Alineamientos de secuencias. ¿Para qué hace falta la compoaración de secuencias? Bases...

Alineamientos de secuencias

¿Para qué hace falta la compoaración de secuencias?

Bases biológicas:

• Muchos genes y proteínas son miembros de familias que tienen funciones biológicas similares o un origen filogenético común.

Se usa para:

• Identificar relacciones evolutivas.• Identificar patrones conservados.• en caso de secuencias con funciones desconocidas:

encontrar dominios similares en otras proteinas implica una función similar.

Claves:• 1- que tipo de alineamiento hay que considerar• 2- que sistema de puntuacion “scoring” hay que

usar para clasificar los alineamientos• 3- que algoritmos hay que usar para encontrar la

solución óptima (o buena)• 4- métodos estadisiticos necesarios para

evaluar la significacion del score de los alineamientos

Alineamiento de secuencias

Tipos de comparación de secuencias

• Pairwise Alignments

• Alineamientos múltiples

• Búsquedas en bases de datos

• Principios de la comparación por pares de secuencias

• alineamientos globales / locales • sistemas de puntuación “scoring” • penalizaciones por GAP

• Métodos de pairwise sequence alignment • Basados en deslizamiento de ventanas “window-based” • programación dinámica

Pairwise Sequence Alignment

• Alineamientos globales

• Alineamientos locales


(Needleman & Wunsch) crea alineamientos en toda la

longitud de la secuencia.

Alineamiento Global

Para secuencias que estan muy relaccionadas

Dos secuencias con varias regiones de similaridad

1 AGGATTGGAATGCTCAGAAGCAGCTAAAGCGTGTATGCAGGATTGGAATTAAAGAGGAGGTAGACCG.... 67

1 AGGATTGGAATGCTAGGCTTGATTGCCTACCTGTAGCCACATCAGAAGCACTAAAGCGTCAGCGAGACCG 70

|||||||||||||| | | | |||| || | | | ||

Con un alineamiento local solo se obtendrá una similaridad muybaja: fragmento azul

Alineamiento Global

Alineamiento Local

14 TCAGAAGCAGCTAAAGCGT 32 ||||||||| |||||||||42 TCAGAAGCA.CTAAAGCGT 59

1 AGGATTGGAATGCT 14 |||||||||||||| 1 AGGATTGGAATGCT 14

39 AGGATTGGAAT 49 ||||||||||| 1 AGGATTGGAAT 11

62 AGACCG 67 ||||||66 AGACCG 71

Alineamiento local encuentra la region que tiene la mejor similaridadlocal.

Pairwise Sequence Alignmentalfa globina humana

beta-globina

leghemoglobina

Glutonina S-tranferasanematodos

Parámetros a tener en cuenta en el alineamiento de secuencias

Sistemas de puntuación:

• A cada par de símbolos se le asigna un valor numerico

basado en una tabla de comparación de síbolos.

Penalizaciones por Gap:

• apertura: Costo de introducir un gap• Extensión: Costo de extender el gap

actaccagttcatttgatacttctcaaa

taccattaccgtgttaactgaaaggacttaaagact

Sequencia 1

Sequencia 2

A G C T

A 1 0 0 0

G 0 1 0 0

C 0 0 1 0

T 0 0 0 1

Match: 1Mismatch: 0Score = 5

Sistemas de puntuación de secuencias de nucleótidos

Valores negativos que penalizen los mismatches:

A T C G

A 5 -4 -4 -4

T -4 5 -4 -4

C -4 -4 5 -4

G -4 -4 -4 5

Matches: 5Mismatches: 19

Score: 5 x 5 + 19 * (-4) = - 51

actaccagttcatttgatacttctcaaa

taccattaccgtgttaactgaaaggacttaaagact

Sequencia 1

Sequencia 2

Sistemas de puntuación de secuencias de nucleótidos

PTHPLASKTQILPEDLASEDLTI

PTHPLAGERAIGLARLAEEDFGM

Sequencia 1

Sequencia 2

Scoringmatrix

T:G = -2 T:T = 5Score = 48

C S T P A G N D . .

C 9

S -1 4

T -1 1 5

P -3 -1 -1 7

A 0 1 0 -1 4

G -3 0 -2 -2 0 6

N -3 1 0 -2 -2 0 5

D -3 0 -1 -1 -2 -1 1 6

.

.

C S T P A G N D . .

C 9

S -1 4

T -1 1 5

P -3 -1 -1 7

A 0 1 0 -1 4

G -3 0 -2 -2 0 6

N -3 1 0 -2 -2 0 5

D -3 0 -1 -1 -2 -1 1 6

.

.

Sistemas de puntuación de secuencias de proteínas

210 valores

• Amino acidos tienen diferentes propiedades bioquímicas y físicasque pueden influenciar su capacidad de ser reemplazados en la evolución

CP

GGAVI

L

MF

Y

W HK

RE Q

DN

S

T

CSH

S+S

positive

chargedpolar

aliphatic

aromatic

small

tiny

hydrophobic

Protein Scoring Systems

• Las matrices reflejan

• Probabilidades de substituciones mutuas

• Probabilidad de ocurrencia de un aminoacido

• Matrices mas usadas:

• PAM

• BLOSUM

Protein Scoring Systems

PAM (Percent Accepted Mutations) matrices

• Derived from global alignments of protein families .

• Family members share at least 85% identity (Dayhoff et al.,

1978).

• Construction of phylogenetic tree and ancestral sequences of each protein family

• Computation of number of replacements for each pair of amino acids

• The numbers of replacements were used to compute a so-called PAM-1 matrix.

• PAM 1 significa: 1% de mutaciones aceptadas, es decir se utilizaría esta matriz cuando uno esperara un 1 % de substituciones. PAM matrices para distancias evolucionarias mas grandes se pueden extrapolar a partir de esta matriz.

• PAM250 = 250 mutaciones por cada 100 residuos.

• A mayor número mayor distancia evolutiva.

PAM (Percent Accepted Mutations) matrices

PAM250 es muy común. a esta distancia evolutiva, 48% de los triptófanos, 41% de las cisteinas y 20% de las histidinas permanecen inalteradas pero solo 7% de las serinas

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z

A 2 -2 0 0 -2 0 0 1 -1 -1 -2 -1 -1 -3 1 1 1 -6 -3 0 2 1 R -2 6 0 -1 -4 1 -1 -3 2 -2 -3 3 0 -4 0 0 -1 2 -4 -2 1 2 N 0 0 2 2 -4 1 1 0 2 -2 -3 1 -2 -3 0 1 0 -4 -2 -2 4 3 D 0 -1 2 4 -5 2 3 1 1 -2 -4 0 -3 -6 -1 0 0 -7 -4 -2 5 4 C -2 -4 -4 -5 12 -5 -5 -3 -3 -2 -6 -5 -5 -4 -3 0 -2 -8 0 -2 -3 -4 Q 0 1 1 2 -5 4 2 -1 3 -2 -2 1 -1 -5 0 -1 -1 -5 -4 -2 3 5 E 0 -1 1 3 -5 2 4 0 1 -2 -3 0 -2 -5 -1 0 0 -7 -4 -2 4 5 G 1 -3 0 1 -3 -1 0 5 -2 -3 -4 -2 -3 -5 0 1 0 -7 -5 -1 2 1 H -1 2 2 1 -3 3 1 -2 6 -2 -2 0 -2 -2 0 -1 -1 -3 0 -2 3 3 I -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2 5 2 -2 2 1 -2 -1 0 -5 -1 4 -1 -1 L -2 -3 -3 -4 -6 -2 -3 -4 -2 2 6 -3 4 2 -3 -3 -2 -2 -1 2 -2 -1 K -1 3 1 0 -5 1 0 -2 0 -2 -3 5 0 -5 -1 0 0 -3 -4 -2 2 2 M -1 0 -2 -3 -5 -1 -2 -3 -2 2 4 0 6 0 -2 -2 -1 -4 -2 2 -1 0 F -3 -4 -3 -6 -4 -5 -5 -5 -2 1 2 -5 0 9 -5 -3 -3 0 7 -1 -3 -4 P 1 0 0 -1 -3 0 -1 0 0 -2 -3 -1 -2 -5 6 1 0 -6 -5 -1 1 1 S 1 0 1 0 0 -1 0 1 -1 -1 -3 0 -2 -3 1 2 1 -2 -3 -1 2 1 T 1 -1 0 0 -2 -1 0 0 -1 0 -2 0 -1 -3 0 1 3 -5 -3 0 2 1 W -6 2 -4 -7 -8 -5 -7 -7 -3 -5 -2 -3 -4 0 -6 -2 -5 17 0 -6 -4 -4 Y -3 -4 -2 -4 0 -4 -4 -5 0 -1 -1 -4 -2 7 -5 -3 -3 0 10 -2 -2 -3 V 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -2 4 2 -2 2 -1 -1 -1 0 -6 -2 4 0 0 B 2 1 4 5 -3 3 4 2 3 -1 -2 2 -1 -3 1 2 2 -4 -2 0 6 5 Z 1 2 3 4 -4 5 5 1 3 -1 -1 2 0 -4 1 1 1 -4 -3 0 5 6

PAM 250

C

-8 17

W

W

El valor de un par de aa idénticos representa la probabilidad de que esteaa permanezca inalterado (e.g. triptófano)

• Derivada de alineamientos de dominios pertenecientes aproteinas alejadas en la evolucion (Henikoff & Henikoff,1992).

• Contaron la presencia de cada par de aa en cada columna de cada bloque de alineamientos.

• Los números obtenidos delanálisis de todos los bloques se usaronpara calcular las matricesde tipo BLOSUM.

A

A

C

E

C

A - C = 4A - E = 2C - E = 2A - A = 1C - C = 1

BLOSUM (Blocks Substitution Matrix)

AACEC

BLOSUM (Blocks Substitution Matrix)

• Las secuencias se clusterizan dentro de un bloque de acuerdo a su grado de identidad. Clusters are counted as a single sequence. • Las matrices BLOSUM difieren en el porcentaje de identidad de secuencias usado para hacer el clustering

• El número de la matriz (e.g. 62 en BLOSUM62) se refiere al porcentaje máximo de identidad entre las secuencias utilizado para crear la matriz

•Mayores número significan distancias evolutivas menores.

Matrices de substitución: Log-odds Ratio

P(x,y|R) =qx qyi iii

Dado un par de secuencias alineadas queremos asignar una score que mida el grado de posibilidad „likelihood“, de que las secuencias estan relaccionadas

Random model (unrelated) :

Match model (related) : P(x,y|M) =px yii i

Odds ratio :related

unrelatedP(x,y|

M)P(x,y|

R)

= =px yii i

qx qyi iii

px yi i

qx qyi i

i

Log-odds ratio : S = s(xi,yi)i

where : s(a,b) = logpab

qa qb

s(a,b) is the log likelyhood ratio of the residue pair (a,b) occurring as an aligned pair, as opposed to an unaligned pair.

x,y = amino acids (A,C......Y) P = likelyhoodi = 1....n (longitud de la secuencia n) q = probabilidad

Como escoger la matriz adecuada

• Generally, BLOSUM matrices perform better than PAM matrices for local similarity searches (Henikoff &

Henikoff, 1993).

• When comparing closely related proteins one should use lower PAM or higher BLOSUM matrices, for distantly related proteins higher PAM or lower BLOSUM matrices.

• For database searching the commonly used matrix is BLOSUM62.

T A T G T G G A A T G A

Como puntuar inserciones y delecciones

A T G T - - A A T G C A

A T G T A A T G C A

T A T G T G G A A T G A

La creación de un gap se penaliza con un score negativo.

insertion / deletion

• Un alineamiento optimo

• maximiza el numero de matches • minimiza el número de gaps

• Permitir la inserción arbitraria de muchos gaps puede dar lugar a scores altos entre secuencias no homologas.

• La penalización de los gaps fuerza a los alineamientos a alcanzar los criterios optimos

Gap Penalties

Gap Penalties

Linear gap penalty score:

(g) = - gd

Affine gap penalty score:

(g) = -d - (g -1)e

(g) = gap penalty score of a gap of lenght g

d = gap opening penalty

e = gap extension penalty

g = gap lenght

Scoring Insertions and Deletions

A T G T T A T A C

T A T G T G C G T A T A

Total Score: 4

Gap parameters:

d = 3 (gap opening)

e = 0.1 (gap extension)

g = 3 (gap lenght)(g) = -d - (g -1)e

(g) = -3 - (3 -1) 0.1 = -3.2

T A T G T G C G T A T A

A T G T - - - T A T A C

insertion / deletion

match = 1mismatch = 0

Total Score: 8 - 3.2 = 4.8

A TTCACATA

T A C A T T A C G T A C

Sequence 1

Sequence 2


Dotplot:

A T T C

A C

A T A

T A C A T T A C G T A CSequence 1

Sequence 2

A dotplot da una visión general del alineamiento

Dotplot:

A T T C

A C

A T A



A T A C A C T T A

Sequence 1

Sequence 2

One possible alignment:

Cada diagonal en elgráfico corresponde a un posible alineamiento sin gap entre las dos secuencias

Window-based Approaches

• Word Size

• Window / Stringency

Word Size Algorithm

T A C G G T A T G

A C A G T A T C

T A C G G T A T G

A C A G T A T C

T A C G G T A T G

A C A G T A T C

T A C G G T A T G

A C A G T A T C

C T A T G A C A

T A C G G T A T G

Word Size = 3

Window / Stringency

T A C G G T A T G

T C A G T A T C

T A C G G T A T G

T C A G T A T C

T A C G G T A T G

T C A G T A T C

T A C G G T A T G

T C A G T A T C

C T A T G A CA

T A C G G T A T G

Window = 5 / Stringency = 4

Considerations

• The window/stringency method is more sensitive than the wordsize method (ambiguities are permitted).

• The smaller the window, the larger the weight of statistical (unspecific) matches.

• With large windows the sensitivity for short sequences is reduced.

• Insertions/deletions are not treated explicitly.

Insertions / Deletions in a Dotplot

T

A

C

T

G

T

C

A

T

T A C T G T T C A TSequence 1

Sequence 2

T A C T G - T C A T| | | | | | | | |T A C T G T T C A T

Hemoglobin -chain

Hemoglobin

-chain

Dotplot (Window = 130 / Stringency = 9)

Dotplot (Window = 18 / Stringency = 10)

Hemoglobin

-chain

Hemoglobin -chain

• Principles of pairwise sequence comparison• global / local alignments• scoring systems• gap penalties

• Methods of pairwise sequence alignment • window-based approaches• dynamic programming approaches

• Needleman and Wunsch• Smith and Waterman


Procedimiento automático que encuentra el mejor

alineamiento con un score óptimo dependiendo de los

parámetros elegidos.

Dynamic Programming

Soluciones recursivas. Los problemas pequeños

se solucionan primero y las soluciones se usan

para resolver problemas mayores despues. Las

soluciones intermedias se almacenan en matrices

tabulares.

Principios básicos de la programación dinámica

-Initialization of alignment matrix: the scoring model

- Stepwise calculation of score values

(creation of an alignment path matrix)

- Backtracking (evaluation of the optimal path)

Initialization of Matrix (BLOSUM 50)

H E A G A W G H E E

P -2 -1 -1 -2 -1 -4 -2 -2 -1 -1

A -2 -1 5 0 5 -3 0 -2 -1 -1

W -3 -3 -3 -3 -3 15 -3 -3 -3 -3

H 10 0 -2 -2 -2 -3 -2 10 0 0

E 0 6 -1 -3 -1 -3 -3 0 6 6

A -2 -1 5 0 5 -3 0 -2 -1 -1

E 0 6 -1 -3 -1 -3 -3 0 6 6

Needleman and Wunsch (global alignment)

Sequence 1: H E A G A W G H E ESequence 2: P A W H E A E

Scoring parameters: BLOSUM50 matrix

Gap penalty: Linear gap penalty of 8

Creation of an alignment path matrix

Idea:Crear un alineamiento global optimo usando soluciones precias para alineamientos optimos de subsecuencias más pequeñas.

• Construct matrix F indexed by i and j (one index for each sequence)

• F(i,j) es el score para el mejor alineamiento entre el segmento inicial x1...i de x hasta xi y el segmento inicial y1...j de y hasta yj

• construir F(i,j) de forma recursiva empezando con F(0,0) = 0

-A

EEHH

G-WWAA

G-AP

E-

H-

Optimal global alignment:

F(i, j) = F(i-1, j-1) + s(xi ,yj)

F(i, j) = max F(i, j) = F(i-1, j) - d

F(i, j) = F(i, j-1) - d

F(i-1, j-1) F(i, j-1)

F(i-1,j) F(i, j)

-d

-d

s(xi ,yj)


HEAGAWGHE-E--P-AW-HEAE

• If F(i-1,j-1), F(i-1,j) and F(i,j-1) are known we can calculate F(i,j)

• Three possibilities:

• xi and yj are aligned, F(i,j) = F(i-1,j-1) + s(xi ,yj)

• xi is aligned to a gap, F(i,j) = F(i-1,j) - d

• yj is aligned to a gap, F(i,j) = F(i,j-1) - d

• The best score up to (i,j) will be the largest of the three options


H E A G A W G H E E 0

P

A

W

H

E

A

E

-8 -16 -24 -32 -40 -48 -56 -64 -72 -80

-8

-16

-24

-32

-40

-48

-56

F(j, 0) = -j d

Boundary conditions

F(i, 0) = -i d


H E A G A W G H E E 0 -8 -16 -24 -32 -40 -48 -56 -64 -72 -80

P -8

A -16

W -24

H -32

E -40

A -48

E -56

Stepwise calculation of score values

-2

-10

-9

-3

F(i, j) = F(i-1, j-1) + s(xi ,yj)

F(i, j) = max F(i, j) = F(i-1, j) - d

F(i, j) = F(i, j-1) - d

F(0,0) + s(xi ,yj) = 0 -2 = -2

F(1,1) = max F(0,1) - d = -8 -8= -16 = -2

F(1,0) - d = -8 -8= -16

F(1,0) + s(xi ,yj) = -8 -1 = -9

F(2,1) = max F(1,1) - d = -2 -8 = -10 = -9

F(2,0) - d = -16 -8= -24

-8 -2 = -10

F(1,2) = max -16 -8 = -24 = -10

-2 -8 = -10

-2 -1 = -3

F(2,2) = max -10 -8 = -18 = -3

-9 -8 = -17

P-H=-2

E-P=-1

H-A=-2

E-A=-1

H E A G A W G H E E 0 -8 -16 -24 -32 -40 -48 -56 -64 -72 -80

P -8 -2 -9 -17 -25 -33 -42 -49 -57 -65 -73

A -16 -10 -3 -4 -12 -20 -28 -36 -44 -52 -60

W -24 -18 -11 -6 -7 -15 -5 -13 -21 -29 -37

H -32 -14 -18 -13 -8 -9 -13 -7 -3 -11 -19

E -40 -22 -8 -16 -16 -9 -12 -15 -7 3 -5

A -48 -30 -16 -3 -11 -11 -12 -12 -15 -5 2

E -56 -38 -24 -11 -6 -12 -14 -15 -12 -9 1

Backtracking

-5

1

-A

EE

HHG-WWAA

G-AP

E-H-

0

-25

-5

-20

-13

-3

3

-8 -16

-17

Optimal global alignment: EE

Two differences:

1.

2. An alignment can now end anywhere in the matrix

Smith and Waterman(local alignment)

Example:Sequence 1 H E A G A W G H E ESequence 2 P A W H E A E

Scoring parameters: Log-odds ratiosGap penalty: Linear gap penalty of 8

0

F(i, j) = F(i-1, j-1) + s(xi ,yj)

F(i, j) = F(i-1, j) - d

F(i, j) = F(i, j-1) - d

F(i, j) = max

H E A G A W G H E E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A 0 0 0 5 0 5 0 0 0 0 0

W 0 0 0 0 2 0 20 12 4 0 0

H 0 10 2 0 0 0 12 18 22 14 6

E 0 2 16 8 0 0 4 10 18 28 20

A 0 0 8 21 13 5 0 4 10 20 27

E 0 0 6 13 18 12 4 0 4 16 26

Smith Waterman alignment

Optimal local alignment: AA

G-

EE

HH

WW

28

0

5

20 12

22

Extended Smith & Waterman

To get multiple local alignments:• delete regions around best path

• repeat backtracking

H E A G A W G H E E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0

W 0 0 0 0 2 0 0 0

H 0 10 2 0 0 0

E 0 2 16 8 0 0

A 0 0 8 21 13 5 0

E 0 0 6 13 18 12 4 0

0

5

20 12 4

12 18 22 14 6

4 10 18 28 20

4 10 20 27

4 16 26


H E A G A W G H E E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0

W 0 0 0 0 2 0 0 0

H 0 10 2 0 0 0

E 0 2 16 8 0 0

A 0 0 8 21 13 5 0

E 0 0 6 13 18 12 4 0

Second best local alignment:

0

21

10

16

HHEEAA


Further Extensions of Dynamic Programming

• Overlap matches

• Alignment with affine gap scores

• Pairwise sequence comparison• global / local alignments• parameters• scoring systems• insertions / deletions

• Methods of pairwise sequence alignment • dotplot• windows-based methods• dynamic programming• algorithm complexity


Methods of Pairwise Comparison

Multiple AlignmentProgressive Alignment:

step

Progressive Alignment:

step

Programs perform global alignments:

• Needleman & Wunsch: (Pileup, Tree, Clustal)

• Word Size Method: (Clustal)

• X. Huang (MAlign) (modified N-W)

1.

Construction of a Guide Tree


step


step

1 2 3 4 5

1

2

3

4

5

Sequence

Similarity Matrix:

displays scores ofall sequence pairs.

The similarity matrix is transformed into a distance matrix . . . . .

2.

Construction of a Guide Tree


step


step

DistanceMatrix

1

23

4

5

Guide Tree

Neighbour-Joining Method or

UPGMA (unweighted pair group method of arithmetic averages)

2.

Multiple Alignment


step


step

1

23

4

5

Guide Tree

2

3.

1

T T A C T T C C A G G

Columns - once aligned - are never changed


step


step


3.

G T C C G - - C A G G

T T - C G C - C - G G

G T C C G - C A G G

T T - C G C C - G G




step


step


3.


T T - C G C - C - G G

G T C C G - C A G G

T T - C G C C - G G

. . . . and new gaps are inserted.




step


step3.


T T - C G C - C - G G

A T C - T - - C A A T

C T G - T C C C T A G

A T C T - - C A A T

C T G T C C C T A G



T T - C G C - C - G G

Sub-sequence alignments

A K-means like clustering problem

Clustering resulting model

Clustering predictions

Assignments

•Describe a pairwise alignment with a different gap penalization.

•Provide an example and perform a multiple global alignment. Describe the recipe.

•Provide an example and perform a multiple alignment of subsequences. Describe the recipe.

•Algorithms Order (polynomial, exponential, NP)

Algorithmic Complexity

How does an algorithm‘s performance in CPU time and required memory storage scale with the size of the problem?

Needleman & Wunsch

• Storing (n+1)x(m+1) numbers

• Each number costs a constant number of calculations to compute (three sums and a max)

• Algorithm takes O(nm) memory and O(nm) time

• Since n and m are usually comparable: O(n2)

Gracias porsu atención…

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Alineamientos de secuencias. ¿Para qué hace falta la compoaración de secuencias? Bases...

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