Universidad de Crdoba, comprometida con el desarrollo regional.

TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE

JUAN JOS RODRIGUEZ DIAZDIEGO LOBO GONZALEZCRISTIAN MORENO CAMAOMARIA JOSE PATERNINA PICOMARIA PAZ VARGAS

UNIVERSIDAD DE CORDOBAFACULTAD DE CIENCIAS BSICASPROGRAMA BIOLOGIAMONTERA CORDOBA2015

1. Que es la tecnologa del DNA recombinante y la ingeniera gentica?

DNA Recombinante:Esta tecnologa nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevar adems elgen o los genesque se desee. Este ADN puede incorporarse a las clulas de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podr "expresar" la informacin de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricacin de insulina, lo que haramos al ponrselo a una bacteria es "obligar" a sta a que fabrique la insulina.En la naturaleza, la recombinacin gentica normalmente tiene lugar entre dos molculas de DNA derivadas de organismos de la misma especie. En animales y plantas, por ejemplo, los dos padres de un individuo son las fuentes originales del DNA que se recombina durante la meiosis. Una molcula de DNA recombinante que surge de forma natural difiere de las molculas de DNA parental slo en la combinacin de alelos que contiene; la identidad fundamental y la secuencia de sus genes se mantienen igual.Una caracterstica clave de la tecnologa del DNA recombinante es la capacidad de replicar o clonar fragmentos especficos de DNA con el propsito de preparar grandes cantidades para investigacin y para otros usos. El clonaje va acompaado del corte y empalme del DNA de inters y el empalme al DNA del elemento gentico, llamado vector de clonaje, que se puede replicar de forma autnoma cuando se introduce en una clula que crece en cultivo en la mayora de los casos, una bacteria como E. Coli. El vector de clonaje puede ser un plsmido o el DNA de un virus, normalmente un bacterifago. En cualquier caso, el DNA pasajero del vector se copia cada vez que se replica ste. De esta forma, es posible generar grandes cantidades de genes especficos u otros segmentos de DNA y tambin sus productos proteicos, si los genes pasajeros se transcriben y se traducen en clulas en proliferacin que portan el vector.La mayora de lo que denominamos tecnologa del DNA recombinante ha sido posible por el descubrimiento de las enzimas de restriccin. La capacidad de las enzimas de restriccin para cortar molculas de DNA en secuencias especficas, denominadas sitios de restriccin las convierte en poderosas herramientas para cortar grandes molculas de DNA en fragmentos ms pequeos que se pueden recombinar de formas diferentes. Las enzimas de restriccin que hacen cortes escalonados en el DNA son especialmente tiles, puesto que generan extremos adhesivos de cadena sencilla (tambin llamados extremos cohesivos) que permiten unir, de manera sencilla, fragmentos de DNA obtenidos de diferentes fuentes. INGENIERA GENTICA:Ingeniera gentica, que implica la aplicacin de la tecnologa de DNA recombinante a problemas prcticos principalmente en medicina y agricultura, es una tcnica que consiste en laintroduccin de genesen el genoma de un individuo que carece de ellos.Se realiza a travs de lasenzimas de restriccinque son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denominaADN recombinanteal que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extrao un un ADN receptor. Por ejemplo, la integracin de un ADN vrico en un ADN celular.La ingeniera gentica incluye un conjunto de tcnicas biotecnolgicas, entre las que destacan: la tecnologa del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro. La secuenciacin del ADN: Tcnica que permite saber el orden o secuencia de los nucletidos que forman parte de un gen. la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el nmero de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mnima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio. las aplicaciones de la ingeniera gentica: Son numerosas las aplicaciones prcticas y comerciales de la ingeniera gentica.Se abre un campo que ofrece adems la posibilidad de utilizarplantas y animales transgnicos as como microorganismos modificados genticamentepara producir frmacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: lainsulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, laobtencin de nuevas vacunaso laclonacin de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podra provocar en el ser humano y en el propio planeta.

2. Explique el origen, la nomenclatura y la aplicacin de las enzimas de restriccin.

Las enzimas de restriccin son protenas cuya funcin es cortar las hebras de ADN. Se podra decir que son tijeras moleculares que cortan ADN. Lo hacen en forma especfica. Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir que reconoce una secuencia particular de nucletidos. Esa secuencia especfica para cada enzima se denomina sitio de restriccin. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se posiciona sobre la molcula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia.Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en:Enzimas que generan extremos romos (parejos)

Enzimas que generan extremos cohesivos (desparejos). Estos extremos colgantes de simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena simple que tengan la secuencia complementaria. Las enzimas encargadas de unir los extremos de ambas cadenas se denominanligasas.

Las enzimas de restriccin reconocen secuencias de 4, 6 o ms bases y cortan generando extremos romos o extremos cohesivos.Los extremos, generados en diferentes molculas de ADN, pueden sellarse con la enzima ADN ligasa y generar as una molcula de ADN nueva, denominada recombinante

ORIGEN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN:

Estas enzimas fueron descubiertas en la dcada del 70 y hasta la fecha existen ms de 250 enzimas de restriccin. Se cree que la funcin natural de estas enzimas en las bacterias es protegerlas contra ADN de virus que podran ingresar en sus clulas. De esta manera, la bacteria utiliza estas tijeras moleculares para cortar en pedacitos el ADN viral que la infecta. El ADN propio de la bacteria no se corta, pues lo tiene protegido contra sus propias enzimas de restriccin.

La enzima de restriccin trmino se origin a partir de los estudios de fago y el fenmeno de restriccin por el hospedante-controlado y la modificacin de un virus bacteriano. El fenmeno fue identificado por primera vez en el trabajo realizado en los laboratorios de Salvador Luria Bertani y Giuseppe en principios de 1950. Se encontr que un bacterifago que puede crecer bien en una cepa de Escherichia coli, por ejemplo E. coli C, cuando se cultiva en otra cepa, por ejemplo E. coli K, sus rendimientos pueden caer significativamente, por tanto como 3-5 rdenes de magnitud. La clula de E. coli K anfitrin, conocido como el anfitrin restringir, parece tener la capacidad de reducir la actividad biolgica del fago?. Si un fago establecerse en una cepa, la capacidad de que los fagos a crecer tambin se restringen en otras cepas. En la dcada de 1960, se demostr en el trabajo realizado en los laboratorios de Werner Arber y Matthew Meselson que la restriccin es causada por una escisin enzimtica del ADN del fago, y por lo tanto la enzima implicada se denomina una enzima de restriccin.Las enzimas de restriccin estudiadas por Arber y Meselson eran de tipo I enzimas de restriccin que escinden el ADN al azar de distancia del sitio de reconocimiento. En 1970, Hamilton O. Smith, Thomas Kelly y Kent Welcox aislaron y caracterizaron la primera enzima de restriccin de tipo II, HindII, desde la bacteria Haemophilus influenzae. Este tipo de enzimas de restriccin es ms til para uso en laboratorio, ya que escinden el ADN en el sitio de su secuencia de reconocimiento. Ms tarde se demostr por Daniel Nathans y Kathleen Danna que la escisin del ADN del virus de simio 40 por enzimas de restriccin produjo fragmentos especficos que se pueden separar usando electroforesis en gel de poliacrilamida, lo que demuestra que las enzimas de restriccin se pueden utilizar para la cartografa del ADN. Por su trabajo en el descubrimiento y caracterizacin de enzimas de restriccin, el Premio Nobel 1978 de Fisiologa o Medicina fue otorgado a Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton O. Smith. Su descubrimiento condujo al desarrollo de la tecnologa de ADN recombinante que permite, por ejemplo, la produccin a gran escala de la insulina humana para los diabticos utilizando bacterias E. coli.

NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN:

Las enzimas de restriccin, conocidas tambin como endonucleasas, slo cortan el ADN si reconocen en su interior una secuencia especfica de nucletidos. Estas enzimas fueron descubiertas en microorganismos. De hecho, se encuentran slo en organismos procariotas (bacterias). Por esto, se les dio una nomenclatura asociada al organismo de donde provienen. Por ejemplo, las enzimas de restriccin que se descubrieron en la bacteria Escherichia coli se denominan Eco. Existen diferentes tipos de enzimas Eco que se diferencian en la secuencia que reconocen y cortan. Para diferenciarlas se les agregan letras y nmeros romanos, por ejemplo: Eco RI (Eco erre uno). As, el sitio de restriccin para EcoRI es la secuencia GAATTC.. Una vez que la enzima encontr ese sitio en el ADN, se acerca a la hebra de ADN y realiza el corte entre la G y la A. Al investigar otras especies de bacterias se descubrieron cientos de enzimas de restriccin distintas y cada una reconoce una regin especfica.

Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extradas, su nombre est dado segn el gnero y la especie de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima.La primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.Ej:Eco RIE = gnero Escherichiaco = especie coliR = cepa RV 13I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

APLICACIONES DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN:

Las enzimas de restriccin tienen diferentes aplicaciones que son de gran importancia en investigaciones en biologa molecular y en las tcnicas que emplea la biotecnologa moderna:1.Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago. El ADN se corta con varias enzimas de restriccin, solas y en parejas, para determinar el nmero de sitios de corte y sus posiciones relativas en la molcula, el orden y la distancia entre ellos.2.Fragmentar ADN para separacin por electroforesis. Los fragmentos obtenidos despus de la actuacin de las distintas enzimas de restriccin, se pueden separar por tamaos mediante la tcnica de electroforesis y as estudiar los distintos fragmentos. Por ejemplo: para la tcnica de Southern blotting o en las usadas para identificar polimorfismos de ADN en distintos individuos 3. Generacin de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear ADN recombinante. Se puede cortar una molcula de ADN con una enzima y, con el mismo tipo de enzima, cortar el fragmento de ADN de inters para clonar. Se unen con ligasas estas dos molculas de ADN, generando as una molcula de ADN Recombinante. Este vector recombinante puede usarse para transformar clulas que expresen el gen de inters clonado (si se us un vector de expresin con el promotor adecuado) o puede usarse simplemente para tener clonado (guardado) ese fragmento de ADN de inters. Por ejemplo: para los proyectos de secuenciacin de genomas.4. Generacin de fragmentos para ser usadoscomo sondas marcadas en Southerny Northern blotting.

3. Explique los tipos y aplicaciones de los vectores de clonacin.

Un vector de clonacin es una pequea pieza de ADN, tomada de un virus, un plsmido, o la clula de un organismo superior, que puede ser mantenido de manera estable en un organismo, y en el que se puede insertar un fragmento de ADN extrao para fines de clonacin.Hay muchos tipos de vectores de clonacin, pero los ms comnmente utilizados son plsmidos de ingeniera gentica. La clonacin se realiza generalmente en primer lugar utilizando Escherichia coli, y los vectores de clonacin en E. coli incluyen plsmidos, bacterifagos, csmidos, y cromosomas artificiales bacterianos. Algunos ADN sin embargo no se puede mantener de forma estable en E. coli, por ejemplo, fragmento de ADN muy grande, y otros organismos tales como levaduras se pueden usar. Vector de clonacin en levaduras incluyen los cromosomas artificiales de levadura.TIPOS DE VECTORES DE CLONACINUn gran nmero de vectores de clonacin estn disponibles, y la eleccin del vector puede depender de un nmero de factores, tales como el tamao de la insercin, el nmero de copias y el mtodo de clonacin. Inserto grande no puede ser mantenida de forma estable en un vector general de clonacin, especialmente para aquellos con un alto nmero de copias, por lo tanto, la clonacin de fragmentos grandes pueden requerir vector de clonacin ms especializado.PlsmidoLos plsmidos son los vectores de clonacin estndar y los ms comnmente utilizados. Plsmidos ms generales se pueden utilizar para clonar inserto de ADN de hasta 15 kb de tamao. Uno de los primeros vectores de clonacin utilizados es el plsmido pBR322. Otros vectores de clonacin incluyen la serie de plsmidos pUC, y un gran nmero de diferentes vectores plasmdicos de clonacin estn disponibles. Muchos plsmidos tienen alto nmero de copias, por ejemplo, pUC19, que tiene un nmero de copias de 500-700 copias por clula, y alto nmero de copias es til, ya que produce un mayor rendimiento de plsmido recombinante para su posterior manipulacin. Sin embargo plsmidos de nmero de copia bajo pueden ser utilizados preferentemente en ciertas circunstancias, por ejemplo, cuando la protena a partir del gen clonado es txico para las clulas.Algunos plsmidos contienen un bacterifago M13 origen de la replicacin y pueden ser utilizados para generar ADN de una sola hebra. Estos se llaman fagmido, y ejemplos son la serie de vectores de clonacin pBluescript.BacterifagoLos bacterifagos son utilizados para la clonacin del fago? y el fago M13. Hay un lmite superior en la cantidad de ADN que puede ser empaquetado en un fago, por lo tanto, para permitir ADN extrao que se inserta en el ADN de fago, los vectores de clonacin de fago necesita tener algunos genes no esenciales eliminan, por ejemplo, los genes para la lisogenia en fago? Hay dos tipos de? vectores de fago - vector de insercin y vector de reemplazamiento. Vectores de insercin contienen un sitio de escisin nico mediante el cual se puede insertar ADN extrao con el tamao de 5-11 kb. En vectores de reemplazo, los sitios de escisin flanquean una regin que contiene los genes no esenciales para el ciclo ltico, y de esta regin puede ser suprimido y reemplazado por el inserto de ADN en el proceso de clonacin, y un ADN de mayor tamao de 8-24 kb puede ser insertado.Tambin hay un lmite de tamao inferior de ADN que puede ser empaquetado en un fago, y vectores que son demasiado pequeos no puede ser empaquetado correctamente en el fago. Esta propiedad se puede utilizar para la seleccin - vector sin inserto puede ser demasiado pequea, por lo tanto, slo con vectores de inserto pueden ser seleccionados para la propagacin.CsmidoLos csmidos son plsmidos que incorporan un segmento de bacterifago? ADN que tiene el sitio de extremo cohesivo que contiene los elementos necesarios para envases de ADN en? partculas. Normalmente se utiliza para clonar grandes fragmentos de ADN entre 28-45 Kb.Cromosoma artificial bacterianoInserte tamao de hasta 350 kb puede clonarse en el cromosoma artificial bacteriano. BAC se mantienen en E. coli con un nmero de copias de slo 1 por clula. BACS se basan en el plsmido F, otro cromosoma artificial llamado el PAC se basa en el fago P1.Cromosoma artificial de levaduraInserte de hasta 3,000 kb se puede llevar por el cromosoma artificial de levadura.Cromosoma artificial humanoCromosoma artificial humano puede ser potencialmente til como vectores de transferencia gnica para la entrega de genes en las clulas humanas, y una herramienta para estudios de expresin y la determinacin de la funcin cromosoma humano. Se puede llevar fragmento de ADN muy grande, por lo tanto, no tiene el problema de la capacidad de clonacin limitado de otros vectores, y tambin evita la posible mutagnesis de insercin causado por la integracin en los cromosomas de acogida por el vector viral.

4. Qu es la transformacin molecular?

Se denomina transformacin al proceso mediante el cual se introduce un vector de clonacin a una bacteria. En biologa molecular, transformacin es la alteracin gentica de una bacteria resultante de la absorcin directa, incorporacin y expresin del material gentico exgeno (ADN exgeno). El ADN exgeno se encuentra en el ambiente y se introduce a travs de la membrana de la clula bacteriana. La transformacin ocurre de forma natural en algunas especies de bacterias, aunque tambin se puede efectuar por medios artificiales. Para que ocurra la transformacin, la bacteria debe estar en un estado de competencia, lo que puede ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a las condiciones ambientales, tales como la falta de nutrientes y una densidad celular elevada. La transformacin es uno de los tres procesos por los que el material gentico exgeno se puede introducir en una clula bacteriana. Los otros dos son la conjugacin y la transduccin. A la transformacin de clulas eucariotas se le llama transfeccin.El trmino transformacin es tambin usado, de manera ms general, para describir mecanismos de transferencia de ADN o ARN en biologa molecular (es decir, teniendo en cuenta ms que las consecuencias genticas)El fenmeno conocido como transformacin bacteriana es de vital importancia en biologa molecular. Por este proceso es posible la introduccin de plsmidos (pequeas molculas de ADN circular) fabricados o naturales dentro de la bacteria. La segunda etapa es la propagacin, expresin gentica y aislamiento del ADN de los plsmidos.

5. Que es un plsmido y porque es tan importante en las tcnicas moleculares?Los plsmidos son fragmentos extracromosmico de cidos nucleicos (ADN o ARN) que aparecen en el citoplasma de algunos procariotas. Son de tamao variable aunque menor que el cromosoma principal. Cada bacteria puede tener uno o varios a la vez. Los plsmidos tienen una conformacin variable que puede ser lineal, circular o con estructura super enrrollada. El control de la replicacin del plsmido depende del tipo de plsmido, existiendo plsmidos cuya replicacin est acoplada con la replicacin del cromosoma bacteriano y plsmidos cuya replicacin no est relacionada con la del cromosoma.Los plsmidos son herramientas muy tiles en ingeniera gentica para la transformacin gnica y la manipulacin gentica de procariotas y eucariotas. Los plsmidos empleados en ingeniera gentica se llaman vectores. Son muy tiles para sintetizar en grandes cantidades protenas de inters, como la insulina o los antibiticos, mediante un procedimiento conocido como transformacin.

6. Explique la tcnica de clonacin de genes.

Por definicin, la clonacin es el procedimiento de obtener una poblacin de varios individuos genticamente homogneos a partir de uno solo mediante reproduccin asexuada.La tcnica de clonacin de genes consiste en la obtencin de un gran nmero de fragmentos idnticos a partir de uno original. Para ello se asla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plsmidos, fagos, csmidos etc...) que tras introducirlo dentro de una clula va a permitir su replicacin por cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran nmero de copias del fragmento de inters.

7. Que es una genoteca y cules son los tipos?GENOTECA: Es una coleccin de clones cada uno d los cuales contiene un vector al que se la ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o del ARN totales de la clula o tejido. Con el tamao suficiente, la coleccin de clones debera contener tericamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir debera contener muestras de todo el ADN del organismo.Es posible buscar en la genoteca un clon con un fragmento de ADN de inters mediante mtodos sensibles de deteccin capaces de detectar dicho fragmento entre millones de clones diferentes.Entre los usos que se le pueden dar a una genoteca encontramos:-El aislamiento de secuencias y genes: punto de partida para el estudio molecular.-La conservacin del genoma: la excepcionalidad de una muestra biolgica aconseja conservar su material gentico (restos arqueolgicos, especies en extincin, individuos con patologas nicas).-Estudio de la secuencia genmica: conocer la secuencia completa de un genoma indica su clonacin previa

TIPOS DE GENOTECA:

Genoteca Genmica.Es un tipo til de genoteca que contiene fragmentos del ADN genmicos generados mediante la digestin parcial con cantidades limitantes de una enzima de restriccin la cual efecta cortes en determinados sitios con una frecuencia elevada en el genoma. Como consecuencia se produce una digestin parcial del ADN, de modo que solo tiene lugar la fragmentacin de unos cuantos sitios de restriccin, quedando el resto intacto.Se genera as una coleccin de fragmentos superpuestos con una longitud idnea para la clonacin en un vector de clonacin tras ligar el vector y el fragmento de ADN, se introduce en una clula husped.La cantidad de clones que se necesitan para generar una genoteca que cubra el genoma entero depender del tamao de dicho genoma y del tamao de los trozos de ADN obtenidos. Por tanto para saber el nmero de clones. Por lo tanto para saber el nmero de clones que necesitamos usamos dos parmetros.N clones= tamao genoma/ tamao medio del fragmento x N de clones con el mismo inserto

Genoteca de ADN Complementario

Es un tipo de genoteca que contiene copias de ADN complementario de la poblacin de ARNm presente en un determinado tejido. Este tipo de genoteca tiene varias ventajas.- El clon obtenido contiene solamente los exones de un gen y por lo tanto es una representacin directa de una secuencia codificante de un gen, sin los intrones ni otras secuencias promotoras. Esto se convierte en una desventaja en caso de querer estudiar estas zonas.-Los diversos conjuntos de ADNc que representan los transcritos de un nico gen pueden presentar diferencias entre s, indicando que se estn usando promotores o sitios depoliadenilacinalternativos, o bien que se est produciendo un corte y empalme en sitios diferentes (splicingalternativo), de manera que algunos exones pueden quedar incluidos o excluidos en algunos transcritor.-El uso de una fuente especfica de ARNm permite crear una genoteca con una buena fuente de clones para genes de los que se sabe que se expresan de manera preferente o exclusiva en un determinado tipo de tejido.-Sin embargo, el ADNc no proporciona indicacin alguna acerca del tamao o el nmero de los exones ni de la secuencia de los lugares de empalme 3' y 5'.1-La clonacin del ADNc se basa en la accin de latranscriptasa inversa, unaADN polimerasadependiente de ARN derivada deretrovirus, que puede sintetizar la cadena de ADN complementaria a una plantilla de ARN. Tras esto, esta cadena nica de ADNc se usa como plantilla para la ADN polimerasa que convierte la molcula de cadena nica en otra de cadena doble. Entonces, esta molcula de ADN bicatenario es ligada en un vector apropiado para crear una genoteca de ADNc representativa de todos los transcritos originales de ARNm que se encuentran en una clula o tejido original. Algunos vectores hbilmente construidos, llamadosvectores de expresin, contienen seales de transcripcin y de traduccin adyacentes al lugar de insercin del ADNc, haciendo posible la transcripcin y traduccin en bacterias, hongos o clulas en cultivo, de una molcula de ADNc de longitud completa para poder as producir la protena que codifica.

8. En qu consiste el proceso de hibridacin de cidos nucleicos. Explique.

Lahibridacindecidos nucleicos(ADNoARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de cidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una nica molcula de doble cadena, que toma la estructura de doble hlice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm), la absorcin de energa ser mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta ltima los dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energa, estn totalmente expuestos a la fuente emisora de energa.Losnucletidosse unirn con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U; CG; GC; T=A o U=AAs que dos cadenas perfectamente complementarias se unirn la una a la otra rpidamente. Por el contrario, debido a las diferentes geometras de los nucletidos, una simple variacin de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultar la unin.El proceso de hibridacin se puede revertir simplemente calentando la disolucin que contiene la molcula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalizacin ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrgeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrgeno; por tanto, y dado que se requiere ms energa para romper tres enlaces que para romper dos, dicha energa se traduce en una mayor temperatura. El%GC no es igual para todas las especies, es ms, el%GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de extraccin de ADN, segn qu tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre otros motivos porque existen enfermedades genticas debidas a mutaciones en el ADN mitocondrial.En biologa molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridacin: TipoSouthern, para uniones ADN-ADN y tipoNorthern blot, para uniones ADN-ARN.

9. Que es la reaccin en cadena de la polimerasa?

La reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica in vitro utilizada para amplificar enzimticamente una regin determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Es decir, consigue que un pequeo segmento de ADN que pasara desapercibido en un anlisis cualquiera se multiplique millones de veces y as sea fcil de detectar.Gracias a esta tcnica se han podido realizarestudios genticosen cualquier campo de la ciencia. Por ejemplo, se utiliza diariamente para la identificacin de cadveres o en el estudio de escenas del crimen para buscar rastros del culpable. Tambin se empleaen la biologa, para identificar cadenas genticas de plantas, animales o, sobre todo, microorganismos. En la medicina se rene la experiencia de todos esos campos y se usa principalmente para identificar grmenes agresoresque se encuentran en nuestro organismo.Cuando se desarroll la prueba de la PCR por primera vez se trataba de una tcnica cara y algo engorrosa de realizar, pero pronto se generaliz su uso y se empezaron a desarrollar equipos sencillos y muy baratos que se utilizan todava hoy en muchos centros diagnsticos.Adems, se han diseado PCR ms especficas que se pueden elegir segn sea la muestra a estudio. Los diferentes tipos de PCR, adems de la bsica, son:PCR anidada: consigue amplificar muestras mnimas de ADN a miles de millones de fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos minsculos.PCR in situ: permite la deteccin de ADN en el mismo lugar de la muestra, sin tener que procesarla primero con tcnicas de laboratorio. Se suele utilizar para biopsias o raspados de clulas.PCR mltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos de ADN a la vez y con una sola muestra.PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN para detectar moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma que utiliza elVIHentre otros virus.PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se aade un componente fluorescente que permite medir la luz. A ms luz, ms cantidad del ADN detectado.

10. Cules son los tipos de marcadores moleculares que hay en la actualidad. Explique cada uno.

Los marcadores moleculares son una herramienta necesaria en muchos campos de la biologa como evolucin, ecologa, bio-medicina, ciencias forenses y estudios de diversidad. Adems se utilizan para localizar y aislar genes de inters. En la actualidad existen varias tcnicas moleculares que nos permiten conocer cmo se encuentran las proporciones de genes en las poblaciones naturales de manera indirecta, como con los anlisis de protenas, o de manera directa con estudios de ADN.Los diferentes tipos de marcadores se distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci nicos o mltiples y son de tipo dominante o co-dominante (Simpson, 1997).

RAPDs

Los RAPDs (polimorfismos de ADN amplificados al azar) son marcadores que amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de especies. Los RAPDs se basan en la probabilidad estadstica de que se presenten sitios complementarios al oligonucletido de 10 pares de bases (pb) a lo largo del genoma. El polimorfismo de las bandas entre los individuos se debe a cambios en la secuencia de los nucletidos en los sitios de acoplamiento del oligonucletido y por insercin o delecin de los fragmentos en estos sitios.

Los RAPDs son tiles en la elaboracin de mapas genticos, en el estudio de parentesco y en el anlisis de la estructura poblacional, ya que ayudan a estimar tamao efectivo, aislamiento reproductivo y niveles de fecundacin cruzada (Otero et al., 1997; Parker et al., 1998; vanse tambin los captulos 2, 3 y 6 de este libro).

Microsatlites

Los microssatlites o secuencias simples repetidas (SSRs; Litt y Luty, 1989) son secuencias de ADN formadas de 1 a 4 pares de bases, por ejemplo mononucletidos(TT)n, dinucletidos (AT)n, o tetra nucletidos (AAGG)n. Estos loci se encuentran en regiones codificantes y no codificantes del ADN y es probable que se formen por eventos de rompimiento que generan polimorfismos con valores superiores al 90%.

Los microsatlites han tomado ventaja sobre otros marcadores genticos como los AFLPs, RAPDs, RFLPs, debido a que: i) tienen el ms alto grado de polimorfismo; ii) segregan de manera mendeliana y son codominantes; iii) la presencia de un solo locus gentico por microsatlite hace que la lectura de las bandas sea clara y fcil de interpretar y iv) son selectivamente neutros (Golstein y Pollock, 1994; Vendraminet al., 1996). Adems, para trabajar con SRR es necesario conocer la secuencia de la regin a analizar para contar con primers especficos que amplifiquen la regin repetitiva (el microsatlite) responsable de la variacin observada, que adems es homloga para diferentes especies o incluso gneros (Golsteinet al., 1996). Esto es, los microsatlites son especficos para ciertos grupos de especies y homlogos entre s (Vendraminet al., 1996), lo que permite hacer estudios comparativos entre especies o gneros de un mismo grupo. Por otra parte, se han realizado estimaciones de las tasas de mutacin de estas regiones y se ha llegado a la conclusin de que los microsatlite del ADN nuclear tienen tasas de mutacin de 1x 10 -3 a 1x 10 -6 (Wiessenbachet al., 1992; Weber y Wong, 1993), ms altas que las que se presentan en el ADN de cloroplasto las cuales segn Provanet al. (1999) son de 3.2-7.9 x 10-5. Conocer las tasas de mutacin nos brinda una base importante para realizar anlisis robustos de la genealoga de las poblaciones que nos hablen acerca de la historia evolutiva de las especies, ventaja muy importante sobre otros marcadores genticos.

ISSRs

Es un marcador molecular conocido como secuencias repetidas intersimples.Esta es una tcnica relativamente nueva y es similar a los RAPDs, excepto que en los ISSRs el primer es un di trinucleotido repetido (Culler y Wolfe, 2001 vase el captulo 19 de este libro).Los dos mtodos que se utilizan en la electroforesis de ISSRs son: a) gel de agarosa visualizado con bromuro de etidio, y b) geles de acrilamida teidos con nitrato de plata.Las bandas que se obtienen con este marcador van de 100 a 2000 pb. La variacin allica en los ISSRs consiste de la presencia o ausencia de los productos amplificados.Comparada con los primers de los RAPDs las secuencias de los ISSRs es usualmente larga lo que resulta en una mayor reproductibilidad de las bandas.

RFLPs

El anlisis de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLPs) fue el primer marcador de ADN utilizado por bilogos poblacionales (Parker et al., 1998). Este mtodo expresa diferencias especficas del ADN que fueron reconocidas por enzimas de restriccin particulares (endonucleasas). Cada una de las endonucleasas (de origen bacteriano), reconoce y corta solamente una secuencia especfica de bases nitrogenadas en el ADN, siempre y cuando stas no estn protegidas (metiladas). Por consiguiente cualquier ADN que no est metilado puede ser reconocido y cortado en fragmentos de Longitud definida; y cualquier mutacin dentro de esos sitios, podra cambiar El patrn del fragmento y permitir que se detecte un RFLP al comparar dos oMs genomas Para detectar RFLPs hay dos tcnicas: southernblots e hibridizacin, y PCR.

RFLP-PCR

El segundo mtodo que se utiliza para la tcnica de RFLPs es la PCR. Los RFLPs son causados por re arreglos del ADN, tales como prdidas, inserciones o sustituciones de secuencias o nucletidos nicos, lo que genera una ganancia o prdida de sitios de restriccin. Esto es detectado a travs de diferencias en el peso molecular de los fragmentos homlogos de restriccin del ADN genmico.Con el producto amplificado de PCR se realiza una digestin con diferentes enzimas de restriccin. Los fragmentos resultantes de la digestin son separados por electroforesis en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio o con acrilamida teidos con nitrato de plata (Karl et al., 1992); este mtodo es ms barato y rpido que el anterior.Los RFLPs generalmente se han utilizado para construir mapas genticos, para la clonacin de genes basados en mapas y para ayudar a resolver problemas taxonmicos o filogenticos.

Southernblots e hibridizacin

Es necesario en primer lugar aislar el ADN del organismo, de purificarlo y cortarlo con una o ms endonucleasas de restriccin. Los fragmentos resultantes se separan en geles de agarosa por electroforesis y se transfieren a una membrana que puede ser de nylon o de nitrocelulosa (southernblotting). La subsecuente hibridacin con una sonda marcada y deteccin con autorradiografa, luminografa o quimioluminiscencia har visible un fragmento de ADN especfico, que puede ser comparado con el fragmento resultante de otros genomas tratados de la misma forma (Parketet al., 1998). La sonda marcada se obtiene de fragmentos de ADN nuclear, de organelos o bien de ADN complementario, tambin denominado ADN copia (ADNc) que es una molcula de una sola hilera producida en el laboratorio usando mRNA como molde y transcripcin reversa (vase el captulo 15 de este libro). Para el caso de obtenerla a partir de ADN nuclear, se requiere construir una biblioteca genmica mediante el aislamiento, restriccin y clonacin del ADN en un vector apropiado , que se explica a continuacin.Las bibliotecas de ADN son colecciones de vectores recombinantes, que cuentan con secuencias de ADN insertadas. La figura 5 muestra la construccin de una biblioteca de ADNc en el vector lambda gt10. En la figura se puede observar cmo, mediante ADN transcriptasas, polimerasas o ligasas se construye un fragmento de ADN (el de inters) y se inserta en el fago a utilizar (parte A de la figura); una vez obtenido el fago se procede a infectar una colonia de E. Coli en una caja de Petri. Cada infeccin producir una placa caracterstica en la caja de Petri (en una caja de Petri de 150 mm pueden caber 50 mil placas).Una vez que las placas se han formado se coloca un filtro de nitrocelulosa en contacto con las colonias de la caja de Petri. El ADN transferido al filtro es desnaturalizado y fijado en el filtro mediante el uso de luz ultravioleta. De esta forma el filtro puede ser hibridizado con una sonda radiactiva de ADNc de inters y sometido a autorradiografia; una mancha en la autor radiografa permitir identificar la placa de la caja de Petri que contiene el fago con el ADN de inters. El fago puede entonces ser extrado del agar de la caja de Petri y re infectar a E. coli. La repeticin de este proceso de separacin de un fago recombinante, permite clonar el ADN que contiene el fago. Este proceso ha permitido desarrollar bibliotecas de ADN de diferentes tejidos.

11. Explique las tecnicas de electroforesis, southern blotting, northern blotting y westhern blotting.

Southernblotting: El mtodo tipo Southern o Southernblot fue desarrollado por E. M. Southern para la deteccin de genes especficos en el ADN celular. El ADN es digerido con una enzima de restriccin y los fragmentos son separados por tamaos mediante una electroforesis en un gel. Se realiza tincin con bromuro de etidio para comprobar la calidad de la electroforesis y del AND. A continuacin los fragmentos de ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados con un cido dbil y desnaturalizados con NaOH para permitir la transferencia. Posteriormente, el ADN es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una rplica de la disposicin de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuacin el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubacin la sonda se va hibridando a las molculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposicin a una pelcula de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una pelcula sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo.Northenblotting: Es esencialmente idntica al mtodo de Southernblot, salvo que las molculas de cido nucleicos de la muestra, en este caso de ARN (total, mensajero, vrico, etc.), se separan por electroforesis en condiciones desnaturalizantes (en presencia de formaldehdo, que forma parte de la composicin del gel). Esto es debido a que, a pesar de ser una molcula de una sola cadena, se forman complejas estructuras secundarias que dificultan la migracin. Al igual que en el Southernblot, el ARN se transfiere a la membrana de filtro y se hibridan con sondas de ADN marcada. Durante la electroforesis se pueden observan grandes cantidades de ARNm correspondiente a ribosomal (unidades 28S y 18S). Tanto la tcnica de Southern como de Northernblot se usan poco hoy en da al haber sido sustituidas por tcnicas derivadas de la PCR.

Western blotting u oinmunoblot: es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada. Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas. Las protenas son transferidas desde el gel a la membrana electroforticamente. Electroforesis de la muestra con las protenas. Transferir las protenas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa. Coloracin de las protenas para confirmar transferencia. Bloqueo de los sitios de unin inespecficos remanentes en la membrana de nitrocelulosa. Incubacin con el anticuerpo especifico primario. Lavados del anticuerpo no unido. Deteccin del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP) Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccin con placas radiogrficas.

12. Cul es la importancia de secuenciar el ADN?Una secuenciacin es la determinacin de la secuencia de nucletidos de una molcula especfica. El proceso de secuenciacin de ADN es fundamental para hacer predicciones sobre su funcin, facilitando su manipulacin. Con la determinacin de la secuencia nucleotdica del genoma humano y la de otros organismos nos hemos adentrado en el conocimiento de la clula. Conociendo la secuencia de todos los genes de un organismo, es posible deducir su proteoma. Asimismo, con la informacin que se tiene, es posible empezar el estudio integral y global de las redes metablicas y conocer la manera en que una clula regula la expresin gentica en diferentes condiciones metablicas. Sin embargo, este nuevo conocimiento es preliminar. Si bien podemos enlistar todos los genes de una clula, la determinacin de las posibles interacciones entre sus productos es una meta a largo plazo todava. Hay, pues, mucho ms que conocer para entender el proceso mismo de la vida.Determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense. El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa.

13. Con sus palabras explique por qu es importante en la actualidad el desarrollo, innovacin e invencin de tcnicas moleculares.

La innovacin en tcnicas moleculares es importante para contribuir a travs de stas con el conocimiento y aplicacin de muchos conceptos en la biologa y en la medicina, ya que esta puede ser usada, para anlisis filogenticos, de enfermedades y muchos otros aspectos en los cuales se ha profundizado, yendo de lo macro a lo micro y siendo cada da ms precisos en el estudio del genoma humano, y de todas las especies que se han estudiado con stos mtodos. nuevas tcnicas moleculares en la actualidad permiten a los cientficos tener un gran avance en el rea de lamedicinacomo dela investigacin, ya que gracias al desarrollo de estas tcnicas es que se ha logrado llevar a cabo laproduccinde medicamentos y vacunas para combatir una serie de enfermedades, incluso incurables, que afectan desde hace tiempo tanto alhombrecomo a los animales de manera individual como colectiva.Si bien es cierto pues, los avances en la comprensin de las bases biolgicas de labiodiversidadmicrobiana a nivel de subespecies puede mejorar el marco conceptual requerido para una apropiada interpretacin epidemiolgica de los resultados de tipificacin. Por lo que una adecuada y ms amplia aplicacin de estas tcnicas puede darluza la epidemiologa de infecciones adquiridas por el hombre y/o animales, permitindole con ello tener uncontrolms eficaz de estas, as como llevar a cabo mejores estrategias de prevencin.

BIBLIOGRAFA.

Robert L., Nussbaum; Roderick R. McInnes; Huntington F. Willard (2008). Captulo 4: Herramientas utilizadas por la gentica molecular humana.

Thompson & Thompson. Gentica en Medicina (7 edicin). Barcelona: Elsevier Masson. pp. 4547. ISBN 978-84-458-1870-1.

http://medmol.es/glosario/87/

http://medmol.es/tecnicas/32/ Synthesis and use of synthetic oligonucleotides. Itakura, K, Rossi, J. J. Y Wallace R. B. 1984. Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356

The Internet and The new biology. Tools for genomic and molecular approach.Peruski, L. F. Jr. Y Peruski, A. H. 1997. American Society for Microbiology, Washington.