación (Ki-67)

• No relacionado con la edad, tamaño tumoral y estado axilar

? Un estado HER2-positivo es un predictor de un pronóstico desfavorable

? En el análisis multivariado, HER2 fue un predictor independiente consistente de la

– recidiva (p=0,001)

– supervivencia global (p=0,02)

? El receptor HER2 proporciona una diana selectivapara el cáncer de mama con sobreexpresión

Slamon DJ et al. Science 1987;235:177–82


Supervivencia de las pacientes con cáncer de mama sin invasión ganglionar, en relación con el estado de HER2

1,00

0,75

0,50

0,25

0

Pro

babi

lidad

acum

ulad

a

0 24 48 72 96 120 144

HER2 no amplificado

HER2 amplificado

Amplificado: >10 copias/núcleoNo amplificado: <3 copias/núcleoCasos límite: excluídos

Tiempo hasta la muerte (meses)

Log rank p<0,001

Ross JS, Fletcher JA. Stem Cells 1998;16:413–28

Supervivencia libre de enfermedad de las pacientes con cáncer de mama con invasión ganglionar, en relación con el estado HER2

100

80

60

40

20

00 12 24 36 48 60 72

Pro

bab

ilid

add

e su

perv

iven

cia

libre

de

enfe

rmed

ad

Tiempo (meses)

Gen HER2 <3 copias/núcleo

Gen HER2 ? 3 copias/núcleo

Log rank p=0,001

Seshadri R et al. J Clin Oncol 1993;11:1936–42

• Valor pronóstico– Se asocia con enfermedad agresiva con evolución clínica pobre

• Valor predictivo– Indicación de sensibilidad disminuída al tamoxifeno y CMF

– Predicción de la sensibilidad a tratamientos con antraciclinas y taxanos

– Identificación de pacientes susceptibles de obtener beneficio con Herceptin®

Hanna W, Gelmon K. Current Oncology 2002;9(Suppl. 1):S2–S17Ross JS, et al. Oncologist 2003;8:307–25


Dianas TerapéuticasFamilia del Receptor HER

Diana intracelular• Inhibición de la fosforilación de la

TK

Diana extracelular• Se une al receptor• Evita la unión al ligando• Puede liberar un agente tóxico• Inhibe la dimerización

Grb2 Sos

ShcGrb2

Sos

PI3K

Akt

Ras

Raf

MEK1/2

MAPKBAD

Survival Proliferation

PTEN

mTOR

Cell-cycle progression

FKHRGSK3p27

Cyclin D1, E

EGFR HER 2Inhibidor reversible y competitivo de las tirosinquinasas de ErbB1 y ErbB2

xx

Herceptin

Lapatinib

Herceptin® (trastuzumab)

? Anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado 95% humano, 5% murino

– menor potencial de inmunogenicidad

? Afinidad (Kd=0,1nM) y especificidad altas

Herceptin®: Nuevas Perspectivas

• Enfermedad metastásica:?Combinaciones con otros citotóxicos?Combinaciones con hormonoterapia?Esquema de administración (1 vs 3 sem)?Combinaciones con inhibidores de tirosinkinasa

• Tratamiento adyuvante:?QT + Herceptin vs QT?Mejor forma de asociación (secuencia vs combinación)?Duración del tratamiento

HERCEPTIN® EN EL TRATAMIENTO ADYUVANTE: CONSIDERACIONES TEORICAS

• Las pacientes con sobreexpresión/amplificación de her2/NEU tienen peor pronóstico

• Estas pacientes parecen beneficiarse de dosis altas de doxorubicina (CALGB)

• Podrían también beneficiarse de trastuzumab adyuvante• El uso combinado de trastuzumab y doxorubicina en

adyuvancia es complicado a causa de la cardiotoxicidad:

• uso concomitante desaconsejable • se desconoce la cardiotoxicidad del uso secuencial

Herceptin®

EN EL TRATAMIENTO ADYUVANTE :

*Herceptest +++ or FISH+ **Only FISH+

NSABP B-31*Paclitaxel q3w x 4

Paclitaxel q3w x 4 + HAC x 4

HERA Trial*H q3w x 12 monthsH q3w x 24 monthsObservation

Any CT and/or RT

Intergroup* N9831

Paclitaxel qw x 12

Paclitaxel qw x 12

Paclitaxel qw x 12 + H

AC x 4

BCIRG 006**

Docetaxel q3w x 4AC x 4

AC x 4 Docetaxel q3w x 4 + H

Carboplatin + docetaxel q3w x 6 + H

H

N=2,700

N=3,100

N=3,192

N=3,200

HER2 y TOPO II en BCIRG 0062120 pacientes analizados

HER2Core region

17 q 12 17 q 21.1 17 q 21.2

1285 pts (60%)

N=2120

91 pts (4%)

Topo IINoCoamplificada

Normal Amplif. Delec.

TOPO II region

744 pts (35%)Coamplificada

SLE en enfermas con coamplificación her2/topoII alfa

% S

LE

Meses

0.5

0.6

0.8

1.0

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54

Pacientes Eventos Tratamiento

227 23 AC->T265 13 AC->TH252 21 TCH

Logrank P= 0.24

TCH

AC->TH

AC->T

SLE en enfermas sin coamplificación%

SLE

Meses

0.0

0.6

0.8

1.0

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54

Pacientes Eventos Tratamiento

458 92 AC->T472 45 AC->TH446 54 TCH

Logrank P= <0.001

TCHAC->TH

AC->T

CONCLUSIONES

• Herceptin es un tratamiento eficaz del cáncer de mama metastásico con sobreexpresión de her2/neu

• El uso del herceptin se ha extendido también al tratamiento adyuvante (1 de cada 5 pacientes)

• El costo y la potencial toxicidad del tratamiento hace crucial la labor identificativa del patólogo

Herceptin®: Nuevas Perspectivas

Mecanismos de disregulaciónde HER2 en tumores

Hiperproducción de ligandos(circuito autocrino)

Sobrexpresión/amplificación

Internalización o regulación

descendente defectuosas

EGFRvII/III

EGFRvI

Mutacionesque confieren

activaciónconstitutiva

Aumento de la producción de HER2

1 = ? número de copias del gen2 = ? transcripción mRNA3 = ? ? xpresión de la proteína del receptor de la superficie celular

A = DNA HER2B = mRNA HER2C = Proteína del receptor HER2

Normal Amplificación/Sobreexpresión

Núcleo

Citoplasma

Membranacitoplasmática

1

2

3

C

B

A

• Amplificación génica de HER2– hibridización in-situ por fluorescencia (FISH)– hibridización in-situ cromogénica (CISH)– reacción en cadena de la polimerasa (RCP)– Southern blot

• Transcripción aumentada de ARNm HER2– RT-RCP– Northern blot

• Sobreexpresión de la proteína HER2– inmunohistoquímica (IHQ)– Western blot

Métodos de análisis de HER2

American Society of Clinical Oncology/College of American PathologistsGuideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor

Receptor 2 Testing in Breast Cancer.

Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz, Karen L. Hagerty, D. Craig Allred,Richard J. Cote, Mitchell Dowsett, Patrick L. Fitzgibbons, Wedad M. Hanna, Amy Langer, Lisa M. McShane, Soonmyung Paik, Mark D. Pegram, Edith A. Perez, Michael F. Press, Anthony Rhodes,

Catharine Sturgeon, Sheila E. Taube, Raymond Tubbs, Gail H. Vance, Marc van de Vijver, Thomas M. Wheeler, and Daniel F. Hayes.

Fuentes de variabilidad en la determinación de Her2

• Preaanalítica:Tiempo hasta la fijaciónMétodo de procesamiento de tejidoTiempo de fijaciónTipo de Fijación

• AnalíticaValidación del ensayoCalibración del equipoProcedimiento de laboratorio standarizadoEntrenamiento y competencia del personal de laboratorioTipo de recuperación antigénicaReactivos del testControlesAutomatización

• PostanalíticaCriterios de interpretaciónUso de análisis de imagenTipo de informeProcedimientos de garantía de calidad

Laboratorios

TestsPatólogos

DAKO Novocastra Zymed

Polyclonal Ab Monoclonal Ab Monoclonal Ab

Peptide Peptide HER2transfectedNIH3T3 cells

Intracellular Intracellular Extracellular

Domain Domain Domain

Herceptest CB11 TAB250

A0485

Valoración del resultado

• % e intensidad de tinción completa de membrana• Lectura sobre el componente infiltrante• Ausencia de tinción en células normales• Puntos de corte: Herceptest 10% de las células

Calibration of immunohistochemistry forassessment of HER2 in breast cancer: results of the French Multicentre GEFPICS* Study.Histopathology 2003 Apr;42(4):337-47

Control de Calidad

• Interno: Controles positivos y negativos

Controles con otras técnicas (FISH/CISH)

• Externo: % de positivos y negativosReevaluación por centros de referenciaConfirmación por FISH/CISH

FISH•Mejor correlación con respuesta a trastuzumab•Altamente reproducible•Poca alteración por la “edad” del bloque•Kits disponibles:

•Oncor•Pathvysion *•Dako *

* Con marcaje centromérico

Assessment of the HER2 status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization: a technical review with interpretive guidelines.

Hicks DG, Tubbs RR.Hum Pathol. 2005 Mar;36(3):250-61

Recomendaciones para el informe

<4 señales Her2/CEP17<2 No amplificado4-6 señales Her2/CEP17<2 Probable polisomía

Her2/CEP17=2 Baja Amplificación>señales Her2/CEP17>2 Amplificación

FISH IHC

• Parafina

• 16-20 h.

• Equipamiento

especial

• Automatizado

• Precio

• Parafina

• 3-5 h.

• Equipamiento standard

• Automatizado

• Precio

Correlación entre IH y FISH

Correlation between immunohistochemistry (Herceptest) andFISH for Her-2 in 426 breast carcinomas from 37 centres.J Pathol 2003;199:418-423

FISH (%)

IHQ – Total

0/1+ 268 (99,3) 2 (0,7) 270

2+ 28 (51,9) 26 (48,1) 54

3+ 6 (5,9) 96 (94,1) 102

+

Chromogenic in situ hybridization (CISH)

Normal Aneuploide AmplificationNo amplific.

British Journal of Cancer (2003) 88, 1587-1591.Agreement between chromogenicin situ hybridisation (CISH) andFISH in the determination of HER2 status in breast cancer

L Arnould1, Y Denoux, G MacGrogan, F Penault-Llorca, M Fiche, I Treilleux6, M C Mathieu, A Vincent-Salomon, M O Vilainand J Couturier

Baja amplificación Alta amplificación

– no requiere microscopio de fluorescencia– permite la evaluación histológica– permite el almacenamiento regular de muestras– menos cara que FISH

• CISH puede usarse como una alternativa a la FISH

Hibridización in-situ cromogénica (CISH):

• La CISH detecta la amplificación génica de HER2 y sigue los mismos principios que la FISH

• Sin embargo, la detección de la señal es similar a la IHQ:


Receptor 2 Testing in Breast Cancer.

Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz, Karen L. Hagerty, D. Craig Allred,Richard J. Cote, Mitchell Dowsett, Patrick L. Fitzgibbons, Wedad M. Hanna, Amy Langer, Lisa M. McShane, Soonmyung Paik, Mark D. Pegram, Edith A. Perez, Michael F. Press, Anthony Rhodes,

Catharine Sturgeon, Sheila E. Taube, Raymond Tubbs, Gail H. Vance, Marc van de Vijver, Thomas M. Wheeler, and Daniel F. Hayes.

American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists GuidelineRecommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer.


Receptor 2 Testing in Breast Cancer.J Clin Oncol 25:1. 2007

• Test positivo: IH: Tinción completa de membrana, intensa y uniforme de >

30% de las células en el componente infiltrante (3+)FISH: >6 copias núcleo (sin sonda centromérica)

Her2/CEP 17 > 2’2

• Test negativo: IH: 0/1+ Ausencia de tinción o tinción débil de membrana

incompletaFISH: <4 copias núcleo (sin sonda centromérica)

Her2/CEP 17 <1’8

• Test equívoco: IH: 2+. Tinción completa de membra, débil o no uniforme en al menos

10% de las célulasFISH: 4-6 copias núcleo (sin sonda centromérica)

Her2/CEP 17= 1’8-2’2

Algoritmo de análisis de HER2

Bilous M, et al. Mod Pathol 2003;16:173–82

FISH

Muestra del tumor del paciente

Terapia conHerceptin®

+–2+ 3+1+0

+–

FISH

IHQ





Inmunohistoquímica en componente infiltrante

Test equívoco (2+)Test positivo Test negativo

Hibridación “in situ”



Hibridación “in situ” en componente infiltrante

Test equívocoHer2/Cep17:1’8-2’24-6 copias/núcleo

Test positivoHer2/Cep17>2’2>6 copias/núcleo

Test negativoHer2/Cep17 <1’8<4 copias/núcleo

Recuento adicional de núcleosRepetir test de FISHInmunohistoquímica

Test equívoco Her2/Cep17 2 ó más

son elegibles para tratamiento adyuvante

Conclusiones para los patólogos

• El análisis preciso es esencial para identificar pacientes que se beneficiarán de tratamientos específicos– Los falsos negativos niegan a pacientes un tratamiento que

prolonga la vida – Los falsos positivos: los pacientes no se beneficiarán de un

tratamiento específico

• Requisitos importantes para el laboratorio de patología:– Estandarización y validación regular del análisis– Medidas de control de calidad y que garantizan la calidad– Número mínimo de casos (>150 por año en FISH)– Documentación detallada

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