Alumno: Alejandra Giovana Gama Rios Titulo proyecto ... · plomo en la primera etapa de desarrollo...
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Alumno: Alejandra Giovana Gama Rios
Titulo proyecto: Prevalencia del trastorno por déficit de
atención y conducta perturbadora en escolares
veracruzanos y su asociación con metales pesados. Estudio
piloto.
Matricula: s13015113
Universidad Veracruzana
Instituto de Medicina Forense
Prevalencia del trastorno por déficit de atención y conducta
perturbadora en escolares veracruzanos y su asociación con
metales pesados. Estudio piloto.
Protocolo de tesis para obtener el grado en la Maestría de
Medicina Forense
Alumna: Alejandra Giovana Gama Ríos
Directora: Ana Laura Calderón Garcidueñas
Programa: Maestría en Medicina Forense, UV
Veracruz, 2014
1. Introducción
1.1 Generalidades.
A través de la tecnología y la industrialización, el ser humano ha facilitado su
vida diaria, sin embargo, el incremento en el desarrollo de tecnología en el
planeta generó también una serie de problemas colaterales, entre ellas la
contaminación, que afecta no solo a los recursos naturales básicos como
suelos, aire y agua, sino también la salud de la población (Kouba et al, 2010).
Los desechos liberados en las industrias como subproductos son las
principales causas de contaminación por metales. Debido a que los metales
tienden a acumularse en casi cualquier organismo y a su alta capacidad para
desplazarse físicamente en los sistemas biológicos, representan un peligro
considerable para la salud humana y animal; por lo tanto, su monitoreo es de
considerable importancia (Kouba et al, 2010)
La toxicidad de estos metales puede variar en gran medida; en algunos casos,
son utilizados en enzimas de varios organismos (por ejemplo el cobre en los
crustáceos). No obstante, siempre se tienen efectos negativos por encima de
ciertas concentraciones (Fatih et al, 2008), causando así serias alteraciones en
los sistemas estructurales, fisiológicos y metabólicos que pueden conducir a
intoxicaciones, insuficiencia de órganos blanco e incluso, enfermedades
neoplásicas (Fatih et al, 2008; Evren, 2013).
Se consideran metales pesados a cualquier elemento metálico que tiene una
densidad relativamente alta y es tóxico, incluso a baja concentración. El
término de metales pesados, se aplica al grupo de los metales y metaloides
con densidad atómica superior a 4 g/cm3. Sin embargo, en lenguaje médico, el
término hace referencia a sus propiedades químicas y su toxicidad. Los
metales pesados incluyen el plomo (Pb), cadmio (Cd), zinc (Zn), mercurio (Hg),
arsénico (As), plata (Ag), cromo (Cr), hierro (Fe) y cobre (Cu) (Duruibe et al,
2007).
Los metales considerados tóxicos por la Asociación Oficial del Control de
Alimentos de los Estados Unidos (por sus siglas en inglés AAFCO, 1996) son:
aluminio (Al), arsénico (As), cadmio (Cd), cromo hexavalente (Cr), hierro (Fe),
manganeso (Mn), mercurio (Hg), níquel (Ni), plomo (Pb), selenio (Se), talio (Tl),
vanadio (V) y zinc (Zn) (Ghaffari y Motlagh, 2011).
Su toxicidad depende de varios factores, incluyendo dosis, la vía de
exposición, tiempo de exposición, frecuencia y las especies químicas de cada
elemento, así como la edad, género, genética y estado nutricional de los
individuos expuestos. Debido a su alto grado de toxicidad, el arsénico, el
cadmio, el plomo, el mercurio y el cromo, se encuentran entre los metales de
mayor importancia para la salud pública. Estos elementos metálicos se
consideran muy tóxicos, por inducir daño múltiple a diversos órganos, incluso
en los niveles más bajos de exposición (Tchounwou et al., 2012).
Algunos metales pueden considerarse como tóxicos sistémicos, es decir, que
pueden afectar más de un órgano. (Tchounwou et al., 2012).
Los metales pesados pueden afectar al organismo directamente por
acumulación de éstos en su cuerpo o indirectamente a través de la
transferencia a nivel trófico mediante la cadena alimentaria (Evren et al., 2013).
Generalmente el plomo, mercurio y cadmio inducen la producción de radicales
libres y debido a las interacciones con los grupos sulfhidrilos de las proteínas,
alteran las actividades de éstas (Vassallo et al., 2011).
Estudios recientes han mostrado un aumento considerable con su distribución
en el mundo, así como un amplio uso de estos agentes químicos. A diferencia
de los contaminantes orgánicos, muchos de estos metales no pueden ser
degradados fácilmente y se acumulan a lo largo de la cadena alimenticia,
produciendo riesgos para la salud humana y disturbios ecológicos (Castro et
al., 2013).
De acuerdo a Martinez (2007) algunos de los daños que pueden causar estos
metales a la salud son los siguientes:
Daños/Metales
Cadmio
(Cd)
Cromo
(Cr)
Plomo
(Pb)
Arsénico
(As)
Mercurio
(Hg)
Cobalto
(Cb)
Estrés Oxidativo
Daño neurológico
Daño al DNA
Alteración de glucosa
Alteración metabolismo
del calcio
Interferir con los
elementos esenciales
1.2 Plomo
Este metal se ha utilizado por más de 8,000 años en una amplia gama de
aplicaciones. Se ha distribuido por todo el planeta debido a los procesos
antropogénicos como la adición de plomo a la gasolina, en la fabricación de
baterías, cerámica vidriada, pintura con plomo, soldadura con plomo, etc.
(Squadrone et al, 2012; Pottier et al, 2013).
Debido a que el plomo no es biodegradable y se distribuye rápidamente,
históricamente ha sido un importante contaminante ambiental en el aire, agua y
suelos. Se ha estimado que la producción de plomo se ha incrementado de 10
a 1,000,000 toneladas por año, las cuales van acompañadas por un
crecimiento poblacional y económico (Sams et al, 2007).
1.2.1 Características Físicas y Químicas
Es un elemento abundante en la corteza terrestre, con un promedio en la
concentración entre 10 y 20 mg/kg en el suelo (Vasallo et al, 2011). Se
encuentra en el grupo 14 de la tabla periódica, tiene un peso atómico de
207.19 g/mol, posee un color gris azulado, brilloso, suave, maleable y flexible;
forma aleaciones con otros metales, especialmente con antimonio y estaño. Se
funde a 327.4° C y hierve a 1,725°C. Relativamente resistente a la corrosión,
dúctil, maleable y denso. Las valencias químicas normales son 2 y 4. El plomo
(Pb) es anfótero, ya que forma sales de plomo de los ácidos, así como sales
metálicas del ácido plúmbico; forma sales, óxidos y compuestos órgano-
metálicos. Industrialmente, sus compuestos más importantes son los óxidos de
plomo y el tetraetilo de plomo (Agency for Toxic Substance and Disease
Registry, 2005).
1.2.2 Toxicidad
La principal vía de exposición para la población general es por la ingesta de
comida y aire, mientras que la exposición ocupacional a plomo ocurre en las
plantas industriales, refinerías, manufactura de baterías, plásticos, pinturas y
esmaltado (Hou et al., 2013).
Este metal no tiene una función biológica en los seres humanos; su alta
electronegatividad interacciona con las proteínas, en particular los que tienen
sitios de unión de metales (rica en oxígeno y azufre) (Hou et al., 2013).
El plomo entra al cuerpo a través de la absorción intestinal por medio de la
ingestión; a los pulmones ingresa a través de la inhalación y en la piel por
absorción; el plomo que ha ingresado al organismo es transportado por medio
del torrente sanguíneo a todos los órganos y tejidos. Una vez que ha sido
absorbido puede acumularse en huesos, dientes, hígado, pulmón, riñón,
cerebro y bazo; asimismo, es capaz de atravesar la barrera hematoencéfalica y
placenta. Se ha sugerido que durante el embarazo y la lactancia este metal
presenta transferencia activa entre el hueso y el sistema sanguíneo
(Gwalteney et al, 2002).
La vida media del plomo en sangre tiene una vida estimada de 35 días,
mientras que en tejidos blandos es de 40 días y en hueso de 20 a 30 años
(Papanikolaou et al., 2005). Los órganos más sensibles al daño por la toxicidad
en exposiciones agudas del plomo son el sistema nervioso central en
desarrollo y maduro, sistema hematológico y cardiovascular; mientras que en
las exposiciones crónicas el plomo afecta los sistemas gastrointestinal, renal,
neuromuscular y hematopoyético (Flora et al, 2008; Agency for Toxic
Substance and Disease Registry, 2005). Los niveles de plomo en sangre
indican una exposición reciente, mientras que los niveles de plomo en hueso
indican una exposición crónica: el depósito óseo constituye el 90 a 95 % de
plomo concentrado en adultos y 80 a 95% del total en niños (Kakkar y Jaffery,
2005). Además el plomo almacenado en el hueso puede permanecer allí
durante diez años y se encuentra en activa transferencia en sangre
especialmente en el embarazo y lactancia. (Castro et al, 2013)
El Pb ejerce sus efectos a través de su unión con grupos sulfhidrilos de
proteínas, por competición con el calcio, inhibición de enzimas asociadas a
membranas y alteración en el metabolismo de la vitamina D; la calmodulina es
una proteína importante para la regulación intracelular del calcio, y su
funcionamiento es alterado por el plomo, inhibe la síntesis y por consecuencia
la actividad de la sintasa del óxido nítrico (SON) que en sus isoformas I y III
son dependientes de calcio (Toscano y Guilarte, 2005; Nava et al., 2010)
Se sabe que la exposición crónica a plomo afecta el desarrollo neuronal. Es importante destacar que un umbral más bajo para los efectos del plomo en el sistema nervioso no ha sido determinado (Pottier et al, 2013). 1.2.3 Patologías asociadas
El plomo tiene múltiples efectos hematológicos induciendo anemia, glóbulos
rojos microcitícos e hipocrómicos, deficiencia de hierro e inusual incremento en
el número de reticulocitos. La anemia resulta de dos defectos básicos:
disminución del tiempo de vida del eritrocito y daño en la síntesis del grupo
hemo (Papanikolaou et al., 2005). El plomo que tiene una alta afinidad por los
grupos sulfhidrilos, puede inactivar enzimas en especial las que están
involucradas en la síntesis del grupo hemo, tal como la inhibición de acido
aminolevulino dehidratasa (ALA-D) por medio de la competición y
desplazamiento del calcio (Flora et al., 2008).
El plomo afecta esencialmente todos los sistemas orgánicos del cuerpo,
incluyendo el hematopoyético, cardiovascular, renal y esquelético, sin
embargo, el sistema nervioso central es particularmente sensible a los efectos
de este metal (Pottier et al, 2013). El plomo se almacena principalmente en la
mitocondria produciendo daños en su metabolismo energético, induciendo la
producción de radicales libres, inhibiendo la captura del calcio mitocondrial a la
vez que favorece su liberación; este desarreglo en la actividad de la
mitocondria lleva a una apertura del poro mitocondrial con subsecuente
liberación del citocromo C y posible activación de caspasas 9 y 3 favoreciendo
la presencia de apoptosis (Flora et al., 2008).
Los efectos neurotóxicos son complejos, en los últimos años se ha reportado
que el plomo interfiere con receptores acoplados a segundos mensajeros como
la proteína cinasa C, que interfiere también con la liberación de
neurotransmisores tales como acetilcolina, dopamina, noradrenalina y GABA.
En recientes investigaciones se ha detectado que cuando los niveles de plomo
en la sangre llegan alrededor de 50 mg/L en el cuerpo de los niños, puede
afectar el crecimiento, la memoria, inteligencia, y el comportamiento, incluso
cuando no hay ninguna manifestación clínica evidente. El efecto adverso más
importante de la exposición al plomo en los niños es el deterioro de la
inteligencia, habilidades de aprendizaje y la memoria. La evidencia de varios
estudios prospectivos sugiere que los efectos adversos de la exposición del
plomo en la primera etapa de desarrollo neurológico del infante persisten en la
segunda década de la vida (Costa et al, 2004; NourEddine et al, 2005).
La contaminación por plomo ha sido relacionada con un gran número de
problemas en la salud, retraso en el crecimiento fisicomotor en los niños,
alteraciones en la audición, en el sistema nervioso periférico y central, en los
sistemas urinarios, gastrontestinales, cardiovasculares y endocrinos en
adultos. Además de ser un carcinógeno, produce daños neurológicos y
provoca alteraciones cognitivas y conductuales. Durante el embarazo se ha
mostrado que la exposición a plomo ha incrementa el riesgo de aborto, de
nacimientos prematuros y muertes prenatales y alteraciones en el peso, talla y
circunferencia de la cabeza en recién nacidos (Castro et al, 2013).
1.5 Cadmio
El cadmio es un metal pesado que se refiere a menudo como el metal del siglo
20. Es ampliamente utilizado en la industria, principalmente en la
galvanización, en la fabricación de pilas, en conductores eléctricos, en la
fabricación de aleaciones, pigmentos y plásticos y en la estabilización de los
fertilizantes de fosfato. Como un subproducto de las fundiciones, el cadmio es
un contaminante del medio ambiente. En la población general, la exposición al
cadmio se produce principalmente a través de fuentes de la dieta, el
tabaquismo y en menor grado, de agua potable (Byrne et al, 2009).
1.5.1 Características Físico Químicas
El Cadmio (Cd) es un metal que se encuentra en la corteza terrestre en
aproximadamente 0,1 partes por millón: por lo general se encuentra como
impureza en depósitos de plomo o zinc o bien como un subproducto de la
fundición de estos mismos metales (Bernhoft, 2013). Se encuentra como una
sal inorgánica (óxido de cadmio (CdO), cloruro de cadmio (CdCl2) o sulfato de
cadmio (CdSO4). Aunque este metal puede cambiar de formas químicas, el
propio ion metálico no se elimina del entorno (Zalups et al., 2003).
Es un metal que pertenece a la familia IIB, es dúctil, de color blanco con un
ligero matiz azulado. Es más blando y maleable que el zinc, pero poco más
duro que el estaño. Peso atómico de 112.40 g/mol y densidad relativa de 8.65
a 20ºC. Su punto de fusión es de 320.9ºC, de ebullición de 765ºC. Hay ocho
isótopos estables en la naturaleza y se han descrito once radioisótopos
inestables de tipo artificial. El cadmio es miembro del grupo II B (zinc, cadmio y
mercurio) en la tabla periódica, y presenta propiedades químicas intermedias
entre las del zinc metálico en soluciones ácidas de sulfato. Generalmente
existe como un catión divalente y su ion es incoloro (Bernhoft, 2013).
El cadmio no se encuentra en estado libre en la naturaleza, y la greenockita
(sulfuro de cadmio), único mineral de cadmio, no es una fuente comercial de
metal. Casi todo el que se produce es obtenido como subproducto de la
fundición y refinamiento de los minerales de zinc, los cuales por lo general
contienen de 0.2 a 0.4%. Hay estimaciones que cerca de 25.000 a 30.000
toneladas de Cd se liberan en el medio ambiente cada año, con las mayores
contribuciones provenientes de las actividades humanas (entre 4.000 y 13.000
toneladas por año), como la minería y la quema de combustibles fósiles
(Zalups et al., 2003).
1.5.2 Toxicidad.
El cadmio es un metal pesado tóxico para el medio ambiente. La deposición de
Cd en los organismos vivos es frecuentemente por ingestión e inhalación. El
hígado es el sitio principal de metabolismo y acumulación/deposición de la
exposición de Cd aguda, resultante en los tejidos hepáticos que son más
susceptibles a las lesiones hepáticas y necrosis. Mientras tanto, los riñones
son el órgano crítico después de la exposición crónica ocupacional o ambiental
al Cd. Dado que los riñones son los principales órganos diana de la toxicidad
crónica Cd, efectos cardiovasculares indirectos podrían surgir secundariamente
a una lesión renal (Kukongviriyapan et al., 2014).
La exposición humana a cadmio se produce principalmente a través de la
inhalación o ingestión. Aproximadamente del 10 al 50% del cadmio inhalado es
absorbido, dependiendo del tamaño de partícula. A través de la ingesta, cerca
del 5 al 10% de cadmio es ingerido, dependiendo del tamaño de la partícula.
La absorción intestinal es mayor en personas con deficiencia en calcio, hierro o
zinc. Después de la absorción, el cadmio es transportado por todo el cuerpo,
usualmente se une a los grupos sulfidrilos que contienen proteínas como
metalotioneinas. Cerca del 30% se deposita e hígado y 30% en riñones, el
resto se distribuye en todo el cuerpo, con una esperanza de vida de 25 años.
La vida media del cadmio ha sido estimada de 75 a 128 días.
Consecuentemente los niveles bajos de cadmio en sangre, orina y pelo reflejan
una exposición reciente (Bernhoft, 2013).
1.5.3 Patologías asociadas
Una vez absorbido el cadmio suele acumularse en varios tejidos,
principalmente en riñones e hígado, lo que puede causar efectos adversos
como disfunción renal, edema pulmonar, cáncer y enfermedades
cardiovasculares. Además, varios estudios experimentales y clínicos han
asociado al cadmio con presión arterial alta, así mismo, los informes han
puesto de manifiesto que el daño endotelial podría ser un proceso importante
para el desarrollo de la hipertensión arterial inducida por el cadmio (Almenara
et al., 2013).
1.5.4 Epidemiologia
Muchos estudios epidemiológicos han sugerido que la exposición crónica al
cadmio aumenta el riesgo de hipertensión y enfermedad cardiovascular en la
población general. Además, un gran número de estudios en animales han
demostrado que la exposición crónica a cadmio puede llevar a la elevación de
la presión arterial. Los mecanismos biológicos exactos que vinculan la
exposición al cadmio y la hipertensión no son claras, sin embargo, existen
muchas evidencias de que el efecto hipertensivo de la exposición Cd resulta de
acciones complejas tanto en el endotelio vascular y células de músculo liso
vascular. Un factor identificable que juega un papel central en la
hepatotoxicidad inducida por Cd (aguda), nefrotoxicidad (crónica) y
complicaciones cardiovasculares en los organismos, que ha sido el foco de
muchas investigaciones es la excesiva generación de especies reactivas de
oxígeno (ROS) y nitrógeno reactivo especies (RNS). La exposición crónica a
Cd no sólo ayuda a la generación de ROS / RNS, sino que también agota los
niveles de antioxidantes, dando como resultado un estado de
oxidante/desequilibrio antioxidante (Kukongviriyapan et al., 2014).
El humo de cigarrillo es considerado la más significativa exposición de cadmio
para el humano. Niveles en sangre y riñón son consistentemente más altos en
fumadores que en no fumadores. La inhalación por exposición industrial puede
ser significativa en lugares de trabajo, por ejemplo en soldaduras, el cual
puede producir neumonitis química (Bernhoft, 2013)
Los fumadores de tabaco tienen aproximadamente tres veces más contenido
de cadmio en sangre que los no fumadores (1.58 μg.L-1 para fumadores contra
0.47 μg.L-1 para no fumadores). Este contenido de cadmio se ha asociado con
un mayor riesgo de hipertensión (Almenara et al., 2013).
MAO
La actividad de la monoamina oxidasa A (MAOA) es alterada en muchos
desordenes y su baja actividad es asociado con un comportamiento agresivo.
Este gen tiene un polimorfismo funcional con un número variable de
repeticiones en tándem (VNTR) en la región regulatoria upstream (MAOA-
Uvntr).
La monoamina oxidasa (MAO), como una enzima catalítica que regula los
niveles de transmisión de la monoamina en el sistema nervioso central. La
actividad de la enzima es en parte regulada genéticamente. Los genes
codifican las formas A y B de la enzima monoamina oxidasa humana (MAOA y
MAOB) y están localizadas junto a un brazo corto del cromosoma X, entre las
bandas Xp11.23 y Xp11.4. El gen MAOA tiene varios polimorfismos comunes:
1) Un polimorfismo de un dinucleotido repetido (MAOA-CA) cerca del
exón 2.
2) Un número variable de repeticiones en tándem de 23 pares de bases
(bp) cerca del exón 1 (MAOA-VNTR).
3) 2 fragmentos de restricción funcionales lenght de polimorfismo.
4) 30 pb funcionales del polimorfismo VNTR (MAOA u VNTR).
Se ha reportado que el polimorfismo funcional en la región promotora del gen
MAOA, el cual consiste de repeticiones de 30 bp con 3, 3.5, 4 y 5 copias. Alelos
con 3.5 o 4 repeticiones transcriben de 2 a 10 veces más eficientemente en líneas
celulares humanas comparadas con alelos con 3 o 5 copias de repetición. Los
alelos con 5 repeticiones fueron asociados con una alta actividad transcripcional.
Sin embargo, las variantes con 3 o 4 copias son más comunes en diferentes etnias
de la población.
El gen no promotor del polimorfismo MAOA ha sido implicado en muchos
desordenes, agresión y suicidio. Algunos estudios han encontrado que los
polimorfismos MAOA CA y VNTR fueron asociados con desordenes de bipolaridad
afectivos.
Estudios de MAOA-uVNTR observaron que hombres con baja expresión den las
variantes de este polimorfismo marcan significativamente una baja en una
composite measure de agresiones e impulsibilidad y muestra una respuesta
serotonergica mas pronunciada comparada con hombres con una alta expresión
de variantes. Individuos quienes poseen el genotipo MAOA-uVNTR confieren una
alta expresión de MAOA, y quienes reportan una historia de abuso en la niñez
(edades de 3-11 años) han sido encontrados con un menor manifiesto de
psicopatología antisocial. Alta actividad de MAOA reduce los efectos de
vulnerabilidad a los efectos de experiencias abusivas en la niñez en el
comportamiento adulto. En adición, la baja expresión de variantes de este
polimorfismo ha sido asociado con un comportamiento antisocial en pacientes
varones dependientes al alcohol.
Estudios con animales han implicado al MAOA en comportamientos agresivos. La
agresión se ha intensificado en el ratón Knockout y en la inhibición de MAO
durante el desarrollo inducido de la agresión patológica en ratón. Una sola familia
de extenso pedigree en Holanda encontró una mutación en el gen MAOA que
resulta en una pérdida de la actividad enzimática asociado con la impulsivilidad,
agresión y retardo mental en varones. Más recientemente, una alta expresión de
de alelos de este polimorfismo fueron reportados siendo asociados con una alta
impulsivilidad y el desorden de déficit de atención e hiperactividad (ADHD).
Se ha encontrado una alta actividad de MAOA en el hipotálamo de individuos que
se han suicidado con una historia de depresión, pero no se han observado
diferencias en la actividad de la corteza frontal o corteza cingulante.
El polimorfismo MAOA-uVNTR ha sido asociado con attemps suicidio en pacientes
bipolares, particularmente en pacientes mujeres con bipolaridad y con suicidio en
hombres con depresión.
Un polimorfismo funcional en la región regulatoria del gen monoamina oxidasa A (monoamina
oxidasa A untranlsates: sobretrasladada nucleótidos repetidos en tándem, MAOA-U vntr) puede
moderar el degree de riesgo conferido por un trauma temprano. Factores de experiencia pueden
mitigar o exacerbar los efectos de trauma en individuos con riesgo genético.
Factores genéticos pueden jugar una rol moderado en conferir riesgos por un
estrés temprano.
En particular, la baja expresión de alelos de la monoamina oxidasa A (MAOA)
unida al cromosoma X sobre traslada un número variable de repeticiones en
tándem de nucleótidos (MAO-uVNTR) upstream promotor del polimorfismo
asociado con la reducción de la transcripción del gen MAOA. Este alelo ha sido
asociado con una reducción en la transcripción del gen MAOA. Este alelo es
asociado con una alta propensity para desarrollar conductas antisociales e
impulsibilidad en hombres quienes han tenido experiencias tempranas al estrés.
Los genes por efecto del medio ambiente pueden extender a desordenes
mentales, incluyendo un desorden en la conducta, desregularización en
emociones y agresividad.
Los genes interaccionan con el medio ambiente involucrando la baja expresión de
los alelos MAOA-uVNTR se han replicada en la presencia de varios tipos de niños
estresados. Estos tienen típicamente 2 estrategias para definir la adversidad
temprana. En contraste, la experiencia de un estrés temprano en el contexto de
una familia o medio ambiente social positivo puede ser asociado con un bajo
riesgo de outcomes adversosn en la salud mental. El impacto de factores
protectivos puede may vary as una variación genética de la función, paralelo a
reportes tempranos de sensitividad diferencial a experiencias negativas.
La Catecol-O-metiltransferasa (COMT) es una enzima que metaboliza las
catecolaminas como la dopamina, noradrenalina y adrenalina.
2. Justificación.
Una oportuna detección de psicopatologías en niños mexicanos a través de factores
genéticos y ambientales son importantes no solo en ámbito educativo, sino también en el
área forense para la prevención de conductas delictivas y evaluando el nivel de
agresividad e impulsos que puedan llegar a desarrollar los niños.
Por tanto, si se quieren implementar medidas funcionales de prevención de trastornos
neuro-psiquiátricos en general y de conductas delictivas en particular, deben de iniciarse
con un diagnóstico integral del problema, con un equipo multidisciplinario y determinar la
participación de factores ya predispuestos como el material genético y la presencia de
tóxicos ambientales.
2. Objetivos.
2.1. Objetivo general.
Caracterizar los problemas de conducta en un grupo piloto de niños escolares de primaria
en la ciudad de Veracruz y determinar la asociación con factores ambientales tóxicos (Pb
y Cd).
2.2. Objetivos específicos.
1. Determinar en la muestra estudiada, la prevalencia de tres desórdenes, el TDAH,
el TND y el TD que cursan o pueden estar asociados, anteceder o escalar a
conductas inadecuadas e incluso delictivas.
2. En los casos diagnosticados con estos 3 problemas, y en el grupo control
determinar los niveles de plomo (Pb) y cadmio (Cd) en sangre y cabellos y realizar
una biometría hemática completa y una química sanguínea básica.
3. Determinar si existe relación entre los trastornos de conducta y las
concentraciones de Pb y Cd en sangre y pelo.
3. Metodología.
3.1. Tipo de estudio.
Dado que se cuenta con tres objetivos, la primera fase comprende un estudio de
prevalencia. En la segunda fase se buscará la relación de los factores biométricos
mediante un estudio de caso-control.
3.2. Selección del grupo piloto y de la muestra.
Se trata de un estudio transversal, comparativo, de asociación, de casos y controles. En
la ciudad de Veracruz existen 284 primarias con un total de 60776 alumnos de todos los
grados. Las diferentes primarias se ubicarán de acuerdo a su localización física dentro del
área de Veracruz. Se realizará en este mapa la división de cuadrantes 3x3 (n=9), con el
siguiente diseño: A B C/ D E F/ G H I. Con la división del área metropolitana, se
determinarán que escuelas corresponden a cada cuadrante y se enumerarán en forma
seriada. Con el programa MINITAB se seleccionará una escuela por cuadrante en forma
aleatoria.
Norte
Oeste
A B C
Este D E F
G H I
Sur
De las escuelas seleccionadas se seleccionará aleatoriamente una escuela que
constituirá el grupo piloto. En esta escuela se invitará a participar a todos los niños
inscritos de I a VI grado. Los niños y sus padres o tutores que acepten participar y firmen
una carta de consentimiento informado serán los componentes de la muestra. Los niños
que presenten trastornos de conducta constituirán el grupo problema y los niños sin estos
problemas, el grupo control.
3.3. Trabajo de campo.
El trabajo de campo incluye las entrevistas con el directivo de la escuela seleccionada y
con sus maestros. Sesiones de encuadre con presentación del panorama de la
investigación y sus alcances, al menos una sesión con los maestros para sensibilizar
acerca de la problemática a tratar y exponer los criterios diagnósticos. Sesiones de
sensibilización con los padres de familia y solicitud de su participación voluntaria. Con los
padres y/o tutores que acepten participar se procederá a firmar la carta de consentimiento
informado y a realizar las entrevistas correspondientes y las tomas de muestras
respectivas.
3.3.1. Pruebas psicológicas de investigación de trastornos de conducta.
Se aplicará un cuestionario de filtro inicial grueso a los maestros para identificar los niños
con problema de conducta. A todos los niños participantes se les aplicará el cuestionario
de conducta de Conners para padres y maestros. Posteriormente, con los alumnos
participantes se realizará entrevista clínica psiquiátrica y entrevista diagnóstica (12). Se
aplicará a cada niño en presencia de sus padres la entrevista estructurada para niños y
adolescentes M.I.N.I.KID (MINI INTERNATIONAL NEUROPSYCHIATRIC INTERVIEW).
En esa entrevista se obtendrá también la muestra de pelo. Si se detecta algún trastorno
de conducta o psicológico en general, se canalizarán estos niños y sus padres a una
consulta especializada para confirmación del diagnóstico y orientación terapéutica sin
costo para los participantes.
3.4. Pruebas de laboratorio.
3.4.1. Química sanguínea y biometría hemática.
Se realizará biometría hemática y química sanguínea de los casos y controles como
parámetros para evaluar la presencia de anemia o alteraciones en urea y creatinina en
relación a toxicidad.
Los niños y sus padres acudirán previa cita, al laboratorio de Bioanálisis de la Universidad
Veracruzana para la extracción de la muestra de sangre (10 ml).
En el laboratorio de bioanálisis se realizarán las pruebas de biometría hemática (BH) y
química sanguínea (QS) y se expedirá un reporte oficial con los resultados obtenidos.
Dichos resultados se comunicarán a los padres en el reporte final. Se determinarán
hemoglobina, hematocrito, número de eritrocitos, concentración media de hemoglobina
corpuscular, volumen globular medio. Se utilizará un analizador hematológico
automatizado Mindray BC 2300. Para la QS se determinará glucosa, urea y creatinina. Se
utilizará un sistema de análisis químico- clínico automatizado DyaSis, Holzheim,
Alemania.
3.4.2. Determinación de niveles de Pb y Cd.
Para la determinación de los metales pesados se utilizará sangre total con EDTA
(exposición aguda/reciente) y pelo (exposición crónica). La medición de estos metales se
realizará por absorción atómica mediante espectrofotometría de flama en un equipo
Thermo Cientific Modelo Ice 3500 AA System (Thermo Cientific®, China), conforme a las
especificaciones de la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-117-SSA1-1994.
En pelo.
Se tomarán muestras de cabello de la nuca (10 cabellos,1 g), lo más cerca posible del
cuero cabelludo en la línea de crecimiento del pelo, con al menos 10-30 mm de
crecimiento total que representan pelos con un crecimiento entre 30-60 días. La muestra
se guarda en viales libres de Cd hasta su procesamiento. Por cada cabello, 1 cm se lava
con 10 ml de hexano, alcohol y agua desionizada. La muestra se seca, se incinera con
ácido nítrico concentrado. El residuo se diluye con agua desionizada previamente al
análisis del metal, con espectrofotómetro de absorción atómica, conforme a las
especificaciones de la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-117-SSA1-1994.
En sangre.
Para la determinación de los metales pesados se utilizará sangre total con anticoagulante
EDTA. La medición de estos metales se realizará conforme a las especificaciones de la
NOM-199-SSA1-2000 (Pb) y NOM-117-SSA1-1994 (Pb y Cd). Se utilizarán los valores de
corte para la concentración de Pb y Cd de acuerdo a la NOM-199-SSA1-2000 y los
criterios de la OMS.
3.4.3. Análisis genético
Extracción de ADN genómico.
Se obtendrá ADN mediante el uso del kit de Promega Wizard® Genomic DNA purification
Kit.
1. Se trabajará con una muestra de 5ml de sangre periférica con anticoagulante
EDTA, el cual será agitado cautelosamente (invertirlo en su totalidad) durante 2-3
minutos aproximadamente.
2. Posteriormente se centrifugará a una velocidad de 2,000 rpm durante 10 minutos
mediante un equipo de marca Eppendorf modelo 5810 R.
3. Una vez que se han separado las dos fases de la sangre (suero y sangre) entre
estas dos se encontrará una fina capa blanca, la cual corresponde a los linfocitos
de la muestra.
4. Con una pipeta de transferencia se retirarán los linfocitos de la muestra (tratando
de evitar tomar sangre y suero) y se colocarán en un tubo de plástico de 1.5 ml.
5. Se agregará solución de lisis celular hasta alcanzar un volumen final de 1.5 ml.
6. La muestra se llevará a vortex para que se mezcle totalmente con la solución de
lisis celular, posteriormente se llevará a centrifugar mediante un equipo Eppendorf
Centrifuge 5415 C durante 20 segundos a 14,000 rpm.
7. Se observará un botón celular de color blanquecino y se removerá y desechará el
sobrenadante teniendo un especial cuidado en no perder el botón celular el cual
será visible.
8. Para limpiar las impurezas que puedan quedar en la muestra se repetirá de 1 a 2
veces más los pasos 5 a 7. El botón celular de preferencia debe quedar de un
color blanco
9. Se agregarán 400 μl de solución de precipitación de proteínas y se llevará a vortex
vigorosamente durante 20 segundos.
10. Posteriormente se llevara a centrifugar durante 3 minutos a 14,000 rpm.
11. La muestra se incubará durante una hora a 37° C, durante este periodo los grumos
que hay en la muestra se deberán disolver, si no es así, se dejará la muestra a
temperatura ambiente durante 1 día, en este periodo la muestra debe de
disolverse por completo.
3.5 Cuantificación de ADN
Para determinar la concentración de ADN de las muestras se utilizo el espectofotometro
de la marca Thermo Scientific modelo Nanodrop 2000. A través de este equipo la muestra
fue estandarizada a 500ng/ml.
3.6 Análisis de los polimorfismos.
MAOA/uVNTR
Primers: MAO-A F: ACA GCC TGA CCG TGG AGA AG
MAO-A R: GAA CGG ACG ACG CTC CAT TCG GA
Mediante la reacción en cadena de la polimerasa en punto se llevo a cabo la
ampliación del polimorfismo MAO-A/uVNTR. El volumen final de la reacción fue de
11.5 μl el cual contenía: 1.25 μl de buffer, 1.25 de dNTPs, 8.7 μl de agua para
PCR, 1.75 μl de cada primer, Dream Taq polimerasa 5 U/ μl (Thermo Scientific) y
100 ng de DNA genómico.
Se programo un método de desnaturalización de 95°C durante 10 minutos,
seguido de 35 ciclos de amplificación (95oC por 1 minuto, 62°C por 1 minuto, 72oC
por 1 minuto) con un tiempo de extensión final de 4 minutos a 72oC.
5HTT LPR
Primers: 5 HTT F: ATG CCA GCA CCT AAC CCC TAA TGT
5 HTT R: GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC
Mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en punto, se llevo a cabo la
amplificación del polimorfismo 5-HTTLPR en un volumen de reacción de 11.5 µl
conteniendo 6.250 μl de enzima Kapa HiFi (Kapa Biosystem), 1.25 μl de DMS, 3.375 µl
de agua para PCR, 0.375 µl de primer sentido, 0.375 µl anti-sentido y 150ng/ml de DNA.
El método de la PCR consiste de un paso inicial de desnaturalización de 5 minutos a
95°C, seguido por ___ ciclos constituidos por 20 segundos a 98°C, 15 segundos a 65°C y
15 segundos a 72°C con un paso final de 5 min. A 72°C.
3.6 Genotipicación.
3 l del producto amplificado es mezclado con 2 l de colorante de electroforesis y
cargado en un gel de agarosa al 2.5% (Agarosa I™ de la marca Biotechnology Grade al
1% y Agarosa MetaPhor™ de la marca Lonza al 1%) en TBE 1X a 110 volts y teñido con
bromurio de etidio para visualizarse a través de un equipo transiluminador UV modelo
M20 de 20x20cm.
COMT/rs4680 (ensayo C_25746809_50)
La genotipificación de la región se realizará mediante el método de discriminación alélica
con sondas TaqMan. El volumen final de la reacción será de 7 ul y contendrá las
siguientes condiciones de reacción: 100 ng/ml de DNA, 2.5 μL de TaqMan Master Mix (de
Applied Biosystem), 0.125 μL de 20x de las sondas “Assay made to order” y 2.367 μL de
agua para PCR. La amplificación será llevada a cabo con el equipo 7500 real time PCR
system with SDS v2.1 software (Applied Biosystems). El análisis de discriminación alélica
será realizará a través de la identificación estandarizada de cada uno de los genotipos
para cada región analizada.
3.7. Análisis estadísticos.
Para ver si existe similitud en la prevalencia en la muestra de los tres trastornos de forma
independiente y conjunta, se utilizará estadística descriptiva para evaluar porcentajes y
posteriormente realizar Tablas de Contingencia (X2)
Para los valores de Pb y Cd se realizarán dos pruebas de ANOVA Multifactorial. Las
determinaciones se harían: Factor A (casos y controles), Factor B (Sexo) y Factor C
(grado escolar).
SOFTWARE libre HWE.exe CALCULAR equilibrio de poblaciones
Equilibrio Hardy Weinberg
COMT X2=0.51 1 gl p=0.471
5HTT X2=0.72 1 gl p=0.395
MAO-AuVNTR X2=1.10 1 gl p=0.294
Frecuencias
El gen de Catecol-O-metiltransferasa (COMT) se encuentra localizado en el
cromosoma 22 (22q11), se ha reportado que este gen COMT, sufre un
polimorfismo funcional también conocido como Val158Met o rs4680, en donde hay
una sustitución de una Valina (Val) por una Metionina (Met) en la posición 158 del
aminoácido, el cual resulta en la reducción de la actividad de la enzima COMT.
X2 =0.30 2gl p=0.860 genotipos
X2 =0.08 1gl p=0.772 alelos
El gen de la monoamina oxidasa (MAO) se encuentra ubicado en el cromosoma X
(Xp11.23) entre las bandas Xp11.23 y Xp11.4 y cuenta con 15 exones con idéntica
organización intrón-exón. Se ha determinado que este gen sufre un polimorfismo
funcional del tipo VNTR (número variable de repeticiones en tándem) localizado
en la región promotora del gen de la MAO-A (MAO-A-uVNTR) y caracterizado por
una repetición de la secuencia de 30 pares de bases que impacta en la eficiencia
de la transcripción del gen.
Frecuencia alelica
2 3 4
1(0.013) 25(0.38) 48(0.65)
El gen del transportador de serotonina está localizado en el cromosoma 17, el cual sufre
un polimorfismo funcional (5-HTTLPR). Inicialmente una variante corta (alelo S) del
polimorfismo fue encontrado y tuvo una baja eficiencia transcripcional y una menor expresión en
COMT (rs4680) GENOTIPOS ALELOS
G/G G/A A/A G A
GRUPO 1 (42) 12 (0.285) 23 (0.547) 7 (0.166) 47 (0.56) 37(0.44)
Control Torilla 72 (0.32) 112(0.51) 38(0.17) 256 (.58) 188 (0.42)
Genotipo de MAOAuVNTR
3 4 23 33 34
GRUPO 1 (42) 3 (0.071) 7 (0.166) 1 (0.023) 7 (0.166) 7 (0.166)
el transportadorEn este caso, hay un cambio en el código del ADN de A por una G.
5HTTLPR
LL SS SL S L
GRUPO 1 (41) 11 (0.26) 7 (0.166) 22 (0.52) 37(0.45) 45 (0.55)
Camarena et al 74 (0.22) 101 (0.30) 162(0.48) 364 (0.54) 310 (0.46)
4. Cronograma.
Actividad Enero-
Marzo
Abril- Junio Julio-
Septiembre
Octubre-
Diciembre
Gestiones SEP, y escuelas
participantes.
Impresión de material para
encuestas y escalas de
evaluación
Ya
realizadas
Ya
realizadas
Implementación de estudio Ya
realizadas
Trabajo de campo con niños,
padres y maestros
Ya
realizadas
Ya
realizadas
Implementación y optimización
de las técnicas de laboratorio
Ya
realizadas
Recolección de muestras Ya
realizadas
Ya
realizadas
Procesamiento de muestras Ya
realizadas
Ya
realizadas
Ya
realizadas
Concentración y análisis de
resultados
x X
Publicación de resultados X