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Prácticas docentes en la Facultad de Ciencias COD: 10-71 Campus Fuentenueva Avenida Fuentenueva s/n 18071 Granada Tfno. 958 24 33 79 Fax. 958 24 33 70 [email protected] Facultad de Ciencias Vicedecanato de Actividades Científicas, Culturales y de Prácticas Externas - 1 - Universidad de Granada APLICACIÓN DE LA PCR: DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS FUNDAMENTO TEÓRICO La PCR es una técnica que permite llevar a cabo la síntesis in vitro de fragmentos de ADN. Está basada en una reacción enzimática catalizada por una ADN polimerasa, que produce múltiples copias (amplificación) de un mismo fragmento de ADN. Para la reacción se requiere: El ADN que va a copiarse, que servirá como molde a la ADN polimerasa para hacer las copias. Polimerasa termoestable, habitualmente se utiliza la polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus conocida como Taq polimerasa. Cebadores o primers específicos, que se unirán a los extremos del fragmento de ADN que quiere amplificarse. En este caso, se unirán a un fragmento de ADN del genoma del parásito. Se utiliza la especificidad de los cebadores para amplificar una región del genoma del parásito cuando se encuentra presente en una muestra. Desoxirribonucleótidos trifosfato, o dNTPs (dATP, dTTP, dCTP,dGTP), que son los sustratos para la síntesis de ADN, y un medio de reacción adecuado, que contenga iones magnesio y otras sales necesarias para que se produzca la reacción enzimática, y que se consigue utilizando un tampón de reacción apropiado para la enzima Una PCR típica incluye tres pasos: Etapa de desnaturalización. Se calientan las muestras a una temperatura por encima de 90ºC durante un periodo de 30s-1 minuto. Las moléculas de ADN están compuestas por dos cadenas de nucleótidos (son bicatenarias). Al incubar las reacciones a esta temperatura elevada se rompen los puentes de hidrógeno que unen las dos cadenas de nucleótidos (la molécula de ADN se desnaturaliza), de modo que
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ANALISIS CLINICO
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APLICACIN DE LA PCR: DIAGNSTICO DE PARSITOS
FUNDAMENTO TERICO
La PCR es una tcnica que permite llevar a cabo la sntesis in vitro de fragmentos de
ADN. Est basada en una reaccin enzimtica catalizada por una ADN polimerasa, que produce
mltiples copias (amplificacin) de un mismo fragmento de ADN. Para la reaccin se requiere:
El ADN que va a copiarse, que servir como molde a la ADN polimerasa para hacer
las copias.
Polimerasa termoestable, habitualmente se utiliza la polimerasa de la bacteria
Thermus aquaticus conocida como Taq polimerasa.
Cebadores o primers especficos, que se unirn a los extremos del fragmento de
ADN que quiere amplificarse. En este caso, se unirn a un fragmento de ADN del
genoma del parsito. Se utiliza la especificidad de los cebadores para amplificar una
regin del genoma del parsito cuando se encuentra presente en una muestra.
Desoxirribonucletidos trifosfato, o dNTPs (dATP, dTTP, dCTP,dGTP), que son
los sustratos para la sntesis de ADN,
y un medio de reaccin adecuado, que contenga iones magnesio y otras sales
necesarias para que se produzca la reaccin enzimtica, y que se consigue utilizando
un tampn de reaccin apropiado para la enzima
Una PCR tpica incluye tres pasos:
Etapa de desnaturalizacin. Se calientan las muestras a una temperatura por
encima de 90C durante un periodo de 30s-1 minuto. Las molculas de ADN estn
compuestas por dos cadenas de nucletidos (son bicatenarias). Al incubar las
reacciones a esta temperatura elevada se rompen los puentes de hidrgeno que unen
las dos cadenas de nucletidos (la molcula de ADN se desnaturaliza), de modo que
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cada una de las dos cadenas sirve como molde para la copia de un nuevo fragmento
de ADN.
Etapa de cebado o annealing. las reacciones se enfran con rapidez a una
temperatura que puede variar entre 50-65 C y se incuban a esta temperatura durante
un periodo de entre 30s a 1 minuto para que los cebadores se unan a las secuencias
complementarias en las cadenas molde. Los cebadores son fragmentos cortos de
ADN, entre 15 y 35 nucletidos, de secuencia inversa y complementaria a los
extremos de la regin de ADN que va a copiarse. Son adems especficos, de modo
que se unen exclusivamente a los extremos del fragmento de ADN a amplificar, y
no se unen a ninguna otra secuencia de ADN cercana.
Etapa de polimerizacin. Las reacciones se incuban durante un periodo de entre
30s a 1 minuto a 72C, temperatura ptima de actuacin de la ADN polimerasa, que
aadir los desoxirribonucletidos trifosfato al extremo de los cebadores e ir
sintetizando las cadenas de ADN copia. Al final de esta etapa, se obtienen dos
molculas de ADN por cada molcula de ADN original de la muestra
Estas tres etapas forman un ciclo que se repite unas 30 veces. En cada nuevo ciclo, tanto
las cadenas de ADN original como las cadenas copiadas sirven como molde para la sntesis de
nuevas copias, de modo que el nmero de molculas de ADN se duplica en cada ciclo
(aumentando la cantidad de molculas de ADN de forma geomtrica).
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El resultado final es un gran
nmero de fragmentos de ADN
flanqueados por los cebadores, que se
obtienen en apenas unas horas (despus
de 30 ciclos, cada molcula de ADN
molde inicial se habr copiado ms de
1000 millones de veces).
Como los cebadores que se utilizarn n la reaccin son especficos para secuencias de
ADN presentes en el genoma de un parsito (cebadores especficos de especie), la PCR puede
utilizarse para detectar la presencia de ADN del parsito en cuestin en una muestra que
contenga tambin ADN que no sea del propio parsito (ADN del hospedador).
Los resultados de la PCR se analizan habitualmente mediante
la tcnica de electroforesis en gel de agarosa. En esta tcnica, la
aplicacin de un campo elctrico permite la separacin a travs
de un soporte slido (gel de agarosa) de molculas cargadas en
funcin de su tamao. Las molculas ms pequeas avanzarn ms
en el gel y las molculas ms grandes avanzarn menos. El ADN
tiene carga negativa y migrar desde el polo negativo hacia el polo
positivo. La separacin simultnea, en diferentes pocillos del gel,
de los productos de PCR y de un marcador de peso molecular con
fragmentos de ADN de tamao conocido, permite determinar el
tamao de los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR.
OBJETIVOS DE LA PRCTICA
Se utilizar la tcnica de Reaccin en Cadena de Polimerasa, o PCR, para diagnosticar
la presencia del protozoo parsito Perkinsus olseni en muestras procedentes de dos de sus
hospedadores habituales, la almeja fina (Tapes decussatus) y la almeja japonesa (Tapes
philippinarum).
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MATERIALES NECESARIOS
Agua ultrapura estril.
ADN de almejas (4 muestras), extrado individualmente de dos individuos sanos y
dos individuos afectados por el parsito.
Controles de la tcnica, control positivo (ADN de un animal fuertemente infectado
por el parsito), y control negativo (agua estril).
Tampn de PCR, 10x.
Mezcla de desoxirribonucletidos trifosfato (dNTPs), 10 mM cada uno.
Cebadores PK1 y PK2, 200 micromolar cada uno, especficos para amplificar un
fragmento del espaciador IGS de los genes ribosmicos del genoma de Perkinsus
olseni.
Enzima Taq polimerasa, 10U/L.
Microtubos estriles, 0,2 mL.
Gradilla para microtubos.
Micropipetas automticas, p2 (0,2-2 L), p10 (1-10 L), y p20 (2-20 L).
Puntas de pipeta estriles.
Termociclador.
Agarosa.
Tampn de electroforesis TAE, 1x.
Colorante SYBR-Safe, 10.000x.
Tampn para cargar muestras en gel de agarosa.
Marcador de peso molecular.
Matraz Erlenmeyer, 250 mL.
Balanza.
Microondas.
Cubeta de electroforesis.
Fuente de alimentacin.
Transiluminador.
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METODOLOGA
1. Preparar las reacciones de PCR, una reaccin para cada una de las muestras a
amplificar: 4 muestras de almejas, 1 control positivo y 1 control negativo.
2. Colocar los tubos en un termociclador, e incubar las reacciones de PCR utilizando un
programa adecuado para los cebadores empleados:
3. Mientras se lleva a cabo la reaccin de PCR, preparar el gel de agarosa.
4. Una vez finalizada la reaccin de PCR y polimerizado el gel, se lleva a cabo la
electroforesis de las muestras amplificadas mediante PCR.
DESARROLLO DE LA PRCTICA
1. En un microtubo de 0,2 ml se aaden los siguientes reactivos en el orden indicado para
cada muestra (muestras de 4 almejas, control positivo y control negativo), y un volumen
final de 25 l:
Agua ultrapura estril 16 l
Tampn de PCR (10x) 2,5 l
dNTPs (10 mM) 1 l
Cebador PK1 (200 M) 2 l
Cebador PK2 (200 M) 2 l
ADN 1 l
Taq polimerasa (10U/l)0,5 l
2. Colocar los tubos en un termociclador, e incubar las reacciones segn el siguiente
programa:
Desnaturalizacin inicial 94C 5 minutos
Desnaturalizacin 94C 30 seg.
Cebado 58C 30 seg. x 30 veces
Polimerizacin 72C 30 seg.
Polimerizacin final 72C 10 minutos
3. Mientras se lleva a cabo la reaccin de PCR, se prepara el gel de agarosa:
a. En un matraz de 250 ml aadir 40 ml de tampn TAE 1x y 0,4 g de agarosa, para
preparar un gel de agarosa al 1%.
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b. Calentar utilizando un microondas hasta que se funda la agarosa y dejar enfriar la
disolucin.
c. Mientras se deja enfriar la agarosa, preparar el molde en el que se dejar
polimerizar el gel, sellando los extremos y colocando un peine que labrar los
pocillos en los que se cargarn las muestras.
d. Cuando la temperatura de la disolucin de agarosa sea inferior a 60C, aadir 4 l
del colorante para ADN SYBR Safe (10.000x) y verter en el molde. El gel estar
preparado cuando adquiera una apariencia translcida.
e. Retirar el peine y dejar libres los extremos del gel. Colocarlo en la cubeta de
electroforesis y cubrirlo con tampn TAE 1x para llevar a cabo una electroforesis
en gel horizontal sumergida.
4. Una vez finalizada la reaccin de PCR y polimerizado el gel, se lleva a cabo la
electroforesis:
a. Aadir 5 l de tampn de carga a cada reaccin de PCR, mezclar con ayuda de
la micropipeta y cargar cada muestra en un pocillo del gel. Cargar en otro
pocillo 4 l de un marcador de peso molecular.
b. Conectar la cubeta de electroforesis a la fuente de alimentacin.
5. El resultado de la electroforesis se observa en un transiluminador. El tamao
esperado del fragmento de ADN del parsito amplificado mediante PCR es de
unos 500 pb.
CUESTIONARIO PARA LOS ALUMNOS
1. Qu criterios deben seguirse a la hora de disear cebadores para el diagnstico de una
enfermedad parasitaria a partir de ADN extrado de los hospedadores?
2. Se han utilizado los cebadores PK1 y PK2 para diagnosticar la presencia del parsito
Perkinsus olseni en tejidos procedentes de 29 almejas muestreadas en una zona de
cultivo de Huelva. Se muestra la fotografa de la electroforesis en gel de agarosa (C+=
control positivo y C-= control negativo).
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Describir los resultados obtenidos.
3. Al analizar los resultados de una PCR en gel de agarosa se observa un fragmento
de ADN del tamao esperado en todas las muestras ensayadas, incluido el
control negativo de la tcnica, tal y como puede verse en la fotografa. Qu
indicara este resultado?
Marcador peso
molecular
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Muestras:
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 C+ C-
1 2 3
800 pb
500 pb
500 pb
Marcador
peso
molecular
C- C+
Muestras:
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4. Sera posible diagnosticar la presencia de dos parsitos distintos en muestras de
un animal mediante una nica PCR? En caso afirmativo, describe brevemente
cmo podra hacerse.
