““ANÁLISIS DE LA ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE EXPRESIÓN GÉNICA DE

PROTEÍNAS DURANTE EL PROTEÍNAS DURANTE EL DESARROLLO DESARROLLO

CITOPLASMÁTICO DEL CITOPLASMÁTICO DEL OVOCITO”OVOCITO”

Asuncion Espinosa, Karen Espinoza, Yasna Espinoza, Asuncion Espinosa, Karen Espinoza, Yasna Espinoza, Alex Finkelstein, Eduardo Flores, Alejandra Galindo, Alex Finkelstein, Eduardo Flores, Alejandra Galindo,

Ricardo Gonzalez, Paula Gonzalez, Francisco Guevara, Ricardo Gonzalez, Paula Gonzalez, Francisco Guevara, Carolina Gutierrez, Eric Hernandez, Connie Kalwitz. Carolina Gutierrez, Eric Hernandez, Connie Kalwitz.

Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile.

OVOGÉNESISOVOGÉNESIS• Proceso de diferenciación y Proceso de diferenciación y

formación de gametos femeninos formación de gametos femeninos (óvulos).(óvulos).

• Desde el desarrollo fetal a la adultez.Desde el desarrollo fetal a la adultez.

• Meiosis: 4 células.Meiosis: 4 células.

• Cambios citoplasmáticos del ovocito.Cambios citoplasmáticos del ovocito.

FOLICULOGÉNESISFOLICULOGÉNESIS• Proceso de formación, Proceso de formación,

crecimiento y diferenciación de crecimiento y diferenciación de folículos.folículos.

• Folículo de Graff.Folículo de Graff.

• Intervienen componentes Intervienen componentes celulares, de la teca y de la celulares, de la teca y de la granulosa.granulosa.

PROTEÍNAS PROTEÍNAS PARTICIPANTESPARTICIPANTES

• Producen cambios fundamentales Producen cambios fundamentales para una adecuada fertilización.para una adecuada fertilización.

• Sirven para determinar etapa de Sirven para determinar etapa de maduración.maduración.

• Técnicas de marcaje Técnicas de marcaje

(Ej: Wester Blot o (Ej: Wester Blot o inmunohistoquímica)inmunohistoquímica)

FATORES INVOLUCRADOS FATORES INVOLUCRADOS EN EL DESARROLLO EN EL DESARROLLO

FOLICULAR TEMPRANO.FOLICULAR TEMPRANO.

FACTOR ORIGEN FUNCIÓN

Figla o Fig OvocitoCoordinación de genes estructurales

que codifican la zona pelúcida

BMP15 (proteína

morfogenética del

hueso) Ovocito

Diferenciación y proliferación celular (granulosa)

GDF 9 (factor

de crecimiento y diferenciación)

OvocitoDiferenciación y proliferación celular

(granulosa)

bFGF (factor de

crecimiento básico de fibroblastos)

OvocitoEstimulación de mitosis y

diferenciación a células de la granulosa

KL (factor Kit)Células

pregranulosaPromoción de la transición folículo primordial-primario

LIF (factor

inhibidor de leucemia)

Células pregranulosa

Promoción de la transición folículo primordial-primario

Insulina Endocrino

Promoción de la transición folículo primordial primario.

Estimulación de la esteroidogénesis en células de

la granulosa y teca

AMH (hormona anti-

mülleriana)

Células de la granulosa

Inhibición del desarrollo de los folículos primordiales

AhR (receptor de

dioxinas)

Células de la granulosa

Regulación del tamaño de la poza del ovocito

CTGF (factor de

crecimiento derivado de

tejido conjuntivo)

Células de la granulosa

Mantenimiento del fenotipo celular y reclutamiento de la

teca

ActivinaCélulas de la

granulosa

Proliferación celular y estimulación de la

esteroidogénesis (granulosa)

KGF (factor

de crecimiento derivado de queratinocito

s)

Células de la teca

Proliferación celular y crecimiento folicular

TRANSICIÓN DE FOLÍCULO TRANSICIÓN DE FOLÍCULO PRIMORDIAL A PRIMARIO.PRIMORDIAL A PRIMARIO.

TRANSICIÓN DE FOLÍCULO PRIMARIO TRANSICIÓN DE FOLÍCULO PRIMARIO A SECUNDARIO.A SECUNDARIO.

TERMINO DE “ARRESTO TERMINO DE “ARRESTO MEIOTICO”.MEIOTICO”.

• cAMP:cAMP: disminuyen sus niveles y se disminuyen sus niveles y se produce desfosforilación de CDK1 produce desfosforilación de CDK1 (Thr14 y Thr15). Se activa MPF.(Thr14 y Thr15). Se activa MPF.

• MPF:MPF:

1.1. Ciclin B; casi indetectable, la Ciclin B; casi indetectable, la mayoría en el citoplasma como mayoría en el citoplasma como RNAm.RNAm.

2.2. PP3434; en altos niveles, la mayoría en ; en altos niveles, la mayoría en citoplasma como proteína.citoplasma como proteína.

TERMINO DE “ARRESTO TERMINO DE “ARRESTO MEIOTICO”.MEIOTICO”.

• CDC25: desfosforila CDK1.CDC25: desfosforila CDK1.• WEE1/MYT1: fosforila CDK1.WEE1/MYT1: fosforila CDK1.• GPR3: aumenta los niveles de cAMP.GPR3: aumenta los niveles de cAMP.• RGS2: inhibe la producción de cAMP.RGS2: inhibe la producción de cAMP.• Gi: inhibe adenil ciclasa, con lo que Gi: inhibe adenil ciclasa, con lo que

disminuye el cAMP.disminuye el cAMP.

ENZIMAS EXPRESADAS ENZIMAS EXPRESADAS DURANTE LA MADURACIÓN DEL DURANTE LA MADURACIÓN DEL

OVOCITOOVOCITO

Glucosa 6 Fosfato Glucosa 6 Fosfato Deshidrogenasa (G6PD) Deshidrogenasa (G6PD) Explica la escasa

funcionalidad al término de esta etapa

Asociada a la producción de energía

Prueba de tinción azul de Prueba de tinción azul de cresol brillante (BCB)cresol brillante (BCB)

Nos permite establecer la madurez del ovocito

Incoloro BCB (-)BCB (-)

Azul BCB (+)BCB (+)

FuncionesFunciones

Método de marcajeMétodo de marcaje

ResultadosResultados

¿Motivo?¿Motivo?

• (A)(A) The diameter excluding the zona pellucida (DEZ) of an oocyte was measured with cumulus cells; oocyte The diameter excluding the zona pellucida (DEZ) of an oocyte was measured with cumulus cells; oocyte plasma membrane was brought into the clearest focus under a phase contrast microscope and the DEZ was plasma membrane was brought into the clearest focus under a phase contrast microscope and the DEZ was measured with a micrometer. measured with a micrometer. (B)(B) Four groups of COCs were observed under a microscope after BCB staining: Four groups of COCs were observed under a microscope after BCB staining: (a) those with a blue color in both the ooplasm and cumulus cells, (b) those showing a blue color in neither (a) those with a blue color in both the ooplasm and cumulus cells, (b) those showing a blue color in neither ooplasm nor cumulus cells, (c) those with blue color in ooplasm but not in cumulus cells and (d) those with blue ooplasm nor cumulus cells, (c) those with blue color in ooplasm but not in cumulus cells and (d) those with blue color in cumulus cells but not in ooplasm (arrows). color in cumulus cells but not in ooplasm (arrows). (C-E)(C-E) Oocytes with fully polarized, partially polarized and Oocytes with fully polarized, partially polarized and non-polarized patterns of mitochondrial distribution, respectively (refer to text for detailed description). non-polarized patterns of mitochondrial distribution, respectively (refer to text for detailed description). (F)(F) After double staining, all the nuclei of cumulus cells were stained blue by Hoechst 33342, but only the nuclei of After double staining, all the nuclei of cumulus cells were stained blue by Hoechst 33342, but only the nuclei of apoptotic cells were stained red by PI and hence looked pink under the fluorescence microscope. apoptotic cells were stained red by PI and hence looked pink under the fluorescence microscope. (G)(G) A merged A merged picture after Annexin V and PI staining, in which early apoptotic cumulus cells were stained exclusively by picture after Annexin V and PI staining, in which early apoptotic cumulus cells were stained exclusively by Annexin V (green), late apoptotic cells were stained by both Annexin V and PI (red), while necrotic cells were Annexin V (green), late apoptotic cells were stained by both Annexin V and PI (red), while necrotic cells were labeled by PI, but were negative for Annexin V. labeled by PI, but were negative for Annexin V.

ENZIMAS EXPRESADAS DURANTE ENZIMAS EXPRESADAS DURANTE LA MADURACIÓN DEL OVOCITOLA MADURACIÓN DEL OVOCITO

• Glutatión Reducido (GSH) Glutatión Reducido (GSH) • Protección contra el daño oxidativo

• Descondensación de la cabeza del espermatozoide

• Rol importante en el desarrollo embrionario in vitro

Indicador de madurez gametogénica

InmunohistoquímicInmunohistoquímica, Western Blot,etca, Western Blot,etc

A medida que el momento de la ovulación se acerca se ven

incrementados los niveles de GSH

FuncionesFunciones

¿Motivo?¿Motivo?

PROTEÍNAS EXPRESADAS EN PROTEÍNAS EXPRESADAS EN LA MADURACIÓN DEL LA MADURACIÓN DEL

OVOCITOOVOCITO

PeroxiredoxinasPeroxiredoxinas

Ubiquitin carboxyl hidrolasa isoenzima L1 (UBL1)(UBL1)

Espermin sintetasa (SPSY) (SPSY)

Balance redox intracelular

Protección contra el estrés oxidativo

Importancia en las etapas finales de la maduración

Transición de la etapa de vesícula germinal (VG) a metafase II (MII) en el ovocito

Niveles extremadamente altos en Niveles extremadamente altos en todas las etapas de la maduración todas las etapas de la maduración In vitro del ovocito del cerdo del ovocito del cerdo

FuncionesFunciones

FunciónFunción

PROTEÍNAS EXPRESADAS PROTEÍNAS EXPRESADAS EN LA MADURACIÓN DEL EN LA MADURACIÓN DEL

OVOCITOOVOCITOProteínas de la vía glicolíticavía glicolítica

Cadena beta de la mitocondria

Alfa enolasa

Triosafosfato isomerasa

ATP sintetasa

Dihidropoamida succinil transferasa

Galactoquinasa

Preparación para Preparación para la modificación del la modificación del metabolismo metabolismo energético luego energético luego de la fecundaciónde la fecundación

DISCUSIÓN - DISCUSIÓN - CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN• Existe un constante interés de los Existe un constante interés de los

factores productivos, tanto en las factores productivos, tanto en las ventajas como en las desventajas.ventajas como en las desventajas.

• Gran importancia el estudio del Gran importancia el estudio del desarrollo del ovocito,desarrollo del ovocito, enfocados en los enfocados en los factores determinantes de su factores determinantes de su maduración y fecundaciónmaduración y fecundación . .

• Falta información mas acabad e integral Falta información mas acabad e integral al respecto.al respecto.

• Métodos de marcaje bastante conocidos Métodos de marcaje bastante conocidos como radioinmunohistoquimica o como radioinmunohistoquimica o western blot nos permiten realizar una western blot nos permiten realizar una identificación directa de la enzima o identificación directa de la enzima o proteína.proteína.

• También se hace necesario utilizar También se hace necesario utilizar pruebas específicas.pruebas específicas.

DISCUSIÓN - DISCUSIÓN - CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

• El objetivo es lograr tener El objetivo es lograr tener una mayor certeza de que el una mayor certeza de que el ovocito está listo para ser ovocito está listo para ser fecundado.fecundado.

• No todas las sustancias No todas las sustancias químicas, proteínas y químicas, proteínas y enzimas que se han enzimas que se han detectado actúan sobre el detectado actúan sobre el ovocito directamenteovocito directamente

• La mayoría de las proteínas La mayoría de las proteínas y enzimas detectadas y enzimas detectadas fluctúan a lo largo de las fluctúan a lo largo de las etapas de maduración del etapas de maduración del ovocitoovocito

• Variaciones significativas o Variaciones significativas o escasas de la concentración escasas de la concentración de proteínas.de proteínas.

G6PD

DISCUSIÓN - DISCUSIÓN - CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

• Cabe destacar que las reacciones que Cabe destacar que las reacciones que se producen no sólo dependen de los se producen no sólo dependen de los niveles de una proteínas, hormonas y/o niveles de una proteínas, hormonas y/o enzimas en un determinado momento.enzimas en un determinado momento.

F I NF I N