ANALISIS MICROBIOLOGICO Y RECUENTOS DE MICROORGANISMOS EN “…QUESO CASERO…”

08/03/2011UNIVERSIDAD DE CARTAGENA

UNIVERSIDAD DE CARTAGENA

FACULTAD DE INGENIERIA

ANALISIS MICROBIOLOGICO Y RECUENTO DE

MICROORGANISMOS EN EL QUESO CASERO

Marlene Duran 1, Arnedo Arnulfo2, Tamara Raul2, Torres Jose,Zuñiga

Lewis2

CARTAGENA DE INDIAS D. C Y T MARZO 8 DE 2011

1. docente de microbiología de alimentos. 2. Estudiantes de Ing. De

Alimentos

Resumen:

Debido a la importancia de la alimentación y teniendo en cuenta que los alimentos mal tratados o con malas prácticas de manufacturas pueden dar consecuencias de enfermedades, causadas por microorganismospatógenos como echerichia coli, salmonella, clostridium etc… que afectan también su calidad organoléptica, Este es uno de los problemas que afronta la ingeniería de alimentos.

En el siguiente trabajo se realizó un análisis de los microorganismos que pueden encontrarse y proliferar en una muestra de queso casero, se procedió a hacer su respectivo análisis y recuento en superficie, y por el método de númeromás probable (NMP)

Abstract:

Due to the importance of feeding and taking into account that food badly treated or manufactured with bad consequences can give diseases caused by pathogens such as Escherichia coli, salmonella, clostridium and so on ... also affect the organoleptic quality, this is One of the problems facing food engineering.In this paper, an analysis of microorganisms that can meet and grow in a sample of farmhouse cheese, it proceeded to its respective surface analysis and counting, and the method of most probable number (MPN)

Keywords: Alimentos, microorganismos patógenos, recuento, NMP,

UFC, queso.

INTRODUCCION

Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias

(UFC) o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP).

El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de microorg-

anismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termo tolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad.

Objetivo general

Analizar los distintos microorga-

nismo presentes en la muestra

de queso artesanal, que pueden

ser causantes de enfermedades

Objetivos específicos

-Familiarizarse con los métodos

de recuento, especialmente con

el de NMP.

-Detectar bacterias coliformes

totales y fecales.

-Detectar si la muestra traída es

apta para el consumo humano.

-Interpretar los resultados

obtenidos, de acuerdo con las

normas aplicables

RECUENTO DE COLIFORMES

TOTALES (N.M.P)

En el caso del NMP En este método preparamos diluciones del alimento igual que el recuento en placa, sin embargo por ser un método estadístico los resultados son generalmente más elevados que el recuento en placa. Este método ofrece las siguientes ventajas:

- Es relativamente sencillo.

- Los resultados son

coincidentes con los de

otros laboratorios.

- Se pueden determinar el

número de

microorganismos

específicos variando el

medio.

- Es el método de elección

para determinar la

densidad de coliformes

fecales.

El NMP es una técnica

ampliamente utilizada en la

determinación de la densidad

de microorganismos viables en

una muestra. El método del

NMP es un procedimiento

indirecto y estimado en

contraste con la técnica en

placa, este es un método más

eficaz en muestras de baja

población microbiana, menos

de 10 células por mL.

Es una prueba que se aplica a

la investigación de coliformes,

pero variando el medio de

cultivo se emplea para recuento

de Estafilococos, Estreptococos,

Vibrio, Salmonella, Bacillos

cereus etc.

La metodología se basa en la

siembra de volúmenes

secuenciales de base 10(10, 1,

0.1, 0.01) de la muestra sin

diluir o de diluciones

secuenciales, estas diluciones

dependen del grado de

contaminación de la muestra y

de los estándares

microbiológicos del producto.

Materiales

1 mortero

Muestra a analizar (queso fresco)

1 frasco con la dilución de 90ml de agua peptonada.

6 pipeta de tres de 1ml tres de 10ml

8 cajas de Petri vacías estériles

100 ml de agar Plate count en Erlenmeyer de 250 ml

1 mechero con alcohol

-Balanza

1 pera de caucho

Incubadora a 35 ± 0.5 °C

Estufa.

PROCEDIMIENTO

Se Homogenizo la muestra macerándola y agitando varias veces. Se hicieron diluciones 10 0, 10 -1, 10-2, 10-3, o más si la muestra lo requería. Para obtener la Dilución 10 0: se le Agrego 1 ml de la muestra patrón en una caja de Petri vacía. Para la Dilución 10 -1: se Agregó 0.1 ml (100micro litros) de la muestra patrón en una segunda caja de Petri. Para la Dilución 10 -2: se Agregó al frasco de dilución con 99 ml de

agua destilada estéril 1 ml de la muestra total, y una vez homogenizado, se sembró 1ml en una tercera caja de Petri para obtener la dilución 10 -

2.Del frasco anterior, se siembro 0.1 ml (100micro litros) en una cuarta caja de Petri, obteniéndose la dilución 10 -3.Agregamos a cada caja de Petri15 a 20 ml de Agar Plate Count fundido y a 44 °C. Mezclamos bien rotando las cajas sobre la mesa.Dejamos solidificar, incubamos a 35 ± 0.5 °C por 24 a 48 horas.Se debieron contar todas las cajas que presentaronentre 30 - 300 colonias. Si el número total de colonias desarrolladas a partir de 1 ml de la muestra es menor, no cuenta la regla anterior, Y Calculamos el número de bacterias y lo expresamos en UFC/ml de muestra.

_ Inocular de cada una de las diluciones 10-1 10-2 10-3 1 ml a cada uno de tres tubos conteniendo caldo bilis verde brillante, incubar los tubos a 35o

C durante 24 o 48 horas, observar los tubos que presenten producción de gas y turbidez, comparar en la tabla de NMP e informar como coliformes por gr. o ml.

CRITERIOS DE LECTURA: La

lectura del NMP depende del

medio de cultivo utilizado y del

microorganismo investigado.

1. Turbidez: Su presencia es

indicadora de crecimiento

bacteriano, si la muestra

genera turbidez en el

medio es necesario

emplear otro parámetro

de lectura o utilizar

pruebas

complementarias.

2. Productos metabólicos

finales: La producción de

gas por los

microorganismos son

capturados y observados

colocando tubos de

Durham en el medio

antes de la esterilización.

Una reacción positiva se

evidencia por la presencia

de burbujas en el interior

del tubo.

3. Detección de ácidos o

bases: Determinando

después de la incubación

el pH 0 acidez titulable en

cada tubo o usando un

colorante indicador de

pH.

Entre las pruebas

complementarias se pueden

utilizar examen microscópico

directo, subcultivo a medios

líquidos o sólidos. (2)

RECUENTO DE COLIFORMES

FECALES

RECUENTO EN PLACA

Este grupo de microorganismo

comprende varios géneros de la

familia Enterobacteriaceae, la

cual está ampliamente

distribuida en la naturaleza,

agua, suelo, e intestino de

hombres y animales. Su

presencia en los alimentos en

niveles altos hace pensar en

una elaboración inadecuada

y/o contaminación posterior.

Dentro de la familia

enterobacteriaceae se incluyen

bacterias patógenas

(Salmonella, Yersinia y Shigella)

Estas se identifican por

métodos específicos. (3)

Materiales:

- Diluciones de la muestra

(Guía anterior, Recuento

de mesofilos aerobios).

- Baño de agua a 500 C.

- Cajas de Petri.

- Pipetas de 1 ml.

- Incubadoras a 350 C.

- Contador de colonias.

- Erlenmeyer con agar

violeta cristal- rojo neutro

(VRBG) fundido y enfriado

a 450C.

PROCEDIMIENTO.

-Inocular por duplicado 1mL de

las diluciones seleccionadas en

cada caja de Petri.

-Verter en cada caja 15mL del

agar.

-Mezclar según instrucciones.

-Dejar solidificar y agregar otra

capa del agar 4-5mL, para

evitar crecimiento de colonias

diseminadas.

-Invertir las cajas e incubar a

350 C por 24 horas.

-Seleccionar las cajas que

presenten entre 15- 150

colonias.

-Leer y calcular el resultado de

coliformes totales contando las

colonias de color rojo oscuro de

diámetro superior a 0,5mm

rodeadas de halo de

precipitación.

-Calcular la media aritmética y

multiplicar el número por la

dilución correspondiente para

obtener el número de

coliformes totales por gramo o

mL de muestra.

CRITERIOS DE LECTURA:

DILUCIONES:

10*0 10-1 10-2 10-3

Tu

rbi

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A

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B

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Norma NMP

limite máximo permisible

Queso fresco________ Coliformes

fecales NMP/g__________ 100

RESULTADOS:

NUMERO MAS PROBABLE

Todos los tubos salieron

positivos

Como el numero de

microorganismos se excedió del

límite establecido que son de

100 NMP/g se concluye que el

queso casero analizado

representa un riesgo para la

salud de los consumidores.

RECUENTO EN PLACA

Cálculos y expresión de los

resultados:

En las placas

que se ha

efectuado el

N = C x D x

10

recuento,

multiplicar por

el inverso de la

dilución y

expresar el

resultado

como Unidades

Formadoras de

Colonias por g

de alimento

(UFC/g).

Expresión de

los resultados:

Media del

número de

colonias típicas

en las dos

placas x

inverso de la

dilución x 10 =

UFC/g o

UFC/ml

Donde: N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra (UFC/g o UFC/mL).   C= Media del número de colonias en las dos placas.   D= Factor o inverso de la dilución.

Se realizaron los cálculos por

medio de un conteo estimado

en los casos que el numero de

UFC/g fue superior a 300.

En las cajas de la dilución 10-2

y 10-3 se obtuvieron los

siguientes resultados 250 y

310 UFC/ g, 350 y 400 UFC/g

respectivamente:

10-2= 250+310/2 *(100)=

28000

10-

3=350+400/2(1000)=375000

375000/28000=13.3928

Como el cociente es mayor de 2

se reporta el resultado de lña

menor dilución

10-2= 28000 UFC/ml o 28x103

UFC/ml

ANALISIS DE RESULTADOS:

Los análisis microbiológicos de

los alimentos son una

herramienta eficaz para

establecer la calidad de un

producto y de su proceso de

elaboración. La interpretación

adecuada de los resultados de

laboratorio debe conducir a

establecer si el alimento es

apto o no para su consumo,

tomando en cuenta los criterios

microbiológicos que determinan

la norma sanitaria para el

producto. La inocuidad de estos

quesos no se enuncia con una

sola determinación

microbiológica, el perfil

higiénico-sanitario debe

evaluarse conjuntamente con

los demás resultados.

Generalmente, estos

microorganismos se eliminan

durante la cocción y su

presencia en el producto

terminado obedece a

contaminación post-

elaboración.

La existencia de coliformes

totales en las muestras de

queso, tal como se evidenció en

esta investigación, no implica

necesariamente presencia de

materia fecal en el alimento o

presencia de patógenos

entéricos, indica más bien

contaminación post-proceso

térmico como pueden ser fallas

en la refrigeración.

Es conocido que en los

expendios al detal del queso, el

producto se encuentra a

temperatura ambiente y

muchas veces a temperaturas

superiores, cuando el expendio

se ubica a orillas de la carretera

en los alrededores. Por su

parte, la presencia de

coliformes fecales y E. coli

indican potencial contaminación

fecal y puede sugerir la

presencia de otros

microorganismos patógenos

entéricos que constituyan un

riesgo para la salud, por

ejemplo Salmonella spp. Sin

embargo, la ausencia de E. coli

no asegura ausencia de

patógenos entéricos.

CONCLUSION:

En esta investigación se

determinaron organismos

indicadores para evaluar la

inocuidad microbiológica del

queso casero. En la

interpretación de un análisis

microbiológico deben tomarse

en cuenta la calidad de la

materia prima, las medidas

higiénicas en su elaboración, la

posible contaminación del

producto terminado y del

ambiente, así como tener

conocimiento del proceso

tecnológico.

Este queso posee una carga microbiana de coliformes que supera los criterios microbiológicos para este alimento, lo que indica que el producto se contaminó luego del proceso de elaboración.

Las muestras de queso analizadas poseen residuos de

materia fecal, por la presencia de E. coli.

Este queso artesanal se expende en los alrededores de barrio zaragocilla , de la ciudad de Cartagena , por no cumplir con la norma sanitaria, se considera un producto de alto riesgo microbiológico para el consumidor.

BIBLIOGRAFIA:

(1). Mercado C. Los ámbitos normativos, la gestión de la calidad y la inocuidad alimentaria: una visión integral. Agro alim. 2007; 12(24):119-31.

(2) Microbiología de los alimentos: fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la integridad (inocuidad y la calidad) microbiológica de los alimentos.

(3) Norma colombiana NTON 03 022 - 99 NORMA DE QUESOS FRESCOS NO MADURADOS.