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ANÁLISIS ACÚSTICO, GENÉTICO Y MORFOMÉTRICO EN RANAS VENENOSAS

ANDINAS (ANURA: Andinobates) DE COLOMBIA

RICARDO ANDRÉS MEDINA RENGIFO

TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR

POR EL TÍTULO DE PROFESIONAL EN BIOLOGÍA

DIRECTOR:

MANUEL H. BERNAL BAUTISTA

DOCTOR EN CIENCIAS - BIOLOGIA

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA

FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE BIOLOGÍA

IBAGUÉ – TOLIMA

2013

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DEDICATORIA

A mi familia que me ha acompañado.

Flor Edith, Miryam, Anaor, Martha, Wilson, Liliana, Dany, Camilo, Manuel, Marlon,

Hamilton, Camila y Sebastián

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AGRADECIMIENTOS

EL Autor de esta investigación desea expresar sus más sinceros agradecimientos a las

siguientes personas:

Al profesor Manuel H. Bernal Bautista de la Universidad del Tolima, por su enseñanza e

introducción a la formación como investigador, además de su apoyo, confianza y

dirección durante el desarrollo de esta tesis.

Un especial agradecimiento al profesor Adolfo Amézquita de la Universidad de los

Andes, por su apoyo y colaboración durante el desarrollo de esta tesis.

A María Triana, por su colaboración, paciencia y buena disposición.

A Gissella Pineda, Tatiana Toro, Sigifredo Clavijo y Johan Romero por su asistencia en

campo y colaboración.

A Luis Mazariegos por su amistad y colaboración.

A Gustavo Suarez por su asistencia en campo y amistad.

A Ted R. Kahn por su gran ilustración.

Al docente Omar Melo por su buena disposición y colaboración para la salida de campo

en el Centro Forestal Tropical Bajo Calima de la Universidad del Tolima.

Finalmente al Fondo de Investigaciones de la Universidad del Tolima y a la Universidad

de los Andes por la financiación del presente trabajo

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CONTENIDO

INTRODUCCIÓN………………………………………………………….....……..

1. PROBLEMA………………………………………………………………….......

2. OBJETIVOS………………………………………………………………….......

2.1 OBJETIVO GENERAL…………………………………………………….......

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………….

3. MARCO REFERENCIAL...……………………………………………………..

3.1 ANFIBIOS……………………………………………………………………….

3.2 LA LLAMADA EN ANUROS…………………………………………………..

3.3 PRODUCCIÓN DE LA LLAMADA……………………………………………

3.4 TIPOS DE LLAMADA……………………………………………………….....

3.4.1 Llamada de Anuncio o Publicidad……………………………………….....

3.4.2 Llamadas de Cortejo Masculino…………………………………………….

3.4.3 Llamadas de Cortejo en Hembras……………………..…………………..

3.4.4 Llamadas Agresivas, de Emergencia o de Alarma……………..………..

3.5 MORFOMETRÍA………………………………………………………………..

4. METODOLOGÍA…………………………………………………………………

4.1 ÁREA DE ESTUDIO……………………………………………………….......

4.2 ANÁLISIS MORFOMÉTRICO…………………………………………….......

4.3 ANÁLISIS ACÚSTICO…………………………………………………………

4.4 ANÁLISIS DE DISTANCIAS GENÉTICAS…………………………………..

4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO……………………………………………………..

5. RESULTADOS…………...…………………………………………………...…

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5.1 RESULTADOS MORFOMÉTRICOS…………………………………….......

5.2 RESULTADOS ACÚSTICOS………………………..……………………..…

5.3 RESULTADOS GENÉTICOS…………………………………………….......

6. DISCUSIÓN………………………………………………………………….......

6.1 EL LLAMADO DE Andinobates.…………….……………………………

6.2 LA MORFOMETRÍA DE Andinobates……………………………….......

6.3 Andinobates dorisswansonae LÍBANO…...………………..……..

7. CONCLUSIONES….……………...………………………………………….....

REFERENCIAS…………...……………………………………………....………..

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LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Resumen de localidades y selección de las especies……………….

Tabla 2. Resumen de medidas morfométricas colectadas para las especies

de estudio……………………………………………………………………………

Tabla 3. Tabla de correlaciones intra-grupos combinadas entre las variables

discriminantes y las funciones discriminantes canónicas tipificadas

morfométricas……………………………………………………………………….

Tabla 4. Prueba estadística para el ADC morfométrico de todas las

especies……………………………………………………………………………...

Tabla 5. Tabla de correlaciones intra-grupos combinadas entre las variables

discriminantes y las funciones discriminantes canónicas tipificadas

morfométricas del grupo bombetes……………………………………………….

Tabla 6. Prueba estadística para el ADC morfométrico del grupo bombetes..

Tabla 7. Resumen de los resultados acústicos para las especies de estudio.

Tabla 8. Tabla de correlaciones intra-grupos combinadas entre las variables

discriminantes y las funciones discriminantes canónicas tipificadas

acústicas……………………………………………………………………………..

Tabla 9. Prueba estadística para el ADC de las variables acústicas para

todas las especies…………………………………………………………………..

Tabla 10. Tabla de correlaciones intra-grupos combinadas entre las

variables discriminantes y las funciones discriminantes canónicas tipificadas

acústicas para el grupo bombetes.……………………………………………….

Tabla 11. Prueba estadística para el ADC de las variables acústicas de las

especies del grupo bombetes……………………………………………………..

Tabla 12. Distancias genéticas derivadas del gen Cytb para las especies de

estudio………………………………………………………………………………..

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Línea evolutiva de los tetrápodos……………………………………..

Figura 2. Producción del canto en Bombina orientalis…………………………

Figura 3. Distribución geográfica de las especies de estudio…………………

Figura 4. Medidas morfométricas evaluadas en las especies de estudio……

Figura 5. Características temporales y espectrales medidas en el llamado

de las especies de estudio…………………………………………………………

Figura 6. Pruebas univariadas para cada variable morfométrica medida en

las especies de estudio…………………………………………………………….

Figura 7. ADC morfométrico para todas las especies de estudio…………….

Figura 8. ADC morfométrico del grupo bombetes………………………………

Figura 9a. Visualización temporal y espectral de las llamadas de anuncio….

Figura 9b. Visualización temporal y espectral de las llamadas de anuncio…

Figura 10. Pruebas univariadas para las variables acústicas con bajo

coeficiente de variación…………………………………………………………….

Figura 11. Ancho de banda de las frecuencias para las especies de

estudio………………………………………………………………………………...

Figura 12. ADC acústico para todas las especies evaluadas………………….

Figura 13. ADC acústico para las especies del grupo bombetes……………..

Figura 14. Relaciones entre la temperatura, variables acústicas y tamaño

corporal de las especies de estudio……………………………………………….

Figura 15. Distancias genéticas y geográficas correlacionadas con la

acústica y morfometría para las especies de Andinobates de estudio………..

Figura 16. Integración de la distribución geográfica, relaciones filogenéticas

y relaciones morfométricas para las especies de estudio………………………

Figura 17. Integración de la distribución geográfica, relaciones filogenéticas,

y relaciones acústicas para las especies de estudio…………………………….

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RESUMEN

Tanto la bioacústica, como la genética y morfometría son herramientas ampliamente

utilizadas en estudios taxonómicos, ecológicos, evolutivos, sistemáticos o de

conservación en Anuros. La hipótesis de aislamiento por distancia indica que las

especies comparten una mayor relación filogenética a medida que la distancia entre

estas disminuye. Para entender como la distribución geográfica actúa sobre las

características acústicas, morfométricas y las relaciones filogenéticas del género

Andinobates (Anura), se utilizó un enfoque integrativo en donde se grabaron llamadas

de anuncio de diferentes especies de Andinobates localizados en cinco puntos de

Colombia, además se midieron 8 variables morfológicas y se tomaron muestras

genéticas a través de frotis (swabs) bucales. Los resultados mostraron que las

especies se encuentran bien definidas taxonómicamente tanto por parámetros

acústicos como morfométricos. Sólo a nivel acústico y genético la hipótesis de

aislamiento por distancia puede correlacionarse con las especies. Tanto la topología

del árbol filogenético reconstruido junto con la prueba de distancias genéticas (K2P)

confirman indudablemente que la población de Andinobates presente en el municipio

de Líbano (Tolima) es afín a A. dorisswansonae, lo que indica que existe un morfotipo

diferente con divergencia acústica e incremento del tamaño corporal, siendo este en

modelo interesante para futuras investigaciones en selección sexual y natural.

Palabras Clave: Aislamiento por distancia, Andinobates, bioacústica, morfometría,

filogenia.

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ABSTRACT

Bioacoustics, genetics and morphometry are tools widely used in taxonomic, ecological,

evolutionary, conservation or systematic studies in Anurans. The hypothesis of isolation

by distance indicates that species share a closer phylogenetic relationship as the

distance between these decreases. To understand how the geographical distribution is

correlated on the acoustic characteristics, morphometric and phylogenetic relationships

of the Andinobates (Anura) genus, an integrative approach was used, where was

recorded calls of different Andinobates' species located in five places of Colombia, also

eight morphological variables were measured and genetic samples were taken through

mouth swabs. I show that the species are taxonomically distinct in acoustic and

morphometric parameters. Only the genetic and bioacoustic can be correlated with

isolation by distance. Both the topology of the phylogenetic tree constructed like that

genetic distances test (K2P) certainly confirm that the population of Andinobates from

Líbano town (Tolima) is akin to A. dorisswansonae, indicating that there is a different

morphotype with acoustic divergence and increased body size and this is an interesting

model for future research on sexual and natural selection.

Keywords: Isolation by distance, Andinobates, bioacoustics, morphometry, phylogeny.

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INTRODUCIÓN

Los dendrobátidos (Grant et al., 2006) son una de las familias de Anuros más

diversificada del mundo, con 175 especies actualmente (Frost, 2013). Sus estrategias

reproductivas inusuales, patrones de actividad diurno, territorialidad, aposematismo y

toxicidad (Lötters et al., 2007), son tan solo algunas de las características más

relevantes de esta familia. Todos los Dendrobátidos son neotropicales y son uno de los

grupos de anfibios más estudiados dentro del amplio marco de las ciencias biológicas.

Dentro de esta familia, Andinobates (sensu stricto Twomey et al., 2011) es un género

de pequeñas ranas venenosas andinas que surge de la división del grupo minuta del

género Ranitomeya. La especiación de las ranas Andinobates ha sido ampliamente

diversificada en Colombia con 11 de las 13 especies reportadas para este género. En

general presentan una distribución andina que va desde el nivel del mar, hasta alturas

superiores a los 2000 metros, incluso algunas especies (Andinobates minutus y A.

claudiae) presentan distribución insular. Las ranas Andinobates se caracterizan por su

aposematismo, polimorfismo y diminutos tamaños (Brown et al., 2011).

La sistemática de este género es reciente, pero es claro que la morfología y los datos

merísticos tanto de sus estados adultos como larvales han sido la principal herramienta

para la descripción de las especies. Aunque aparentemente la sistemática y

distribución de las especies del género parece ser bastante clara, los caracteres

taxonómicos (Eg. patrón de coloración) más contrastantes en adultos no son variables

de tipo discreto. Teniendo en cuenta esto, en la actualidad no existen estudios que

analicen variables morfológicas y acústicas de forma cuantitativa que permitan

entender mejor las relaciones filogenéticas de las especies. Por lo tanto, ¿Que tanto de

esta información merística, permite discriminar las especies?, es un interrogante

importante si se tiene en cuenta que las especies de Andinobates son reconocibles

principalmente debido a su distribución y patrón de coloración.

Debido a que la vocalización en anuros tienen el potencial de afectar el éxito en el

apareamiento, es considerada como un fuerte mecanismo de selección sexual

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(Gerhardt, 1994); por ende, esta selección debe favorecer los mecanismos que

permitan una mayor eficiencia, teniendo en cuenta el costo beneficio de tan alto gasto

de energía en la producción y transmisión del sonido (Wells & Schwartz, 2007).

Descripciones detalladas en las características vocales de Andinobates han sido solo

revisadas por Brown et al., (2011) en la descripción del género. Sin embargo, el valor

real de las características acústicas como posibles predictores de las relaciones

filogenéticas, aún no ha sido analizado.

Teniendo en cuenta lo anterior, técnicas estandarizadas como la morfometría, en

conjunto con análisis acústicos de caracteres comportamentales como el llamado de

anuncio (Wells, 1977), un reconocido mecanismo de aislamiento reproductivo

(Duellman & Trueb, 1994), pueden ayudar a comprender mejor las relaciones

filogenéticas en este género.

Estudios como los de Arroyo et al., (2005) Lougheed et al., (2006), Padial et al., (2008),

Vences et al., (2010) y Fouquet et al., (2012), han mostrado la utilidad de herramientas

como la morfometría y/o la bioacústica para evidenciar procesos de especiación donde

la taxonomía o la diversidad criptica de las especies han sido una gran dificultad.

En esta investigación: (1) se analizan a detalle caracteres acústicos y morfométricos de

cuatro especies de Andinobates; (2) se evalúa si los resultados acústicos y/o

morfométricos son concordantes con las relaciones filogenéticas de las especies; (3) se

analiza si las relaciones acústicas y/o morfométricas observadas presentan una

relación geográfica y (4) se evalúa morfológica, acústica y genéticamente una

población de Andinobates presente en el municipio de Líbano (Tolima) para determinar

su estatus taxonómico.

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1. PROBLEMA

La señalización acústica es el principal modo de comunicación en anuros (Narins et al.,

2007; Vitt y Caldwell, 2009), este es un reconocido mecanismo de aislamiento

reproductivo (Duellman & Trueb, 1994). Debido a que la vocalización en Anuros tienen

el potencial de afectar el éxito en el apareamiento, es considerada un fuerte

mecanismo de selección sexual (Gerhardt, 1994); por ende, esta selección debe

favorecer los mecanismos que permitan una mayor eficiencia, teniendo en cuenta el

costo beneficio de tan alto gasto de energía en la producción y transmisión del sonido

(Wells & Schwartz, 2007).

Algunos estudios han realizado comparaciones acústicas permitiendo entender las

relaciones evolutivas y los procesos de especiación en Anuros, es así como Brown y

Twomey (2009), evaluaron especies del género Ameerega (Anura: Dendrobatidae) a

través de características acústicas, genéticas y morfológicas revelando así nuevas

especies para este género; por otro lado, Simöes et al., (2008) y Amézquita et al.,

(2009) han evidenciado una variación intra-específica del llamado entre poblaciones de

Allobates femoralis, una especie con aparentemente amplio rango de distribución en el

Amazonas, esto junto con evidencia morfológica y genética parece indicar la posibilidad

de especies crípticas. De igual forma análisis intra-específicos en Hyla leucophyllata

(Lougheed et al., 2006) e Hyla japonica (Jang et al., 2011) indican que las especies con

amplios rangos de distribución varían sus características acústicas, genéticas y

morfológicas en concordancia con la hipótesis de aislamiento por distancia geográfica

(Slatkin, 1993).

Teniendo en cuenta lo anterior, en este estudio se evalúa el efecto de la distribución

geográfica sobre características acústicas, genéticas y morfométricas en ranas del

genero Andinobates.

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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Analizar las características acústicas, genéticas y morfométricas de cuatro especies de

ranas venenosas (Anura: Andinobates) con su distribución geográfica y relaciones

filogenéticas.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar y comparar las características temporales y espectrales del llamado de

anuncio de cuatro especies de Andinobates.

Comparar variables morfológicas en cuatro especies de Andinobates.

Correlacionar aspectos acústicos, morfométricos y geográficos con las relaciones

filogenéticas entre las especies de estudio.

Determinar el estatus taxonómica de una población de Andinobates presente en el

municipio de Líbano, Tolima.

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3. MARCO REFERENCIAL

3.1 ANFIBIOS

Con más de 7.000 especies conocidas (amphibiaweb.org), los anfibios son uno de los

grupos de vertebrados más diversificado en la actualidad; no obstante, ha pasado a ser

uno de los grupos taxonómicos más estudiados y con mayor interés para la comunidad

científica debido a su altísimo riesgo de extinción. Los datos reportados por Bailliet et

al., (2010) indican que alrededor del 41% de las especies de anfibios conocidos están

en algún grado de amenaza.

Los anfibios actuales son un grupo de vertebrados descendientes de un grupo diverso

de tetrápodos durante el periodo Devónico (aproximadamente 370 a 360 millones de

años) (Wells, 2007), con los Sarcopterigios (peces de aletas lobuladas), como posibles

ancestros comunes (Figura 1). El término anfibio se deriva del griego amphi que

significa “dos” y bios que se refiere a “vida”, esto en alusión al carácter bifásico del

desarrollo de una gran mayoría de anfibios que inicia con una etapa acuática o larval y

una terrestre o adulta. Particularmente, los anfibios se caracterizan por la

permeabilidad de su piel que permite el intercambio de gases y agua, la ausencia de

escamas y su incapacidad de mantener una tasa metabólica independiente de la

temperatura ambiental. Otro aspecto importante es su embriogénesis, ya que

presentan un huevo desprovisto de cáscara, con un desarrollo post-embrionario

acompañado de una metamorfosis; no obstante, no todos los anfibios presentan

metamorfosis (Wells, 2007).

Los anfibios desempeñan un papel fundamental en el ciclo de los alimentos y en el flujo

de energía, debido a que son presas y predadores, además como ectotermos los

anfibios son muy eficientes para convertir la comida en masa para su crecimiento y la

reproducción (Crump, 2010). Los anfibios convierten cerca del 50% de la energía

ganada en tejido nuevo, que es transferido al próximo nivel de la cadena alimenticia, a

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diferencia de mamíferos y aves que utilizan alrededor del 98% de la energía obtenida

en la termorregulación y el metabolismo, solo el 2% se transforma en nuevos tejidos

(Pough et al., 2004; Crump, 2010). Los anfibios actuales son una clase de vertebrados

compuesta por 3 ordenes: Gymnophiona, Urodela y Anura (Crump, 2010).

El orden Anura grupa tanto a los sapos como a las ranas y sus raíces griegas significan

an “sin o carente” y uro ”cola”. Este orden es el más diversificado en el mundo entre los

anfibios (Wells, 2007; Vitt & Caldwell, 2009).

Las ranas venenosas, pertenecen a la familia Dendrobatidae y se distribuyen

únicamente en el neotrópico (desde Nicaragua hasta Bolivia y desde las selvas

atlánticas de Brasil hasta la costa pacífica de sur américa, incluyendo las Antillas

francesas). Son uno de los casos más extraordinarios de evolución, sus característicos

colores aposemáticos que representan en muchas especies su grado de toxicidad y su

comportamiento social y reproductivo, además de su tamaño reducido, las hace uno de

los modelos biológicos más interesantes dentro del orden Anura (Grant et al., 2006;

Lötters et al., 2007). Dentro de esta familia, el género Andinobates (sensu stricto

Twomey et al., 2011) comprende un grupo de ranas venenosas de tamaño pequeño

(<20mm) con coloración dorsal brillante en la mayoría de los casos, solo Andinobates

abditus exhibe un patrón dorsal negro o marrón y no presentan membranas

interdigitales.

En Colombia, actualmente se encuentran 11 de las 13 especies reportadas para el

género, lo que permite argumentar que este género con tan amplia diversificación en el

país, ha debido soportar unos procesos de especiación importantes e interesantes de

investigar.

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Figura 1. Línea evolutiva de los tetrápodos.

Fuente. Clack J. A. (2004). From Fins to Fingers. Science, 304, p58

3.2 LA LLAMADA EN ANUROS

La señal acústica es la principal forma de comunicación de los anuros en el mundo (Vitt

& Caldwell, 2009) y su éxito biológico esta medido en su capacidad de comunicarse

con fines reproductivos. La mayoría de las ranas macho producen una variedad de

cantos o llamadas que son específicos (Bogert, 1960), basados en la especificidad-

especie, las características del canto de anuncio o publicidad son frecuentemente

usadas como parámetro taxonómico para delimitar especies de grupos complejos de

ranas (De la Riva et al., 1996; Angulo & Reichle, 2008, Rodríguez et al., 2010; Funk et

al., 2012).

La territorialidad en Dendrobátidos ha sido ampliamente reportada (Lötters et al., 2007;

Vitt & Caldwell, 2009). Esta territorialidad suele mantenerse gracias a la señalización

acústica que es el principal modo de comunicación en Anuros (Narins et al., 2007; Vitt

& Caldwell, 2009). Dentro del repertorio vocal en anuros, el llamado de anuncio (Wells,

1977) es el tipo de “canto” más difundido, este puede dar un detalle tanto a hembras

como a machos conespecíficos del tamaño, posición y hasta la identidad del emisor

(Wells & Schwartz, 2007), aspectos que tienen el potencial de afectar el éxito del

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apareamiento, por lo que esta actividad es considerada un fuerte mecanismo de

selección sexual (Gerhardt, 1994) y por lo tanto de aislamiento reproductivo (Duellman

& Trueb, 1994).

3.3 PRODUCIÓN DE LA LLAMADA

La forma en que se produce la llamada en los anuros es relativamente sencilla; no

obstante, la gran diversidad de llamadas y coros contrasta con su sencillez. Algunas

llamadas pueden consistir desde una simple nota, hasta complejos sonidos pulsados

con una estructuración temporal compleja (Wells & Schwartz, 2007). El aire ingresa a

los pulmones por presión durante la inspiración, seguidamente el aire es forzado a salir

por la contracción muscular del tronco y pasa por la laringe donde se genera el sonido

por la vibración de las cuerdas vocales (Wells, 2007; Walkowiak, 2007) (Figura 2); no

obstante, es importante precisar que este proceso presenta algunas excepciones como

en la familia Pipidae donde la producción del sonido se genera bajo el agua debido a la

perdida de las cuerdas vocales (Walkowiak, 2007) esto fue comprobado por Yager

(1992) quien descubrió en Xenopus borealis la modificación y calcificación de cartílagos

en la laringe como respuesta a la ausencia de las cuerdas vocales. Otras excepciones

son la producción de sonidos tanto en la inspiración como expiración en el caso de

Discoglossus (Weber, 1974) y Bombina que genera sus cantos en el proceso de

inspiración (Lörcher, 1969).

3.4 TIPOS DE LLAMADAS

3.4.1 Llamada de Anuncio o Publicidad. La llamada de anuncio o publicidad es el tipo

de llamada más reconocida en los Anuros, esta puede dar un detalle tanto a hembras

como a machos conespecíficos del tamaño, posición y hasta la identidad del emisor

(Wells & Schwartz, 2007). Dentro de la familia Dendrobatidae, los Andinobates no son

la excepción debido a que prácticamente todas las descripciones de las especies han

reportado este tipo de llamada como referente para cada especie (Myers & Daly, 1976;

Bernal et al., 2007; Twomey et al., 2011; Amézquita et al., 2013).

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3.4.2 Llamadas de Cortejo Masculino. Puede ser considerado como una modificación

de la llamada de anuncio, debido a que esta influenciado por la cercanía o presencia de

hembras grávidas, los cantos de cortejo son a menudo prolongaciones en la duración y

repetición de notas, pulsos o trinos (Wells, 2007; Wells & Schuratz, 2007; Vitt &

Caldwell, 2009).

3.4.3 Llamadas de Cortejo en Hembras. Son llamadas poco usuales producidos por

hembras, este tipo de llamada ha sido ampliamente estudiada en ranas del género

Alytes y supone una forma para que los machos puedan encontrar a las hembras para

efectos de la reproducción; no obstante, parece ser que este tipo de llamada no esta

ampliamente distribuida dentro de los Anuros. Por otro lado, Wells y Schuartz (2007)

proponen que esta llamada puede ser más recurrente de lo esperado dentro del orden

Anura y su poco conocimiento puede obedecer más a las características propias del

sonido que impiden su fácil distinción.

3.4.4 Llamadas Agresivas, de Emergencia o de Alarma. Este tipo de llamada se da

como respuesta a la presencia de un macho en la proximidad del territorio de otro

macho, o también son pequeñas llamadas modificadas que se dan cuando el emisor es

atrapado por alguna depredador o cuando son manipulados por personas (Vitt &

Caldwell, 2009).

3.5 MORFOMETRÍA

La morfometría como lo define Roth y Mercer (2000), es una caracterización

cuantitativa para el análisis y comparación de las formas biológicas, que se apoya de la

estadística para determinar la variabilidad o distribución en la forma de los individuos y

así transformar los datos cualitativos en resultados cuantitativos más claros.

En ocasiones, la sistemática de un taxón puede ser ambigua y por consiguiente

confusa, técnicas de análisis multivariante morfométrico a través de caracteres

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morfológicos han permitido dilucidar complejos sistemáticos en diferentes taxones

(Rooijen & Vogel, 2008; Vences et al., 2010; Riyanto et al., 2011; Fouquet et al., 2012;

Moço et al., 2012). Dentro de los anuros, enfoques integrativos que combinen dos o

más aspectos como la morfometría, bioacústica y/o genética han permitido reconocer

ampliamente la diversidad críptica en diferentes grupos de Anuros (Vences et al., 2010;

Fouquet et al., 2012; Funk et al., 2012). Por ende, la morfometría como herramienta es

un enfoque acompañante común en el estudio de las relaciones evolutivas de las

especies.

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Figura 2. Producción de la llamada en Bombina orientalis. (A) Descripción de la

oscilación bucal, (B) Inflación de los pulmones, (C) Llamada con respecto al flujo de

aire. Las flechas continuas indican la secuencia del movimiento en un solo ciclo y las

flechas punteadas muestran la transición de los diferentes movimientos respiratorios y

de canto.

Fuente. Narins et al., (2007). Hearing and Sound Communication in Amphibians. p93.

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4. METODOLOGÍA

4.1 ÁREA DE ESTUDIO

Este estudio se realizó en cinco localidades de tres Departamentos donde se

estudiaron cuatro especies de Andinobates y dos poblaciones aisladas, para el caso de

A. dorisswansonae (Tabla 1, Figura 3).

Tabla 1. Resumen de localidades y selección de las especies.

Especies Localidad Coordenadas

(WGS 84)

Elevación Autor

Andinobates

opisthomelas

Sonsón (Antioquia) N 5º46’39.1’’

W 75º17’45.9’’

2.211m Boulenger, 1899

Andinobates

cassidyhornae

Jardín (Antioquia) N 5º29’76.1’’

W 75º53’34.9’’

2.091m Amézquita et al.,

2013

Andinobates

dorisswansonae

Falan (Tolima) N 5º02’19.1’’

W 75º04’96.9’’

1.763m Rueda-Almonacid

et al., 2006

Andinobates

dorisswansonaeL

Líbano (Tolima) N 4º89’13.5’’

W 75º10’34.9’’

2.188m Este estudio

Andinobates

minutus

Buenaventura (Valle

del Cauca)

N 3º56’08.7’’

W 77º21’01.9’’

22m Shreve, 1935

4.2 ANÁLISIS MORFOMÉTRICO

Ocho variables morfológicas recurrentes en la taxonomía de Andinobates fueron

medidas in vivo por la misma persona con un calibrador digital Mitutoyo Absolute CD-

6”CSX. Las medidas fueron longitud rostro-cloaca (SVL), longitud de la tibia (T), la

distancia inter-orbital (IO), la distancia inter-nasal (IN), la longitud del disco tres (D3) y

cuatro (D4) de la pata posterior derecha, el diámetro horizontal del ojo (E) y el ancho de

la cabeza (HW), medido justo detrás de los ojos (Figura 4).

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4.3 ANÁLISIS ACÚSTICO

Las ranas venenosas del género Andinobates muestran un llamado de anuncio similar

a un zumbido de insecto, consistente en múltiples pulsos (Myers & Daly, 1976; Lötters

et al., 2002; Brown et al., 2011) con variación de la amplitud pero no en la frecuencia

(Erdtmann & Amézquita, 2009). En este análisis se tomó la definición de McLister et al.,

(1995) para determinar el llamado de las especies evaluadas como de tipo pulsado, sin

presencia de notas, contrario a lo propuesto por Twomey et al., (2011).

Las llamadas de anuncio grabadas fueron espontaneas. Un total de 160 llamadas de

59 individuos se analizaron. Las grabaciones se hicieron con un micrófono profesional

supercardio Audio-Technica AT897 acoplado a un boompole K-Tek KE-89CC en una

grabadora profesional Tascam DR-100. La temperatura del aire se registró con un

termo-higrómetro RH 101 Extech IR. Debido a que los anfibios son ectotermos y

dependen de la temperatura ambiente para regular su metabolismo, por lo cual las

variaciones de la temperatura pueden afectar la tasa metabólica y por ende la actividad

vocal. Las llamadas fueron analizadas a través de Raven V.1.4 (Cornell Laboratory of

Ornithology, NY, USA) a 44,1 kHz y 16 bits, Los espectros fueron analizados con una

rápida transformación de Fourier bajo el algoritmo de Blackman a 724 muestras y una

red de frecuencias DFT de 2048. Para determinar el ancho de banda, se midieron las

frecuencias más alta y mas baja a 10dB por debajo de la frecuencia pico.

Las características acústicas analizadas fueron una combinación de parámetros

espectrales y temporales (Figura 5). Se analizó la duración del pulso inicial (IP), medida

como el tiempo promedio de los tres primeros pulsos; la duración del pulso a media

llamada (MP), medida como el tiempo promedio de tres pulsos justo a la mitad de la

llamada; la duración del pulso final (FP), medida como el tiempo promedio de duración

de los tres últimos pulsos (debido a que en muchos casos múltiples pulsos se solapan

al final de la llamada, los pulsos medidos fueron los inmediatamente anteriores a

estos), la duración del intervalo silencioso entre pulsos iniciales (IIP), medida como el

tiempo promedio de los tres primeros intervalos silenciosos; la duración del intervalo

24

silencioso a media llamada (MIP), medida como el tiempo promedio de tres intervalos

silenciosos entre pulsos justo a la mitad de la llamada; la duración del intervalo

silencioso entre pulsos al final (FIP) medida como el tiempo promedio de los tres

últimos intervalos silenciosos entre pulsos, el número de pulsos totales en la llamada

(P), el número de pulsos solapados en la llamada (OP), medido como la totalidad de

pulsos que se unían entre sí y no presentaban intervalo silencioso; la duración de la

llamada (CT), la tasa de repetición de pulsos (PR) medida como el valor de P/CT; la

tasa de repetición de pulsos solapados (OPR), medida como el valor de OP/CT; la

frecuencia pico o de mayor energía (PF), la frecuencia más baja (LF), la frecuencias

más alta (HF), el delta de frecuencias (DF), el ancho de banda inter-cuartiles (IQR-BW)

tomado como la diferencia entre las frecuencias en el primer y tercer cuartil, el ancho

de banda al 90% (BW90%) medido como la diferencia de frecuencias entre el 5 y el

95%.

4.4 ANÁLISIS DE DISTANCIAS GENÉTICAS

Las muestras de tejido para análisis moleculares se obtuvieron a partir de frotis (swabs)

bucales preservados en seco de 4 individuos de A. aff dorisswansonae (Líbano) y 3 de

A. opisthomelas (Sonsón). ADN genómico fue extraído por medio de un kit de sangre y

tejido QIAGEN DNeasy. Las muestras y extracciones fueron almacenadas a -20ºC. El

gen amplificado fue Citocromo b (Cytb:700pb) utilizando primers CytbDen3-L y

CytbDen1-H (Santos & Cannatella, 2011). Los ciclos de PCR consistían en un inicial de

2min a 95°C y 30-35 ciclos de 30sg a 95°C, 1min a 45°C , 1:30min a 72°C y una

extensión final pasada por 6min a 72°C. También se obtuvieron secuencias de genes

Cytb de otros Andinobates publicados previamente (Brown et al., 2011; Amézquita et

al., 2013) bajo el mismo protocolo descrito. Las secuencias homólogas obtenidas, así

como las secuencias disponibles en GenBank (Tabla 12), fueron alineadas utilizando

MUSCLE (Edgar, 2004) bajo parámetros estándares implementados en Geneious

v4.8.5 (Drummond et al., 2010). Con el producto obtenido se construyó un árbol

filogenético bajo el método Neighbor-Joining con 1000 bootstrap en el modelo Tamura-

Nei. Las distancias genéticas de las secuencias Cytb se calcularon bajo el modelo

25

Kimura de dos parámetros (Kimura, 1980) usando MEGA 5.2 (Tamura et al., 2011).

4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Previo a los análisis se comprobó la distribución normal de las variables tanto acústicas

como morfométricas y se escogieron las variables con distribución normal y menor

coeficiente de variación. Seguido a esto se realizaron pruebas multivariadas y

univariadas. Para determinar si se pueden hacer inferencias entre las relaciones

filogenéticas y las variables acústicas y/o morfológicas evaluadas se realizó un análisis

discriminante para cada tipo de datos y se comprobaron los resultados para todas las

especies y las especies del grupo bombetes. Las distancias acústicas y morfométricas

se calcularon usando la distancia euclidiana entre los centroides de las poblaciones a

través de un análisis discriminante bajo el programa ImageJ v1.46r. Para determinar la

distancia geográfica se utilizaron las coordenadas en Google Earth v7.1.1.1888 y se

midió la distancia lineal entre estas. Finalmente las distancias acústicas, morfométricas,

genéticas y geográficas se correlacionaron en una prueba de mantel con 9999

repeticiones bajo el programa R v3.0.1 (Package ade4 v1.5-2) en Mac OS X. El resto

de los análisis se realizó en el programa IBM SPSS Statistics 20 en Mac Os X.

26

Figura 3. Distribución geográfica de las especies de estudio. De arriba hacia abajo:

Andinobates cassidyhornae, A. opisthomelas, A. dorisswansonae, A. dorisswansonaeL

y A. minutus.

Fuente. Autor

27

Figura 4. Medidas morfométricas evaluadas en las especies de estudio. (1) SVL, (2) T,

(3) IO, (4) IN, (5) D4, (6) D3, (7) E y (8) HW. Andinobates opisthomelas.

Fuente. Ilustración por Ted R. Kahn.

28

Figura 5. Características temporales y espectrales medidas en el llamado de las

especies de estudio. (A y B) (Forma) de la onda, (C) espectrograma y (D) espectro de

poder. El área dentro de la caja roja y sombreada de color rojo indican el ancho de

banda medido a 10dB. (1) Indica la forma del pulso, (2) pulsos solapados, (3) intervalo

silencioso entre pulsos, (4) pulsos totales, (5) frecuencia pico, (6) frecuencia más baja y

(7) frecuencia más alta.

Fuente. Autor

1 2

3

4

5

7 6

A

B

C

D

29

5. RESULTADOS

5.1 RESULTADOS MORFOMÉTRICOS

Tabla 2. Resumen de medidas morfométricas colectadas para las especies de estudio.

(L) Nueva localidad y nuevo patrón de coloración críptico Líbano, Tolima. Las unidades

están en milímetros.

Especies

Parámetro A.

opisthomelas

A.

cassidyhornae

A.

dorisswansonae

A.

dorisswansonaeL

A.

minutus

N 20 20 24 22 9

SVL Rango 16.31-20.06 17.59-19.87 16.01-18.28 16.87-19.42 11.49-12.3

X 18.45 18.77 17.19 18.24 11.88

SD 0.97 0.64 0.56 0.80 0.34

T Rango 7.17-8.44 7.81-8.76 7.33-8.17 7.17-8.81 4.49-5.73

X 8.06 8.32 7.77 8.28 4.99

SD 0.41 0.25 0.22 0.29 0.34

IO Rango 1.99-2.32 1.80-2.28 1.98-2.59 2,01-2.65 1.38-1.76

X 2.14 1.96 2.21 2.40 1.58

SD 0.10 0.13 0.18 0.18 0.12

IN Rango 2.40-2.92 2.34-2.82 2.27-2.83 2.52-2.96 1.88-2.13

X 2.69 2.58 2.57 2.74 2.01

SD 0.15 0.15 0.11 0.10 0.09

D4 Rango 0.70-0.92 0.68-0.96 0.51-0.90 0.64-0.93 0.44-0.61

Mean 0.79 0.85 0.76 0.72 0.48

SD 0.06 0.08 0.09 0.06 0.05

D3 Rango 0.42-0.87 0.53-0.84 0.51-0.83 0.54-0.83 0.37-0.41

X 0.73 0.72 0.67 0.65 0.39

SD 0.10 0.08 0.09 0.09 0.01

E Rango 1.91-2.63 2.13-2.76 2.15-2.78 2.19-2.81 1.61-1.74

X 2.37 2.41 2.52 2.44 1.70

SD 0.17 0.17 0.15 0.20 0.04

HW Rango 5.76-6.43 4.83-6.52 5.34-6.20 5.69-6.70 4.18-4.47

X 6.10 5.89 5.76 6.11 4.29

SD 0.19 0.47 0.22 0.23 0.09

30

Figura 6. Pruebas univariadas para cada variable morfométrica medida en las especies

de estudio. (*) ANOVA solo para el grupo bombetes. Los gráficos de la izquierda SVL,

IN, E; centro T, D4, HW y derecha IO y D3.

F = 178.944 P < 0.000

*F = 18.677 P < 0.000

F = 224.538 P < 0.000

*F = 16.275 P < 0.000

F = 60.831 P < 0.000

*F = 30.304 P < 0.000

F = 64.968 P < 0.000

*F = 9.795 P < 0.000

F = 42.024 P < 0.000

*F = 11.200 P < 0.000

F = 32.447 P < 0.000

*F = 3.736 P = 0.014

F = 46.411 P < 0.000

*F = 2.640 P = 0.055

F = 84.404 P < 0.000

*F = 7.286 P < 0.000

De izquierda a derecha:

A. opisthomelas

A. cassidyhornae

A. dorisswansonae

A. dorisswansonaeL

A. minutus

Fuente. Autor

31

Figura 7. ADC morfométrico para todas las especies de estudio. Cada punto pertenece

a un individuo, 8 variables morfométricas fueron medidas.

Fuente. Autor

32

Tabla 3. Tabla de correlaciones intra-grupos combinadas entre las variables

discriminantes y las funciones discriminantes canónicas tipificadas morfométricas. En

negrita las variables con mayor correlación absoluta y la función discriminante.

Matriz de estructura

Función

1 (86.4%) 2 (11.2%) 3 (1.5%) 4 (0.8%)

SVL 0.679 -0.294 0.096 -0.310

T 0.801 -0.118 -0.417 0.062

IO 0.315 0.718 -0.034 0.334

IN 0.400 0.240 0.366 -0.275

D4 0.304 -0.438 0.070 0.757

D3 0.270 -0.204 0.437 0.489

HW 0.467 0.106 0.402 -0.142

Tabla 4. Prueba estadística para el ADC morfométrico de todas las especies.

Contraste de las funciones Lambda de Wilks Chi-Cuadrado gl Sig.

1 a la 4 0.014 377.073 28 0.000

2 a la 4 0.227 130.570 18 0.000

3 a la 4 0.680 33.880 10 0.000

4 0.869 12.369 4 0.015

33

Figura 8. ADC morfométrico del grupo bombetes. Cada punto pertenece a un individuo,

8 variables morfométricas fueron medidas

.

Fuente. Autor

34

Tabla 5. Tabla de correlaciones intra-grupos combinadas entre las variables

discriminantes y las funciones discriminantes canónicas tipificadas morfométricas del

grupo bombetes. En negrita las variables con mayor correlación absoluta y la función

discriminante.

Matriz de estructura

Función

1 (61%) 2 (28.9%) 3 (10.1%)

SVL -0.320 0.632 -0.084

T -0.152 0.627 -0.528

IO 0.672 0.223 0.019

IN 0.191 0.473 0.262

D4 -0.416 -0,078 -0.007

D3 -0.202 0.035 0.323

E 0.098 -0.233 -0.191

HW 0.062 0.457 0.267

Tabla 6. Prueba estadística para el ADC morfométrico del grupo bombetes.

Contraste de las funciones Lambda de Wilks Chi-Cuadrado gl Sig.

1 a la 3 0.103 179.614 24 0.000

2 a la 3 0.343 84.510 14 0.000

3 0.722 25.723 6 0.000

Los resultados separaron morfométricamente a las especies. Se observó claramente

que la relación morfométrica entre las especies del grupo bombetes (A. opisthomelas,

A. cassidyhornae, A. dorisswansonae y A. dorisswansonaeL) son más constreñidas

(Figura 7). Las relaciones morfométricas entre todas las especies del grupo bombetes

permiten separar de forma destacada a A. minutus (grupo minuta) en concordancia con

las relaciones filogenéticas (Figura 16).

35

Las pruebas multivariadas morfométricas mostraron diferencias importantes entre todas

las especies y las especies de solo el grupo bombetes (Wilks’ Lambda T2 = 23.746 P <

0.000; T2 = 10.816 P < 0.000 solo el grupo bombetes). Un análisis más detallado, bajo

una prueba univariada indicó que el diámetro del ojo es la única característica

morfológica que no presenta diferencias (F = 2.640 P = 0.055), aunque sólo cuando se

analizan por separado las especies del grupo bombetes (Figura 6). En general, las

respuestas morfométricas de las especies se comportan de forma diferencial, por lo

que no existe un patrón de respuesta particular.

El ADC morfométrico separó correctamente el 78.9% de los individuos medidos para

los grupos pronosticados (Figura 7). De los 96 individuos, 20 (21.1%) casos fueron mal

clasificados. A. opisthomelas, A. cassidyhornae, A. dorisswansonae y A.

dorisswansonaeL presentaron 7, 4, 4 y 5 muestras mal clasificadas respectivamente.

Solo en A. minutus todos los individuos fueron perfectamente clasificados. Cuatro

funciones fueron extraídas, todas significativas (Tabla 3 y 4). La función 1 y 2 indicaron

el 97.6% de la variabilidad entre los grupos. La primera función determinada por la

longitud de la tibia (T) explico el 86.4% de la variabilidad, por lo que esta función

prácticamente esta representando la clasificación de los grupos. La función 2 explicó el

11.2% y esta determinada por la distancia inter-orbital (IO). El eje de la primera función

separó claramente A. minutus de las demás especies debido a su reducido tamaño; por

otro lado, el eje de la función 2 muestra la separación de las especies del grupo

bombetes (Figura 7).

El ADC de las variable morfométricas del grupo bombetes, separó correctamente el

83.7% de las muestras (Figura 8) de los grupos originales. De los 86 individuos, 13

casos fueron mal clasificados, lo que representó el 16.3%. 6 muestras de A.

opisthomelas, 4 de A. cassidyhornae, 1 de A. dorisswansonae y 3 de A.

dorisswansonaeL fueron mal clasificadas. Este ADC indicó 3 funciones muy

significativas que se extrajeron (Tabla 5 y 6). Las dos primeras funciones mostraron el

89.9% de la variabilidad entre los grupos. La primera función determinada por la

36

distancia inter-orbital (IO) explicó el 61% de la variabilidad de los grupos, la función 2

explicó el 28.9% y esté determinada por la longitud rostro-cloaca (SVL).

La SVL se correlacionó de forma negativa con la PF como era de esperarse (Figura

14). Aunque la correlación entre la distancia geográfica y morfométrica, y la distancia

genética y morfométrica fue positiva, esta no fue significativa cuando se evaluaron solo

las especies del grupo bombetes (Figura 15).

37

5.2 RESULTADOS ACÚSTICOS

Tabla 7. Resumen de los resultados acústicos para las especies de estudio. (L) Nueva

localidad y nuevo patrón de coloración críptico Líbano, Tolima. Unidades de IIP, MIP,

FIP y CT en segundos y PF, LF y HF en Hertz.

Especies

Parámetro A.

opisthomelas

A.

cassidyhornae

A.

dorisswansonae

A. aff

dorisswansonaL

A. minutus

N 11 9 9 18 12

IIP Rango 0.014-0.003 0.004-0.009 0.009-0.020 0.008-0.018 0.002-0.005

X 0.008 0.007 0.015 0.012 0.003

SD 3.04 1.80 4.52 3.10 0.97

MIP Rango 0.005-0.009 0.003-0.006 0.006-0.010 0.007-0.013 0.003-0.005

X 0.006 0.005 0.008 0.010 0.004

SD 1.29 0.88 1.20 1.77 0.58

FIP Rango 0.004-0.011 0.003-0.011 0.007-0.013 0.008-0.016 0.003-0.005

X 0.006 0.005 0.010 0.012 0.004

SD 2.63 2.59 2.13 2.90 0.65

P Rango 160-250 160-236 125-161 128-185 108-144

X 201 200 145 149 124

SD 32.96 19.58 11.61 16.96 10.00

PR Rango 91.0-103.0 94.0-111.0 52.0-72.0 54.0-71.0 107.0-126.0

X 95.9 101.3 64.7 61.9 120.6

SD 3.88 6.40 6.56 5.06 6.20

CT Rango 1.663-2.564 1.454-2.243 1.989-2.493 1.909-3.012 0.970-1.119

X 2.090 1.987 2.252 2.422 1.028

SD 0.33 0.24 0.16 0.31 0.04

PF Rango 4234.4-4916.7 4177.4-4593.8 4572.2-5175.2 4191.8-4844.9 5986.3-6955.2

X 4552.6 4353.7 4929.7 4478.1 6528.8

SD 199.37 151.27 167.71 231.39 245.02

LF Rango 3686.3-4010.4 3591.0-4078.7 4244.1-4673.1 3490.1-4460.0 5549.5-6172.8

X 4010.4 3867.2 4421.7 4006.1 5980.8

SD 236.17 173.90 149.98 291.45 194.59

HF Rango 4642.2-5284.2 4566.5-5054.3 4900.1-5410.3 4502.0-5393.4 6540.1-7181.9

X 4931.5 4764.6 5261.3 4902.1 6907.7

SD 210.64 190.69 153.71 264.55 218.27

38

Figura 9a. Visualización temporal y espectral de las llamadas de anuncio. (1) A.

opisthomelas (2) A. cassidyhornae y (3) A. dorisswansonae. Arriba amplitud de la onda,

abajo espectrograma. La línea indica la escala a 1sg, números de la izquierda en kHz.

1

2

3

39

Figura 9b. Visualización temporal y espectral de las llamadas de anuncio. (1)

Andinobates dorisswansonaeL y (2) A. minutus. Arriba amplitud (forma) de la onda,

abajo espectrograma. La línea indica la escala a 1sg, los números de la izquierda en

kHz.

Fuente. Autor

1

2

40

Figura 10. Pruebas univariadas para las variable acústicas con bajo coeficiente de

variación. (*) ANOVA solo para el grupo bombetes. De izquierda a derecha: A.

opisthomelas, A. cassidyhornae, A. dorisswansonae, A. dorisswansonaeL y A. minutus.

Gráficos de arriba IIP, MIP, FIP; centro P, PR, CT y abajo PF, LF y HF.

F = 29.367 P < 0.000

*F = 12.534 P < 0.000

F = 50.914 P < 0.000

*F = 35.132 P < 0.000

F = 24.884 P < 0.000

*F = 17.977 P < 0.000

F = 33.459 P < 0.000

*F = 22.970 P < 0.000

F = 257.322 P < 0.000

*F = 167.144 P < 0.000

F = 59.371 P < 0.000

*F = 5.914 P = 0.002

F = 220.769 P < 0.000

*F = 14.211 P < 0.000

F = 175.189 P < 0.000

*F = 9.409 P < 0.000

F = 193.536 P < 0.000

*F = 8.319 P < 0.000

Fuente. Autor

41

Figura 11. Ancho de banda de las frecuencias para las especies de estudio. Cuadro

naranja indica el promedio de la frecuencia más alta, el rombo gris el promedio de la

frecuencia más baja y los cuadros de color azul indican el ancho de banda de las

especies. De izquierda a derecha A. opisthomelas, A. cassidyhornae, A.

dorisswansonae, A. dorisswansonaeL y A. minutus. Escala en Hertz.

Fuente. Autor

3700

4200

4700

5200

5700

6200

6700HF LF

42

Figura 12. ADC acústico para todas las especies evaluadas. Cada punto pertenece a

un individuo, 9 variables acústicas fueron significativas.

Fuente. Autor

43

Tabla 8. Tabla de correlaciones intra-grupos combinadas entre las variables

discriminantes y las funciones discriminantes canónicas tipificadas acústicas. En

negrita las variables con mayor correlación absoluta y la función discriminante.

Matriz de estructura

Función

1 (75.6%) 2 (22.7%) 3 (1.4%) 4 (0.3%)

IIP -0.219 0.213 -0.457 0.010

MIP -0.257 0.375 0.461 0.618

FIP -0.173 0.273 0.410 0.197

P -0.126 -0.437 -0.226 0.349

PR 0.647 -0.722 -0.112 -0.100

CT -0.362 0.062 0.051 0.292

PF 0.670 0.374 -0.360 0.376

LF 0.594 0.354 -0.255 0.144

HF 0.629 0.348 -0.173 0.329

Tabla 9. Prueba estadística para el ADC de las variables acústicas para todas las

especies.

Contraste de las funciones Lambda de Wilks Chi-Cuadrado gl Sig.

1 a la 3 0.001 332.534 36 0.000

2 a la 3 0.050 152.471 24 0.000

3 a la 4 0.552 30.318 14 0.007

4 0.901 5.329 6 0.502

44

Figura 13. ADC acústico para las especies del grupo bombetes. Cada punto pertenece

a un individuo, 9 variables acústicas fueron medidas.

Fuente. Autor

45

Tabla 10. Tabla de correlaciones intra-grupos combinadas entre las variables

discriminantes y las funciones discriminantes canónicas tipificadas acústicas para el

grupo bombetes. En negrita las variables con mayor correlación absoluta y la función

discriminante.

Matriz de estructura

Función

1 (90.8%) 2 (8.3%) 3 (0.8%)

IIP -0.234 0.239 -0.078

MIP -0.389 -0.404 -0.487

FIP -0.276 -0.330 -0.103

P 0.330 0.019 -0.422

PR 0.890 0,330 0.062

CT -0.154 -0.210 -0.284

PF -0.133 0.734 -0.363

LF -0.128 0.558 -0.094

HF -0.117 0.528 -0.270

Tabla 11. Prueba estadística para el ADC de las variables acústicas de las especies

del grupo bombetes.

Contraste de las funciones Lambda de Wilks Chi-Cuadrado gl Sig.

1 a la 3 0.024 146.676 27 0.000

2 a la 3 0.379 38.327 16 0.001

3 0.885 4.832 7 0.680

46

Figura 14. Relaciones entre la temperatura, variables acústicas y tamaño corporal de

las especies de estudio. (*) Indica que la ANOVA solo se hizo con las especies del

grupo bombetes.

Relación PF-SVL

R2 Lineal = 0.909

F = 459.34 P < 0.000

*Relación PF-SVL

R2 Lineal = 0.471

F = 32.942 P < 0.000

Relación CT-T

R2 Lineal = 0.553

F = 56.926 P = 0.000

*Relación CT-T

R2 Lineal = 0.099

F = 4.070 P = 0.051

*Relación P-T

R2 Lineal = 0.140

F = 1.277 P = 0.264

Relación P-T

R2 Lineal = 0.027

F = 6.004 P = 0.019

Relación PR-T

R2 Lineal = 0.514

F = 48.598 P < 0.000

*Relación PR-T

R2 Lineal = 0.207

F = 9.680 P = 0.004

Fuente. Autor

Las pruebas multivariadas acústicas al igual que las morfométricas, mostraron

diferencias importantes entre todas las especies (Wilks’ Lambda T2 = 16.472 P < 0.000

para todas las especies; T2 = 7.196 P < 0.000 solo el grupo bombetes). De las 17

variables iniciales, solo 9 fueron seleccionadas debido a su significancia para el análisis

acústico (Tabla 7 y Figura 10). De la misma forma que las variables morfométricas, los

resultados acústicos fueron diferenciales sin ningún patrón.

Inicialmente las variables acústicas a probar fueron 11 parámetros temporales y 6

espectrales; sin embargo, los resultados obtenidos indicaron que sólo 6 parámetros

temporales y 3 espectrales fueron importantes en el análisis. Al igual que en los

47

resultados morfométricos las respuestas en las variables temporales fueron

diferenciales, lo que no sucedió con las características espectrales que siguieron un

único patrón. Indicando como era de esperarse que las especies con SVL menor

presentaron una mayor PF, en este caso la frecuencia fue mayor para las especies A.

minutus seguido por A. dorisswansonae. Por otro lado, la PF más baja fue la de A.

cassidyhornae lo que puede verse como un resultado esperado debido a que la SVL

promedio fue la mayor con 18.77mm (Tabla 2 y Grafica 6), esta relación se comprobó a

través de una regresión lineal (Figura 14)

El ADC acústico para todas las especies evaluadas, separó correctamente el 88.1% de

los individuos medidos para los grupos pronosticados (Figura 12). De los 59 individuos,

2 de A. opisthomelas, 2 de A. cassidyhornae, 1 de A. dorisswansonae y 2 de A.

dorisswansonaeL fueron mal clasificados, lo que representó el 11.9%. Cuatro funciones

fueron extraídas, tres de estas significativas (Tabla 8 y 9). Las funciones 1 y 2

mostraron el 98.3% de la variabilidad entre los grupos. La primera función determinada

por la frecuencia con más energía o frecuencia pico (PF) explicó el 75.6% de la

variabilidad. La función 2 explicó el 22.7% y está determinada por la tasa de repetición

de los pulsos (PR).

Por otro lado, el ADC acústico sólo con las especies del grupo bombetes (Figura 13)

extrajo tres funciones, las dos primeras fueron muy significativas (Tabla 10 y 11) y

representaron el 99.2% de la variabilidad entre las especies. La función 1 fue dominada

por la tasa de repetición de los pulsos (PR) con un 90.8% de la variabilidad, lo que

indica que esta función prácticamente esta representando la discriminación de las

especies. La función 2 determinada por la frecuencia pico (PF) represento el 8.3% de la

variabilidad. 47 individuos fueron analizados, de estos 2 de A. opisthomelas, 2 de A.

cassidyhornae y 1 de A. dorisswansonaeL fueron mal clasificados, lo que representó el

10.6%, el restante 89.4% de los individuos fueron correctamente clasificados.

48

El ancho de banda se calculó como el rango entre los valores promedio de la

frecuencia más alta y la frecuencia más baja, los datos de estas frecuencias fueron

tomados a 10dB por debajo de la frecuencia pico (Figura 11).

Los resultados de la correlación entre temperatura y parámetros temporales como CT,

P y PR mostraron que la temperatura actúa de forma negativa sobre la duración de la

llamada y positiva sobre la tasa de pulsos por llamada; sin embargo, la relación entre

temperatura y la totalidad de los pulsos en la llamada no mostraron una relación,

siendo los resultados demasiado variables cuando se evalúan todas las especies y sólo

las especies del grupo bombetes (Figura 14).

Finalmente una relación positiva y significativa se obtuvo entre las relaciones genética y

acústica; y geográfica y acústica; aunque la distancia genética y acústica no se pueden

correlacionar significativamente cuando se analiza sólo las especies del grupo

bombetes (Figura 15).

49

5.3 RESULTADOS GENÉTICOS

Tabla 12. Distancias genéticas derivadas del gen Cytb (700pb) para las especies de

estudio. En negrita la distancia genética entre las poblaciones de A dorisswansonae.

(F) Población de Falan y (L) población de Líbano. (1) Amézquita et al., (2013), (2) este

estudio y (3) Brown et al., (2011)

Distancias genéticas

A.

minutus

A.

cassidyhornae

A.

opisthomelas

A.

dorisswansonae

A.

dorisswansonaeL

A. cassidyhornae1 0.1579 - - - -

A. opisthomelas2 0.1557 0.0287 - - -

A. dorisswansonae3 0.1719 0.1183 0.1309 - -

A. dorisswansonaeL2 0.1730 0.1206 0.1332 0.0029 -

A. tolimensis3 0.1581 0.0425 0.0455 0.1259 0.1277

50

Figura 15. Distancias genéticas y geográficas correlacionadas con la acústica y

morfometría para las especies de Andinobates de estudio. La distancia acústica en el

eje vertical arriba, distancia morfométrica en el eje vertical centro y distancia genética

en el eje vertical abajo. (*) Prueba de Mantel para solo el grupo bombetes. En negrita

pruebas no significativas.

r = 0.809 P < 0.000 *r = 0.534 P = 0.041 r = 0.799 P < 0.000 *r = 0.913 P =0.064

r = 0.886 P = 0.002 *r = -0.110 P = 0.537 r = 0.251 P = 0.090 *r = -0.241 P =0.847

r = 0.493 P = 0.0031 *r = 0.732 P = 0.033

Distancia Genética

Distancia Geográfica

Fuente. Autor

51

Figura 16. Integración de la distribución geográfica (1), relaciones filogenéticas (2), y

relaciones morfométricas (3) para las especies de estudio.

.

Fuente. Autor

1

2

3

52

Figura 17. Integración de la distribución geográfica (1), relaciones filogenéticas (2), y

relaciones acústicas (3) para las especies de estudio.

Fuente. Autor

El alineamiento final consistió de 700pb (Gen Cytb). La topología del árbol filogenético

(Figura 16 y Figura 17) mostró inequívocamente que la población de Andinobates

presente en el municipio de Líbano (Tolima) forma un grupo monofilético con A.

dorisswansonae (Falan, Tolima), por lo que estos resultados revelan que esta debe

1

2

3

53

considerarse como una población y no como una nueva especie. De igual forma, la

topología es altamente recíproca con Amézquita et al., (2013) y refleja como las

poblaciones de Sonsón y Guatape se agrupan formando un clado que concuerda con

una distribución geográfica hacia la zona suroriente de Antioquia, separando así la

población A. aff opisthomelas de Amalfi (Norte del Departamento de Antioquia) y

sugiriendo estos resultados lo que puede ser un posible caso de especies crípticas que

debe ser evaluado en futuras investigaciones.

Adicionalmente, los resultados obtenidos a través de la prueba de distancias genéticas

(K2P, Tabla 12) indican que existe muy poca divergencia genética (0.0029) entre las

poblaciones de Andinobates de los municipios de Líbano y Falan probablemente

debido a la cercanía geográfica (<12km en línea recta), por lo que ambas deben ser

consideradas como A. dorisswansonae.

Por otro lado, la morfometría no pudo correlacionarse con distancia geográfica o

genética (Figura 15), caso contrario de la distancia acústica que si se correlaciono con

la distancia geográfica y genética; no obstante, cuando se analizo la correlación entre

distancia acústica y distancia genética solo con el grupo bombetes esta no fue

estadísticamente importante.

En conjunto, el árbol filogenético reconstruido junto con la prueba de distancias

genéticas indican indudablemente que la población de Andinobates del municipio de

Líbano pertenece a la especie A. dorisswansonae.

54

6. DISCUSIÓN

6.1 EL LLAMADO DE Andinobates

Los resultados acústicos de este trabajo son bastante contrastantes con lo reportado

por Twomey et al., (2011) para la descripción del género Andinobates. Inicialmente, se

definió la llamada de publicidad de las especies de estudio como pulsadas (McLister et

al., 1995) sin presencia de notas, con variación en la amplitud pero no en la frecuencia

(Erdtmann & Amézquita, 2009). Debido a que las variables acústicas analizadas en la

publicación de Twomey et al., (2011) no son las mismas que se revisan en esta

investigación, solo se puede comparar las frecuencias de las especies A. minutus, A.

opisthomelas y A. dorisswansonae. Para estas especies, las frecuencias de este

estudio son relativamente más altas a las reportadas. Los resultados obtenidos de A.

dorisswansonae son bastante contrastantes si tenemos en cuenta que esta población

es significativamente menor en SVL, por lo que la frecuencia debería ser la más alta

dentro de los Andinobates del grupo bombetes, como concuerda en lo registrado por

esta investigación. Por otro lado, el resultado obtenido por Amézquita et al., (2013) en

la duración de la llamada (CT) para las especies A. cassidyhornae y A. opisthomelas

concuerda con la relación observada en este estudio, indicando que la variabilidad en

este parámetro es alta para la especie A. opisthomelas enmascarando la duración de la

llamada de A. cassidyhornae.

Las variables estáticas y dinámicas en el canto (Gerhardt, 1991) de los Andinobates

presentaron características propias que definieron a las especies (Figura 10). Los

parámetros temporales evaluados a diferencia de los espectrales mostraron una mayor

variabilidad, lo que concuerda con Gerhardt (1991) quien propone que las variables

temporales en el canto de los anuros son llamadas dinámicas debido precisamente a la

alta variabilidad. Este es el primer estudio que analiza de forma cuantitativa y

cualitativa, la presencia de pulsos solapados (OP) en la llamada de anuncio de

Andinobates. Aunque no se encontró ninguna relación o diferencias entre las especies

55

debido a la variabilidad de los datos, la presencia de estos en todas las llamadas de

anuncio de las diferentes especies, promueve varias hipótesis, que de acuerdo con lo

propuesto por Erdtmann y Lima (2013) podrían ser: 1) los OP pueden ser una

respuesta relacionada con la estructura del hábitat o las variables ambientales; 2) la

presencia de OP puede estar asociada a las relaciones filogenéticas de las especies

y/o a estructuras morfológicas propias del género y 3) la presencia de OP dentro del

canto de los Andinobates pueda tener algún valor dentro de la selección sexual. Estas

hipótesis indican que los análisis acústicos mostrados en este trabajo abren un campo

amplio de investigación dentro de la comunicación acústica conespecifica y la selección

sexual en especies del género Andinobates.

Esta investigación mostró una relación negativa entre la duración del canto y la

temperatura (Figura 14), lo que concuerda con lo descrito por Duellman y Trueb (1994).

No obstante, se esperaba que esta relación fuera positiva teniendo en cuenta que los

anfibios son vertebrados ectotermo y dependen de la temperatura ambiental para

regular su metabolismo (Wells, 2007; Crump, 2010). Esto indica que algunas

características del canto pueden estar más asociadas a factores ambientales y

comportamentales que a las respuestas determinadas fisiológicamente. Por ejemplo,

Erdtmann y Lima (2013) sostienen que la duración del canto debería ser menor en

áreas abiertas que en áreas con estructuras vegetales complejas, las cuales pueden

afectar la comunicación acústica por la presencia de barreras u obstáculos. Este

argumento podría justificar el que las especies del grupo bombetes estudiadas

presenten una mayor duración del canto, ya que su hábitat incluye cuevas que se

forman por las raíces de árboles o de troncos caídos, que generan una mayor

perturbación para la comunicación acústica; en tanto que en A. minutus presenta un

canto corto que es realizado en un hábitat abierto con presencia de hojarasca o en las

cercanías a la base de los árboles. Aunque acá no se analiza sistemáticamente debido

a los pocos datos, el llamado de A. minutus parece tener variación temporal y espectral

muy marcada (Figura 9b), lo que supone un canto único y particular dentro de las

especies de Andinobates.

56

Los resultados observados en el ancho de banda de las especies sugieren varias

escenarios: (1) es probable que la SVL para las especies del grupo bombetes se

presente de la siguiente forma: A. cassidyhornae y A. dorisswansosnaeL son las

especies más grandes, mientras que la población de A. dorisswansonae es mucho mas

pequeña, esta relación del tamaño es el resultado de la correlación entre SVL y PF

(Figura 14) y el ancho de banda (Figura 11). Aunque los análisis morfométricos (Figura

6) no son tan claros, la unión de las evidencias acústicas y morfométricas nos puede

dar una idea de que esta relación es constante. (2) La especie A. minutus esta muy

bien separada acústicamente de las demás, esto puede indicar, como se evidencia en

las relaciones filogenéticas, que en definitiva hay una gran divergencia evolutiva entre

esta especie y las especies del grupo bombetes. (3) Las especies del grupo bombetes

presentan anchos de banda que se pueden solapar, lo que da una idea de que estas

especies no han divergido tanto en las características espectrales en su llamada,

probablemente debido a la especiación alopátrica que impide el contacto entre estas,

evitando así la especialización o diferenciación en la frecuencia como efecto del

reforzamiento. Sin embargo, basados en la idea de la especificidad del canto (Bogert,

1960), un aspecto interesante a evaluar en investigaciones futuras sería ¿que tanto

conocimiento (respuesta fonotáctica) pueden tener las especies acerca de sus propias

llamadas o llamadas de especies relacionadas?. Los aspectos temporales de la

llamada, podrían así jugar un papel importante como un mecanismo de reconocimiento

y aislamiento entre las especies debido al solapamiento de frecuencias.

Finalmente, la relación entre la distancia geográfica y genética, así como la distancia

geográfica y la variación acústica de las especies fueron significativamente

correlacionadas (Figura 15), esto pone de manifiesto el papel que juega el aislamiento

por distancia geográfica dentro de las características acústicas de las especies y su

diferenciación genética; sin embargo, no se obtuvo la misma relación entre la distancia

genética y la variación acústica cuando se analizaron sólo las especies del grupo

bombetes (r = 0.913, P = 0.064). Este resultado seguramente se debe a la amplia

diferenciación espectral que presentan los llamados de las dos poblaciones de A.

dorisswansonae y que evidencia probablemente un proceso de adaptación local a una

57

mayor elevación en la población de Líbano. Esto sugiere que, bajo un gradiente

elevacional las características acústicas podrían cambiar mucho más rápido y en efecto

mostrar diferencias no relacionables con la distancia genética o el aislamiento por

distancia geográfica.

6.2 LA MORFOMETRÍA EN Andinobates

En general, siete de las ocho variables morfométricas medidas permiten determinar

diferencias claras entre las especies de Andinobates evaluadas; por otro lado, los

parámetros morfométricos que mejor representaron la variabilidad de las especies

fueron la longitud de la tibia (T) y la distancia inter-orbital (IO). Este segundo parámetro

fue significativamente importante a la hora de entender las relaciones de las especies

del grupo bombetes (Figura 8). Es probable que las respuestas diferenciales a las

variables morfométricas puedan deberse a efectos metodológicos a la hora de la toma

de datos, así como lo sugieren Bernal y Clavijo (2009) al comparar como una variable

medida puede estar sujeta a errores en la precisión debido a la medición de animales

vivos. Si se tiene en cuenta que las especies analizadas no alcanzan los 20mm de SVL

y que además algunas variables están bajo un rango menor a 1mm (Eg. D4 y D3), es

probable que el efecto de la aleatoriedad en las respuestas morfológicas pueda

deberse a la falta de precisión metodológica de las mediciones in vivo; por tal razón, las

comparaciones morfométricas del presente estudio deben ser tratadas con precaución.

Teniendo en cuenta esto, acá se pudo observar que la SVL una variable ampliamente

utilizada en los estudios en Anuros, no ha permitido diferenciar las especies A.

opisthomelas, A. cassiydhornae y A. dorisswansonaeL, aunque es probable que esta

indiferenciación pueda deberse a errores metodológicos, otra explicación es que la

distribución alopátrica de las especies sea la razón por la cual no exista mayor

variabilidad en el tamaño corporal de las especies, esto como respuesta a la falta de

competencia heteroespecífica y probablemente a la falta de especialización en el nicho.

Es probable que debido a que el tamaño corporal es un punto central dentro de una red

de complejas interacciones ecológicas y fisiológicas (Barbault, 1988), la variación en

tamaño no sea una respuesta correlacionable con la distribución geográfica o con la

58

distancia genética, esto concuerda con los resultados obtenidos en los cuales no se

evidenció correlación entre la variación morfométrica, y la distribución geográfica y

distancia genética. Sólo hay un correlación positiva cuando se analiza la distancia

geográfica y morfométrica de todas las especies; sin embargo, esto parece ser

producto del arrastre que hacen las variables morfométricas tan reducidas de la

especie A. minutus.

En general, las variables morfométricas evaluadas aunque de forma aleatoria,

mostraron ser importantes para la diferenciación de las especies. Aunque relativamente

si se observa una relación morfométrica entre especies filogenéticamente relacionadas

(Eg. A. opisthomelas y A. cassidyhornae), la variación intraespecífica de A.

dorisswansonae impide que las relaciones morfométricas puedan ser correlacionables

con la distribución geográfica o la distancia genética (Figura 15).

6.3 Andinobates dorisswansonae LIBANO

En este trabajo se destaca la variación intraespecífica en tamaño y patrón de

coloración de A. dorisswansonae entre las poblaciones de Líbano y Falan. Inicialmente

esta variación permitió suponer que podrían ser dos especies diferentes; sin embargo,

la fusión del primer dedo de las patas posteriores, una característica compartida por A.

dorisswansonae y A. dalesswansonae (Rueda-Almonacid et al., 2006) mantenían la

precaución en la determinación de esta población como una nueva especie. Por tal

razón, para determinar el estatus taxonómico de esta población, se realizó un análisis

de distancias genéticas (Tabla 12) que confirmó a los individuos de la localidad Líbano

como una población de A. dorisswansonae, lo que supone la evolución de un

polimorfismo críptico, un aumento del tamaño corporal (SVL) y variación en la acústica

para esta especie. Aunque los polimorfismos son comunes en los dendrobátidos (Eg.

Oophaga histrionica, O. pumilio, O. sylvatica, O. lehmanni, Dendrobates auratus, D.

tintorius, Ranitomeya imitator, R. variabilis), los polimorfismos con coloración críptica no

son muy abundantes. Para el caso de la población de Andinobates Líbano, esta

presenta un morfotipo similar a A. abditus (Plate 2, Figure 6; Brown et al., 2011) y sería

59

el primer caso de polimorfismo críptico dentro del género. Si bien no se evaluó la

reflectancia espectral de las dos poblaciones ni el contraste del fondo, se propone que

la población de Líbano con coloración críptica deber ser menos conspicua que la

población aposemática de Falan, esto podría ser un resultado importante y contrastante

teniendo en cuenta que la relación mostrada por Rudh (2013) indica un aumento de la

SVL acompañado por un incremento de la señal conspicua en poblaciones de Oophaga

pumilio, relación que podría ser contraria a la presente en las poblaciones de A.

dorisswansonae. Por otro lado, la relación entre crípsis y aumento de SVL en A.

dorisswansonaeL podría ser una respuesta fisiológica a la disminución de la

temperatura por distribución altitudinal (Tabla 1) acorde con la regla de Bergmann

(Blackburn et al., 1999).

De igual forma, la variación morfológica de la población ha tenido consecuencias en el

llamado de anuncio, disminuyendo la frecuencia pico (PF) y por ende presentando LF y

HF más bajas (Figura 10) que la población tipo (Falan). No obstante, las variables

temporales evaluadas no mostraron diferencias entre estas poblaciones.

Esta divergencia morfológica en tamaño y color (Figura 6), además de la distribución

(Tabla 1, Figura 3), supone un gran reto para futuras investigaciones debido a que

estas pueden ser el producto de procesos adaptativos locales, que han sido resultado

de eventos vicariantes y que pueden estar bajo fuertes presiones de selección natural y

sexual. Por otro lado, aunque no existe evidencia de selección sexual por señalización

acústica en especies de Andinobates, el escenario presentado en estas poblaciones de

A. dorisswansonae es idóneo para determinar como las divergencia acústica puede

afectar la selección sexual entre poblaciones, lo que en principio podría resultar en un

proceso de especiación temprana.

La importancia de los análisis con múltiples enfoques se resalta de forma imperante en

este estudio debido a la ambigüedad de los resultados que pueden presentar especies

politípicas como el caso de la población de A. dorisswansonae de Líbano. Finalmente,

la determinación de esta nueva población de A. dorisswansonae, amplia el rango de

60

distribución tanto longitudinal como elevacional lo que conlleva consecuencias

importantes en el estatus de conservación para la especie.

61

7. CONCLUSIONES

Las especies estudiadas se encuentran bien definidas taxonómicamente por las

características acústicas y morfométricas evaluadas. El presente estudio destaca como

a través de análisis acústicos y morfométricos se pueden inferir y comprender mejor las

relaciones filogenéticas de las especies. Las características acústicas y morfométricas

de los Andinobates evaluados han permitido entender y comprender como las especies

del grupo bombetes presentan fuertes relaciones congruentes con las relaciones

filogenéticas. Este es el primer trabajo que describe de forma cuantitativa y cualitativa

la presencia de pulsos solapados (OP) dentro del género Andinobates y sus posibles

implicaciones en la comunicación y la selección sexual. Las variables acústicas en

general soportaron la divergencia entre las especies; no obstante, los parámetros que

mejor representaron la variabilidad entre las especies fueron la frecuencia pico (PF) y la

tasa de pulsos por llamada (PR). Las relaciones acústicas son congruentes con la

distribución geográfica, y la distancia genética, caso contrario a las relaciones

morfométricas que indican tener un patrón no correlacionable a la distribución

geográfica o a la variación genética. Esta investigación aporta de forma significativa

una mejor comprensión de los parámetros acústicos importantes a tener en cuenta en

futuras investigaciones bioacústicas dentro de los Andinobates. La hipótesis de una

nueva especie para la población de Líbano se rechaza y se propone que esta es una

población de A. dorisswansonae con una importante divergencia acústica, morfológica

y geográfica.

62

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