ANTICUERPO PRIMARIO

CÉLULAS EN MONOCAPA

TRANSFECCIÓN

FIJACIÓN (paraformaldehído o gluteraldehido)

PERMEABILIZACIÓN

ANTICUERPO SECUNDARIO

LAVADOS

BLOQUEO ANALISIS PORMICROSCOPIA

DE FLUORESCENCIA

INMUNOCITOQUÍMICAINMUNOCITOQUÍMICA

fijación con metanol (fija y permeabiliza a la vez)

Manipulación de células en cultivo:

AporteRequerimientos

MEDIO DE CULTIVO Nutrientes

SUEROEstimulo proliferativo yadhesivo

ANTIBIOTICO Prevención de contaminaciones

SUPLEMENTO Estimulo especifico*hormonas*Factores de crec.

*penicilina*estreptomicina*gentamicina

*glucosa (fuente de C)*aminoácidos (fuente de N)*cofactores enzimáticos*vitaminas*sales

*Transferrina*Albumina, *Factores de crec.*Factores de anclaje

Composición

1) MEDIO DE CULTIVO1) MEDIO DE CULTIVO

BUFFER Mantiene el PH *Bicarbonato*Indicador: Rojo Fenol

2) FACTORES FISICOQUIMICOS 2) FACTORES FISICOQUIMICOS

•PH: 7.2-7.5•OSMOLARIDAD : 280-320mOsmol/kG•CO2: 2-5 %•TEMPERATURA: 35-37 ºC

3) ESTERILIDAD3) ESTERILIDAD

1) Manipulación de células en flujo laminar2) Exposición de luz UV dentro del gabinete del flujo por 15´ antes de empezar a trabajar3) Todo el material usado debe estar estéril * por autoclavado (120 C, 1 atm, 20´) en el caso de tips, frascos, eppendorfs, pipetas, etc. * por filtración (poro de 0,2µM) en el caso de medio (antes del agregado de SFB y antibióticos), buffers, agua, etc. 4) Todo los elementos que ingresan al flujo laminar deben ser lavados con etanol 70%

Tipos de transfección:Tipos de transfección:

1) Coprecipitación por fosfato de calcio

2) Electroporación

3) DEAE-Dextran y Polibreno

4) Fusión de protoplastos

5) Lípidos cationicos (Liposomas)

6) Métodos Mecánicos *Microinjección *Biobalistica (gene gun)

Fijación

La función de la fijación es preservar la morfología celular y la localización y estructura de los antigenos lo mas fielmente posible a lo que ocurre en la realidad.

Gluteraldheído Paraformaldheido Metanol/Acetona

Modo de acciónPor puentes entre grupos aminos de las proteínas

Por puentes entre grupos aminos de las proteínas

Por precipitación deproteínas y carbohidratos

Uso mas frecuenteMicroscopia electrónicay algunos estudios de fluorescencia

Ampliamente usado para estudios de fluorescencia e inmunocitoquímicos

Gran variedad de estudios

ventajas/desventajas

*provee la mayor preservación de la estructura fina*es el mas severo delos fijadores*en gral. Altera los epitopes*provoca fluorescenciainespecifica

*produce menor autofluorescencia que el gluteraldheído*menor cantidad de puentesque el gluteraldheído*penetra mas rápidamente dentro de la célula.

*fijación mas rápida que el aldheído*frecuentemente altera el patrón de localización de antígenos*antígenos solubles pueden perderse*contracción de la muestra

PERMEABILIZACION

Micela de detergente e agua

Ruptura de la membrana por detergente.

ANTICUERPOS

• Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer y unirse específicamente y con alta afinidad a otras proteínas .

• La molécula que induce la producción de anticuerpos se denomina antígeno.

• Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.

Anticuerpos

Anticuerpos producidos por diferentes clones de linfocitos

Mezcla heterogénea de anticuerpos, reconocen distintos epitopes de

un mismo antígeno.

PoliclonalesPoliclonales MonoclonalesMonoclonales

Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos

Población de anticuerpos homogéneos,reconoce un único epitope del anticuerpo

Anticuerpos policlonales

Separar el suero

Purificación de

anticuerpos

Conejo, cabra, oveja, etc.

Anticuerpos monoclonales

• Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por fusión con células de mieloma de ratón.

• Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el linfocito B normal parental y es inmortal como el mieloma que le dio origen.

Anticuerpos monoclonales

Células productoras de anticuerpos

Células de mieloma Fusión

hibridomas

Producción de anticuerpos monoclonales

Anticuerpos monoclonales

• Ventajas con respecto a los policlonales:

• Alta especificidad, reconocen un único epitope

• Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características.

• Desventajas:• Mayor costo

Inmunofluorescencia

DIRECTA INDIRECTA

Anticuerpo marcadocon fluoróforo

primario secundario

Ventajas

• Mayor sensibilidad• El anticuerpo secundario puede ser usado para localizar cualquier anticuerpo primario producido en el mismo animal para el cual fue hecho el secundario

Inmunofluorescencia indirecta

Células fijadas y permeabilizadas

Inmunofluorescencia indirecta

Células fijadas, permeabilizadas y bloqueadas

Inmunofluorescencia indirecta

Anticuerpo primario (IgG)

•anti-tubulina (producido en conejo)

•anti-vinculina (producido en conejo)

Inmunofluorescencia indirecta

Anti-Conejo (producido en cabra)

Anticuerpo secundario

Inmunofluorescencia indirecta

Microscopio defluorescencia

GFP-PTP 1B DAVINCILUNA

ACTINA ACTINA/NUCLEO/RETICULO

VINCULINA/NUCLEO/RETICULO

MICROTUBULOS/NUCLEO/VESICULAS