ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO Y EXPERIMENTAL DE LAS
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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA INSTITUTO DE CIENCIAS CENTRO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS MICROBIOLÓGICAS POSGRADO EN MICROBIOLOGÍA ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO Y EXPERIMENTAL DE LAS PROPIEDADES INMUNOGÉNICAS DE LA ENOLASA DE Haemophilus influenzae TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRÍA EN CIENCIAS (MICROBIOLOGÍA) CON OPCIÓN EN: MICROBIOLOGÍA MÉDICA PRESENTA: L.F. Yesenia Osorio Aguilar ASESOR DE TESIS: D.C. Rosa del Carmen Rocha Gracia COASESOR DE TESIS D.C. Alejandro Carabarin Lima PUEBLA, PUE. ENERO 2018
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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
INSTITUTO DE CIENCIAS
CENTRO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS MICROBIOLÓGICAS
POSGRADO EN MICROBIOLOGÍA
ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO Y EXPERIMENTAL DE LAS
PROPIEDADES INMUNOGÉNICAS DE LA ENOLASA DE
Haemophilus influenzae
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRÍA EN CIENCIAS (MICROBIOLOGÍA)
CON OPCIÓN EN: MICROBIOLOGÍA MÉDICA
PRESENTA:
L.F. Yesenia Osorio Aguilar
ASESOR DE TESIS:
D.C. Rosa del Carmen Rocha Gracia
COASESOR DE TESIS
D.C. Alejandro Carabarin Lima
PUEBLA, PUE. ENERO 2018
II
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer infinitamente a mis padres, por el apoyo y el amor
incondicional que siempre me han brindado, por forjarme como la persona que soy. A
mis hermanos, por estar siempre presentes y ser una fuente de inspiración,
alentándome día a día a seguir adelante.
También quiero expresar mi más sincero agradecimiento a mi asesora de tesis la
Dra. Rosa del Carmen Rocha Gracia, por haberme dado la oportunidad de trabajar
en su laboratorio bajo su asesoría, gracias por su disposición y tiempo brindado, por
orientarme y trasmitirme su conocimiento para la realización de este trabajo, además
de sus palabras de aliento y motivación para ir más allá.
A mi coasesor el Dr. Alejandro Carabarín Lima, gracias Ale por el apoyo inmenso que
me has brindado, por hacerme parte de este proyecto y por el arduo trabajo de
trasmitirme tus conocimientos, además de estar siempre dispuesto a resolver mis
dudas o a cuestionarme sobre las mismas.
A la Dra. Patricia Lozano Zarain por su grata colaboración, apoyo y asesoría sobre
este proyecto. Al Dr. Miguel Castañeda y la Dra. Claudia Martínez, por su orientación
y valiosas aportaciones hacia el proyecto.
También quiero agradecer a la Dra. María Cristina González Vázquez, Cris muchas
gracias por brindarme un magnifico asesoramiento y porque siempre estuviste en la
mejor disposición para enseñarme, gracias por tus consejos y sobre todo gracias por
tu amistad.
A todos mis compañeros de laboratorio por hacer de nuestro lugar de trabajo un
lugar más ameno y lleno de compañerismo.
III
A CONACYT por la beca que me proporciono (No. de Becario 675962), porque
gracias a ello, fue posible la realización de este proyecto y mi estancia en el
Laboratorio Microbiología Hospitalaria y de la Comunidad.
Al CICM-BUAP por la oportunidad de seguir adelante en mi formación académica y
por el gran apoyo brindado durante este tiempo.
A PRODEP/511-6/17-8017 por la beca otorgada para culminar la etapa final del
proyecto de investigación.
IV
INDICE
Página
INTRODUCCIÓN 1
1. Haemophilus influenzae 1
1.1. Características generales 1
1.2. Clasificación 1
1.3. Patogénesis 1
2. Enolasa 3
3. ANTECEDENTES 5
3.1. Antecedentes directos 6
4. JUSTIFICACIÓN 7
5. OBJETIVO GENERAL 8
5.1. Objetivos particulares 8
5.2. Objetivos específicos 8
6. DIAGRAMA DE TRABAJO 10
7. MATERIALES Y MÉTODOS 11
7.1. Material biológico utilizado 11
7.2. Cultivos de cepas 12
7.3. Análisis in silico 13
7.3.1. Análisis in silico de la proteína enolasa 13
7.4. Extracción de ADN genómico 15
7.5. Amplificación del gen eno de H. influenzae 15
7.5.1. Condiciones de amplificación del gen
eno de H. influenzae 17
7.6. Electroforesis en gen de agarosa 17
7.7. Cuantificación de ADN 17
7.8. Secuenciación 18
7.8.1. Análisis de las secuencias 18
V
7.9 Células competentes 18
7.10. Clonación del gen de la enolasa 19
7.11. Subclonación 19
7.12. Transformación 20
7.13. Purificación de rEnoHibBUAPNAN 20
7.14. Cuantificación de proteínas por método de Bradford 21
7.15. Inmunodetección mediante Western-blot 22
7.16. Obtención de anticuerpos policlonales 22
7.17. Obtención de proteínas totales 23
7.18. Inmunodetección mediante inmunofluorescencia 23
8. RESULTADOS 25
8.1. Análisis in silico de secuencias del gen eno 25
8.2. Análisis in silico de la proteína enolasa 25
8.2.1. Propiedades fisicoquímicas 25
8.2.2. Determinación de regiones transmembranales
e identificación de epítopes 25
8.2.3. Alineamiento múltiple de distintas enolasas 31
8.3 Amplificación del gen eno de H. influenzae 35
8.4. Clonación y subclonación del gen eno 37
8.5. Obtención de la proteína recombinante 39
8.6. Obtención de anticuerpos policlonales 41
8.7. Identificación de la enolasa nativa 42
8.8. Localización de la enolasa en la superficie
de H. influenzae 43
9. DISCUSIÓN 46
10. CONCLUSIÓN 54
11. PERSPECTIVAS 55
12. BIBLIOGRAFÍA 56
13. ANEXOS 64
VI
Índice de Tablas
Tabla Titulo Página
1 Cepas utilizadas 11
2 Plásmidos utilizados 12
3 Programas utilizados para el análisis in silico de la proteína enolasa
14
4 Componentes y concentraciones de la PCR para amplificar el gen eno de H. influenzae
16
5 Aminoácidos importantes en la secuencia de la enolasa 31
VII
Índice de Figuras
Figura Titulo Página
1 Condiciones de PCR 17
2 Fórmula para calcular la ligación [Vector/inserto] 20
3 Predicción de hélices transmembranales 26-28
4 Características inmunológicas de la enolasa de H. influenzae
30
5 Alineamiento múltiple de las enolasas de distintas cepas
32-33
6 Estructura tridimensional de la enolasa de H. influenzae
34
7 Producto de PCR; amplificación del gen de la enolasa 35
8 Análisis en BLAST protein de la secuencia de la enolasa
36
9 Clonación del gen de la enolasa en el plásmido pCR®2.1-TOPO®
37
10 Subclonación del gen de la enolasa en el plásmido de expresión pRSET-A
38
11 Purificación e identificación de la proteína recombinante (rEnoHibBUAPNAN), mediante Western-blot
40
12 Titulación de anticuerpos policlonales mediante Western-blot
41
13 Identificación de la enolasa nativa de diferentes cepas de H. influenzae mediante Western-blot.
42
14 Inmunolocalización de la enolasa nativa mediante epifluorescencia
44
15 Inmunolocalización de la enolasa nativa mediante microscopía confocal
45
VIII
Abreviatura Significado
ADN
Ácido Desoxirribonucleico
Asn
Asparigina
BET
Bromuro de Etidio
BHI
Agar Infusión Cerebro Corazón
BLAST
Herramienta Básica de Búsqueda para Alineamientos Locales
BSA
Albumina sérica bovina
CaCl2
Cloruro de calcio
CICM
Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas
CO2
Dióxido de carbono
DAPI
4 ',6-diamino-2-fenilindol
DIC
Microscopía diferencial de contraste de interferencia
DO
Densidad óptica
EPOC
Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica
et al.
Y colaboradores
FITC
Isotiocianato de fluoresceína
g
Gramo
Gly
Glicina
HCl
Ácido Clorhídrico
H. influenzae
Haemophilus influenzae
IX
Abreviatura Significado
HiNT
Haemophilus influenzae No Tipificable
His
Histidina
IBT
Instituto de Biotecnología
IgG
Inmunoglobulina G
IPTG
Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido
Kb
Kilo base
kDa
Kilo Dalton
L
Litro
LB
Luria Bertani
LCR
Líquido cefalorraquídeo
Leu
Leucina
LMHC
Laboratorio de Microbiología Hospitalaria y de la Comunidad
Lys
Lisina
Met
Metionina
MgCl2
Cloruro de Magnesio
mg
Miligramo
ml
Mililitro
mM
Milimolar
NaCl
Cloruro de sodio
NAD
Nicotidamida Adenina Dinucleótido
NBT Abreviatura
Nitroazul de tetrazolio Significado
X
ng
Nano gramo
NiSO4
Sulfato de níquel
OM
Otitis media
pb
Pares de bases
PBS
Buffer salino de fosfatos
PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
PGA
D-2- Fosfoglicerato
Phe
Fenilalanina
rEno
Enolasa recombinante
rpm
Revoluciones por minuto
SDS-PAGE
Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
Ser
Serina
T
Temperatura
TM
Transmembranal
Tyr
Tirosina
mg
Microgramo
μL
Microlitro
[]
Concentración
XI
RESUMEN
H. influenzae es un bacteria gram negativa, responsable de enfermedades
pediátricas, e invasivas como meningitis, epiglotitis, neumonía, artritis séptica,
pericarditis, celulitis, bacteriemia (principalmente provocadas por H. influenzae
serotipo b). Las cepas de H. influenzae No Tipificables (HiNT), están asociadas
principalmente a infecciones localizadas, como infecciones agudas y crónicas de
tracto respiratorio, tales como otitis media aguda (OM), otitis media crónica con
efusión, conjuntivitis, otorrea, sinusitis, bronquitis, neumonía adquirida en la
comunidad y se encuentra asociada a la enfermedad pulmonar obstructiva crónica en
adultos (EPOC). Existe la vacunación contra H. influenzae serotipo b; sin embargo,
queda desprotegida la población que adquiere una infección por otros serotipos o por
HiNT.
La enolasa (2-fosfo-D-glicerato hidrolasa, EC 4.2.1.11) es una metaloenzima que
cataliza la reacción reversible de D-2-fosfoglicerato (PGA) a fosfoenolpiruvato (PEP)
en la glicólisis y la gluconeogénesis; sin embargo, puede estar presente en la
superficie celular de algunas bacterias patógenas, donde actúa como receptor del
plasminógeno, promoviendo su activación a plasmina activa, favoreciendo la
degradación de los componentes de la matriz extracelular y la diseminación
sistémica de las bacterias en el hospedero.
En este estudio se amplificó, clonó, y secuenció el gen codificante para la enolasa de
H. influenzae, además se obtuvo la proteína recombinante (rEnoHibBUAPNAN) con
un peso aproximado de 52 kDa. Con esta recombinante se realizó un esquema de
inmunización en conejos Nueva Zelanda. Los anticuerpos policlonales generados
contra rEnoHibBUAPNAN, alcanzaron títulos > 1:30,000, además mediante ensayos
de Western-blot, reconocieron específicamente a rEnoHibBUAPNAN y a la enolasa
nativa (46 kDa), en extractos proteicos totales de cepas tipificables y No Tipificables.
En las diferentes cepas estudiadas y mediante microscopía confocal se confirmó la
localización de la enolasa en la superficie celular de H. influenzae. Por otra parte, los
análisis in silico demostraron que la enolasa de cepas tipificables y No Tipificables se
encuentra altamente conservadas, con un 94.89 hasta un 100 % de identidad.
Además, contiene los motivos característicos para la actividad de enolasa, y el
motivo putativo de unión a plasminógeno 340ILIKFNQIGSLTET353, así como un
residuo de lisina (Lys433) en el extremo C- terminal, con los cuales se podría unir a
los dominios Kringle del plasminógeno. Adicionalmente, se identificó una región
transmembranal mediante la cual podría estar anclada a la superficie celular de H.
influenzae y se predijeron epítopes capaces de activar a linfocitos B y linfocitos T
citotóxicos. La capacidad inmunogénica demostrada y la expresión de la enolasa en
la superficie de H. influenzae, son características importantes para ser considerada
un candidato potencial para el desarrollo de una vacuna.
Palabras Clave: Haemophilus influenzae, enolasa, clonación, purificación, proteína
recombinante, localización superficial, inmunógeno, vacuna.
1
INTRODUCCIÓN
1. Haemophilus influenzae
1.1. Características generales
Haemophilus influenzae, es un cocobacilo Gram negativo, aerobio o anaerobio
facultativo, pleomorfico, no móvil, no forma esporas, y pertenece a la familia
Pasteurellaceae. Para su crecimiento in vitro requiere de medios complejos
adicionados de factores de enriquecimiento presentes en la sangre, como son el factor
X (grupo Hemo), factor V (NAD), protoporfirina IX o protohemoglobina que contenga
hierro, y una atmosfera del 5-10 % de CO2. Crece en forma óptima entre 35°C y 37°C,
es quimiorganotrófico (Foxwell et al., 1998; Tang et al., 2001).
1.2 Clasificación
En 1930 Marget Pittman identificó seis diferentes tipos de cepas capsuladas a las
cuales designó como serotipos y los nombra de la a-f; y a las cepas no capsuladas las
denomina cepas No Tipificables (Shapiro et al., 1991). Existen 8 biotipos denominados
con números romanos I- VIII, los cuales se identifican con base a tres pruebas
bioquímicas; producción de indol, actividad de la ureasa y actividad de ornitina
descarboxilasa (Gilsdorf et al., 1997; Sosa, 1992).
1.3. Patogénesis
Esta bacteria coloniza de forma natural la nasofaringe de humanos sin causar daño, a
menos que logre vencer las barreras del sistema inmune del hospedero, afectando
principalmente a individuos inmunocomprometidos (Tang et al., 2001). Su transmisión
ocurre típicamente de persona a persona a través de la inhalación de gotas de
secreciones respiratorias contaminadas o por inoculación de mano a boca (Foxwell et
al., 1998).
H. influenzae puede ser responsable de enfermedades pediátricas invasivas como
meningitis, epiglotitis, neumonía, artritis séptica, pericarditis, celulitis y bacteriemia
(principalmente provocadas por H. influenzae serotipo b). Las cepas de H. influenzae
No Tipificables (HiNT), están asociadas principalmente a infecciones localizadas como
2
son las infecciones agudas y crónicas de tracto respiratorio, tales como otitis media
aguda (OM), otitis media crónica con efusión, conjuntivitis, otorrea, sinusitis, bronquitis,
neumonía adquirida en la comunidad y se encuentra asociada a la enfermedad
pulmonar obstructiva crónica en adultos (EPOC). También pueden ocasionar
enfermedad invasiva como meningitis y sepsis en hospederos inmunocomprometidos
(Langereis et al., 2015)
La enfermedad por HiNT ocurre cuando la bacteria se adhiere y coloniza células
epiteliales en el tracto respiratorio o invade tejidos circundantes (Terán et al., 2009). Sin
embargo un daño a la mucosa del tracto respiratorio por otro agente como un virus o el
humo del tabaco, es predisponente para que HiNT se asocie a la nasofaringe y
posteriormente pueda producir otitis media, sinusitis, bronquitis y conjuntivitis (Murphy
et al., 1987). De igual manera, la EPOC, la bronquiectasia y la fibrosis quística, se
asocian con anormalidades en el espacio mucociliar y predisposición a adquirir HiNT
(Rao et al., 1999).
HiNT es el segundo agente etiológico aislado de otitis media aguda y la causa más
común bacteriana de otitis media con derrame (Giebink, 1989; Roberts et al., 1986). Se
estima que este organismo causa aproximadamente un tercio de episodios de sinusitis
aguda y crónica. Ocasionalmente HiNT es aislado de tracto urogenital y asociado con
endometriosis, cervicovaginitis, otras infecciones urogenitales y sepsis neonatal (Rao et
al., 1999; Hall et al., 1983).
Se han identificado cepas de HiNT formadoras de biopelícula (Bakaletz et al.2005), lo
que puede contribuir a la patogénesis en el caso de otitis media, esta característica
contribuye a la persistencia de la bacteria en vías respiratorias del huésped lo cual es
considerado como un factor que contribuye a la enfermedad de naturaleza crónica y/o
recurrente (Swords et al., 2003). HiNT Presenta una elevada heterogeneidad en sus
estructuras de superficie (LOS, pili hemaglutinante, HMW1, HMW2, y receptores de
hierro), debido a la variación de fase que puede emplear. Haciéndolo un excelente
colonizador capaz de evadir el sistema inmune y sobrevivir intracelularmente (Rao et
al., 1999).
3
Actualmente existe la vacuna contra H. influenzae serotipo b, que está compuesta por
el polisacárido capsular polirribosil ribitol fosfato (PRP), conjugado a una proteína
acarreadora. Dicha vacuna es específica para el serotipo b, por tanto no protege a la
población que adquiere una infección por otros serotipos o por HiNT, además es el
principal microorganismo relacionado con las exacerbaciones de la EPOC, ya que es
aislada en cerca de la mitad de los casos, además de que se ha reportado un
incremento en la incidencia de infecciones causadas, por lo que es importante su
estudio como patógeno no sólo de interés pediátrico, sino también en la población
adulta.
2. Enolasa
La enolasa (2-fosfo-D-glicerato hidrolasa, EC 4.2.1.11) es una metaloenzima que
cataliza la reacción reversible de D-2-fosfoglicerato (PGA) a fosfoenolpiruvato (PEP)
tanto en la glicólisis como la gluconeogénesis. Puede estar presente en una gran
variedad de organismos, desde bacterias hasta vertebrados superiores, muestra
secuencias de aminoácidos altamente conservadas, particularmente en el sitio
catalítico. La enolasa requiere magnesio para la catálisis y su estabilización (Pancholi
2001). Es considerada una proteína multifuncional, ya que está involucrada en una
amplia variedad de eventos, por ejemplo, como proteína de choque térmico, proteína de
estrés hipoxico o como adhesina.
Por otra parte, se ha reportado que un incremento en la expresión de la enolasa está
relacionada con la progresión de tumores como: neuroblastoma y cáncer de pulmón por
lo que ha sido considerada un marcador potencial para el diagnóstico de algunos tipos
de cáncer (Roig-borrellas et al., 2012). Además se ha visto que la enolasa puede actuar
como un receptor de plasminógeno cuando se expresa en la superficie celular de
ciertos patógenos (Bergmann et al., 2001; Pancholi y Fischetti 1998).
El plasminógeno juega un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis de la
coagulación, cuando es convertido en plasmina activa, la que a su vez degrada a la
fibrina. La presencia de receptores de proteínas de plasminógeno en la superficie
bacteriana como la enolasa, permite a las bacterias invasoras emplear la actividad
4
fibrinolítica de la plasmina y escindir la lámina de fibronectina, proteoglicanos y otros
componentes de matrices extracelulares de humanos (Kinloch et al. 2005; Agarwal et
al. 2008). De tal forma que la capacidad para transmigrar a través de las capas de
epitelio y endotelio vascular le permite a las bacterias romper la barrera y colonizar
diferentes tejidos del huésped.
La presencia de la enolasa en la superficie celular, donde actúa como receptor de
plasminógeno en lugar de una hidrolasa no es sorprendente, hay una lista creciente de
proteínas tanto procariotas como eucariotas con funciones biológicas variables
localizadas en distintos sitios o compartimentos de la célula (Agarwal et al. 2008), y
tienen un papel importante en varios aspectos biológicos y fisiopatológicos (Díaz-
Ramos et al., 2012).
Algunos ejemplos en los que la enolasa se encuentra involucrada es en el cáncer, la
enfermedad fúngica sistémica y en enfermedades dentales (Pancholi, 2001), e inclusive
se ha reportado que la expresión de la enolasa en la superficie de células
cancerígenas de pulmón promueve la migración o metástasis del mismo (Hsiao et al.,
2013; Capello et al., 2011). Dada su importancia en distintos eventos patológicos, la
enolasa se ha descrito como un antígeno inmunodominante, considerada un potencial
candidato vacunal (Sundstrom et al., 1992; Chen et al., 2012) tanto en infecciones
micóticas, bacterianas , parasitarias y como blancos terapéuticos contra el cáncer.
5
3. Antecedentes
En años recientes, distintos grupos de investigación se han dado a la tarea de
investigar el papel inmunogénico de la enolasa, ya sea mediante herramientas
bioinformáticas y/o trabajos experimentales, en los cuales se ha evidenciado la
capacidad inmunoprotectora que confiere la enolasa en distintos modelos infectivos.
El uso de la enolasa para desencadenar una respuesta inmune protectora fue
reportada en un estudio realizado por Wang en 2015, en donde observan la
participación de la enolasa en la adhesión e invasión por Streptococcus iniae en células
BHK-21 (Células cancerígenas de riñón de hamster); además, la inmunización con la
proteína recombinante, puede conferir protección efectiva contra la infección por S.
iniae en ratones (Wang et al., 2015). Otro estudio reporta que rEnolasa de S. sobrinus
actúa como un antígeno inmunogénico, observando la existencia de una asociación
oral terapéutica con la previa inmunización de la enolasa recombinante y la disminución
en la colonización por S. sobrinus, en ratas (Dinis et al., 2009).
Por otra parte en Vibrio parahaemolyticus se demostró que la vacunación con la
enolasa confiere inmunidad eficaz contra una dosis letal de V. parahaemolyticus en un
modelo de ratón (Jiang et al., 2014). Estos resultados no se limitan a bacterias, el
efecto protector de la enolasa se ha observado también en parásitos. Por ejemplo, un
estudio realizado en la india en 2007, demostró que la enolasa de Plasmodium
falciparum está presente en la superficie de los merozoitos, y el uso de anticuerpos de
conejo anti enolasa de P. falciparum inhibe su crecimiento en un cultivo in vitro,
además también se observó que los ratones inmunizados con r-Pfen demostraron
protección contra la cepa letal Plasmodium yoelii 17XL del parásito de la malaria (Pal-
Bhowmick et al., 2007). Resultados similares se reportaron para la enolasa de Ascaris
suum, en donde se observa una disminución del 61.13 y 88.62% en la recuperación de
larvas y huevos, en ratones previamente inmunizados con la enolasa recombinante y
posteriormente infectados con 2500 larvas de A. suum, sugiriendo una vez más que la
enolasa es un candidato vacunal en contra de A. suum (Chen et al., 2012).
6
Para el caso de Chlamydia pneumoniae un screening múltiple identifica cuatro
proteínas de superficie, incluida la enolasa, capaces de inducir la producción de
anticuerpos neutralizantes. En este estudio se sugiere la participación de la enolasa en
la inhibición de la difusión de Chlamydia pneumoniae en un modelo de hámster (Finco
et al., 2005). Más allá la inmunización con la enolasa de Candida albicans confiere
protección contra la infección sistémica en un modelo de ratón (Li et al., 2011). En S.
agalactie se demuestra la inmunoreactividad con rEnolasa utilizando sueros de
pacientes infectados (Brzychczy-Wloch et al., 2013).
Adicionalmente se han registrado dos patentes de vacunas usando a la enolasa, una
en contra de Streptococcus sobrinus y Streptococcus mutans (Paten. N0.: US 7,
541,041 B12 Date of Patent Jun. 2, 2009) (Gomes et al., 2009) y otra en contra de
Staphylococcus aureus (Pub.N0.: US 2014/0030287 A1 Pub. Date: Jan. 30, 2014).
Estos reportes, son alentadores para sugerir que la enolasa de H. influenzae podría
tener el mismo efecto inmunoprotector.
3.1. Antecedentes directos
En el laboratorio de Microbiología Hospitalaria y de la Comunidad, Carabarin-Lima en
2015 diseñó oligonucleótidos específicos, amplificó y clonó el gen de la enolasa de la
cepa HiNTBUAP96 en el plásmido pCR®2.1-TOPO®, además de obtener la secuencia
completa de dicho gen (datos no publicados).
7
4. JUSTIFICACIÒN
H. influenzae tiene importancia médica por ser causa de una amplia variedad de
infecciones tanto sistémicas como localizadas, principalmente en niños menores de 5
años, adultos mayores de 65 años, y personas inmunocomprometidas. Además, en los
últimos años se ha reportado un incremento en la incidencia de infecciones producidas
por otros serotipos y por HiNT. Pese a la existencia de la vacuna contra H. influenzae
serotipo b, esta no protege contra el resto de los serotipos, ni contra las infecciones
adquiridas por cepas de HiNT. Aunado a esto, el incremento de la resistencia a
múltiples antibióticos por estas cepas, hace cada vez más difícil el tratamiento de las
infecciones causadas por las mismas, lo que constituye un problema importante en
salud pública, por lo que es importante buscar alternativas principalmente profilácticas,
como la vacunación, (método más eficaz para prevenir una infección).
Por lo anterior es importante estudiar la posible presencia de la enolasa en la
membrana externa de H. influenzae y determinar si esta proteína puede actuar como
inmunógeno. Lo anterior conduciría a ensayarla como un posible candidato para el
desarrollo de una vacuna en contra de H. influenzae y de esta manera se podría
contribuir a la disminución de las infecciones causadas por esta bacteria en la
población vulnerable.
8
5. OBJETIVO GENERAL
Determinar las propiedades inmunogénicas de la enolasa de Haemophilus influenzae,
mediante análisis bioinformáticos y experimentales.
5.1. Objetivos particulares:
1.- Analizar mediante herramientas in sílico los genes que codifican para la enolasa de
H. influenzae No Tipificable y tipificable a partir de genomas secuenciados.
2.- Purificar la enolasa recombinante de la cepa HibBUAPNAN (rEnoHibBUAPNAN)
3.- Obtener anticuerpos policlonales contra la enolasa recombinante
(rEnoHibBUAPNAN)
4.- Inmunolocalizar a la enolasa nativa en distintas cepas de H. influenzae.
5.2. Objetivos específicos:
1.1 Obtener secuencias de los genes que codifican para la enolasa de H. influenzae No
Tipificable y tipificable a partir de genomas secuenciados y determinar el porcentaje de
identidad entre cepas tipificables y No Tipificables.
1.2 Identificar mediante PCR y secuenciación el gen de la enolasa de las cepas:
HiNTBUAP96 y HibBUAPNAN.
1.3 Analizar las propiedades inmunogénicas y bioquímicas de la enolasa de las cepas
HiNTBUAP9612540 y HibBUAPNAN.
2.1 Clonar en un vector de expresión, el gen de la enolasa de las cepas HiNTBUAP96 y
HibBUAPNAN.
2.2 Purificar mediante cromatografía de afinidad, la enolasa recombinante de la cepa
HibBUAPNAN.
9
3.1 Inmunizar conejos con la rEnoHibBUAPNAN.
3.2 Cuantificar el título de anticuerpos obtenidos contra la rEnoHibBUAPNAN.
4.1 Identificar la localización en diferentes fracciones proteicas de la enolasa nativa de
distintas cepas de H. influenzae.
4.2 Inmunolocalizar la enolasa de las cepas HiNTBUAP96 y HibBUAPNAN.
10
6. DIAGRAMA DE TRABAJO
MATERIALES Y METODO
7. MATERIALES Y MÉTODOS
Análisis in sílico del gen de la enolasa: 80 genomas secuenciados de
H. influenzae, identificación del % de identidad
Identificación (PCR y secuenciación) gen de la enolasa.
Análisis in sílico (Propiedades inmunogénicas y bioquímicas de las enolasas).
Purificación (cromatografía de afinidad) de la enolasa recombinante de HibBUAPNAN.
Obtención anticuerpos policlonales contra la enolasa recombinante de HibBUAPNAN.
Localización de la enolasa nativa de H. influenzae, en diferentes fracciones proteicas, mediante Western-blot
y microscopía confocal.
Clonación y subclonación gen eno de HiNTBUAP96 y HibBUAPNAN.
11
7.1 Material biológico utilizado
Para el estudio se incluyeron 4 cepas de H. influenzae: 2 tipificables y 2 No Tipificables
(Tabla 1.). La cepa No Tipificable HiNTBUAP96, fue aislada de un niño menor de 5
años que presentaba un cuadro clínico de otitis media con secreción. La cepa
HibBUAPNAN serotipo b fue aislada de una niña menor a 2 años que presentaba un
cuadro clínico de meningitis, HiNTBUAPPAU es una cepa No Tipificable aislada de un
hombre de 45 años que presentaba un cuadro clínico faringoamigdalitis (pacientes del
Hospital Universitario del estado de Puebla). La cepa ATCC® 33930™ de origen
Tailandés, serotipo b, aislada de LCR con nivel de bioseguridad 2. También se trabajó
con dos cepas de E. coli, la cepa E. coli DH5α y E. coli BL21 (DE3) pLysS,
características referidas en la tabla 1.
Todas las cepas utilizadas en este estudio forman parte del cepario del Laboratorio de
Microbiología Hospitalaria y de la Comunidad del Centro de Investigaciones en
Ciencias Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la BUAP (ICUAP).
Tabla 1. Cepas utilizadas
Cepa Características Origen
HiNTBUAP96 Cepa No Tipificable aislada de un cuadro clínico de otitis media con secreción.
Oído
HibBUAPNAN Cepa serotipo b aislada de un cuadro clínico de meningitis.
LCR
HiNTBUAPPAU Cepa No Tipificable de un cuadro clínico de faringoamigdalitis.
Faringe
HibATCC33930 Cepa serotipo b, aislada de LCR con nivel de bioseguridad 2.
ATCC
E. coli DH5α F- Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-
Invitrogen
E. coli BL21(DE3) pLysS F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3) pLysS (CamR)
Invitrogen
12
7.2. Cultivo de cepas
Las cepas de H. influenzae se cultivaron rutinariamente en medio Agar Infusión
Cerebro Corazón (BHI) enriquecido con Fildes al 5%, el cual es un digerido de
sangre de carnero, y aporta los factores X y V para su crecimiento. Las cepas se
incubaron a 37°C con una atmósfera de CO2 del 5-10%, durante 24 horas. Las cepas
de E. coli se cultivaron en medio LB e incubaron a 37 ºC, suplementadas con
antibiótico según el plásmido portado, descritos en el punto 7.10 y 7.11.
Tabla 2. Plásmidos utilizados
Plásmido Características Origen
pCR®2.1-TOPO® Operón LacZα, sitio múltiple de clonación, T7 promotor, f1 origen, resistencia kanamicina y ampicilina, pUC origen.
Invitrogen
pCR®2.1-TOPO::EnoHiNTBUAP96
Derivado de pCR®2.1-TOPO® con inserción de gen eno de HiNTBUAP96.
Este trabajo
pCR®2.1-TOPO::EnoHibBUAPNAN
Derivado de pCR®2.1-TOPO® con inserción de gen eno de HibBUAPNAN
Este trabajo
pRSETA Promotor T7, alto nivel de expresión de proteínas fusionadas a bandera 6xHis (N-term), Resistencia a ampicilina, inducible con IPTG.
Invitrogen
pRSETA::EnoHiNTBUAP96 Derivado de pRSETA con inserción al gen eno de HiNTBUAP96.
Este trabajo
pRSETA::EnoHibBUAPNAN Derivado de pRSETA con inserción del gen eno de HibBUAPNAN.
Este trabajo
13
7.3. Análisis in sílico
Los análisis in silico se llevaron a cabo utilizando distintos programas bioinformáticos,
así como bases de datos en las cuales se encuentran genomas ya secuenciados de
una gran variedad de microorganismos, incluidos el genoma de distintas cepas de H.
influenzae.
A partir de la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information)
se obtuvieron las secuencias de los genes codificantes para la enolasa de cepas
tipificables y No Tipificables de H. influenzae. Las secuencias nucleotidicas de los
genes se alinearon usando Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/),
con la finalidad de evaluar el porcentaje de identidad entre todas la cepas.
7.3.1. Análisis in sílico de la proteína enolasa
Una vez obtenidas las secuencias de aminoácidos se analizaron mediante diversos
programas bioinformáticos, para determinar: estructura secundaria, terciaria, modelaje
de la proteína, identificación de motivos importantes para la actividad bioquímica,
regiones transmembranales, así como la predicción de posibles epítopes para la
activación de linfocitos B, linfocitos T citotóxicos, entre otros. En la tabla 3, se describe
a detalle (programa, página de internet y tipo de análisis).
14
Tabla 3. Programas utilizados para el análisis in silico de la proteína
enolasa
Programa Análisis
ProtParam
(http://ca.expasy.org/tools/protparam/html)
Peso molecular, punto isoeléctrico, estabilidad y composición
PredictProtein
(http://www.predictprotein.org/)
Estructura secundaría
MotifScan
(http://myhits.isb-sib.ch/cgibin/motif_scan)
Modificaciones postraduccionales
Chimera 1.11.2 Estructura tridimensional
Singnal P
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)
Péptido señal
PredictProtein, TMpred y HMMTOP
(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)
(http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)
Hélices transmembranales
BepiPred 1.0 Server
(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)
Posibles epítopes para activación de linfocitos B
NetCTL 1.2 Server
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)
Posible epítopes para activación de linfocitos Tc
InterPro Scan
(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)
Dominios funcionales
15
7.4. Extracción de ADN genómico
A partir de un cultivo puro de H. influenzae crecido en medio BHI, se tomaron cuatro
asadas y se suspendieron en 700 µl de solución salina estéril en un tubo eppendorf de
1.5 ml.
La mezcla se disolvió por vórtex hasta quedar homogenizada, y se centrifugó 5 minutos
a 3,000 rpm, el sobrenadante fue retirado y el paquete celular se resuspendió en 400 µl
de buffer STE (Anexo 1), seguido de una centrifugación a 10,000 rpm/2 min/4ºC.
Nuevamente se eliminó el sobrenadante, y el paquete se resuspendió en 200 µl de
buffer TE, adicionando 100 µl de solución fenol-cloroformo-alcohol isoamilico, se
homogenizó con vórtex a máxima velocidad durante 3 min, y se centrifugó a 12,000
rpm/5 min/ 4ºC.
Posteriormente la fase acuosa se transfirió a un tubo eppendorf nuevo, agregando 50
µl de buffer TE mas 200 µl de cloroformo-alcohol isoamilico; se homogenizó y
centrifugó a las mismas condiciones del paso anterior.
Una vez más el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se agregó 200 µl de
isopropanol al 100% frio e incubó a -20 ºC/30 min, se centrifugó 12,000/15 min/ 4ºC y
decantó el sobrenadante. Posteriormente la pastilla se lavó con 500 µl de etanol al 70%
frio, se decantó y dejó secar a temperatura ambiente.
Finalmente se adicionaron 50 µl de solución TE con 100 µg/ml de RNasa y se incubó a
37 ºC/20 min, posteriormente la muestra se mantuvo a -20 ºC hasta su uso para la
amplificación del gen eno de las distintas cepas de H. influenzae.
7.5. Amplificación del gen eno de H. influenzae
Una vez obtenido el ADN genómico de H. influenzae el gen eno fue amplificado
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleando los
oligonucleótidos diseñados por Carabarin-Lima en 2015, utilizados para amplificar el
gen eno de la cepa HiNTBUAP96, además de obtenerse la secuencia completa de este
gen.
16
Como oligonucleótido delantero se empleó
5´CTCGAGATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTG-3’, y como oligonucleótido reverso
5’- GGTACCCTTGACCTTTAACCGCTTTTAAG- 3’, los cuales contienen secuencias
de restricción insertadas para las enzimas XhoI y KpnI respectivamente, para facilitar la
subclonación.
La reacción de PCR se llevó a un volumen final de 15 µl con los reactivos y
concentraciones descritas más adelante (Tabla 4). La PCR se realizó en el
termociclador Tprofessional TRIO Thermocycler de Biometra. Como control positivo se
utilizó el plásmido pCR®4-TOPO::EnoHiNTBUAP96, el cual contiene el gen eno de la
cepa HiNTBUAP96.
Tabla 4. Componentes y concentraciones de la PCR para amplificar el
gen eno de H. influenzae
Componentes Concentración Inicial
Volumen añadido por
tubo (μL)
Concentración final de la reacción
Maxima Hot Start Taq DNA
Polymerase (Thermo Scientific)
5 U/ µL
0.1
0.03 U
Buffer de reacción 10X 1 0.66X
MgCl2 25 mM 1 1.66 mM
dNTPs 10 mM 0.4 0.266 mM
Oligonucleótido delantero
25 mM 1 1.66 mM
Oligonucleótido reverso
25 mM 1 1.66 mM
ADN 2 ---
Agua libre de nucleasas
--- 8.5 µL ---
Volumen final 15 µL
17
7.5.1. Condiciones de amplificación del gen eno de H. influenzae
Las condiciones de reacción para la amplificación del gen eno de las distintas cepas de
H. influenzae se pueden observar en la Fig. 1.
Figura 1. Condiciones de PCR
7.6. Electroforesis en gel de Agarosa
La electroforesis se realizó en geles de agarosa al 1% con buffer TAE 1X a un voltaje
de 90 V por 40 minutos, usando un marcador de peso molecular con un rango que va
de 100 a 3000 pb, GeneRulerTM o 100pb Plus DNA Ladder (FERMENTAS),
posteriormente los geles se tiñeron con Bromuro de Etidio (BET) y finalmente los geles
se observaron en el foto-documentador Minibis Pro, Bioimaging System.
7.7. Cuantificación de ADN
La cuantificación de ADN se realizó en el equipo NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)
para evaluar la concentración en ng/ml. El equipo se calibró a una longitud de onda (λ)
de 260 nm, usando como blanco 2 μL de agua inyectable estéril, una vez calibrado se
cuantificaron las muestras de ADN.
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización Extensión Extensión final
4’ 1’
1’
2’ 5’
Alineamiento
30 ciclos
95°C 94°C
58°C
72°C 10°C 72°C
18
7.8. Secuenciación.
Los productos de PCR obtenidos se purificaron utilizando el kit ZymocleanTM Gel DNA
Recovery Kit™, siguiendo las instrucciones del fabricante y se mandaron a secuenciar
a un servicio externo (IBT-UNAM), con la finalidad de identificar si los productos
obtenidos correspondían al gen codificante para la enolasa de las distintas cepas de H.
influenzae.
7.8.1. Análisis de las secuencias.
Las secuencias se visualizaron con el programa FinchTV, además con ayuda del
programa Nucleic Acid Sequence Massager
(http://www.attotron.com/cybertory/analysis/seqMassager.htm) se les dio formato para
de esta manera obtener la secuencia completa del amplicón. Una vez obtenida la
secuencia de cada cepa, la homología del gen con respecto a las secuencias de otras
cepas ya reportadas, se realizó mediante BLAST (Basic Local Alignment Sequence
Tool) programa del National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Posteriormente la traducción de nucleótidos a aminoácidos se llevó a cabo utilizando
el programa ExPASy-Translate tool ( http://web.expasy.org/translate/) y finalmente las
secuencias de nucleótidos así como las de aminoácidos, (obtenidas y reportadas en la
base de datos del NCBI) fueron alineadas empleando Clustal Omega
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
7.9. Células competentes
A partir de un cultivo de toda la noche de la cepa E. coli DH5α y/o E. coli BL21(DE3)
pLysS, se inocularon 5 ml en un matraz con 50 ml de LB, se mantuvo a 37 ºC en
agitación constante hasta alcanzar una densidad óptica (DO) de 0.4 - 0.6 leída a λ=
600 nm, en el JENWAY 6305 Spectrophotometer.
Posteriormente la muestra se colocó en hielo durante 30 min y se centrifugó a 8,000
rpm/5min/4ºC, la pastilla se resuspendió en 10 ml de una solución de CaCl2 200 mM, e
incubó en hielo durante 1 h, una vez trascurrido el tiempo se repitió la centrifugación,
19
A continuación la pastilla se resuspendió en 2 ml de una solución de CaCl2 200 mM-
20% glicerol.
Finalmente la mezcla se alicuotó (600 μL en tubos eppendorf) y se mantuvieron a -70
ºC hasta su uso.
7.10. Clonación del gen de la enolasa
El producto de PCR obtenido, correspondiente al gen de la enolasa de las distintas
cepas se clonó en el plásmido pCR®2.1-TOPO® (Fig. 9 A) acorde a las instrucciones
del proveedor (InvitrogenTM by life Technologies, Carlsbad,CA, USA); posteriormente el
plásmido se transformó en células competentes de la cepa de E. coli DH5α mediante
transformación química por CaCl2.
Las células transformadas se cultivaron en placas con medio LB adicionando una
concentración de ampicilina de 100 µg/ml (como método de selección) y se incubaron
37 ºC durante toda la noche.
Posteriormente se seleccionaron algunas colonias y se les realizó una PCR de colonia
(mismas condiciones de la PRC convencional, usando como templado una pequeña
muestra directa de la colonia) con la finalidad de identificar cuál de ellas era la que
contenía el plásmido con la construcción pCR®2.1-TOPO::Hieno.
El plásmido se recuperó mediante miniprep Kit (250) acorde a las instrucciones del
proveedor (QIAprep® Spin the QIAGEN), y fue digerido con las enzimas de restricción
XhoI y KpnI durante 2.5 h/37ºC, para liberar el inserto (Anexo 2).
7.11. Subclonación
El gen de la enolasa digerido del plásmido pCR®2.1-TOPO::Hieno fue subclonado y
ligado en el plásmido pRSETA (InvitrogenTM by life Technologies, Carlsbad,CA, USA)
previamente restringido con XhoI y KpnI. La ligación se llevó a cabo con 65 ng del
inserto, (valor calculado con la fórmula de la Fig. 2), 50 ng del vector, 1 μL de enzima
ligasa y 3 μL de buffer Tango; la mezcla se incubó a 17ºC/18h, y el plásmido fue
transformado en células competentes E. coli BL21(DE3) pLysS.
20
Las colonias que contenían la construcción pRSET-A::Hibeno, se cultivaron a las
mismas condiciones que describe el punto anterior; sin embargo, el cultivo se
suplementó con ampicilina 100 µg/ml y cloranfenicol 34 µg/ml. La construcción se
comprobó mediante digestiones simples y dobles con las enzimas de restricción antes
descritas. Los ensayos de biología molecular se realizaron según se describe por
(Sambrook y Maniatis 1989).
Figura 2. Fórmula para calcular la ligación [Vector/inserto]
7.12. Transformación
Tubos eppendorf que contenía 600 μL de una solución de células competentes de E.
coli DH5α y/o E. coli BL21(DE3) pLysS se colocaron en hielo durante 20 minutos.
Posteriormente se agregaron 4 μL del plásmido pCR®2.1-TOPO::Hieno o pRSET-
A::Hieno, e incubaron nuevamente en hielo por 20 minutos, seguido de un choque
térmico a 42 °C/1 min. El tubo se regresó rápidamente al hielo, se adicionó 1 ml de LB
manteniéndolo en agitación constante a 37°C/1h.
Una vez trascurrido el tiempo la pastilla se obtuvo por centrifugación a 3,000 rpm/1min,
el sobrenadante fue eliminado, y la pastilla se distribuyó con una varilla de vidrio en una
placa de LB suministrado con él o los antibióticos correspondientes a la cepa
transformante.
7.13. Purificación de rEnoHibBUAPNAN
Las células de E. coli BL21(DE3) pLysS, que contenían el plásmido pRSET-A::Hibeno
se cultivaron toda la noche. Posteriormente a partir del precultivo se inocularon 5 ml a
un matraz que contenía 50 ml de LB suplementado con ampicilina y cloranfenicol, el
matraz se mantuvo a 37ºC en agitación constante hasta alcanzar una densidad óptica
DO600 =0.4-0.6.
21
Una vez alcanzada la DO, se adicionó Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a
una concentración final de 1mM para inducir la sobrexpresión de la proteína
recombinante: rEnoHibBUAPNAN, el cultivo se mantuvo a 37ºC en agitación constante
durante 1h y las células se colectaron mediante centrifugación a 8,000 rpm/5 min, a
continuación la pastilla se resuspendió en 20 ml de buffer de lisis (0.5 M de NaCl, Tris-
HCl 20 mM PH 8, 0.5 mM de imidazol y 0.1 X de inhibidores de proteasas).
La suspensión obtenida se sonicó a 10 pulsaciones y 50 de amplitud durante 40 min,
en el equipo Ultrasonic processor y el contenido celular sonicado, se centrifugó a 8000
rpm/10 min y la recombinante rEnoHibBUAPNAN fusionada a una etiqueta de histidinas
se purificó mediante cromatografía de afinidad a Níquel como se indica a continuación.
Primeramente, la columna que contenía 500 µl de resina (Ni-NTA Agarose Invitrogen),
se cargó con 5 volúmenes de buffer de carga (se dejó interaccionando con la columna
por 30 min), posteriormente se pasaron 3 volúmenes de buffer de unión. Una vez
equilibrada la columna, el extracto se dejó pasar a un flujo lento (aproximadamente por
una hora), y se lavó con 10 vol. de buffer de unión, seguido de 12 vol. de buffer de
lavado.
Posteriormente la proteína recombinante se eluyó con 6 vol. de buffer de elución,
seguido de 10 vol. de buffer strip (el contenido y concentraciones de las soluciones se
describen en Anexo 3). Finalmente la purificación de la proteína se visualizó mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE), (Anexo 4), y la proteína
purificada se cuantificó mediante el método de Bradford.
7.14. Cuantificación de proteínas por método de Bradford
Se realizó una curva de calibración con albumina bovina sérica (BSA) a partir de un
Stock de 10 mg/ml, agregando concentraciones de 0-30 µg/µl, y se llevó a 1ml con
reactivo de Bradford, se midió la absorbancia a λ= 595 nm, en el espectrofotómetro
JENWAY 6305, posteriormente 5 µl de la solución que contenía la proteína se llevó a 1
ml con reactivo de Bradford, se midió la absorbancia y se realizó una regresión lineal
para determinar la concentración de la proteína.
22
7.15. Inmunodetección mediante Western-blot
A partir de un corrimiento en gel SDS-PAGE al 12%, cargado con 10 μg de la proteína
recombinante en cada carril, se realizó la trasferencia a una membrana de nitrocelulosa
a 15 V por 40 min (TRANS_BLOT’ SD SEMY-DRY TRANSFER CELL BIO-RAD). La
membrana se bloqueó con una solución de leche sin grasa al 5% en PBS, durante 1
h/37ºC en agitación constante, seguida de 3 lavados con PBS-Tween al 0.05% por 10
min.
Posteriormente la membrana se incubó con el anticuerpo monoclonal anti-histidinas
(1:5000 en PBS) durante toda la noche a 4 ºC. Se realizaron tres lavados más, y se
incubó con el anticuerpo secundario: Anti-ratón IgG (H+L) producido en conejo
acoplado a fosfatasa alcalina (Novex® by Life Technologies), a una dilución 1:5000 en
PBS por 1 h/37ºC, seguida de 3 lavados.
Finalmente la membrana se relevó con NBT (nitro blue tetrazolium) y BCIP (5-bromo-4-
chloro-3-indolyl-phosphate) (Thermo Scientific).
7.16. Obtención de anticuerpos policlonales
Dos conejos hembras, de tres meses de edad (raza Nueva Zelanda) se sangraron de la
vena de la oreja para obtener el suero preinmune. Posteriormente se realizó la
inmunización con 100 microgramos de la proteína recombinante emulsificada 1:1 con
adyuvante completo de Freund. Se dieron cuatro refuerzos cada 15-25 días con
adyuvante incompleto de Freund.
Al término del esquema de inmunización los conejos se sangraron mediante punción
cardiaca, para obtener el suero hiperinmune. El cuidado y mantenimiento de los
animales se realizó en el bioterio Claude Bernard de la BUAP acorde a su reglamento y
a los descritos en la NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999.
23
7.17. Obtención de proteínas totales
La obtención de enriquecidos de proteínas de membrana se obtuvieron mediante
centrifugaciones a distintos intervalos de tiempo, como se describe a continuación: a
partir de un cultivo de H. influenzae se recolectaron las bacterias en un tubo eppendorf
que contenía 700 µl de PBS, se centrifugó a 3,000 rpm/2 min, la pastilla se resuspendió
en buffer RIPA/ 0.1x inhibidores de proteasas, se mezcló con vórtex durante 3 min y se
incubó a 37ºC/ 1 h para lisar la células.
Posteriormente se realizaron centrifugaciones a 8,000 rpm/10 min, 10,000 rpm/20 min
y 13,000 rpm/40 min, separando el sobrenadante en cada intervalo; el sobrenadante se
precipitó con 500 µl de acetona fría a 4 ºC durante toda la noche, seguida de una
centrifugación a 13,000 rpm/ 10 min. Adicionalmente se agregó 50 µl de agua destilada
y 100 µl de buffer de carga y la muestra se calentó a ebullición durante 10 min.
Los extractos totales se obtuvieron con la primera centrifugación; ambos extractos se
visualizaron en un SDS-PAGE al 12% que fue transferido a una membrana de
nitrocelulosa para realizar el Western-Blot.
7.18. Inmunodetección mediante Inmunofluorescencia
A partir de un cultivo de H. influenzae de las cepas HiNTBUAP96, HibBUAPNAN,
HibATCC y HiNTBUAPPAU se tomó una pequeña cantidad de bacterias (lo que toma
una asa) y se realizó un frotis en un portaobjetos utilizando solución fijadora al 4% de
paraformaldehído, se incubó a Tº ambiente durante 30 min, en una cámara húmeda.
Posteriormente se lavó suavemente con PBS dos veces, se agregó solución
Quenching (glicina 0.1M en PBS), durante 15 min, seguida de 3 lavados con PBS, y se
incubó con solución de bloqueo (1 % de Albumina Bovina en PBS) durante 1 h/ Tº
ambiente. Posteriormente se lavó una vez y se agregó el anticuerpo primario (suero
hiperinmune en PBS, 1:50), cómo control negativo se utilizó suero preinmune a la
misma dilución, y se incubó a 4ºC toda la noche.
Como control positivo se utilizaron anticuerpos policlonales totales contra HiNT y Hib,
hechos en conejo. Proporcionados por el LMHyC.
24
Al día siguiente realizaron 4 lavados con PBS-Tween, se incubó con el anticuerpo
secundario utilizando una dilución 1:250 de Anti-conejo IgG(H+L) hecho en cabra
acoplado a FITC (ZyMax TM) en PBS y se incubó 1h/37ºC en una cámara húmeda,
protegida de la luz; trascurrido el tiempo se realizaron 4 lavados con PBS-Tween,
además de un lavado con agua destilada y se eliminó el exceso de agua; se agregaron
8µl de VECTASHIELD ® y se colocó un cubreobjetos, procurando que quedara
extendido en toda la muestra.
Finalmente se selló toda la periferia con una resina acrílica, las muestras se
mantuvieron a 4ºC protegidas de la luz, hasta su observación con microscopio de
epifluorescencia y microscopio confocal.
25
8. RESULTADOS
8.1. Análisis in silico de secuencias del gen eno
Inicialmente se realizó una búsqueda de genomas en la base de datos del NCBI para
obtener la secuencia del gen que codifica para la enolasa de H. influenzae de cepas
tipificables y No Tipificables. Se obtuvieron 35 secuencias, tres de ellas serotipificables:
B, D y F con número de acceso en la base de datos del Genbank FQ312006.1,
L42023.1, CP005967.1 respectivamente; el resto corresponden a cepas No
Tipificables.
Posteriormente se realizó un alineamiento múltiple mediante Clustal Omega, para
determinar la homología que existe entre ellas, incluidas las secuencias de
HiNTBUAP96 (secuencia obtenida en un trabajo anterior por el Dr. Carabarín) y
HibBUAPNAN (secuencia obtenida en este trabajo, anexo 5). El alineamiento demostró
un porcentaje de identidad de entre 94.36 hasta un 100 % a nivel de nucleótidos, sólo
se muestran los extremos 5’ y 3’ de todas las secuencias (anexo 6).
8.2. Análisis in silico de la proteína enolasa
8.2.1. Propiedades fisicoquímicas
Las propiedades fisicoquímicas de la proteína se evaluaron usando el servidor
Expasy's Protparam; la proteína está compuesta de 437 residuos de aminoácidos, con
un Peso Molecular calculado de 46.30 kDa, el punto isoeléctrico (PI) teórico fue de
5.03, el coeficiente de extinción en unidades a 280 nm fue de 23505 M - 1 cm – 1. La
vida media se estimó en 30 h y la proteína fue clasificada como estable con un índice
de estabilidad (II) de 28.60 (un valor debajo de 40 es considerado estable).
8.2.2. Determinación de regiones transmembranales e identificación de epítopes
Con la finalidad de identificar si la proteína enolasa se encuentra en la superficie celular
de H. influenzae y si esta puede desencadenar una respuesta inmune, se realizaron
análisis in silico con ayuda de softwares específicos (descritos en materiales y
métodos), que predicen con un 85 % de confiabilidad, si la proteína presenta dominios
transmembranales, además de predecir posibles epítopes, capaces de activar a
26
linfocitos B y linfocitos Tc. Los análisis in silico se realizaron a las secuencias de las
cepas HiNTBUAP96 y HibBUAPNAN. Como los análisis mostraron las mismas
predicciones, ya que tienen un porcentaje de identidad del 99.54 %, sólo se muestran
los resultados para la cepa HiNTBUAP96.
Para la determinación de regiones transmembranales se utilizaron tres programas
bioinformáticos: PredictProtein, TMpred y HMMTOP; dichos programas predijeron
una región o hélice transmembranal (TM) en el extremo N-terminal que va del
aminoácido Asn105 - Ala124 ± 2 a. a.
Para el caso de TMpred (Fig.3B) el programa mostró tres regiones TM (His26-Gly44,
Fhe106-Ser125, Tyr133- Met150); sin embargo, un score abajo de 500 no es
significativo, por lo que sólo consideramos los residuos Fhe106-Ser125 con un score
de 699, como posible sito TM. HMMTOP predice el mismo residuo, además de una
región intracelular Met1- Ser104 y otra extracelular Ser125-Tyr437 (Fig. 3C).
A)
PredictProtein
27
B)
(106-125)
1 strong transmembrane helices, total score: 699
TMpred
28
C)
C1)
Figura 3. Predicción de hélices transmembranales; A) PredictProtein; predice el residuo Ala108- Ser 125, B) TMpred; predice tres regiones 26-44, 104-125,133-154, considerando la región TM con el score de 699 (resaltado con una línea roja) como el más probable C) HMMTOP; además de la predicción del sitio TM en la posición Asn105- Ala124 (a. a resaltados en color rojo), una región intracelular o citoplasmática Met1- Ser104 y la región extracelular Ser125- Tyr437, todas la regiones también se representan en la imagen C1.
HMMTOP
29
Una vez predicha la región TM, se procedió a identificar mediante BepiPred 1.0
Server y NetCTL 1.2 Server, los potenciales epítopes capaces de activar a Linfocitos
B y Linfocitos T citotóxicos (CTL), respetivamente. Se identificaron 18 posibles
epítopes ubicados a lo largo de la secuencia de la proteína; 11 para linfocitos B (Fig.
4 subrayados con una línea negra) y 7 para LTc (sombreados con color azul); dos
epítopes muestran reconocimiento por LTc y linfocitos B, (Asn257-Tyr271) y
(Glu296- Fhe302). Además, también se identificaron los epítopes que se encuentran
más expuestos en la estructura tridimensional de la proteína (Fig. 6 y Fig. 4,
números sombreados en verde).
30
Figura 4. Características inmunológicas de la enolasa de H. influenzae. Secuencia de nucleótidos del gen eno y su traducción a proteína, así como los epítopes predichos para Linfocitos B (BepiPred 1.0 Server), subrayados con línea negra; epítopes para Linfocitos Tc (NetCTL 1.2 Server) en azul; los epítopes que se encuentran más expuestos identificados en la estructura tridimensional de la enolasa se muestran en color verde.
31
8.2.3. Alineamiento multiple de distintas enolasas
Se realizó un alineamiento multiple mediante CLUSTAL O, de las secuencias de la
enolasa de distintas especies tanto procariotas como eucariotas. Para el análisis se
incluyeron las secuencias de algunas especies, en las cuales ya se ha reportado a la
enolasa como proteína de superficie como: V. parahaemolyticus, S. aureus, T. cruzi S.
sobrinus, S. mutans, entre otros. En el análisis se identificaron los aminoácidos
importantes que intervienen con la actividad de la proteína, así como el motivo probable
de unión a plasminógeno, y la firma de la enolasa (Tabla 5). El aminoácido Asp318
interviene en la unión a magnesio así como en la unión a sustrato y Lys343
interacciona con el sustrato, además de participar en el sitio activo de la enolasa, por lo
que se encuentran repetidos en la tabla 5. Por otra parte el porcentaje de identidad que
existe entre la enolasa de humano y la enolasa de H. influenzae es de 51.05%, existe
mayor porcentaje de identidad con V. parahaemolyticus con un 84.76% y menor con P.
falciparum 49.42%; con el resto de la especies presenta un 50-59 % de identidad; sin
embargo, los aminoácidos que forman parte del sitio activo, unión a magnesio, así
como la firma de la enolasa, es decir los que intervienen en la actividad de la proteína
se encuentran altamente conservados en todas la especies (Fig. 5).
Tabla 5. Aminoácidos importantes en la secuencia de la enolasa
Función Aminoácidos y posición Sombreado
en la secuencia
Unión a magnesio Asp244, Glu291, Asp318 Amarillo
Sitio activo Glu209, Lys343 Verde
Unión a sustrato His159, Glu168, Asp318, Lys343, Lys394,
370SHRS373
Rosa
Firma enolasa 340 ILIKFNQIGSLTET 353 Azul
Motivo probable de unión
a plasminógeno
252 FYNKENGMY 260 Gris
32
CLUSTAL O (1.2.4) multiple sequence alignment T.cruzi --MTIQKVHGREILDSRGNPTVEVEVTTELGVF-RSAVPSGASTGIHEACELRDDDKRRY 57
C.albicans -MSYATKIHARYVYDSRGNPTVEVDFTTDKGLF-RSIVPSGASTGVHEALELRDGDKSKW 58
H.sapiens --MSILKIHAREIFDSRGNPTVEVDLFTSKGLF-RAAVPSGASTGIYEALELRDNDKTRY 57
P.falciparum MAHVITRINAREILDSRGNPTVEVDLETNLGIF-RAAVPSGASTGIYEALELRDNDKSRY 59
P.aeruginosa -MAKIVDIKGREVLDSRGNPTVEADVILDNGIVGSACAPSGASTGSREALELRDGDKSRY 59
V.parahaemolyticus -MSKIVKVLGREIIDSRGNPTVEAEVHLEGGFVGMAAAPSGASTGSREALELRDGDKARF 59
HiNTBUAP9612540 -MAKIVKVIGREIIDSRGNPTVEAEVHLEGGFVGLAAAPSGASTGSREALELRDGDKSRF 59
HibBUAPNAN -MAKIVKVIGREIIDSRGNPTVEAEVHLEGGFVGLAAAPSGASTGSREALELRDGDKSRF 59
B.burgdorferi MGFHIYEIKARQIIDSRGNPTVEADVILEDGTYGRAAVPSGASTGINEAVELRDGDKSVY 60
S.aureus -MPIITDVYAREVLDSRGNPTVEVEVLTESGAFGRALVPSGASTGEHEAVELRDGDKSRY 59
S.sobrinus -MSIITDVYAREVLDSRGNPTLEVEVYTESGAFGRGMVPSGASTGEHEAVELRDGDKSRY 59
S.mutans -MSIITDVYAREVLDSRGNPTLEVEVYTESGAFGRGMVPSGASTGEHEAVELRDGDKSRY 59
: .* : *******:*.:. . * . .******* ** ****.** :
T.cruzi LGKGCLNAVKNVNDVLAPALVGK--DELQQSTLDKLMRDL-DGTP-----NKSKLGANAI 110
C.albicans LGKGVLKAVANVNDIIAPALIKAKIDVVDQAKIDEFLLSL-DGTP-----NKSKLGANAI 112
H.sapiens MGKGVSKAVEHINKTIAPALVSKKLNVTEQEKIDKLMIEM-DGTE-----NKSKFGANAI 111
P.falciparum LGKGVQKAIKNINEIIAPKLIG--MNCTEQKKIDNLMVEELDGSKNEWGWSKSKLGANAI 117
P.aeruginosa LGKGVLKAVANINGPIRDLLLG--KDAADQKALDHAMIEL-DGTE-----NKAKLGANAI 111
V.parahaemolyticus LGKGVLKAIEAVNGPIAEALVG--KDAKDQAAIDAVMIEL-DGTE-----NKSKFGANAI 111
HiNTBUAP9612540 LGKGVLKAVAAVNNEIAQAIVG--KDATNQAEIDQIMIDL-DGTE-----NKSNFGANAI 111
HibBUAPNAN LGKGVLKAVAAVNNEIAQAIVG--KDATNQAEIDQIMIDL-DGTE-----NKSNFGANAI 111
B.burgdorferi MGKGVLKAIENIKNIIAPELEG--MSALNQVAIDRKMLEL-DGTP-----TKEKLGANAI 112
S.aureus LGKGVTKAVENVNEIIAPEIIEGEFSVLDQVSIDKMMIAL-DGTP-----NKGKLGANAI 113
S.sobrinus GGLGTQKAVDNVNNIIAEAIIG--YDVRDQQAIDRAMIAL-DGTP-----NKGKLGANAI 111
S.mutans GGLGTQKAVDNVNNIIAEALIG--YDVRDQQAIDKAMIAL-DGTP-----NKGKLGANAI 111
* * :*: :: : : . :* :* : **: .* ::*****
T.cruzi LGCSMAISKAAAARKGVPLYRYLAELAGTK--EVRLPVPCFNVINGGKHAGNALPFQEFM 167
C.albicans LGVSLAAANAAAAAQGIPLYKHIANISNAKKGKFVLPVPFQNVLNGGSHAGGALAFQEFM 172
H.sapiens LGVSLAVCKAGAVEKGVPLYRHIADLAGNS--EVILPVPAFNVINGGSHAGNKLAMQEFM 169
P.falciparum LAISMAVCRAGAAPNKVSLYKYLAQLAGKKSDQMVLPVPCLNVINGGSHAGNKLSFQEFM 177
P.aeruginosa LAVSLAAAKAAAQAKGVPLYAHIADLNGT-PGQYSMPVPMMNIINGGEHADNNVDIQEFM 170
V.parahaemolyticus LAVSLANAKAAAAAKGMPLYEHIAELNGT-AGQFSMPLPMMNIINGGEHADNNVDIQEFM 170
HiNTBUAP9612540 LAVSLANAKAAAASKGLPLYAYIAELNGT-AGVYSMPLPMMNIINGGEHADNNVDIQEFM 170
HibBUAPNAN LAVSLANAKAAAASKGLPLYAYIAELNGT-AGVYSMPLPMMNIINGGEHADNNVDIQEFM 170
B.burgdorferi LAVSMATAKAAAKYLGLRPYQYLGAYKAN-----ILPTPMCNIINGGAHSDNSVDFQEFM 167
S.aureus LGVSIAVARAAADLLGQPLYKYLGGFNGK-----QLPVPMMNIVNGGSHSDAPIAFQEFM 168
S.sobrinus LGVSIAAARAAADYLEIPLYSYLGGFNTK-----VLPTPMMNIVNGGSHSDAPIAFQEFM 166
S.mutans LGVSIAVARAAADFLEIPLYSYLGGFNTK-----VLPTPMMNIINGGSHSDAPIAFQEFM 166
*. *:* ..*.* * ::. :* * *::*** *:. : :****
T.cruzi IAPVKAGSFNEALRMGAEVYHSLKSIIKKKYGQDAVNVGDEGGFAPPITDINEPLPILME 227
C.albicans IAPTGVSTFSEALRIGSEVYHNLKSLTKKKYGQSAGNVGDEGGVAPDIKTPKEALDLIMD 232
H.sapiens ILPVGAANFREAMRIGAEVYHNLKNVIKEKYGKDATNVGDEGGFAPNILENKEGLELLKT 229
P.falciparum IVPVGAPSFKEALRYGAEVYHTLKSEIKKKYGIDATNVGDEGGFAPNILNANEALDLLVT 237
P.aeruginosa VQPVGAKNFAEALRMGAEIFHHLKAVLKARG--LNTAVGDEGGFAPNLSSNEDALAAIAE 228
V.parahaemolyticus IQPVGAATLKEAVRMGAEVFHNLAKVLKSKG--YNTAVGDEGGFAPNLKSNAEALEVIAE 228
HiNTBUAP9612540 IQPVGAKTLREALRIGAEVFHNLAKVLKSKG--MSTAVGDEGGFAPNLASNADALACIKE 228
HibBUAPNAN IQPVGAKTLREALRIGAEVFHNLAKVLKSKG--MSTAVGDESGFAPNLASNADALACIKE 228
B.burgdorferi IMPIGAKTFSEAIRMAAEVFHTLKGILSGKG--YATSVGDEGGFAPNLKSNEEACEVIIE 225
S.aureus ILPVGATTFKESLRWGTEIFHNLKSILSKRG--LETAVGDEGGFAPKFEGTEDAVETIIQ 226
S.sobrinus IMPVGAPTFKEGLRWGAEVFHALKKILKERG--LETAVGDEGGFAPRFDGIEDGVETILK 224
S.mutans IVPAGAPTFKEALRWGAEIFHALKKILKERG--LETAVGDEGGFAPKFDGTEDAVETIIK 224
: * . .: *.:* .:*::* * . : ****.*.** : : :
T.cruzi AIEQAGHKG---RFAICMDSAASETYDENKKQYNLTFKSPEA---TWVTAKQLAETYAKW 281
C.albicans AIDKAGYKG---KVGIAMDVASSEFYKDG--KYDLDFKNPESDPSKWLSGPQLADLYEQL 287
H.sapiens AIGKAGYTD---KVVIGMDVAASEFFRSG--KYDLDFKSPDDPSRYI-SPDQLADLYKSF 283
P.falciparum AIKSAGYEG---KVKIAMDVAASEFYNSENKTYDLDFKTPNNDKSLVKTGAQLVDLYIDL 294
P.aeruginosa AVEKAGYKLGDD-VTLALDCASSEFFK--DGKYDLEG------EGKVFDAAGFADYLAGL 279
V.parahaemolyticus AVAAAGYELGKD-VTLAMDCAASEFFDKEAGIYNMKG------EGKTFTSEEFNHYLAGL 281
HiNTBUAP9612540 AVEKAGYVLGKD-VTLAMDCASSEFYNKENGMYEMKG------EGKSFTSQEFTHYLEEL 281
HibBUAPNAN AVEKAGYVLGKD-VTLAMDCASSEFYNKENGMYEMKG------EGKSFTSQEFTHYLEEL 281
B.burgdorferi AIKKAGYEPGKD-IAIALDPATSELYDPKTKKYVLKWS-----TKEELTSEQMVEYWAKW 279
S.aureus AIEAAGYKPGEE-VFLGFDCASSEFYENGVYDYSKFEG----EHGAKRTAAEQVDYLEQL 281
S.sobrinus AIETAGYEAGEKGIMLGFDCASSEFYEDGVYDYTKFEG----EKGAKRSAAEQIDYIEGL 280
S.mutans AIETAGYKPGEE-VFLGFDCASSEFYDNGVYDYTKFEG----EKGAKRSAAEQIDYIEEL 279
*: **: . : :* *:** : * .
33
T.cruzi VSEYPIVSLEDPYDQDDFDGFAGITEALKGKAQVVGDDLTVTNVSRIKMAIEKKACNSLL 341
C.albicans ISEYPIVSIEDPFAEDDWDAWVHFFERVGDKIQIVGDDLTVTNPTRIKTAIEKKAANALL 347
H.sapiens IKDYPVVSIEDPFDQDDWGAWQKFTASAG--IQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKSCNCLL 341
P.falciparum VKKYPIVSIEDPFDQDDWENYAKLTAAIGKDVQIVGDDLLVTNPTRITKALEKNACNALL 354
P.aeruginosa TQRYPIISIEDGMDESDWAGWKGLTDKIGAKVQLVGDDLFVTNTKILKEGIEKGIGNSIL 339
V.parahaemolyticus VEQFPIVSIEDGLDESDWDGFAHQTQLLGDKIQLVGDDLFVTNTKILAEGIEKGIANSIL 341
HiNTBUAP9612540 TKQYPIVSIEDGQDESDWEGFAYQTKVLGDRVQLVGDDLFVTNTKILKEGIEKGIANSIL 341
HibBUAPNAN TKQYPIVSIEDGQDESDWEGFAYQTKVLGDRVQLVGDDLFVTNTKILKEGIEKGIANSIL 341
B.burgdorferi VEKYPIISIEDGMAEEDWDGWKKLTDKIGNKIQLVGDDLFVTNTSFLKKGIEMGVANSIL 339
S.aureus VDKYPIITIEDGMDENDWDGWKQLTERIGDRVQLVGDDLFVTNTEILAKGIENGIGNSIL 341
S.sobrinus VNKYPIITIEDAMDENDWEGWKALTERLGNRVQLVGDDFFVTNTDYLARGIKEGAANSIL 340
S.mutans VNKYPIITIEDAMDENDWDGWKALTARLGDRVQLVGDDFFVTNTDYLARGIKEGAANSIL 339
. :*::::** :.*: : *:****: *** : .:: *.:*
T.cruzi LKINQIGTITEAIEASKFCMSNGWSVMVSHRSGETEDTYIADLVVGLGTGQIKTGAPCRG 401
C.albicans LKVNQIGTLTESIQAANDSYAAGWGVMVSHRSGETEDTFIADLSVGLRSGQIKTGAPARS 407
H.sapiens LKVNQIGSVTESLQACKLAQANGWGVMVSHRSGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCRS 401
P.falciparum LKVNQIGSITEAIEACLLSQKNNWGVMVSHRSGETEDVFIADLVVALRTGQIKTGAPCRS 414
P.aeruginosa IKFNQIGSLTETLEAIQMAKAAGYTAVISHRSGETEDSTIADLAVGTAAGQIKTGSLCRS 399
V.parahaemolyticus IKFNQIGSLTETLAAIKMAKDAGYTAVISHRSGETEDATIADLAVGTAAGQIKTGSMSRS 401
HiNTBUAP9612540 IKFNQIGSLTETLAAIKMAKDAGYTAVISHRSGETEDATIADLAVGTAAGQIKTGSMSRS 401
HibBUAPNAN IKFNQIGSLTETLAAIKMAKDAGYTAVISHRSGETEDATIADLAVGTAAGQIKTGSMSRS 401
B.burgdorferi IKVNQIGTLTETFEAVEMAKKAGYTAIVSHRSGETEDTTIADLVVALGTGQIKTGSLSRT 399
S.aureus IKVNQIGTLTETFDAIEMAQKAGYTAVVSHRSGETEDTTIADIAVATNAGQIKTGSLSRT 401
S.sobrinus IKVNQIGTLTETFEAIEMAKEAGYTAVVSHRSGETEDSTIADIAVATNAGQIKTGSLSRT 400
S.mutans IKVNQIGTLTETFEAIEMAKEAGYTAVVSHRSGETEDSTIADISVATNAGQIKTGSLSRT 399
:*.****::**:: * . .: .::********* ***: *. :******: .*
% de identidad
T.cruzi ERTAKLNQLLRIEEELG---AHAKFGFPAWS------ 429 51.07
C.albicans ERLAKLNQILRIEEELG---SEAIYAGKDFQKASQL- 440 50.23
H.sapiens ERLAKYNQLLRIEEELG---SKAKFAGRNFRNPLAK- 434 52.13
P.falciparum ERNAKYNQLLRIEESLG---NNAVFAGEKFRLQLN-- 446 49.42
P.aeruginosa DRVSKYNQLLRIEEQLG---AKAPYRGRAEFRG---- 429 73.43
V.parahaemolyticus DRVAKYNQLIRIEEALG---ERAPFNGLKEVKGQA-- 433 84.76
HiNTBUAP9612540 DRIAKYNQLIRIEEALERAGTPAAFPGLKAVKGQAY- 437 100.00
HibBUAPNAN DRIAKYNQLIRIEEALERAGTPAAFPGLKAVKGQGY- 437 99.54
B.burgdorferi DRIAKYNQLIRIEEELE---TTAEYHGKSVFYSIKQK 433 58.14
S.aureus DRIAKYNQLLRIEDELF---ETAKYDGIKSFYNLDK- 434 59.07
S.sobrinus DRMAKYNQLLRIEDQLG---EVAQYKGINSFYNLKK- 433 57.21
S.mutans DRIAKYNQLLRIEDQLG---EVAEYRGFKSFYNLKK- 432 57.91
:* :* **::***: * * :
Figura 5. Alineamiento múltiple de la enolasa de H. influenzae y las enolasas de distintas especies, con número de acceso al GenBank entre paréntesis. T. cruzi (EKG04398.1), C. albicans (AAA71939.1), H. sapiens (CAA34360.1), P. falciparum (AAA18634.1), P. aeruginosa (OPF47834.1) V. parahaemolyticus (WP_041955221.1), HiNTBUAP96, HibBUAPNAN, B. burgdorferi (AGS66354.1), S. aureus (CEH25490.1), S. sobrinus (CAD60544.1), S. mutans (WP_002305322.1). Regiones de identidad (*), regiones con alta similitud (:), regiones con baja similitud (.). Los residuos identificados con el sito activo (Glu209, Lys343), residuos de unión a Mg 2+ (Asp244, Glu291, Asp318), interacción con el sustrato (His159, Glu168, Asp318, Lys343, Lys394, 370 SHRS 373), firma de la enolasa (340 ILIKFNQIGSLTET 353), motivo probable de unión a plasminógeno (252 FYNKENGMY 260), están sombreados con color verde, amarillo, rosa, azul, y gris respectivamente. El dominio de Hélice TM fue subrayado con línea negra y se indica el % de identidad entre las especies.
34
Los resultados anteriores se complementaron con un análisis mediante Chimera 1.11.2, para obtener la estructura
tridimensional de la proteína. En la estructura se identificaron los posibles epítopes que se encuentran en las regiones más
expuestas o en la superficie de la proteína, además de la hélice TM y las regiones extracelular e intracelular, las cuales se
muestran en la Fig. 6
Figura 6. Estructura tridimensional en Chimera 1.11.2 de la enolasa de H. influenzae: Región intracelular o citoplasmática, Región extracelular, Región TM, Motivo de unión a Plasminógeno, Epítopes Linfocitos B, Epítopes Linfocitos Tc.
35
8.3. Amplificación del gen eno de H. influenzae El ADN genómico de las cepas HibBUAPNAN, HibATCC33, HiNTBUAPPAU, fue
utilizado como templado para amplificar mediante PCR el gen de la enolasa. El
producto obtenido, se migró en electroforesis en gel de agarosa al 1%. Para todas las
cepas se observó un amplificado de 1.3 Kb aproximadamente (Fig. 7).
Figura 7. Amplificación mediante PCR del gen de la enolasa de H. influenzae, sometido a una electroforesis de agarosa al 1%. MP: marcador de peso molecular. Carriles 1-2: Amplificado de 1.3 Kb de HiNTBUAPPAU; Carriles 3-4: HibBUAPNAN; Carriles 5-6: HibATCC33930.
Posteriormente los amplificados obtenidos se purificaron, y se mandaron a secuenciar
a un servicio externo (IBT-UNAM). Se obtuvieron las secuencias parciales del gen eno
de 573 pb para la cepa HiNTBUAPPAU, de 1237 pb para HibATCC33930, y para el
caso de la cepa HibBUAPNAN, se obtuvo la secuencia completa de 1311pb, las
secuencias se tradujeron a aminoácidos y se analizaron mediante BLAST protein, los
cuales mostraron un 99-100 % de homología con la enolasa de H. influenzae (Fig. 8),
comprobando así, que los productos obtenidos correspondían al gen de interés.
MP 1 2 3 4 5 6
1.3Kb
36
Figura 8. Análisis en BLAST Protein de la secuencia del gen de la enolasa de las cepas: HiNTBUAPPAU, HibATCC33930, HibBUAPNAN. El análisis mostró un valor del 99-100%
de identidad con las secuencias de la enolasa de H. influenzae ya reportadas en la base de datos.
37
8.4. Clonación y subclonación del gen eno
Una vez obtenido el producto de PCR correspondiente al gen de la enolasa de las
diferentes cepas, estos fueron clonados en el plásmido pCR®2.1-TOPO (Fig. 9A).
Obteniendo las construcciones: pCR®2.1-TOPO::EnoHibBUAPPAU, pCR®2.1-
TOPO::EnoHibATCC33930, pCR®2.1-TOPO::EnoHibBUAPNAN. En el PCR de colonia
que se les realizó se observó el amplificado de 1.3 Kb.
Por otra parte las transformantes con el plásmido pCR®2.1-TOPO::EnoHibBUAPNAN,
que fueron resembradas en placa, posteriormente incubadas en caldo LB toda la noche
a 37ªC con agitación constante; además se les realizó extracción plasmidíca. En todas
la condiciones se obtuvo el amplificado de 1.3 Kb esperado, indicando que la
construcción era estable; como control positivo se utilizó el plásmido pCR®2.1-
TOPO::EnoHiNTBUAP96, (Fig.9B).
A) B)
Figura 9. A):Esquema del plásmido pCR®2.1-TOPO®, B): PCR de colonia de TOPO::EnoHibBUAPNAN. MP: marcador de peso molecular, Carril 1: Colonia; Carril 2: Resembrado; Carril 3: cultivo en tubo 37°C; Carril 4: Plásmido; Carril 5: Control Positivo.
1.3 Kb
MP 1 2 3 4 5
38
Posteriormente, para realizar las subclonaciones, se eligieron dos cepas
rerpresentativas de cada grupo, una serotipo b (HibBUAPNAN) y una No Tipificable
(HiNTBUA96). El gen de estas cepas fue digerido a partir de los plasmidos: pCR®2.1-
TOPO::EnoHibBUAPNAN y pCR®2.1-TOPO::EnoHiNTBUAP96, con las enzimas de
restricción XhoI y KpnI.
Una vez liberado el inserto, fue subclonado y ligado en el plásmido de expresión
pRSET-A (Fig. 10 A), previamente digerido con las mismas enzimas, obteniendo las
contrucciones: pRSETA::EnoHibBUAPNAN y pRSETA::EnoHiNTNBUAP96; los
plásmidos fueron transformados en células competentes E. coli BL21(DE3) pLysS,
posteriormente se obtuvo ADN plasmídico de las células transformantes. Finalmente
las fusiones se comprobaron mediante ensayos de restricción, en donde se observó la
liberación del inserto de 1.3 Kb, correspondiente al gen de la enolasa (Fig. 10 B).
A) B)
Figura 10 A): Esquema del plásmido pRSET-A, B): Fragmento de ADN de 1.3 Kb correspondiente al gen eno de las distintas cepas, obtenidas mediante digestiones simples y dobles. MP: marcador de peso molescular; Carril 1: plásmido vacio; Carril 2: PRSETA::EnoHibBUAPNAN (kpnI); Carril 3: PRSETA::EnoHibBUAPNAN (KpnI y XhoI); Carril 4: PRSETA::EnoHiNTBUAP96 (kpnI); Carril 5: PRSETA:: EnoHiNTBUAP96 (kpnI y XhoI).
4.2 Kb
MP 1 2 3 4 5
2.9 Kb
1 2 3 4 5 6
1.3 Kb
39
8.5. Obtención de la proteína recombinante
En el presente trabajo se pretendía obtener la proteína recombinante de la cepa
serotipo b y la cepa No Tipificable; sin embargo, debido a que el porcentaje de
identidad existente entre la enolasa de ambas cepas es del 99.54%, se decidió
limitar el estudio de la expresión y purificación de la proteína recombinante
únicamente a la cepa HibBUAPNAN.
Se obtuvo la proteína recombinante (rEnoHibBUAPNAN) purificada con un peso
aproximado de 52 kDa, evidenciada mediante electroforesis SDS-PAGE al 12% (Fig.
11 A y B). La purificación se realizó varias veces hasta obtener la cantidad necesaria
para realizar el esquema de inmunización, y se confirmó mediante Western-blot
utilizando anticuerpos monoclonales anti-histidinas (Fig. 11 C).
40
A) B) C)
Figura 11. A) Expresión y purificación de rEnoHibBUAPNAN visualizada con SDS-PAGE al 12%. MP: marcador de peso molecular; Carril 1: No inducido; Carril 2: Inducido; Carril 3: pastilla; Carril 4: Solución de lavado, Carriles 5-7: rEnoHibBUAPNAN purificada 52 kDa. B) Carril 1: C+; Carril 2: No inducido; Carril 3: Inducido; Carril 4: pastilla; Carril 5: Solución de lavado; Carriles 6-8: rEnoHibBUAPNAN purificada. C) Inmunodetección mediante Western-blot de rEnoHibBUAPNAN con anticuerpo anti-histidinas. MP: marcador de peso molecular; Carril1; No inducido; Carril 2: Inducido.
100 - - -
1 2 3 4 5 6 7 8 MP 1 2
52kDa. 52 kDa.
260 - 140 - - -
70 - - - 50 - - - 40 - - - 35 - - - 25 - - -
15 - - -
kDa.
10 - - -
MP 1 2 3 4 5 6 7
52 kDa.
41
8.6. Obtención de anticuerpos policlonales
Con la finalidad de generar anticuerpos policlonales se inmunizaron conejos Nueva
Zelanda con 100 µg de rEnoHibBUAPNAN. El esquema de inmunización consistió de
una primera inmunización con adyuvante completo de Freund, seguida de cuatro
refuerzos con la misma dosis, emulsificada con adyuvante incompleto de Freund, en
relación 1:1. Al término del esquema de inmunización el suero hiperinmune con los
anticuerpos policlonales generados contra la rEnoHiNTBUAP96, fue utilizado en los
ensayos de Western-blot, con distintas diluciones del suero hiperinmune en PBS, en
donde se observó un reconocimiento por la proteína recombinante, con títulos de
anticuerpos mayores a la dilución 1:30,000 (Fig. 12).
Figura 12. Inmunodetección mediante Western-blot de rEnoHibBUAPNAN (52kDa.) con anticuerpos policlonales. Carril 1: Suero pre inmune; Carril 2: dilución 1:1000; Carril 3: dilución 1:10000; Carril 4: dilución 1:20000; Carril 5: dilución 1:50000; Carril 6: dilución 1:40000, indicados con una flecha.
1 2 3 4 5 6
42
8.7. Identificación de la enolasa nativa
La enolasa nativa de HibBUAPNAN, HiNTBUAP96, HibATCC33 y HiNTBUAPPAU, fue
reconocida por los anticuerpos policlonales anti-rEnoHibBUAPNAN, tanto en extractos
de proteínas totales, como en enriquecidos de proteínas de membrana. En el Western-
blot se identificó a la enolasa nativa con un peso aproximado de 46 kDa, peso
correspondiente a lo reportado en la bibliografía, y a la recombinante con un peso de
52 kDa. Estos anticuerpos demostraron ser específicos al reconocer a la enolasa nativa
de cepas tipificables y No tipificables, en extractos de proteínas totales (Fig. 13).
Figura 13. Inmunodetección mediante Western-blot de la enolasa nativa de H. influenzae (46 kDa.) con anticuerpos Policlonales anti-rEnoHibBUAPNAN. MP: marcador de peso molecular; Carriles 1-4: Proteínas totales de HibBUAPNAN, HibATCC33, HiNTBUAP96 y HiNTBUAPPAU, respectivamente; Carriles 5-8: enriquecidos de proteínas de memebrana, mismo orden; Carril 9: rEnoHibBUAPNAN (52 kDa).
52 kDa.
46 kDa.
MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 - - -
15 - - -
25 - - -
35 - - -
40 - - -
50 - - -
70 - - -
100 - - -
140 - - -
260 - - -
43
8.8. Localización de la enolasa en la superficie de H. influenzae
Una vez corroborada la especificidad de los anticuerpos policlonales con la que
reconocen a la enolasa nativa de H. influenzae, se realizaron ensayos de
inmunofluorescencia indirecta, utilizando como anticuerpo primario anti-
rEnoHibBUAPNAN y como anticuerpo secundario un anti-conejo hecho en cabra
acoplado a FITC. En las Figuras 14 B y 14 D (capturadas con microscopio de
epifluorescencia), se observa en color verde como la proteína se encuentra
ampliamente distribuida en toda la superfie de HiNTBUAP96 y HibBUAPNAN; una mejor
señal se observa para el control positivo en donde se utilizaron anticuerpos totales
contra toda la bacteria (Fig. 14 C); ninguna señal fue observada en el control negativo,
donde las células fueron tratadas con el suero preinmune (Fig 14 A).
En las imágenes obtenidas mediante microscopía confocal, se utilizaron los siguientes
fluoróforos: FITC (Fig. 15 A) y DAPI que tiñe ADN (Fig. 15 B), tambien se observó DIC
(Fig. 15 C) y se realizó el MERGE (Fig. 15 D). En estas imágenes se comprobó la
localización de la enolasa en toda la superficie bacteriana ya que al realizar el
“MERGE”, las señales de DAPI y FITC no se empalman. La expresión se observó en
las distintas cepas de H. influenzae.
44
Figura 14. Inmunolocalización de la enolasa nativa en la superfice celular de HiNTBUAP96 mediante epifluorescencia. A) Control Negativo (suero preinmune) B) HiNTBUAP96 marcaje con FITC, C) control positivo anticuerpos totales contra H. influenzae, D) HibBUAPNAN marcaje con FITC.
A) B)
C)
CONTROL -
CONTROL +
HiNTBUAP96 (FITC)
HibBUAPNAN (FITC)
D)
45
Figura 15. Inmunolocalización de la enolasa nativa en la superfice de HiNTBUAP96 mediante microscopía confocal A) FITC, B) DAPI, C) DIC, D) MERGE.
A) FITC B) DAPI
C) DIC D) MERGE
46
9. DISCUSIÓN
H. influenzae es una bacteria con importancia médica por ser causa de una gran
variedad de infecciones tanto localizadas como sistémicas, afecta principalmente a
niños menores de 5 años, adultos mayores de 65 años e individuos
inmunocomprometidos. En 1989 se introdujo la vacuna contra H. influenzae serotipo b,
la cual ha tenido un gran éxito. No obstante, no protege contra el resto de los serotipos,
ni contra cepas No Tipificables. Estudios recientes han reportado, un incremento en la
incidencia de infecciones invasivas producidas por cepas no Hib (Langereis et al.,
2015), tal es el caso de H. influenzae serotipo a (Hia), el cual es reconocido como un
importante patógeno emergente considerado el segundo tipo clínicamente más
virulento entre los 6 serotipos de H. influenzae. Este serotipo afecta especialmente a
menores de 2 años y se ha demostrado la relación de algunas clonas de Hia con
enfermedades graves con alta tasa de letalidad. Otros serotipos como el Hif y el Hie
afectan principalmente a los adultos con alguna enfermedad predisponente y, en menor
frecuencia, a la población pediátrica.
Un estudio realizado en Bogotá Colombia en el periodo de 2002-2013, aisló a distintas
cepas de H. influenzae a partir de enfermedades invasivas. El 50.5% eran de pacientes
con meningitis, 23.5% de neumonías, 19,5% de sepsis y bacteriemia, 2.0% de otros y
4.5% sin dato, donde el serotipo predominante fue el Hib (40.5%), seguido de HiNT
(38.0%), Hia (17.5%), Hid (2.0%), Hif (1.5%) y Hie (0.5%), (Rodríguez et al., 2015). Es
importante mencionar que la vigilancia continua es esencial para todas las infecciones
por H. influenzae, ya que los serotipos no-b y las cepas No Tipificables, pueden
convertirse en la principal causa de enfermedades invasivas (Roaa et al., 2016).
La falta de una vacuna que genere protección contra todos los serotipos y las cepas No
Tipificables, promueve la búsqueda de nuevos antígenos con potencial vacunal en
contra de esta bacteria.
Por otra parte, debido a los avances biotecnológicos, la secuenciación masiva del
genoma de múltiples microorganismos y el diseño de herramientas bioinformáticas han
dado paso al uso de la vacunología reversa, un enfoque reciente y descrito por primera
vez por Rappuoli a principios del 2000. Este método se utiliza para predecir antígenos a
través del desarrollo de la genómica y herramientas bioinformáticas (Meunier et al.,
47
2016). La vacunología reversa es mucho más efectiva que la vacunología
convencional, teniendo algunas ventajas ya que es más rápida y minimiza costos.
Mediante esta metodología se han podido descubrir nuevos antígenos que no se
encontrarían mediante los métodos tradicionales, además de que no es necesario
cultivar al microorganismo. Aunque esta estrategia se limita a proteínas las cuales
deben estar expuestas en la superficie y ser reconocidas por el sistema inmunológico
(Meunier et al., 2016). Una de las vacunas desarrolladas mediante vacunología reversa
con gran éxito fue en contra de Neisseria meningitidis (Ferreira et al., 2008; Sette,
2010).
La enolasa es una enzima esencial en el metabolismo de la glucosa de múltiples
organismos (Liu et al., 2017); sin embargo, se ha demostrado la presencia de esta
proteína expuesta en la superficie celular de algunos microorganismos como: bacterias,
parásitos, levaduras, entre otros, donde se encuentra como receptor a plasminógeno.
También ha demostrado ser un antígeno capaz de generar una respuesta inmune
específica y protectora que conlleva a la neutralización de una infección.
Debido a lo anterior, en este trabajo se estudió la posible presencia de la enolasa en la
membrana externa H. influenzae, además de demostrar la actividad inmunogénica de
la enolasa recombinante (rEnoHibBUAPNAN).
En este trabajo se realizó la clonación, expresión y caracterización in silico de la
enolasa de H. influenzae mediante técnicas moleculares, cromatografía de afinidad,
SDS-PAGE e Inmunodetección, por Western-blot y microscopía confocal. Los
resultados demostraron la obtención a homogeneidad de la proteína recombinante
rEnoHibBUAPNAN (Fig. 11 A y B) con un peso aproximado de 52 kDa fusionada a una
etiqueta de histidinas, la cual fue identificada mediante Western-blot, con el uso de
anticuerpos monoclonales anti-histidinas (Fig. 11C). Sin embargo en los ensayos de
Western-blot, con extractos de proteínas totales de las diferentes cepas de H.
influenzae se identificó una banda con un peso aproximado de 46.30 kDa (Fig. 13), el
cual corresponde con nuestra predicción usando el servidor Expasy's Protparam.
48
Estos resultados coinciden con los pesos de la enolasa en V. parahaemolyticus (48
kDa), S. iniae (47 kDa), C. albicans (47 kda), T. cruzi (46.01 kDa.) A.
actinomycetemcomitans (47 kDa) (Hara et al., 2000) (Jiang et al., 2014; Wang et al.,
2015; Sundstrom et al., 1992; Carabarín-Lima et al., 2014), de tal manera que el
aumento en el peso de la recombinante, es debido a la etiqueta de histidinas fusionada
al extremo N-terminal, una secuencia estabilizadora de transcripción del gen 10 del
fago T7, el epítope Xpress™ y la secuencia de reconocimiento de escisión de la
enteroquinasa, las cuales se encuentran rio arriba del inserto de ADN y son codificadas
por el plásmido.
Por otra parte se realizó un alineamiento múltiple de la enolasa de diferentes especies,
en las cuales se ha reportado la expresión de la enolasa en la superfice celular,
funcionando como receptor a plasminógeno (Fig. 5).
Es importante destacar que la enolasa de la cepas HiNTBUAP96 y HibBUAPNAN
presentan un 99.54 % de identidad, de tal manera que el cambio entre la secuencia de
aminoacidos de las cepas tipificables y No Tipificables no es significativo. Seguida de
V. parahaemolyticus (84.76%), y presenta menor identidad con la enolasa de humano
(51.05 %). Con el resto de las especies tiene un 50-59 % de identidad. También se
identificaron los residuos indispensables para su actividad como es el sitio catalítico,
residuos de unión a magnesio, los cuales determinan la conformación necesaria para
la dimerización y la función enzimática además de la firma o huella de la enolasa.
Datos que coinciden con lo reportado por diferentes autores (Liu et al., 2017; Wang et
al., 2015; de la Torre-Escuadero et al., 2010; Carabarín-Lima et at., 2014). Estos
resultados indican que la enolasa se encuentra ampliamente conservada,
principalmente en los residuos involucrados con la actividad enzimática; sin embargo,
ha ido adquiriendo modificaciones en su secuencia, específicas para cada especie.
El plasminógeno es una proenzima de 92 kDa, su activación esta mediada por los
activadores de plasminógeno (PAs) (Rijken, 1995; Lähteenmäki et al., 2001), involucra
una escisión del enlace Arg561-Val562 de la cadena pesada (A), que se encuentra
unida por dos puentes disulfuro al extremo C-terminal de la cadena pequeña (B). La
cadena B contiene el residuo con actividad de proteasa (Ser740, Aps645 y His 602)
49
(Ponting et al., 1992). La región N-terminal del plasminógeno contiene cinco dominios
Kringle de 80 aminoácidos, que contienen sitios de unión a lisina (Derbise et al., 2004;
Ghosh et al., 2011); la interacción con la lisina conduce a un cambio conformacional,
que lo hace más susceptible a la escisión por PAs (Lähteenmäki et al., 2001)
Un motivo probable de unión a plasminógeno (252-FYNKENGMY-260), fue identificado en
la secuencia de la enolasa de H. influenzae, el cual tiene un 55.56% de similitud con el
motivo de nueve aminoácidos FYDKERKVY detectado en la enolasa de S. pneumoniae
(los residuos cruciales para la unión al plasminógeno están en negrita y subrayados).
Se reporta que las mutaciones puntuales de esos aminoácidos disminuye en gran
medida la unión a plasminógeno (Bergmann et al., 2003; Jones et al., 2007). De los tres
aminoácidos importantes, se conservan Lys255 y Glu256 en la secuencia de H.
influenzae.
La interacción enolasa-plasminógeno también se ha reportado estar mediada por los
residuos de Lys433 y 434 en el extremo C-terminal de S. pneumoniae, equivalente a la
Lys433 en H. influenzae, como sitios de unión para los motivos Kringle del
plasminógeno (Wang et al., 2015). Por otro lado, en Lactobacillus plantarum se reporta
que la doble sustitución de K259A / K442A resulta en la abolición completa de la unión
enolasa-plasminógeno (Vastano et al., 2013) De tal manera que la enolasa se une
fuerte y específicamente al plasminógeno mediante la lisina del extremo C-terminal con
los motivos Kringle (Ghosh et al., 2011), (Candela et al., 2007).
En S. mutans se observó que un análogo de la lisina, el ácido ε-aminocaproico inhibe
casi por completo las activación del plasminógeno, resultados semejantes se reportan
en B. microti, B. burgdorferi, S. bovis, (Jones et al., 2007; Liu et al., 2017; Floden.,
2011; dela Torre- Escudero 2010; Derbise et al., 2004; Nogueira et al., 2013); estos
datos sugieren que la enolasa de H. influenzae, podría interaccionar con los dominios
Kringle del plasminógeno, no sólo con Lys433, sino también por el motivo (252 –
FYNKENGMY-260), que fue encontrado en la secuencia de enolasa de H. influenzae.
Dado que la interacción está relacionada principalmente con los residuos de lisina, se
podría proponer que los aminoácidos aledaños a Lys255 que conforman el motivo de
unión a plasminógeno, actuarían como secuencias estabilizadoras de dicha interacción.
50
Uno de los puntos clave de este trabajo era demostrar si la enolasa se expresa en la
superficie celular de H. influenzae. Dado que la enolasa se encuentra descrita como
una proteína de exportación no clásica debido a la carencia de péptido señal
(Kainulainen & Korhonen, 2014), se procedió a localizar posibles hélices
transmembranales en la secuencia de la enolasa mediante análisis in silico.
En los resultados obtenidos por los programas, se identifica una región TM en la región
comprendida por los aminoácidos Asn105- Ala124. Estos resultados permiten inferir
que la enolasa de H. influenzae podría estar anclada en la membrana bacteriana a
través de esta región. Un grupo de investigadores en 2011, identificaron un alfa hélice
con características hidrofóbicas en la enolasa de Bacillus subtilis en la posición Ala108
Leu126 y dentro de esta región se encuentra un dominio TM (Ala110 a Cys118),
pudiendo estar inmerso en la membrana de B. subtilis (Yang et al., 2011). En T. cruzi
también se identificó un dominio transmembranal en la región N- terminal entre los
aminoácidos Gly105- Ala122 (Carabarín-Lima et al., 2014), estos últimos datos
coindicen con los obtenidos para la enolasa de H. influenzae.
Aunque se desconoce el mecanismo preciso por el cual la enolasa es exportada a la
superficie, una hipótesis era que se llevaba a cabo mediante miscrovesiculas; sin
embargo, se observó que el transporte a través de vesículas no es significativo, por lo
que deben existir mecanismos alternativos para liberar al medio a esta proteína carente
de péptido señal. Por otro lado se ha observado que esta alfa hélice es indispensable
para que se lleve a cabo su exportación, ya que cuando se muta esa región (Ala108 -
Leu126) y se sustituye por otra alfa hélice (para no alterar la estructura tridimensional),
se observa que la enolasa de B. subtilis, ya no es secretada al medio (Yang et al.,
2011).
Por otra parte un estudio realizado por Boël en 2004, reporta que una pequeña fracción
de la enolasa (aproximadamente el 1-2%) de E. faecalis, E. coli y S. cerevisiae, es
modificada covalentemente por su sustrato (2- fosfoglicerato); el aminoácido Lys341 y
Lys345 en E. coli y S. cerevisiae, respectivamente, equivalente a la Lys343 en H.
influenzae, sufre una fosforilación, esta modificación inhibe la actividad de la enzima,
pero es indispensable para su exportación al medio extracelular (Boël et al., 2004).
Con estos datos se puede sugerir que la exportación de la enolasa depende de ambos
51
procesos, en primera instancia la fosforilación en el sitio activo (el cual inactiva a la
enzima), pudiendo estar localizada en la superficie celular sin la actividad de enolasa, a
pesar de que el sitio activo se encontrara expuesto y en segunda instancia, la
presencia de la alfa hélice (identificada también en la secuencia de la enolasa de H.i),
que quizá actúe como una posible “secuencia señal” para su exportación mediante
sistemas de secreción para proteínas de exportación no clásica.
Un ejemplo es el sistema auxiliar de secreción de proteínas (SecA2), descrito
recientemente en Listeria monocytogenes y ocho patógenos Gram positivos como
Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae entre otros, en
donde se observa que la secreción de la enolasa de L. monocytogenes es dependiente
de SecA2. Aunque éste sistema sólo ha sido descrito en baterías Gram positivas (Lenz
et al., 2003), se podría pensar que en H. influenzae, exista un sistema homologo a
SecA2 (aún no reportado) o que puede utilizar mecanismos alternativos para liberar
dichas proteínas sin señal.
Otro aspecto importante es la asociación de la enolasa a la membrana; algunos
reportes sugieren que puede estar anclada mediante la región TM antes mencionada
(Yang et al., 2011), este hecho estaría justificado en bacterias Gram negativas y en otro
tipo de células, como los parásitos; sin embargo, para el caso de las bacterias Gram
positivas que tienen la pared celular de peptidoglicano relativamente gruesa, se podría
pensar que sólo una pequeña región de la proteína se encontraría expuesta.
Por otra parte la secreción de la enolasa al medio extracelular como se observó en B.
subtilis y en L. monocytogenes, darían indicios de que primero es secretada al espacio
extracelular y posteriormente se uniría a la superficie celular mediante interacciones
iónicas. En este caso, evidencia in vitro reciente indica que las interacciones iónicas,
son críticas en el anclaje superficial de varias proteínas multifuncionales, como la
enolasa de L. crispatus ST1, que se desprenden de la superficie celular a pH 8, pero se
observa una re-asociación a la misma a pH 4 (Kainulainen et al., 2012). Además, un
análisis de la liberación de enolasa a pH 5 con concentraciones de cloruro de sodio o
cloruro de colina de 0,1 a 2 M, reveló que estas proteínas se desprenden de la
superficie celular por concentraciones de sal por encima de 0.25 M; más allá, la
enolasa purificada de L. crispatus ST1 se une in vitro a ácidos lipoteicoicos cargados
52
negativamente, así como a la superficie celular de L. crispatus. Los ácidos lipoteicoides
son componentes comunes de la superficie de bacterias Gram positivas, y los
resultados sugieren que pueden anclar proteínas multifuncionales a la superficie
bacteriana, indicando la importancia de las interacciones iónicas en la asociación a la
pared celular de Gram positivos (Antikainen et al., 2007). Sin embargo para H.
influenzae (no presentan ácidos lipoteicoicos), podrían existir otros componentes de la
membrana involucrados en su asociación, o en su defecto estar anclada mediante esta
región TM.
El análisis in silico se complementó con experimentos in vitro, la localización superficial
de la enolasa se demostró mediante epifluorescencia (Fig. 14 B) y microscopía
confocal (Fig. 15 A), en donde se observa que la enolasa se encuentra ampliamente
distribuida en toda la superficie bacteriana tanto en cepas tipificables como No
Tipificables, lo que concuerda con estudios previos en V. parahaemolyticus (Jiang et
al., 2014), donde la enolasa se encuentra en la superficie celular, así como en P.
aeruginosa (Ceremuga et al., 2014) y en gram positivos como S. inae (Wang et al.,
2015), B. antracis (Agarwal et al., 2008), L. crispatus (Hurmalainen et al., 2007) además
de Plasmodium falciparum (Pal-Bhowmick et al. 2007) y Cryptosporidium parvum (Mi et
al., 2017). Al respecto, este estudio muestra la primera identificación de la enolasa en
la superficie de H. influenzae mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta lo
que indica que esta proteína se encuentra asociada a membrana, ya sea por
interacciones iónicas o por una región TM.
Por otra parte se determinaron las propiedades inmunogénicas de la enolasa. Los
análisis in silico, predijeron 18 epítopes a lo largo de la secuencia de la proteína y dos
de ellos muestran reconocimiento por ambos tipos de células (Asn257-Tyr271) y
(Glu296- Fhe302). Más allá en el análisis tridimensional de la enolasa en Chimera
1.11.2 (Fig.6), se localizaron los epítopes en las regiones más expuestas de la
proteína, de tal manera que en una infección natural y al estar expuesta en la
superficie, dichos epítopes serían fácilmente reconocidos por el sistema inmunológico.
Al respecto reportes previos confirman que la estimulación con la enolasa
recombinante de Clonorchis sinensis (rCsenolasa), conlleva a la producción de IgG1 e
IgG2a y que rCsenolasa fusionada a una espora de Bacillus subtilis induce respuestas
53
inmunitarias Th1 / Th2 (Wang et al., 2014). Por otra parte la enolasa de C. albicans
puede estimular IL-12 e IL-10, así como anticuerpos protectores del tipo IgG1 e IgG2a
(Li et al., 2011). Más allá la enolasa recombinante de T. cruzi fue reconocida por
sueros de pacientes infectados, lo que indica que la enolasa presenta alta
inmunogenicidad (Carabarín-Lima et al., 2014). Con estos datos se podría inferir la
posible capacidad de la enolasa de H. influenzae para generar una respuesta inmune
tanto celular como humoral.
Para corroborar la posible inmunogenicidad de la enolasa de H. influenzae, la
recombinante purificada fue utilizada en ensayos de inmunización a conejos. Al término
del esquema de inmunización se ensayaron los títulos de anticuerpos generados por la
administración de la enolasa recombinante, observando la inducción de títulos altos de
anticuerpos policlonales (>1:30,000) en contra de rEnoHibBUAPNAN (Fig.12); estos
anticuerpos mostraron ser específicos al reconocer exclusivamente a la enolasa nativa
y rEnoHibBUAPNAN, en extractos de proteínas totales (Fig. 13) mediante Western-blot.
Este resultado indica que la enolasa además de ser inmunogénica, es capaz de
generar anticuerpos específicos y estos anticuerpos son capaces de reconocer a la
enolasa de cepas Tipificables y No Tipificables.
Estos resultados eran esperados debido al porcentaje de identidad que existe entre las
cepas trabajadas en este experimento, así como las obtenidas de la base de datos del
NCBI que es de 94.89 hasta un 100 % de identidad. Con los resultados obtenidos en
este trabajo se plantea que la inmunización previa con rEnoHibBUAPNAN será capaz
de generar una buena respuesta inmunogénica y podría proporcionar protección contra
las infecciones causadas por cepas capsuladas y no capsulas de H. influenzae; sin
embargo, se sugiere realizar más estudios para confirmar que la enolasa de H.
influenzae es un buen candidato vacunal.
54
10. CONCLUSIONES
El gen de la enolasa de H. influenzae de cepas tipificables y No Tipificables se
encuentra altamente conservado.
Los anticuerpos policlonales generados demostraron ser específicos al
reconocer a la enolasa nativa y a rEnoHibBUAPNAN, en un extracto de
proteínas totales de diferentes cepas de H. influenzae.
rEnoHibBUAPNAN es altamente inmunogénica.
La enolasa se encuentra expuesta y distribuida en toda la superficie de H.
influenzae, tanto en cepas tipificables como No Tipificables.
Estos resultados indican que rEnoHibBUAPNAN podría ser un candidato
potencial para el desarrollo de una vacuna en contra de H. influenzae.
55
11. PERSPECTIVAS
Diseñar un protocolo en un biomodelo adecuado, para evaluar la protección que
confiere la inmunización con rEnoHibBUAPNAN mediante curvas de
sobrevivencia.
Descartar el reconocimiento de los anticuerpos policlonales anti
rEnoHibBUAPNAN, por la enolasa de humano.
Diseñar un péptido quimérico con los epítopes localizados en regiones no
conservadas con respecto a la enolasa de humano.
Inmunizar un modelo animal con un péptido quimérico y con la enolasa
recombinante en diferentes grupos, para determinar cuál de los dos confiere
mayor protección.
Determinar el isotipo de los anticuerpos policlonales generados.
Determinar el tipo de citocinas producidas mediante citometría de flujo, en un
modelo de infección in vivo.
Analizar la posible interacción enolasa-plasminógeno.
Caracterizar bioquímicamente a la enolasa recombinante.
56
12. BIBLIOGRAFIA
Agarwal, S., Kulshreshtha, P., Bambah Mukku, D., & Bhatnagar, R. (2008). α-
Enolase binds to human plasminogen on the surface of Bacillus anthracis.
Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, 1784(7–8), 986–994.
https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2008.03.017
Antikainen, J., Kupannen, V., Lähteenmäki, K., & Korhonen, T. K. (2007). pH-
dependent association of enolase and glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase of Lactobacillus crispatus with the cell wall and lipoteichoic acids.
Journal of Bacteriology, 189(12), 4539–4543.
Bakaletz L.O., Baker B.D., Jurcisek J.A., Harrison A., Novotny L.A., Bookwalter J.
E., Mungur R t Munson R.S. ( 2005). Demostration of Type IV Pilus Expression
and a “twutching” Phenotype by Haemophilus influenzae. Infect. Immun.
73.3:1635-1643.
Bergmann S. Rohde M. Chhatwal G. S. Hammerschmidt S. (2001). Alphaenolase
of Streptococcus pneumoniae is a plasminogen-binding protein displayed on the
bacterial cell surface. Mol Microbiol 40: 1273–1287.
Bergmann, S., Wild, D., Diekmann, O., Frank, R., Bracht, D., Chhatwal, G. S., &
Hammerschmidt, S. (2003). Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif
in surface displayed α-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular
Microbiology, 49(2), 411–423.
Boël, G., Pichereau, V., Mijakovic, I., Mazé, A., Poncet, S., Gillet, S., y Deutscher,
J. (2004). Is 2-phosphoglycerate-dependent automodification of bacterial
enolases implicated in their export? Journal of Molecular Biology, 337(2), 485–
496.
Brzychczy-Wloch, M., Gorska, S., Brzozowska, E., Gamian, A., Heczko, P. B., &
Bulanda, M. (2013). Identification of high immunoreactive proteins from
Streptococcus agalactiae isolates recognized by human serum antibodies. FEMS
Microbiology Letters, 349(1), 61–70.
57
Candela, M., Bergmann, S., Vici, M., Vitali, B., Turroni, S., Eikmanns, B. J., y
Brigidi, P. (2007). Binding of human plasminogen to Bifidobacterium. Journal of
Bacteriology, 189(16), 5929–5936.
Capello, M., Ferri-Borgogno, S., Cappello, P., & Novelli, F. (2011). α-enolase: A
promising therapeutic and diagnostic tumor target. FEBS Journal, 278(7), 1064–
1074.
Carabarín-Lima, A., Rodríguez-Morales, O., González-Vázquez, M. C., Baylón-
Pacheco, L., Reyes, P. A., Arce-Fonseca, M., & Rosales-Encina, J. L. (2014). In
silico approach for the identification of immunological properties of enolase from
Trypanosoma cruzi and its possible usefulness as vaccine in Chagas disease.
Parasitology Research, 113(3), 1029–1039.
Ceremuga, I., Seweryn, E., Bednarz-Misa, I., Pietkiewicz, J., Jermakow, K.,
Banaś, T., & Gamian, A. (2014). Enolase-like protein present on the outer
membrane of Pseudomonas aeruginosa binds plasminogen. Folia Microbiologica,
59(5), 391–397.
Chen, N., Yuan, Z. G., Xu, M. J., Zhou, D. H., Zhang, X. X., Zhang, Y. Z., y Zhu,
X. Q. (2012). Ascaris suum enolase is a potential vaccine candidate against
ascariasis. Vaccine, 30(23), 3478–3482.
de la Torre-Escudero, E., Manzano-Román, R., Pérez-Sánchez, R., Siles-Lucas,
M., & Oleaga, A. (2010). Cloning and characterization of a plasminogen-binding
surface-associated enolase from Schistosoma bovis. Veterinary Parasitology,
173(1–2), 76–84.
Derbise, A., Song, Y. P., Parikh, S., Fischetti, V. A., & Pancholi, V. (2004). Role
of the C-Terminal Lysine Residues of Streptococcal Surface Enolase in Glu-
and Lys-Plasminogen-Binding Activities of Group A Streptococci. Infection and
Immunity, 72(1), 94–105.
58
Díaz-Ramos, À., Roig-Borrellas, A., García-Melero, A., & López-Alemany, R.
(2012). α-enolase, a multifunctional protein: Its role on pathophysiological
situations. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012.
Dinis, M., D. Tavares, I. Veiga-Malta, A. Fonseca, E. B. Andrade, G. Trigo, A.
Ribeiro, A. Videira, A. M. S. Cabrita, and P. Ferreira. (2009). Oral Therapeutic
Vaccination with Streptococcus sobrinus Recombinant Enolase Confers
Protection against Dental Caries in Rats: Journal of Infectious Diseases, v. 199, p.
116-123.
Ferreira, J., & Porco, A. (2008). Vacunas derivadas del análisis de los genomas:
Vacunología inversa. Interciencia, 33(5), 353–358.
Finco, O., Bonci, A., Agnusdei, M., Scarselli, M., Petracca, R., Norais, N., y
Grandi, G. (2005). Identification of new potential vaccine candidates against
Chlamydia pneumoniae by multiple screenings. Vaccine, 23(9), 1178–1188.
Foxwell, A, R., J. M. Kyd., and A. W., Cripps. (1998). Nontypeable Haemophilus
influenza: Pathogenesis and prevention. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:294-308.
Floden, A. M., Watt, J. A., & Brissette, C. A. (2011). Borrelia burgdorferi
enolase is a surface-exposed plasminogen binding protein. PLoS ONE,
6(11).https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027502
Ghosh, A. K., Coppens, I., Gardsvoll, H., Ploug, M., & Jacobs-Lorena, M. (2011).
Plasmodium ookinetes coopt mammalian plasminogen to invade the mosquito
midgut. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(41), 17153–
17158.
Giebink, G., S. (1989). The microbiology of otitis media. Pediatr. Infect. Dis. J.
8,S18-S20.
Gilsdorf, J. R. McCrea, K. W. and Marrs, C. F. (1997). Role of pili in Haemophilus
influenzae adherence and colonization. Infect. Immun. 65:2997-3002.
59
Gomes, T., Pt, P., Maria, P., Ferreira, N., Pt, M., Vilanova, M. J. R., Pinto, A. M.
(2009). ( 12 ) United States Patent, 2(12), 354–358.
Hall, GD., Washington JA 2nd. (1983) Haemophilus influenzae in genitourinary tract infections. Diagn Microbiol Infect Dis. Mar;1(1):65-70.
Hara, H., Ohta, H., Inoue, T., Ohashi, T., Takashiba, S., Murayama, Y., & Fukui,
K. (2000). Cell surface-associated enolase in Actinobacillus
actinomycetemcomitans. Microbiol Immunol, 44(5), 349–356. Retrieved from.
Hsiao, K. C., Shih, N. Y., Fang, H. L., Huang, T. S., Kuo, C. C., Chu, P. Y., Liu, K.
J. (2013). Surface α-Enolase Promotes Extracellular Matrix Degradation and
Tumor Metastasis and Represents a New Therapeutic Target. PLoS ONE, 8(7),
1–15.
Hurmalainen, V., Edelman, S., Antikainen, J., Baumann, M., Lähteenmäki, K., &
Korhonen, T. K. (2007). Extracellular proteins of Lactobacillus crispatus enhance
activation of human plasminogen. Microbiology, 153(4), 1112–1122.
Jiang, W., Han, X., Wang, Q., Li, X., Yi, L., Liu, Y., & Ding, C. (2014). Vibrio
parahaemolyticus enolase is an adhesion-related factor that binds plasminogen
and functions as a protective antigen. Applied Microbiology and Biotechnology,
98(11), 4937–4948.
Jones MN, Holt RG, (2007). Cloning and characterization of an alpha-enolase of
the oral pathogen Streptococcus mutans that binds human plasminogen. Biochem
Biophys Res Commun. 2007 Dec 28;364(4):924-9. Epub 2007 Oct 25.
Kainulainen, V., & Korhonen, T. (2014). Dancing to Another Tune—Adhesive
Moonlighting Proteins in Bacteria. Biology, 3(1), 178–204.
Kainulainen, V., Loimaranta, V., Pekkala, A., Edelman, S., Antikainen, J., Kylväjä,
R., Korhonen, T. K. (2012). Glutamine synthetase and glucose-6-phosphate
isomerase are adhesive moonlighting proteins of Lactobacillus crispatus released
by epithelial cathelicidin LL-37. Journal of Bacteriology, 194(10), 2509–2519.
60
Kinloch, A., Tatzer, V., Wait, R., Peston, D., Lundberg. K., Donatien, P., Moyes,
D., Taylor P., C. Venables, P., J. (2005). Identification of citrullinated alpha-
enolase as a candidate autoantigen in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther
7:R1421–R1429.
Lähteenmäki, K., Kuusela, P., & Korhonen, T. K. (2001). Bacterial plasminogen
activators and receptors. FEMS Microbiology Reviews, 25(5), 531–552.
Langereis, J. D., & De Jonge, M. I. (2015). Invasive disease caused by
nontypeable Haemophilus influenzae. Emerging Infectious Diseases, 21(10),
1711–1718.
Lenz, L. L., Mohammadi, S., Geissler, A., & Portnoy, D. A. (2003). SecA2-
dependent secretion of autolytic enzymes promotes Listeria monocytogenes
pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 100(21), 12432–12437.
Li, W. qing, Hu, X. chu, Zhang, X., Ge, Y., Zhao, S., Hu, Y., & Ashman, R. B.
(2011). Immunisation with the glycolytic enzyme enolase confers effective
protection against Candida albicans infection in mice. Vaccine, 29(33), 5526–
5533.
Liu, X., Zheng, C., Gao, X., Chen, J., & Zheng, K. (2017). Complete molecular
and immunoprotective characterization of Babesia microti enolase. Frontiers in
Microbiology, 8(APR), 1–11.
Meunier, M., Guyard-Nicodème, M., Hirchaud, E., Parra, A., Chemaly, M., & Dory,
D. (2016). Identification of novel vaccine candidates against Campylobacter
through reverse vaccinology. Journal of Immunology Research, 2016.
Mi, R., Yang, X., Huang, Y., Cheng, L., Lu, K., Han, X., & Chen, Z. (2017).
Immunolocation and enzyme activity analysis of Cryptosporidium parvum
enolase. Parasites & Vectors, 10(1), 273.
Murphy T. F. y Apicella M. A. (1987). Nontypable Haemophilus influenzae: a
rewiew of clinical aspects, surface anigens and human inmune response to
infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15.
61
Nogueira, S. V., Backstedt, B. T., Smith, A. A., Qin, J., Jr, E. A. W., Ko, A., & Pal,
U. (2013). Leptospira interrogans Enolase Is Secreted Extracellularly and
Interacts with Plasminogen, 8(10), 1–11.
Pal-Bhowmick, I., Mehta, M., Coppens, I., Sharma, S., & Jarori, G. K. (2007).
Protective properties and surface localization of Plasmodium falciparum enolase.
Infection and Immunity, 75(11), 5500–5508.
Pancholi, V., Fischetti, V., A. (1998). Alpha-enolase, a novel strong plasminogen
binding protein on the surface of pathogenic streptococci. J Biol Chem
273:14503–14515.
Pancholi, V. (2001). Multifunctional alpha-enolase: its role in diseases. Cellular
and Molecular Life Sciences, 58(7), 902–920.
Ponting, CP., Marshall, JM., Cederholm-Williams, SA. (1992). Plasminogen: a
structural review. Blood Coagul Fibrinolysis.
Rijken, D., C. (1995). 2 Plasminogen activators and plasminogen activator
inhibitors: biochemical aspects. Bailliere’s Clinical Haematology, 8(2), 291–312.
Rao, V. K., G. P. Krasan, D. R. Hendrixson, S. Dawid, J. W. St Geme III. (1999).
Moleculas determinants of the pathogenesis of disease due to non-typable
Haemophilus influenzae. FEMS Microbiol. Rev. 23: 99-129.
Roaa, Z., Abdulsalam, A., Shahid, G., Kamaldeen, B., & Tariq, A. F. (2016).
Pediatric invasive disease due to Haemophilus influenzae serogroup A in riyadh,
Saudi Arabia: Case series. Journal of Infection in Developing Countries, 10(5),
528–532. https://doi.org/10.3855/jidc.6687
Roberts M. C., Bell T.A., Sandstrom K.I., Smith A.L. y Holmes K.K (1986).
Characterisation of Haemophilus spp. Isolated from infant conjuntivitis. J. Med.
Microbiol. 21, 219-224.
62
Rodríguez, M. K., Agudelo, C. I., & Duarte, C. (2015). Aislamientos invasivos de
Haemophilus influenzae en menores de 5 años: Distribución de los serotipos y de
la sensibilidad antimicrobiana, SIREVA II, Colombia 2002-2013. Infectio, 19(2),
67–74.
Roig-borrellas, A., Garc, A., & Roser, L. (2012). α -Enolase , a Multifunctional
Protein : Its Role on Pathophysiological Situations, 2012.
Sambrook, Fritsch, y Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York,
Volume 3, apendix B.12
Sette, A. (2010). Reverse Vaccinology: Developing Vaccines in the Era of
Genomics. Immunity, 33(4), 530–541.
https://doi.org/10.1016/j.immuni.2010.09.017.Reverse
Shapiro, E.D., y. Ward, J., L. (1991). The Epidemiology and prevention of
dDisease by Haemophilus influenza Type b. Epidemiol Rev; 13: 113-141.
Sosa Iglesias, E. G., C. S. Giono., G, A., Escobar. (1992). Manual de
procedimientos para el aislamiento e identificación de Haemophilus. Publicación
técnica No. 19. Subsecretaria.
Sundstrom, P., & Aliaga, G. R. (1992). Molecular cloning of cDNA and analysis of
protein secondary structure of Candida albicans enolase, an abundant,
immunodominant glycolytic enzyme. Journal of Bacteriology, 174(21), 6789–
6799.
Swords W.E., Moore M. L., Godzicki L., Bukofzer G., Mitten M. J., VonCannon J.
(2003). Sialylation of Lipooligosaccharides Promotes Biofilm Formation by
Nontypeable Haemophilus influenzae. Infect. Immun. 72:106-113.
Tang, C. M., D. W. Hood and E. R. Moxon. (2001). Pathogenesis of Haemophilus
influenzae infections. P.675-716.En Groisman E. (Ed). Principles of Bacterial
Pathogenesis.Academic press.
63
Terán A. F., Carlson R., Monds J., Veeh R., Hu F., Stewart P., Lal R., Ehrlich G.
D., Avci R. (2009). Nanoscale Structural and Mechanical properties of
Nontypeable Haemophilus influenzae Biofilms. Bacteriology 2512-2520
Vastano, V., Capri, U., Candela, M., Siciliano, R. A., Russo, L., Renda, M., &
Sacco, M. (2013). Identification of binding sites of Lactobacillus plantarum
enolase involved in the interaction with human plasminogen. Microbiological
Research, 168(2), 65–72.
Wang, J., Wang, K., Chen, D., Geng, Y., Huang, X., He, Y Lai, W. (2015). Cloning
and characterization of surface-localized α-enolase of Streptococcus iniae, an
effective protective antigen in mice. International Journal of Molecular Sciences,
16(7), 14490–14510.
Wang, X., Chen, W., Tian, Y., Mao, Q., Lv, X., Shang, M., Huang. (2014). Surface
display of Clonorchis sinensis enolase on Bacillus subtilis spores potentializes an
oral vaccine candidate. Vaccine, 32(12), 1338–1345.
Yang, C.-K., Ewis, H. E., Zhang, X., Lu, C.-D., Hu, H.-J., Pan., Tai, P. C. (2011).
Nonclassical Protein Secretion by Bacillus subtilis in the Stationary Phase Is Not
Due to Cell Lysis. Journal of Bacteriology, 193(20), 5607–5615.
https://doi.org/10.1128/JB.05897-11.
64
13. ANEXOS
Anexo 1. Soluciones para extracción de ADN genómico
Reactivo/ solución Formula
Buffer STE NaCl 100mM; Tris-HCl 10 mM pH 8; EDTA 1mM
Buffer TE Tris-HCl 10 mM pH 8; EDTA 1mM
Buffer TE con 100 µg/ml de RNasa Tris-HCl 10 mM pH 8; EDTA 1mM; 100 µg/ml
de RNasa
Fenol- cloroformo- alcohol isoamilico (25:24:1)
Cloroformo: alcohol isoamilico Cloroformo 24 ml; alcohol isoamilico 1ml
Anexo 2. Componentes y concentraciones para las Digestiones
Componentes Concentración Inicial
Volumen añadido por tubo
(μL)
Concentración final de la reacción
ADN plasmidíco
pCR®2.1-TOPO::Hieno.
85 ng/ μL 6 25.5 ng/ μL
XhoI 10 U/μL 1 0.5 U
KpnI 10 U/μL 1 0.5 U
Buffer Tango 10X 3 1.5X
H2O inyectable estéril
cbp… 20μL
---- 9
65
Anexo 3. Soluciones para la purificación de proteínas
solución Componentes
Buffer de carga 50 mM de NiSO4
Buffer de unión 20mM Tris-HCl pH =8.0, 5 mM de imidazol, 0.5 M de NaCl
Buffer de lavado 20mM Tris-HCl pH =8.0, 60 mM de imidazol, 0.5 M de NaCl
Buffer eluyente 20mM Tris-HCl pH =8.0, 1 M de imidazol, 0.5 M de NaCl
Buffer strip 20mM Tris-HCl pH =8.0, 100 mM de EDTA, 0.5 M de NaCl
Anexo 4. Componentes SDS-PAGE
Componentes Gel separador 12% Gel concentrador 12%
Agua 1.82 ml 1.04 ml
Acrilamida 30% 4.04 ml 0.32 ml
Bis-acrilamida 2% 1.64ml 0.13 ml
Tris-HCl1.5 M pH=8.8
SDS=0.4%
2.8ml ----------
Tris-HCl1.5 M pH=6.8
SDS=0.4%
--------- 0.5 ml
Persulfato de amonio 10% 80 μL 40 μL
TEMED 8 μL 3 μL
66
Anexo 5. Secuencia completa y parcial del gen eno de las cepas
HiNTBUAP96, HibBUAPNAN y HibATCC33930 y su traducción a proteína
>HiNTBUAP96
ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACTGTTGAAGCTGAAGTTCATCTTGAAGGTGGTTT
TGTTGGTTTAGCAGCAGCTCCATCTGGCGCATCAACTGGTTCTCGTGAAGCATTAGAATTACGTGACGGCGACAAATCTCGTTTCTTAGGTA
AAGGCGTATTAAAAGCTGTGGCGGCAGTGAACAACGAAATTGCACAAGCTATCGTTGGTAAAGATGCAACAAACCAAGCTGAAATCGACCAA
ATCATGATCGATTTAGACGGAACCGAAAACAAATCTAACTTTGGTGCAAATGCAATCTTAGCGGTATCTTTAGCAAATGCAAAAGCAGCTGC
AGCATCTAAAGGTTTACCACTTTACGCTTACATTGCAGAATTAAATGGCACTGCTGGTGTTTATTCTATGCCATTACCAATGATGAACATCA
TTAACGGTGGCGAACATGCAGATAACAACGTTGATATCCAAGAATTCATGATTCAACCAGTTGGTGCGAAAACATTACGTGAAGCACTTCGT
ATCGGTGCTGAAGTATTCCACAACCTTGCAAAAGTATTAAAATCTAAAGGCATGAGCACTGCGGTTGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCAAA
CTTAGCCTCTAACGCAGACGCTTTAGCCTGTATCAAAGAAGCAGTAGAAAAAGCAGGTTATGTATTAGGTAAAGACGTTACTTTAGCGATGG
ACTGCGCATCTTCTGAGTTCTATAACAAAGAAAATGGTATGTACGAAATGAAAGGTGAAGGTAAATCATTCACTTCTCAAGAGTTCACACAC
TATCTTGAAGAATTAACTAAACAATACCCAATCGTGTCTATCGAAGATGGTCAAGATGAATCTGACTGGGAAGGTTTTGCATACCAAACTAA
AGTGTTAGGCGACCGCGTTCAATTAGTGGGCGATGATTTATTCGTAACGAATACCAAAATCTTAAAAGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCAA
ACTCTATCTTAATCAAATTCAACCAAATCGGTTCTTTAACTGAAACTTTAGCAGCAATTAAAATGGCGAAAGATGCAGGTTACACCGCTGTA
ATCTCTCACCGTTCAGGCGAAACTGAAGATGCAACTATCGCTGATTTAGCGGTGGGTACAGCAGCAGGTCAAATCAAAACTGGTTCTATGAG
CCGTTCTGACCGTATTGCGAAATACAACCAATTAATCCGTATCGAAGAAGCATTAGAACGCGCTGGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAA
AAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAC
>EnolasaHiNTBUAP96
MAKIVKVIGREIIDSRGNPTVEAEVHLEGGFVGLAAAPSGASTGSREALELRDGDKSRFL
GKGVLKAVAAVNNEIAQAIVGKDATNQAEIDQIMIDLDGTENKSNFGANAILAVSLANAK
AAAASKGLPLYAYIAELNGTAGVYSMPLPMMNIINGGEHADNNVDIQEFMIQPVGAKTLR
EALRIGAEVFHNLAKVLKSKGMSTAVGDEGGFAPNLASNADALACIKEAVEKAGYVLGKD
VTLAMDCASSEFYNKENGMYEMKGEGKSFTSQEFTHYLEELTKQYPIVSIEDGQDESDWE
GFAYQTKVLGDRVQLVGDDLFVTNTKILKEGIEKGIANSILIKFNQIGSLTETLAAIKMA
KDAGYTAVISHRSGETEDATIADLAVGTAAGQIKTGSMSRSDRIAKYNQLIRIEEALERA
GTPAAFPGLKAVKGQAY
>HibBUAPNAN
ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACTGTTGAAGCTGAAGTTCATCTTGAAGGTGGTTT
TGTTGGTTTAGCAGCAGCTCCATCTGGCGCATCAACTGGTTCTCGTGAAGCATTAGAATTACGTGACGGCGACAAATCTCGTTTCTTAGGTA
AAGGCGTATTAAAAGCTGTGGCGGCAGTGAACAACGAAATTGCACAAGCTATCGTTGGTAAAGATGCAACAAACCAAGCTGAAATCGACCAA
ATCATGATCGATTTAGACGGAACCGAAAACAAATCTAACTTTGGTGCAAATGCAATCTTAGCGGTATCTTTAGCAAATGCAAAAGCAGCTGC
AGCATCTAAAGGTTTACCACTTTACGCTTACATTGCAGAATTAAATGGCACTGCTGGTGTTTATTCTATGCCATTACCAATGATGAACATCA
TTAACGGTGGCGAACATGCAGATAACAACGTTGATATCCAAGAATTCATGATTCAACCAGTTGGTGCGAAAACATTACGTGAAGCACTTCGT
ATCGGTGCTGAAGTATTCCACAACCTTGCAAAAGTATTAAAATCTAAAGGCATGAGCACTGCGGTTGGTGACGAAAGTGGTTTCGCTCCAAA
CTTAGCCTCTAACGCAGACGCTTTAGCCTGTATCAAAGAAGCAGTAGAAAAAGCAGGTTATGTATTAGGTAAAGACGTTACTTTAGCGATGG
ACTGCGCATCTTCTGAGTTCTATAACAAAGAAAATGGTATGTACGAAATGAAAGGTGAAGGTAAATCATTCACTTCTCAAGAGTTCACACAC
TATCTTGAAGAATTAACTAAACAATACCCAATCGTGTCTATCGAAGATGGTCAAGATGAATCTGACTGGGAAGGTTTTGCATACCAAACTAA
AGTGTTAGGCGACCGCGTTCAATTAGTGGGTGATGATTTATTCGTAACGAATACCAAAATCTTAAAAGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCAA
ACTCTATCTTAATCAAATTCAACCAAATCGGTTCTTTAACTGAAACTTTAGCAGCAATTAAAATGGCGAAAGATGCAGGTTACACCGCTGTA
ATCTCTCACCGTTCAGGCGAAACTGAAGATGCAACTATCGCTGATTTAGCGGTGGGTACAGCAGCAGGTCAAATCAAAACTGGTTCTATGAG
CCGTTCTGACCGTATTGCGAAATACAACCAATTAATCCGTATCGAAGAAGCATTAGAACGCGCTGGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAA
AAGCGGTTAAAGGTCAAGGGTAC
>EnolasaHibBUAPNAN
MAKIVKVIGREIIDSRGNPTVEAEVHLEGGFVGLAAAPSGASTGSREALELRDGDKSRFL
GKGVLKAVAAVNNEIAQAIVGKDATNQAEIDQIMIDLDGTENKSNFGANAILAVSLANAK
AAAASKGLPLYAYIAELNGTAGVYSMPLPMMNIINGGEHADNNVDIQEFMIQPVGAKTLR
EALRIGAEVFHNLAKVLKSKGMSTAVGDESGFAPNLASNADALACIKEAVEKAGYVLGKD
VTLAMDCASSEFYNKENGMYEMKGEGKSFTSQEFTHYLEELTKQYPIVSIEDGQDESDWE
GFAYQTKVLGDRVQLVGDDLFVTNTKILKEGIEKGIANSILIKFNQIGSLTETLAAIKMA
KDAGYTAVISHRSGETEDATIADLAVGTAAGQIKTGSMSRSDRIAKYNQLIRIEEALERA
GTPAAFPGLKAVKGQGY
67
>HibATCC33930
TCATCGACTCACGCGGTAATCCAACTGTTGAAGCTGAAGTTCATCTTGAAGGTGGTTTTGTTGGTTTAGCAGCAGCTCCATCTGGCGCATCA
ACTGGTTCTCGTGAAGCATTAGAATTACGTGACGGCGACAAATCTCGTTTCTTAGGTAAAGGCGTATTAAAAGCTGTGGCGGCAGTGAACAA
CGAAATTGCACAAGCTATCGTTGGTAAAGATGCAACAAACCAAGCTGAAATCGACCAAATCATGATCGATTTAGACGGAACCGAAAACAAAT
CTAACTTTGGTGCAAATGCAATCTTAGCGGTATCTTTAGCAAATGCAAAAGCAGCTGCAGCATCTAAAGGTTTACCACTTTACGCTTACATT
GCAGAATTAAATGGCACTGCTGGTGTTTATTCTATGCCATTACCAATGATGAACATCATTAACGGTGGCGAACATGCAGATAACAACGTTGA
TATCCAAGAATTCATGATTCAACCAGTTGGTGCGAAAACATTACGTGAAGCACTTCGTATCGGTGCTGAAGTATTCCACAACCTTGCAAAAG
TATTAAAATCTAAAGGCATGAGCACTGCGGTTGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCAAACTTAGCCTCCAACGCAGACGCTTTAGCCTGTATC
AAAGAAGCAGTAGAAAAAGCAGGTTATGTATTAGGTAAAGACGTTACTTTAGCGATGGACTGCGCATCTTCTGAGTTCTATAACAAAGAAAA
TGGTATGTACGAAATGAAAGGTGAAGGTAAATCATTCACTTCTCAAGAGTTCACACACTATCTTGAAGAATTAACTAAACAATACCCAATCG
TGTCTATCGAAGATGGTCAAGATGAATCTGACTGGGAAGGTTTTGCATACCAAACTAAAGTGTTAGGCGACCGCGTTCAATTAGTGGGCGAT
GATTTATTCGTAACGAATACCAAAATCTTAAAAGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCAAACTCTATCTTAATCAAATTCAACCAAATCGGTTC
TTTAACTGAAACTTTAGCAGCAATTAAAATGGCGAAAGATGCAGGTTACACCGCTGTAATCTCTCACCGTTCAGGCGAAACTGAAGATGCAA
CTATCGCTGATTTAGCGGTGGGTACAGCAGCAGGTCAAATCAAAACTGGTTCTATGAGCCGTTCTGACCGTATTGCGAAATACAACCAATTA
ATCCGTATCGAAGAAGCATTAGAACGCGCTGGTACTCCAGC
>EnolasaHibATCC33930
IDSRGNPTVEAEVHLEGGFVGLAAAPSGASTGSREALELRDGDKSRFLGKGVLKAVAAVN
NEIAQAIVGKDATNQAEIDQIMIDLDGTENKSNFGANAILAVSLANAKAAAASKGLPLYA
YIAELNGTAGVYSMPLPMMNIINGGEHADNNVDIQEFMIQPVGAKTLREALRIGAEVFHN
LAKVLKSKGMSTAVGDEGGFAPNLASNADALACIKEAVEKAGYVLGKDVTLAMDCASSEF
YNKENGMYEMKGEGKSFTSQEFTHYLEELTKQYPIVSIEDGQDESDWEGFAYQTKVLGDR
VQLVGDDLFVTNTKILKEGIEKGIANSILIKFNQIGSLTETLAAIKMAKDAGYTAVISHR
SGETEDATIADLAVGTAAGQIKTGSMSRSDRIAKYNQLIRIEEALERAGTP
68
Anexo 6. Alineamiento y porcentaje de identidad del gen eno de las distintas cepas de H. influenzae (extremos 5’ y 3’).
Extremo 5’
CLUSTAL O (1.2.4) multiple sequence alignment
JMQP01000002.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
CP007805.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_JXLX01000027.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_LHSN01000008.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_ABWV01000001.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_AAZG01000001.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
CP007471.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_LFFS01000014.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
HibBUAPNAN (b) ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
FQ312006.1 (b) ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
HINTBUAP9612540 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_JXMB01000024.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_JXMD01000015.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_JXLZ01000014.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
CP000057.2 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_JXMC01000018.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
CP007472.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
CP009610.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_LFFT01000002.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_ABWW01000001.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
FQ670204.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_ACSL01000001.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAACCCAACT
NZ_LFFP01000005.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAACCCAACT
NZ_JXLY01000020.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
AAZD01000001.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_LFDN01000008.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_JFZM01000005.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_JXMG01000055.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
FQ670178.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
NZ_JXMH01000019.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
L42023.1 (d) ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
CP008740.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAACCCAACT
NZ_LHSO01000003.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAACCCAACT
CP005967.1 (f) ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAACCCAACT
NZ_LFDK01000001.1 ATGGTAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAACCCAACT
NZ_LFDL01000001.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
CP007470.1 ATGGCAAAAATCGTTAAAGTGATTGGTCGCGAAATCATCGACTCACGCGGTAATCCAACT
**** ************************************************ ******
Extremo 3’
% De identidad
JMQP01000002.1 GGTACTCCAGCTGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 100.00
CP007805.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 99.08
NZ_JXLX01000027.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCAGTTAAAGGTCAAGCGTAA 97.79
NZ_LHSN01000008.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.02
NZ_ABWV01000001.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.02
NZ_AAZG01000001.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.02
CP007471.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.02
NZ_LFFS01000014.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.02 HibBUAPNAN (b) GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGGGTAC 97.71
FQ312006.1 (b) GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.02
HINTBUAP9612540 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAC 97.94
NZ_JXMB01000024.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.78
NZ_JXMD01000015.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.78
69
NZ_JXLZ01000014.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.78
CP000057.2 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.25
NZ_JXMC01000018.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.25
CP007472.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.25
CP009610.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.25
NZ_LFFT01000002.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.25
NZ_ABWW01000001.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.25
FQ670204.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCTAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 98.17
NZ_ACSL01000001.1 GGCACACCAGCCCCGTTCTTAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 96.64
NZ_LFFP01000005.1 GGTACTCCAGCTGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 96.26
NZ_JXLY01000020.1 GGTACTCCAGCAGCATTTCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 96.49
AAZD01000001.1 GGTACTCCAGCTGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 97.10
NZ_LFDN01000008.1 GGTACTCCAGCTGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 97.10
NZ_JFZM01000005.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 96.72
NZ_JXMG01000055.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 97.25
FQ670178.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 97.41
NZ_JXMH01000019.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCAGTTAAAGGTCAAGCGTAA 97.41 L42023.1 (d) GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 97.33
CP008740.1 GGCACACCAGCCCCGTTCTTAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 94.36
NZ_LHSO01000003.1 GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 94.89 CP005967.1 (f) GGTACTCCAGCAGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 94.89
NZ_LFDK01000001.1 GGTACTCCAGCTGCATTCCCAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 95.19 NZ_LFDL01000001.1 GGCACACCAGCCCCGTTCTTAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 94.89
CP007470.1 GGCACACCAGCCCCGTTCTTAGGCTTAAAAGCGGTTAAAGGTCAAGCGTAA 96.72 ** ** ***** * ** ************ ************* ***
