Universidad Autónoma de Chiriquí

Facultad de Ciencias Naturales y exactas

Escuela de Química

Informe de Química Orgánica 236

Pruebas Cualitativas para Aminoácidos

Presentado por:

Ibeth Martínez 4-764-39

Diana Staff 4-751-1091

Prof.: Omar Chacón

Fecha de Entrega: 10/10/2012

Resumen:

En esta experiencia de laboratorio el objetivo principal era aplicar pruebas cualitativas especificas que permitan reconocer grupos químicos de los aminoácidos; para esto se llevaron a cabo diferentes pruebas.

En la prueba de la Ninhidrina, se emplearon los aa (glicina, tirosina, triptófano, cisteína, prolina, Hidroxiprolina, fenilalanina, cistina, arginina), donde la fenilalanina y triptófano; dieron positivo el ensayo generando un color azul-violeta. Adicional a esto, cisteína, generó una coloración naranja claro, hidroxiprolina, generaron una coloración amarillo-naranja, la arginina generó un color amarillo, la

cual indica que el ensayo también es positivo, la tirosina y Prolina no cambiaron, esto se debe a una mala estandarización de los aminoácidos.

Cuando se realizó la prueba para la cisteína y cistina; los mismos generaron una coloración gris-oscuro luego de la adición del NaOH, (CH3COO)2 Pb y calentando.

El siguiente ensayo consistió en la reacción de Xantoproteica, donde el triptófano y tirosina, produjeron un color amarillo tras la adición de HNO3 y una coloración naranja con un medio alcalino; el fenol, produjo un color naranja intenso; los aminoácidos (glicina, cisteína, prolina, cistina, fenilalanina, arginina e Hidroxiprolina), dieron la prueba negativa. Adicional a estos ensayos, se realizó la prueba del ácido glioxílico, donde el triptófano, dio la prueba positiva, debido a la formación de un anillo color amarillo, dando positiva la prueba, a diferencia de la glicina y tirosina, que dieron un resultado negativo.

A través de las diferentes pruebas realizadas en el laboratorio, logramos entender el comportamiento de un aminoácido frente a diferentes reactivos, por lo tanto puede decirse que se cumplió con los objetivos propuestos.

Objetivos:

Aplicar pruebas cualitativas generales y específicas que permitan reconocer grupos químicos de los aminoácidos.

Palabras Claves:

Aminoácidos, Grupo Guanidino, Grupo indólico, xantoproteica, grupo tiólicos, Ninhidrina.

Marco Teórico:

Los aminoácidos son las unidades constituyentes de las proteínas, biomoléculas estas últimas de interés en las organizaciones estructurales y funcionales de células y tejidos.(Mathews, 2002)

Téngase en cuenta que todas las enzimas, fundamentales para las reacciones bioquímica, y todos los anticuerpos, esenciales en los procesos de inmunidad, son proteínas y se encuentran por tanto constituidos por aminoácidos. Los aminoácidos desde el punto de vista químico son ácidos orgánicos (R-COOH), portadores de un grupo amino (-NH2) y un radical variable R. Según la naturaleza del grupo R los aminoácidos pueden ser clasificados en cuatro grandes grupos: apolares, polares sin carga, aniónicos y catiónicos. (Wade, 2005)

Materiales:

Nombre Capacidad CantidadTubos de ensayo

--- 10

Vaso químico

250 ml100 ml

10

Probeta 10 ml 2Gradilla --- 1Goteros --- 10

Potenció-metro

--- 1

Plancha --- 1

Reactivos:

GlicinaToxicidadManifestaciones dermatológicas, Enrojecimiento facial, Piel seca. Piel con erupciones.Manifestaciones gastrointestinalesFallo hepático fulminante.El enrojecimiento facial, es el efecto secundario más comúnmente informado. Dura aproximadamente 15-30 minutos y algunas veces es acompañada por una sensación de prurito o picazón.

TirosinaToxicidadEn el ojo: No produce fuertes irritaciones.Ingestión: Puede ser nocivo por ingestión.Inhalación: Puede ser nocivo si se inhala.

TriptófanoDensidad 1.340 kg/m3; 1.34 g/cm3Masa molar 204,23 g/molPunto de fusión 501 K (228 °C)Punto de descomposiciónPropiedades químicasAcidez 2,38; 9,34 pKaPunto isoeléctrico (pH)ToxicidadManifestaciones dermatológicas, Enrojecimiento facial, Piel seca. Piel con erupciones.Manifestaciones gastrointestinalesFallo hepático fulminante.El enrojecimiento facial, es el efecto secundario más comúnmente informado. Dura aproximadamente 15-30 minutos y algunas veces es acompañada por una sensación de prurito o picazón.

CisteínaToxicidadEfecto latente, es irritante y al ingerir en dosis elevadas puede causar dolor abdominal.

CistinaFórmula molecular

C3H7NO2SPropiedades físicasMasa molar 121,16 g/molPunto de fusión 513,15 K (240 °C)Propiedades químicasAcidez 1,91; 8,14; 10,28 pKaSolubilidad en agua 280 g/lFamilia AminoácidoEsencial NoPunto isoeléctrico (pH) 5,07ToxicidadProvoca acidosis metabólica.

ProlinaEs una molécula hidrófoba. Su masa molar es 115,13 g/molPunto de fusión 494 K (221 °C).Cambio de estadoPunto de ebullición /campo de ebullición: Indeterminado.Punto de inflamación: No aplicable.Inflamabilidad (sólido, gaseiforme): La sustancia no es inflamable.Densidad a 20°C: 0,3 g/cm³Solubilidad en / miscibilidad conagua a 20°C: 1623 g/ldisolventes orgánicos: InsolubleToxicidadEn el ojo: No produce fuertes irritaciones.Ingestión: Puede ser nocivo por ingestión.Inhalación: Puede ser nocivo si se inhala.

HidroxiprolinaEfecto estimulante primario:· en la piel: No data available· en el ojo: Sin datos disponibles.· Tras inhalación No data available· Sensibilización: No se conoce ningún efecto sensibilizante.· Indicaciones toxicológicas adicionales:Según nuestra experiencia y las informaciones que tenemos al respecto, el producto no produce ningún efectoperjudicial para la salud cuando se maneja adecuadamente y se emplea con los fines especificados.El producto no requiere etiquetaje conforme a la última versión de

las Listas de la CE.

ArgininaToxicidadEn el ojo: No produce fuertes irritaciones.Ingestión: Puede ser nocivo por ingestión.Inhalación: Puede ser nocivo si se inhala.

FenilalaninaIdentificación del productoPeso molecular: 165.19Características físicas y químicasAspecto: Polvo cristalino blanco.Olor: Inodoro.Solubilidad: LeveGravedad específica: 1.29pH: es de volátiles por el volumenPresión del vapor (milímetro hectogramo): No aplicable.ToxicidadEfecto latente, es irritante y al ingerir en dosis elevadas puede causar dolor abdominal.

Ácido Nítrico (HNO3)Masa molar : 63.01 g/molDensidad: 1.52 g/cc (20°C)Inhalación: Aire limpio, reposo, posición de semiincorporado, respiración artificial si estuviera indicada y proporcionar asistencia médica. Contacto con la piel: Quitar las ropas contaminadas, aclarar la piel con agua abundante o ducharse y proporcionar asistencia médica. Ingestión: No provocar el vómito, dar a beber agua abundante, guardar

reposo y proporcionar asistencia médica. Contacto con los ojos: Enjuagar con agua abundante durante varios minutos (quitar las lentes de contacto si puede hacerse con facilidad) y proporcionar asistencia médica.

NaOH 10 MPropiedades físicas y químicasEstado de agregación SólidoApariencia BlancoDensidad 2,1 g/cm3Masa molar 39,99713 g/mol,Punto de fusión (323 °C)Punto de ebullición (1390 °C)Toxicología:Ingestión Puede causar daños graves y permanentes al sistema gastrointestinal. Inhalación Irritación con pequeñas exposiciones, Piel Peligrosa. Los síntomas van desde irritaciones leves hasta úlceras graves. Ojos Peligrosos. Puede causar quemaduras.

Ácido Acético GlacialPropiedades físicas y químicas: Aspecto: Líquido transparente e incoloro. Olor: PicantepH X2,5(10g/l)Punto de ebullición :118°CPunto de fusión : 17°CPunto de inflamación : 40°CTemperatura de auto ignición : 485°CLímites de explosión (inferior/superior): 4 / 17 vol.%Presión de vapor: 15,4 mbar(20°CDensidad (20/4): 1,05Solubilidad: Miscible con agua

Toxicidad:Por inhalación de vapores: Irritaciones en vías respiratorias.Sustancia muy corrosiva. Puede provocar bronconeumonía, edemas en el tracto respiratorio.En contacto con la piel: quemaduras.Por contacto ocular: quemaduras, trastornos de visión, ceguera (lesión irreversible del nervio óptico). Quemaduras en mucosas.Por ingestión: Quemaduras en esófago y estómago. espasmos, vómitos, dificultades respiratorias.

Acetato de Plomo IIInhalación: El plomo se puede absorber a través del sistema respiratorio. La irritación local del bronchiay los pulmones pueden ocurrir y, en casos de la exposición aguda, los síntomas tales como gustometálico, pecho y dolor abdominal, y los niveles crecientes de la sangre de plomo pueden seguir. Vertambién la ingestión.Ingestión: ¡VENENO! Los síntomas del envenenamiento del plomo incluyen el dolor y los espasmosabdominales, náusea, vomitando, dolor de cabeza. El envenenamiento agudo puede conducir a ladebilidad del músculo, “línea del plomo” en las gomas, gusto metálico, pérdida definida de apetito,insomnio, los vértigos, los altos niveles del plomo en sangre y orina con choque, coma y muerte

encasos extremos.Contacto de la piel: El plomo y los compuestos de plomo se pueden absorber a través de la piel en laexposición prolongada; los síntomas del plomo que envenenan descritos para la exposición de laingestión pueden ocurrir. Los períodos del cortocircuito del excedente del contacto pueden causar lairritación, la rojez y el dolor locales.Contacto visual: La absorción puede ocurrir a través de tejidos finos del ojo pero los peligros máscomunes son irritación local o abrasión.

Ácido Clorhídrico (HCl)Estado físico: Líquido humeante en el aire a concentraciones superiores al 20%.Color: Incoloro o amarillo.Olor: Picante. pH: < 1Pto.de ebullición: 50,5ºC (38%); 110ºC (20%)Pto.de fusión: -25,4ºCSolubilidad: Soluble en agua en todas las proporciones. Soluble en alcohol, éter, benceno, acetona, ácido acético y cloroformo.Toxicología: El cloruro de hidrógeno es irritante y corrosivo para cualquier tejido con el que tenga contacto. La exposición breve a bajos niveles produce irritación de la garganta. La exposición a niveles más altos puede producir respiración jadeante, estrechamiento de los bronquiolos.

NinhidrinaFórmula C9-H6-O4Propiedades físicasDensidad 862 kg/m3; 0,862 g/cm3Punto de fusión 523 K (250 °C)TOXICIDADIrrita la piel, es nocivo por ingestión en grandes cantidades.

a-naftolen la piel: Irrita la piel y las mucosas.· en el ojo: Produce irritaciones fuertes con el riesgo de perjudicar seriamente los ojos.· Ingestión: Nocivo por ingestión.· Inhalación: Nocivo si se inhala. Puede provocar una irritación en el tracto respiratorio.· Sensibilización: No se conoce ningún efecto sensibilizante.· Datos adicionales (a la toxicología experimental): No se haben otros datos importantes

Ácido SulfúricoPropiedades físicas y químicas:Líquido aceitoso, incoloro o café. Inodoro, pero concentrado, es sofocante e higroscópico.Punto de ebullición: 274 (100%), 280 (95%)Punto de fusión: 3 (98%); -64 (65%)Densidad relativa del vapor (aire=1): 3.4Solubilidad: soluble en agua y alcohol etílico.Toxicología:El producto debe manejarse con las precauciones apropiadas para los productos químicos.

Procedimiento:

Reacción con la Ninhidrina

Reacciones para cisteína y cistina

Reacción Xantoproteica

1

Coloque 1 ml de la solución de aminoácido en un tubo de ensayo.

2

Ajuste el ph cerca de la neutralidad .

3

Agregue 5 gotas de la solución de ninhidrina y deje hervir por 2 minutos.

1

Mezcla 1 ml de solución de cisteína y cistina con 5 ml de NaOH.

2

Añada luego unas gotas de solución de acetato de plomo II.

3

Caliente hasta ebullición y observe los cambios.

1

Agregue volumenes iguales de pacido nitrico concentrado a 0,5 ml de la solución de aminoácido.

2

Deje enfriar y observe el cambio de color.

3

Agregue NaOH 10M para que la solución sea fuertemente alcalina. Repita con fenol.

Prueba del ácido Glioxílico

Resultados:

Reacción con la Ninhidrina

Aminoácido ResultadoCisteína Naranja claro

Fenilalanina MoradoCistina Naranja claro

Triptófano MoradoProlina No cambio

Hidroxiprolina Amarillo-NaranjaGlicina Morado Claro

Tirosina No cambioArginina Amarillo

Con triptófano

Con Glicina

Con cisteína:

Con Prolina:

1

A2 ml de una solución de triptófano añada 2 ml de ácido acético glacial.

2

Luego deje caer lentamente 2 ml de ácido sulfurico concentrado por las paredes del tubo.

3

Enseaye también con glicina y tirosina.

Con Hidroxiprolina:

Con cistina

Reacción para la Cisteína y Cistina

Aminoácido ResultadosCisteína Precipitado

NegroCistina Precipitado

Negro

Reacción Xantoproteica:

Aminoácidos HNO3 NaOH

Tirosina Naranja Naranja intenso

triptófano Amarillo NaranjaCisteína incoloro IncoloroProlina No hubo

reacciónNo hubo reacción

Hidroxiprolina

No hubo reacción

No hubo reacción

Cistina Amarillo incoloroFenilalanina No cambio No cambio

Glicina No cambio No cambio

Arginina No cambio No cambio

Fenol Naranja Naranja intenso

Prueba de Ácido Glioxílico:

Aminoácidos C2H4O2 HSO4

Triptófano Color amarillo

Color naranja ladrillo

Tirosina Sin rx Color amarillo

Glicina Sin rx Sin rx

Discusión:

Reacción de la Ninhidrina

En este ensayo, se emplearon los aa (glicina, tirosina, triptófano, cisteína, prolina, Hidroxiprolina, fenilalanina, cistina, arginina), donde la fenilalanina y triptófano; dieron positivo el ensayo generando un color azul-violeta. Adicional a esto, cisteína, generó una coloración naranja claro, hidroxiprolina, generaron una coloración amarillo-naranja, la arginina generó un color amarillo, la cual indica que el ensayo también es positivo, la tirosina y Prolina no cambiaron, esto se debe a una mala estandarización de los aminoácidos. Esto nos dice, que La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energético que por una desanimación oxidativa de los aminoácidos conduce a la formación del aldehído correspondiente, con liberación de amoniaco y gas carbónico y formación de la ninhidrina reducida o hidrindrantina. Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre, reaccionaran con la

ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparición de un color violáceo o amarillo. Debido a que las proteínas y los aminoácidos, poseen esta característica, la reacción sirve para identificarlos. Algunas soluciones de amonio y aminas, dan la coloración característica, aparentemente debido a una oxidación y reducción intramolecular de la ninhidrina en presencia de amoníaco. Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino (-NH-), dan un color rojo que pasa rápidamente a amarillo. (Identificación de Aminoácidos, En línea)

Reacción de la Cisteína y Cistina

Cuando se realizó la prueba para la cisteína y cistina; los mismos generaron una coloración gris-oscuro luego de la adición del NaOH, (CH3COO)2 Pb y calentando. Es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y las proteínas que los contienen, se reconocen por la formación de una coloración negra o gris. Esta reacción dará positiva con aquellos aminoácidos que presenten azufre en su estructura, como lo fueron la cistina, la cisteína. La reacción consiste en someter la muestra a una hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio. De esta manera el sulfuro de sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo; generando un precipitado de sulfuro de plomo, color gris oscuro. (Identificación de Aminoácidos, En línea)

Reacción Xantoproteica:

En este ensayo, el triptófano y tirosina, dio positiva la prueba, produciendo un color naranja; a diferencia de la glicina, cisteína, cistina, prolina, Hidroxiprolina, fenilalanina y arginina, las cuales fueron negativas. El fenol, generó un color amarillo-naranja. Esta reacción reconoce los aminoácidos que poseen el grupo bencénico. Las proteínas que tienen en su composición estos aminoácidos también darán positiva la reacción. La positividad se reconoce por la aparición de un color amarillo debido a la formación de nitrocompuestos, es decir se da la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos aromáticos. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro.

Reacción de ácido Glioxílico

Esta prueba es específica del grupo indol característico del Triptófano. El anillo del indol se hace reaccionar con ácido Glioxálico en presencia de ácido Sulfúrico concentrado para formar un compuesto violeta que se forma en la interface entre la solución de proteína y el ácido sulfúrico. En la presente experiencia, solo el triptófano, dio positiva la prueba, ya que se formo un anillo color amarillo. A diferencia de la glicina y tirosina, ya que ambas no hubo ningún cambio al agregar el acido acético, por lo que se puede decir que fueron negativas. El cambio ocurrido en el tubo de

ensayo que contenía el triptófano se debe a que el grupo indol del aminoácido triptófano se condensa con el ácido glioxílico del reactivo, formando compuestos coloreados. El agregado de una pequeña cantidad de ácido sulfúrico concentrado puro, aumenta la sensibilidad de la reacción. En este caso se debió formar un precipitado morado, sin embargo se dio la formación de un anillo color naranja ladrillo en la superficie de separación, esta coloración pudo ser provocada por que el Triptófano en solución se encontraba puro por lo que entonces la reacción no fue positiva, es decir no se produjo el color esperado.

Conclusión:

Comprobamos que en la prueba de la Ninhidrina, donde el reactivo, genera un color azul-purpura, y en algunos casos como la Hidroxiprolina genera una coloración amarilla, y es por la presencia de grupos aminos libres en los aminoácidos proteínas y péptidos.La reacción de la cistina y cisteína, sirvió para identificar aminoácidos que posean el azufre, formando un precipitado gris oscuro.A través de las diferentes pruebas realizadas en el laboratorio, logramos entender el comportamiento de un aminoácido frente a diferentes reactivos.

Pudimos comprobar que el ensayo xantoproteico, solo da positivo con los aminoácidos que posean un núcleo aromático, formándose nitroderivados.Comprobamos que el ensayo que identifica los grupos indólico, generándose un complejo color purpura, es la reacción del ácido Glioxílico.Se realizaron todas las pruebas para la identificación de los aminoácidos por lo que podemos concluir que se cumplió con los objetivos propuestos.

Bibliografía:Identificación de Aminoácidos, En línea.

http://www.buenastareas.com/ensayos/Identificacion-Aminoacidos/493570.html

Wade, L.G.2005.Química Orgánica. 5ta Edición, Editorial PEARSON EDUCATION. Madrid.Mathews, C.K. Bioquímica. Editorial Pearson Education. Madrid 2002.

Cuestionario:

1. Describa la reacción de la Ninhidrina con ácido aspártico, lisina y glutamina.

Reacción de Glutamina

Reacción de Glicina

2. Se tienen cuatro frascos sin rotular, que se sabe contienen soluciones de los siguientes aminoácidos: glicina, arginina y tirosina y otro con el tripéptido Gli-Arg-Gli. ¿Cómo los identificaría?R/: Al frasco uno, se le adicionaría la ninhidrina, si aparece un color azul-púrpura, existen grupos aminos libres; esta evidencia confirma la prueba positiva, es decir hay presencia de la glicina. Al frasco dos, le realizaría la reacción de xantoproteíca, si hay formación de sales de color naranja intenso, hay presencia de

núcleo aromático en el aminoácido, por ende la prueba daría positiva, indicando que hay presencia de la tirosina. Para el tercer frasco, le haría la prueba para la arginina, con el reactivo de sakaguchi, si hay presencia de un color rojo, la prueba es positiva, para la arginina. Y al cuarto frasco, que presuntamente puede contener el tripéptido; conformaría su presencia con la reacción de sakaguchi, para la arginina; la reacción de la ninhidrina, para la glicina.

Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa (Figura inferior). Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.

Estado nativo Estado desnaturalizado

Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su estabilidad

en disolución y provocará la precipitación. Así, la desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitará la agregación intermolecular y provocará la precipitación. La precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización y se dice entonces que la proteína se encuentra desnaturalizada (Figura superior).

En una proteína cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan sólo tienen en común la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los demás niveles de organización estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada.

La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:

cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión

una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie

pérdida de las propiedades biológicas

Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalización es reversible ya que es la estructura primaria la que contiene la información necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuración. El proceso mediante el cual la proteína desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalización. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificación de proteínas, ya que no todas la proteínas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. En algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo que la proteína precipita. La formación de agregados fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible.

Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de

manera selectiva mediante cambios en:

la polaridad del disolvente

la fuerza iónica

el pH

la temperatura