Análisis de AAS, paracetamol y cafeina por HPLC.
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN
FACULTAD DE QUÍMICA
“MÉTODOS, ÓPTICOS, ELECTROQUÍMICOS Y CROMATOGRÁFICOS”
“ANÁLSIS DE PARACETAMOL, ÁCIDO ACETILSALICÍLICO Y CAFEÍNA
EN TABLETAS”.
INTEGRANTES:
Ayil Tuz Edgar Gregorio
Chan Balan Reyna Guadalupe
Chan Chalé Laureano de Jesús
Palma Chim María del Socorro
Tun González Álvaro Manuel
SALÓN: Audio 1
PROFESORAS: M. en C. Durcy V. Ruiz Ciau
M. en C. Ligia Alcocer Can
Fecha de entrega: lunes 17 de mayo de 2010
0
ÍNDICE
OBJETIVOS……………………………………………………………………….2
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….2
MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………...4
PROCEDIMIENTO…………………………………………………………….......4
JUSTIFICACIÓN…………………….……………………………………………..6
REFERENCIAS……………………………………………………………………9
1
OBJETIVOS
Proponer un método viable para la separación y determinación cuantitativa
de aspirina, cafeína y ácido acetilsalicílico que son constituyentes usuales en
algunos analgésicos.
INTRODUCCIÓN
Para el tratamiento de la migraña suelen administrarse tabletas compuestas
de ácido acetilsalicílico (AAS), paracetamol, y cafeína con un contenido de
250 mg, 200 mg y 25 mg respectivamente.
El paracetamol es un analgésico antipirético no narcótico con acción
selectiva en el sistema nervioso central sin bloqueo cortical, cuya absorción
se lleva a cabo en el tubo digestivo, alcanzando las concentraciones
plasmáticas máximas entre 15 minutos y 2 horas después de su
administración oral, aproximadamente de 90 a 95% se conjuga
primariamente con el ácido gluconórico y se elimina por excreción urinaria a
través de metabolitos. Sólo 3% se elimina sin cambios. Su efecto terapéutico
se prolonga hasta seis horas sin producir irritación gástrica a dosis
terapéuticas.
Por otro lado, la cafeína es un alcaloide que funciona como un estimulante
cardiovascular y del sistema nervioso central (SNC), y es un adyuvante del
analgésico. La cafeína se distribuye ampliamente en el organismo con un
volumen de distribución aparente de 0.55 L/kg, se une a proteínas
plasmáticas en 35% aproximadamente.
La aspirina o ácido acetil salicílico es el NSAID (fármaco antiinflamatorio no
esteroidal) de uso más extendido. Funciona bloqueando las enzimas
cicloooxigenasas (COX) que realizan las síntesis corporal de las
prostaglandinas y previene la formación de tromboxano A2, disminuyendo la
agregación plaquetaria. Las dosis más altas de ácido acetilsalicílico no
tienen un efecto beneficioso mayor, pero parecen asociarse a una mayor
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incidencia de efectos secundarios (hemorragia gastrointestinal, ulceración
gástrica). Con dosis bajas de AAS, todo el efecto antitrombótico tarda 2 días
en manifestarse, mientras que con dosis estándar el efecto aparece en
horas.
La cromatografía líquida de alta resolución, HPLC (de High-Performance
Liquid Chromatography) es un proceso de migración diferencial en el cual los
componentes de una mezcla son transportados por una fase móvil líquida y
posteriormente los componentes son retenidos selectivamente por una fase
estacionaria. Existen cuatro tipos principales de cromatografía de líquidos en
columna: cromatografía de reparto (líquido-líquido), cromatografía de
adsorción (sólido-sólido), de intercambio iónico y de excusión molecular. Se
pueden distinguir dos tipos de cromatografía de reparto en función de las
polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria, la cromatografía de
fase normal y de fase inversa. En la primera, la fase estacionaria es muy o
moderadamente polar y la fase móvil no polar. En cromatografía de fase
inversa, la polaridad es inversa. Por lo tanto, en cromatografía de fase
normal, el componente menos polar es el primero que se detecta; al
aumentar la polaridad de la fase móvil disminuye el tiempo de elución. En
cambio, en el método de fase inversa, el componente más polar es el
primero que se eluye y al aumentar la polaridad de la fase móvil aumenta el
tiempo de elución.
Como se ha mencionado, la cromatografía de fase inversa utiliza un
empaque enlazado hidrofóbico, usualmente con un grupo funcional
octadecilo (C-18) u octilo (C-8) y una fase móvil polar, frecuentemente una
fase móvil parcial o totalmente acuosa. Se estima que más de las tres
cuartas partes de las separaciones por cromatografía de líquidos de alta
resolución se realizan habitualmente en fase inversa. Los grupos
hidrocarbonados de cadena larga de estos empaquetados de columna, se
alinean paralelamente entre sí y perpendicularmente a la superficie de la
partícula (analito), originando una capa de hidrocarburos no polares, como
un cepillo.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Equipo: Para realizar el análisis cuantitativo y cualitativo de la muestra se
utiliza un cromatógrafo de líquidos adicionado con una bomba de alta
presión con dos pistones, una válvula de inyección con un bucle de 20μL,
detector UV fijado a 280 nm. Filtros de membrana de nylon 0.45 μm de
diámetro de poro y jeringuilla. Los datos cromatográficos son procesados a
través de una interfase por un ordenador que contiene un programa de
integración.
Fase estacionaria: Columna cromatográfica C18 de 16 cm de longitud,
4.0mm de diámetro interno y 5 μm de tamaño de partícula.
Fase móvil: Análisis por gradiente con una velocidad de flujo de 1.5 ml/min.
Disolventes: etanol/nitrometano/dioxano 80:10:10 (v/v/v), 15:75:10 (v/v/v) y
10:20:70 (v/v/v) respectivamente.
PROCEDIMIENTO
Preparación de patrones para determinar el tiempo de retención de cada
compuesto.
Disolución patrón de paracetamol de 100 ppm (0.1g L-1): pesar 0.1g de
paracetamol, disolver en la fase móvil y transferir la disolución obtenida a un
matraz de 100 mL. Aforar a ese volumen con más de la fase móvil.
Disolución patrón de ácido acetilsalicílico de 100 ppm (0.1g.L-1): pesar 0.1g
de ácido acetilsalicílico, disolver con la fase móvil, transferir la disolución
obtenida a un matraz de 100 mL. Aforar a ese volumen con más de la fase
móvil.
Disolución patrón de cafeína de 100 ppm (1gL-1) pesar 0.1g de cafeína,
disolver y aforar a 100 mL con la fase móvil.
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Preparación de patrón de cuantificación, disolución multicomponente.
Se preparará una única disolución en la que se encuentren concentraciones
de: paracetamol 100 ppm, ácido acetilsalicílico 300 ppm, y cafeína 50 ppm.
Para ello pesan 100 mg de paracetamol, 300 mg de ácido acetilsalicílico y 50
mg de cafeína, se disuelve con la fase móvil y la disolución obtenida se
transfiere a un matraz de 100 mL. Añadir a este patrón ácido benzoico, que
se emplea como patrón interno, y poder recalcular las concentraciones de
cada sustancia patrón. Se emplearan 50mg de ácido benzoíco para 100 mL.
Todo ello se enrasara a 100 mL con la fase móvil.
A partir de este primer patrón se preparará un segundo y tercero mediante
dilución, obteniéndose disoluciones estándar 50 y 25 ppm de paracetamol,
25 y 12 ppm de cafeína y 150 y 75 ppm de Acido acetilsalicílico.
Para ello se toman 5 mL de la primera disolución patrón y se afora a 10 mL.
A partir de esta segundo se prepara un tercero operando de igual manera.
Se toman 5 mL de la segunda disolución patrón y se enrasa a 10 mL,
siempre empleando fase móvil.
Preparación de la muestra
Se pesan 3 o 4 comprimidos y se calcula el peso medio de un comprimido.
Se trituran en un mortero y se pesa con una presición de 0.1 mg una
muestra de aproximadamente 0.1g. Se introduce la muestra en un vaso de
100 mL, se disuelve en fase móvil, se filtra si fuera necesario y se transvasa
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL donde se enrasa con la
fase móvil. A partir de esta disolución se debe preparar otra mas diluidas
que se inyectara en el cromatógrafo, para ello será necesario conocer la
cantidad aproximada de cada compuesto por comprimido (indicado en el
prospecto del medicamento). Una vez conocida se diluirá de tal manera que
la concertación quede entre el primer y el segundo patrón. La disolución se
hace en fase móvil.
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Análisis de la muestra
Antes de inyectar cualquier componente es necesario acondicionar la
columna cromatográfica, para lo cual se hace circular la fase móvil por el
sistema aproximadamente durante 15 minutos.
A continuación se filtra una cierta cantidad de las disoluciones patrón a
través de una membrana de nylon de 0.45 μm de poro, utilizando como
sistema de filtración una jeringuilla. Se inyectan los patrones en el
cromatógrafo y se determina el tiempo de retención correspondiente a cada
sustancia. Posteriormente inyectar los patrones de distintas concentraciones
para obtener las rectas de calibrado correspondientes.
Finalmente se filtra una pequeña cantidad de la muestra a través de la
membrana, se inyecta y se identifican los picos a través de los tiempos de
retención identificados previamente.
JUSTIFICACIÓN
Se eligió la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) porque se
utiliza de forma sistemática con una preparación de muestra muy sencilla en
el análisis de fármacos en líquidos biológicos y en el análisis de
formulaciones farmacéuticas. Existen dos modalidades: de partición en fase
normal o en fase inversa. Si el fármaco no es hidrosoluble, se utiliza la
cromatografía de partición de fase inversa con una fase móvil polar como
metanol, acetonitrilo o mezclas acuosas. Si es polar se utiliza la
cromatografía de partición en fase normal, con una fase móvil relativamente
no polar. La fase inversa permite variar más parámetros. Si el fármaco es
iónico (por tanto hidrosoluble) se utiliza la cromatografía de intercambio
iónico con fase móvil polar, y si tiene un peso molecular superior a 2000, se
utiliza la cromatografía de exclusión molecular y una fase móvil polar.
Los sistemas de inyección son variados y pueden ser automáticos. En
cuanto a los detectores más populares, aparte del índice de refracción, que
resulta poco sensible, se encuentran los de absorción UV, que son los más
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adecuados para fármacos o sus derivados que poseen grupos cromóforos
con gran absorción. Éstos pueden ser de longitud de onda fija (más
sensibles y estables) o variable. Por otro lado, los detectores de
fluorescencia permiten determinar menores concentraciones, pero requieren
que los fármacos posean fluorescencia natural o se deriven con los reactivos
adecuados. Por último, los detectores electroquímicos, cuando pueden
aplicarse, son muy sensibles.
En fase reversa las columnas de uso más extendido son las compuestas de
partículas de sílice fijas a cadenas de C18 (C18H37); los componentes eluyen
de forma decreciente respecto a su polaridad, una disminución de la
polaridad de la fase móvil disminuye el tiempo de elución. La elución se
produce por la interacción del compuesto entre la fase móvil y la fase
estacionaria.
La HPLC en fase reversa se emplea para separar mezclas de polaridad
media o alta; en este análisis los compuestos a separar poseen polaridad
intermedia; el AAS es capaz de formar puentes de hidrógeno por lo tanto es
un compuesto polar al igual que en su estructura cuenta con varios átomos
muy electronegativos como es el caso del oxígeno (figura 1.); la molécula de
paracetamol puede formar un puente de hidrógeno ya que cuenta con una
átomo de hidrógeno (figura 2.) y por otra parte la molécula de cafeína en su
estructura tiene un anillo aromático con nitrógenos (base púrica)(figura 3.)
disminuyendo su polaridad comparada con la del AAS y del paracetamol.
Figura 1. AAS Figura 2. Paracetamol Figura 3. Cafeína
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Fase Móvil: Etanol/Dioxano/Nitrometano.
Para la elección de la fase móvil se tendrá que tomar en cuenta que
compuestos se desean separar, tomando como factor importante la
polaridad de los compuestos para la correcta elección de los disolventes y
sus respectivas proporciones.
En este caso los compuestos a separar van de un compuesto polar (AAS)
hasta uno con polaridad muy baja (cafeína) en consecuencia la elección de
la fase móvil tendrá que tener ciertas características; para la optimización del
análisis la elución por gradiente sería la más adecuada.
Para el análisis por gradiente se consideró que dentro del rango de los
primeros 3 minutos se eluiran etanol (80%), nitrometano (10%), dioxano
(10%) para la separación del AAS, prosiguiendo con la separación del
paracetamol con etanol (15%), nitrometano (75%) y dioxano (10%) y para la
separación de la cafeína se utilizó etanol (10%), nitrometano (20%) y
dioxano (70%), estas proporciones fueron tomadas de acuerdo al orden de
polaridad de los compuestos y de acuerdo al orden que eluirán.
Para la fase móvil utilizada en este análisis se eligió la elución por gradiente,
la cual involucra el cambio de la composición de la fase móvil en forma
escalonada o continua conforme la elución procede.
Se eligió este tipo de elución con preferencia sobre la elución isocrática
porque esta última no puede separar una mezcla compleja con resolución
adecuada en un tiempo razonable y con buena detectibilidad. Esto se debe a
que la fase móvil se mantiene sin cambio durante todo el tiempo necesario
para que los componentes de la muestra eluyan de la columna.
Además en la elución por gradiente frente a la isocrática se puede alcanzar
un aumento potencial del doble o más de la sensibilidad, aun con muestras
que no requieren de elución por gradiente. La elución por gradiente
proporciona anchos de las bandas más parecidos y separaciones globales
más rápidas.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Compedio esencial de química farmacéutica., Andrejus Korolkovas et al.,
pp. 182.
2. Famacología integrada., Curtis M.J. et al., pp. 168.
3. Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J. Fundamentos de química analítica.
4ª ed. Editorial Reverté S. A.; España, 1997; pp. 715, 716.
4. Willard, H. H.; Merrit, L. L.; Dean, J. A.; Settle, F. A. Métodos
instrumentales de análisis. Grupo editorial Iberoamérica. México, 1994; pp.
576, 577, 616.
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