ANTECEDENTES
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ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORALDEL LITORAL
Facultad de Ingeniería Mecánica y Ciencias de Facultad de Ingeniería Mecánica y Ciencias de la Producciónla ProducciónTesis de GradoTesis de Grado
Previo a la obtención del título dePrevio a la obtención del título de
INGENIERO AGROPECUARIOINGENIERO AGROPECUARIOPresentado por:Presentado por:
Omar Oswaldo Olvera VacaOmar Oswaldo Olvera VacaDirector: Rodolfo Maribona H.Director: Rodolfo Maribona H.
Guayaquil - EcuadorGuayaquil - Ecuador20032003
“INFLUENCIA DE FACTORES ABIÓTICOS SOBRE LA
EXPRESIÓN DEL VIRUS DEL RAYADO DEL BANANO (BSV) EN
PLANTAS DE BANANO”
ANTECEDENTESANTECEDENTES• En 1998, la superficie afectada por el “Fenómeno del
Niño” fue de 24.803 ha que afectó a la economía agrícola ecuatoriana.
• El estrés ocasionado por la saturación hídrica de los suelos y los cambios de temperatura provocaron el incremento de síntomas del BSV.
• Oficialmente la intensidad de esta epifítia no ha sido
monitoreada.
• En la actualidad, la presencia del BSV ha comenzado extendiéndose a lugares tales como: Patricia Pilar, Quevedo, Empalme, Valencia, La Maná, Vinces, Milagro, El Triunfo y Bucay.
ANTECEDENTESANTECEDENTES
-- EL BSV frecuentemente se confunde en las primeras EL BSV frecuentemente se confunde en las primeras etapas con la infección del Virus del Mosaico del Pepino etapas con la infección del Virus del Mosaico del Pepino (CMV), deficiencia de P. y variación somaclonal.(CMV), deficiencia de P. y variación somaclonal. -El efecto del cultivo de tejidos de meristema no logra un -El efecto del cultivo de tejidos de meristema no logra un saneamiento del BSV debido a que se integra al genoma saneamiento del BSV debido a que se integra al genoma de la célula de la planta (AAB).de la célula de la planta (AAB).
HIPÓTESISHIPÓTESIS
EXISTE INFLUENCIA DE FACTORES ABIÓTICOS QUE CAUSAN LA
EXPRESIÓN DEL BSV.
OBJETIVO GENERALOBJETIVO GENERAL- Establecer los síntomas típicos ocasionados por el Virus del - Establecer los síntomas típicos ocasionados por el Virus del Rayado del Banano (BSV) y su efecto sobre el vigor en plantas Rayado del Banano (BSV) y su efecto sobre el vigor en plantas de banano en distintas etapas de desarrollo sometidas a estrés de banano en distintas etapas de desarrollo sometidas a estrés abióticoabiótico..
OBJETIVOS ESPECÍFICOSOBJETIVOS ESPECÍFICOS- Establecer el diagnóstico diferencial visual en plantas adultas - Establecer el diagnóstico diferencial visual en plantas adultas de banano.de banano.- Estudiar los efecto del estrés térmico, hídrico y la influencia - Estudiar los efecto del estrés térmico, hídrico y la influencia hormonal en la expresión de los síntomas del BSV y vigor en hormonal en la expresión de los síntomas del BSV y vigor en plantas juveniles cultivadas plantas juveniles cultivadas in vitro.in vitro.- Detectar precozmente los síntomas del BSV en plantas - Detectar precozmente los síntomas del BSV en plantas procedentes de cultivo de tejido.procedentes de cultivo de tejido.- Confirmar la sintomatología mediante la comprobación de la - Confirmar la sintomatología mediante la comprobación de la presencia del BSV en las hojas de Banano por presencia del BSV en las hojas de Banano por Microscopía Microscopía electrónica.electrónica.
DESCRIPCIÓN DEL VIRUS DEL RAYADO DEL DESCRIPCIÓN DEL VIRUS DEL RAYADO DEL BANANO (BSV)BANANO (BSV)
Reichel, H., Belalcazar, S.
Bell Lockhart ESPOL 2000
INFECCION VIRAL DEL BSV EN INFECCION VIRAL DEL BSV EN UNA CELULA VEGETALUNA CELULA VEGETAL
SINTOMAS POR DIFICIENCIAS DE FOSFORO SINTOMAS POR DIFICIENCIAS DE FOSFORO Y ZINCY ZINC
Fig. a) Deficiencia de fósforo
INPOFOS 1995
Fig. b) Deficiencia de Zinc
INPOFOS 1995
SINTOMAS POR TOXICIDAD Y CMVSINTOMAS POR TOXICIDAD Y CMV
Fig. c) Toxicidad por herbicida
INPOFOS 1995
Fig. d) sintomas del Virus del Mosaico del Pepino (CMV)
(Dr H.J. Su, National Taiwan University, Taipei)
MATERIALESMATERIALESEtapa1. Identificación de los síntomas y
Purificación del BSV. • Muestras foliares del clon Valery• Tubos de ensayo, pipetas, papel filtro,
licuadora, balanza, peachimetro(Modelo 15) • Centrifuga (Hitachi SCR 208,Rotor RPR9-260,RPM
=8500).• Ultracentrifuga (Hitachi SSP-72,Rotor,RP65T-
627,RPM=65000)• Triton x-100,Mercaptoetanol,Tris, Polivinilpirrolidona
Etapa 2.Propagación in vitroEtapa 2.Propagación in vitro
• 30 hijuelos (Valery)• Herramientas de limpieza• Equipos de laboratorio• Medio normal de Murashige y Skoog• Reactivos: polietilen glicol(PEG),6-
bencilaminopurina(BAP) y temperatura• Equipo de computación• Literatura consultada
MÉTODOMÉTODOEtapa 1• Identificación de los síntomas de BSV en plantas adultas
de banano, en la Agrícola Martinica provincia de Los Ríos.• El diagnóstico visual fue confirmado por inmunoensayo
(Lockhart B.) y se comprobó por microscopía electrónica la presencia de la partícula viral.
• Se utilizó el protocolo del Dr. Lockhart 1986, se realizó ciertas modificaciones (Instituto Higiene Izquieta Pérez Guayaquil).
MÉTODOMÉTODO
Etapa 2• Se recolectó hijuelos de plantas madres enfermas y
sanas que estaban diagnosticadas.• Estos hijuelos fueron micropropagados en el
laboratorio de SEBIOCA-ESPOL.• Las plántulas asintomáticas, obtenidas por
micropropagación, cultivadas in vitro en condiciones de estrés por frío, estrés hídrico y hormonal.
Plantas adultas de banano Rayado amarillo en hojas inferiores
Etapa 1: Recolección del material en el campo. •Identificación de las plantas adultas de banano del clon Valery con los síntomas foliares causados por el BSV.
OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL VIRUS PARA EL DIAGNÓSTICO.VIRUS PARA EL DIAGNÓSTICO.
Tomar hojas inferiores con síntoma de BSV
Incubar a 4º C Extraer 125g / tejido 4 volúmenes de Tampón de extracción
1 (*) 2 3
Homogenizar 1minuto/3 veces
Filtrar con gaza doble
Mezclar extracto con 1/3 v /cloroformo (-4º C)
4 5 6
Agitar por 1 minuto
Centrifugar 10' /10.000g
Dializar y concentrar con Polietilen glicol/
hasta 100ml (-4º C)
7 8 9 (*)
Ultracentrifugar concentrado 1h/136.000g
Conservar precipitado a (-20º C)
Observar por Microscopía-electrónica de transmisión.
10 11 12
Etapa 2. Propagación in vitro de plantas Etapa 2. Propagación in vitro de plantas sanas e infectadassanas e infectadas
Explantación PropagaciónIntroducción
Plántulas en invernadero
ESQUEMA DEL PRECESO DE LOS ESQUEMA DEL PRECESO DE LOS TRATAMIENTOS IN VITROTRATAMIENTOS IN VITRO
Tratamientos correspondientes a la investigación
Medios de cultivos T E M P E R A T U R A
7 18º C 26º C 18° C a 34º C
Enfermas Sanas Enfermas Sanas Enfermas Sanas
1. m1=PEG 1 (3%) 20 20 20 20 20 20
2. m2=PEG 2 (6%) 20 20 20 20 20 20
3. m3=PEG 3 (9%) 20 20 20 20 20 20
4. m4=Sin BAP en el medio 20 20 20 20 20 20
5. m5=5 veces menor /dosis 20 20 20 20 20 20
6. m6=Testigo /dosis normal 20 20 20 20 20 20
7. m7=5 veces mayor /dosis 20 20 20 20 20 20
T O T A L P L A N T A S 840
Variable evaluadasVariable evaluadas
Los parámetros de crecimiento que se evaluaron en los periodos de estrés, enraizamiento y adaptación fueron:
• Área foliar (ancho por largo cm2) • Altura desde la base del pseudo tallo hasta la ¨ V ¨ foliar
en cm.• Peso de todas las plantas de cada tratamiento en gramos • Se valora en cruces (X hasta 4X) el crecimiento radical de
cada tratamiento. Los valores son los siguientes:
X 0-1 raíz
2X 2-3 raíces
3X 4-5 raíces
4X 6-7 raíces
ANÁLISIS ESTADÍSTICOANÁLISIS ESTADÍSTICO• Se utilizó un diseño completamente al azar con un arreglo
factorial, 7 (medios de cultivos) x 2 (presencia – ausencia del virus) x 3 (tipo de temperaturas de 18º C, 26º C y 18º C a 32º C)
Factores en estudio: • Medio de crecimiento• Tipo de planta• Temperatura de crecimiento Interacciones presentes:• Medios de cultivo por tipo de planta• Medios de cultivos por temperatura de crecimiento• Tipo de planta por temperatura de crecimiento• Medio de cultivo por tipo de planta por temperatura de
crecimiento
RESULTADOSRESULTADOSDescripción de las plantas adultas con síntomas.
Los síntomas diferenciales de plantas adultas enfermas en el campo fueron el rayado amarillo que se torna en café oscuro y la presencia de lesiones necróticas en las nervaduras de las hojas inferiores y moteado clorótico. Estos síntomas fueron confirmados por inmunoensayo y microscopia electrónica
Fig. a) Un rayado amarillo .
Fig. c)Lesiones necróticas Fig. b) Un rayado café oscuro
Síntomas atípicos del Virus del Rayado del Banano (BSV)
Fig. a) Los síntomas empiezan desde el borde de la hoja
Fig. b) Síntomas locales en las hojas inferiores
Fig. c) Síntomas del moteado clorótico
Evaluación de síntomas en hijuelosEvaluación de síntomas en hijuelos
Los hijuelos no presentaron ningún rayado amarillo en las hojas antes de la introducción in vitro (Fig. a)
Fig. a) hijuelos asintomáticos
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
m1
i1t1
m1
i1t3
m1
i2t2
m2
i1t1
m2
i1t3
m2
i2t2
m3
i1t1
m3
i1t3
m3
i2t2
m4
i1t1
m4
i1t3
m4
i2t2
m5
i1t1
m5
i1t3
m5
i2t2
m6
i1t1
m6
i1t3
m6
i2t2
m7
i1t1
m7
i1t3
m7
i2t2
Stress Enraizamiento Adaptación
ÁREA FOLIAR EN LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS IN VITRO
**: ALTAMENTE SIGNIFICATIVA
** m4i2t2 , m4i1t1 , m6i1t1 (interacción) ; ns periodo de enraizamiento y adaptación
** 18° C , 26° C
ALTURA DE LAS PLANTULAS ALTURA DE LAS PLANTULAS Evolución Altura de Plantas pos Tratamiento
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Stress Enraizamiento Adaptación
** m4i1t1 ; m4i1t2 ; m6i1t1 ; m4i2t1 (interacción) -ns en el periodo de enraizamiento y adaptación
ns 18° C a 34° C valores bajo de crecimiento.
PESO DE LAS PLANTULAS PESO DE LAS PLANTULAS
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
m1i1
t1
m1i1
t3
m1i2
t2
m2i1
t1
m2i1
t3
m2i2
t2
m3i1
t1
m3i1
t3
m3i2
t2
m4i1
t1
m4i1
t3
m4i2
t2
m5i1
t1
m5i1
t3
m5i2
t2
m6i1
t1
m6i1
t3
m6i2
t2
m7i1
t1
m7i1
t3
m7i2
t2
Stress Enraizamiento
** m4, m5, m6 (medios)ns m2, m3, (Peg 6% y 9%)
CRECIMIENTO RADICULAR EN EL CRECIMIENTO RADICULAR EN EL PERIODO DE ESTRESPERIODO DE ESTRES
Crecimiento Radicular
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41
Tratamientos
Porc
enta
je
X 2X 3X 4X
m4,(19-24); m5,(25-30) mayor crecimiento radicular.
m7,(37-42) menor crecimiento radicular, m3,(13-18 Peg 9%)
Plántulas con síntomas precoces de BSV en cultivo in vitro en combinación con estrés de frío e hídrico
Fig. a) Plántulas con PEG al 3% a 18º C
Fig. b) Testigo.
Vitroplantas con síntomas precoz causado por el virus
Plántulas con síntomas por BSV en el periodo de invernadero
Fig. a) un rayado amarillo en las hojas
Fig. b) testigo.
Plantas de variación somaclonal
Fig. a) tipo variegado
Aislamiento, purificación y caracterización del virus Aislamiento, purificación y caracterización del virus mediante la tinción negativa al 1% de ácido mediante la tinción negativa al 1% de ácido Fosfotúngstico, de fracciones virales purificadas por Fosfotúngstico, de fracciones virales purificadas por CsCl, fueron observadas al microscopio electrónico CsCl, fueron observadas al microscopio electrónico
Partículas virales baciliformes del virus del rayado del banano (BSV).
CONCLUSIONESCONCLUSIONES• Los síntomas diferenciales de plantas adultas enfermas en
el campo fueron el rayado amarillo que se torna en café oscuro y la presencia de lesiones necróticas en las nervaduras de las hojas inferiores y un moteado clorótico en el área foliar. Esto síntomas permiten diferenciar el BSV de otras enfermedades.
• Existió un crecimiento vegetativo heterogéneo de las plantas sanas y enfermas en el periodo de estrés de los tratamientos in vitro de 18° C y 26° C. La presencia de concentraciones mayores de PEG de 6% y 9% disminuye el crecimiento vegetativo in vitro. En el periodo de enraizamiento y adaptación se recuperaron significativamente.
• Las plántulas enfermas en condiciones de cultivo in vitro presentaron síntomas de la enfermedad en un 20 %, cuando fueron sometidas al estrés combinado de frío y estrés hídrico. Estos síntomas aumentaron a un 50 %, cuando las plántulas fueron transplantadas y cultivadas en el invernadero, se observó que los síntomas resultaron semejantes a las que se presentan en plantas adultas enfermas con el BSV presencia de un rayado amarillo en las hojas.
• Por primera vez en el Ecuador se logró el aislamiento, purificación por ultracentrifugación en CsCl y caracterización por microscopia electrónica de un virus de planta realizado mediante modificaciones exitosas del protocolo descrito por Lockhart, 1986.
RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES• Difundir en la práctica agrícola bananera los síntomas
descritos en este trabajo que permiten diferenciar el BSV de otras enfermedades.
• Introducir en la práctica de la micropropagación comercial de banano el diagnóstico precoz establecido para plántulas en la fase de endurecimiento en invernadero.
• Descifrar los mecanismos moleculares que inducen la aparición de los síntomas de la enfermedad del BSV cuando las plántulas son sometidas al estrés combinado de frío e hídrico.
• Basado en el diagnóstico diferencial visual establecido para plantas adultas, monitorear la presencia de la enfermedad y erradicar las plantas enfermas.
AGRADECIMIENTO A:Dra. Sofia KornevaDr. Anselmo OteroDr. Amano GasupiDr. Miguel RamosDr. Sabino HernándezSr. Cyndrich MiljenkoIng. Bernardo ManzanoBiol. José FloresBiol. Miguel GutiérrezSr. Jorge VillavicencioMSc. Florence Malafose (INIBAP).• Dejo constancia de mi profundo aprecio por creer en la
juventud que sí podemos hacer investigaciones aplicadas para resolver problemas nacionales como es el Virus del Rayado del Banano (BSV), al Dr. Rodolfo Maribona, Director de mí Tesis, por su ayuda invaluable.