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Aportaciones del laboratorio en el diagnóstico y el tratamiento del
paciente intoxicado.
Dra. Ana María López Parra
Dpto. Toxicología y Legislación Sanitaria, Fac. MedicinaUniversidad Complutense de Madrid
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Esquema• Introducción.• Muestras.• Envasado, conservación y almacenamiento.• Análisis químico-toxicológico. • Métodos de extracción.• Detección e identificación del tóxico:
técnicas espectrofotométricastécnicas cromatográficastécnicas inmunoquímicas
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IntroducciIntroduccióónn
La investigación toxicológica es el conjunto de procesos analíticos que tienen por objeto el aislamiento, identificación y determinación cuantitativa de los tóxicos, tanto en el vivo como en el cadáver, con el fin de permitir el diagnóstico de la intoxicación.
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MuestrasMuestras• Contenido gástrico• Sangre• Orina• Pelo• Saliva• Meconio
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MuestrasMuestras
Contenido gástrico-Vómito, aspirado gástrico y lavados estomacales.-En el caso de los lavados estomacales, primer
lavado.-Un volumen de aproximadamente 20 ml.-Puede ser necesario procedimientos de
homogenización, filtración y/o centrifugación.-No representa grado de intoxicación.
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MuestrasMuestrasSangre-Es una de las muestras más útiles para la identificación y
especialmente para el análisis cuantitativo.-La sangre total y el plasma son las muestras más
representativas.-Recoger la muestra en tubos con heparina o EDTA como
anticoagulante. -Si se sospecha de intoxicación con etanol, utilizar fluoruro
sódico como conservante. Y la extracción deberáefectuarse desinfectando la zona con cloruro mercúrico.
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MuestrasMuestras
Orina-Ensayos preliminares en el screening de tóxicos.-Para drogas de abuso.-La concentración de un tóxico puede llegar a ser 100 veces mayor que en la sangre. -Se debe de tomar antes del tratamiento.-Como mínimo 50 ml.
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MuestrasMuestras
Pelo-Tóxicos minerales-Detección de drogas de abuso. -Refleja el estado promedio de los elementos minerales del organismo durante su crecimiento.
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MuestrasMuestrasSaliva.-Correlación de los análisis séricos con drogas de abuso y psicofármacos.
Meconio. -Meconio: líquido amniótico, moco, lanugo, bilis y células que se han desprendido de la piel y del tracto intestinal. -Identificación de drogas durante la gestación.
Drager DrugCheck™ Kit
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MuestrasMuestrasHígado
-Niveles de tóxicos superioresa los de la sangre.
-Especialmente útil cuando nose puede disponer de sangre.
-Evitar contaminación por bilis.-Evitar añadir conservantes.
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Envasado y conservaciEnvasado y conservacióónn
• Tapones PTFE (polytetrafluoroethylene)
• Conservantes:– Azida sódica (0,1%, p/v)– Fluoruro sódico (1%, p/v)
• Anticoagulante:- Heparina- EDTA- Oxalato potásico (0,5%, p/v).
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AlmacenamientoAlmacenamientoFactores que intervienen:
Temperatura
Descomposición biológica
Luz
Hidrólisis
Oxidación
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AnAnáálisis lisis ququíímicomico--toxicoltoxicolóógicogico
• 1. Separación o extracción del tóxico de la muestra.
• 2. Detección e identificación del tóxico.
• 3. Cuantificación.
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióónn
Desde el punto de vista analítico los tóxicos se dividen en:
– Tóxicos volátiles– Tóxicos gaseosos– Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles– Tóxicos inorgánicos o minerales
Finalidad:
Aislamiento y purificación del tóxicoConcentración del tóxico en el extracto obtenido
Parte de la muestra se reserva íntegra
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos volxicos voláátilestiles
• Aquellos que se volatilizan por debajo de los 100ºC, por lo cual son arrastrados por el vapor de agua cuando ésta destila (alcohol etílico, alcohol metílico, benceno, fenoles, ...).
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos volxicos voláátilestiles
Las técnicas son:
-Destilación simple.-Destilación fraccionada.-Destilación directa al vacío.-Destilación por arrastre en corriente de vapor.-Microdifusión.-Técnica de “espacio de cabeza” ("head space" ).
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DestilaciDestilacióón simplen simple
Muestraproblema
Tóxicovolátilextraído
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DestilaciDestilacióón fraccionadan fraccionada
Separación según puntos de ebullición
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MicrodifusiMicrodifusióónnAnálisis Muestra Agente
liberador Compartimento interior
Tiempo de difusión
Acetaldehído 3 ml de sangre 5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de SO3HNa 0,15M
3 horas
Acetona 3 ml de sangre 5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de SO3HNa 0,15M
3 horas
Monóxido de carbono
1 ml de sangre 1 ml de SO4H2 al 10%
2 ml de cloruro de paladio
1 hora
Cianuro 2-4 ml de sangre 5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de NaOH 0,1N
3 horas
Etanol 0,8 ml de sangre 4 ml de tejido
1 ml de CO3K2 al 10%
2 ml de dicromato potásico
3 horas
Formaldehído 3 ml de sangre 5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de SO3HNa 0,15M
3 horas
Hidrocarburos halogenados
1-4 ml de sangre 1-4 ml de tejido
- 1 ml de tolueno 3 horas
Isopropanol 2 ml de sangre 5 ml de tejido
1 ml de CO3K2 3,3 ml de SO4H2 al 10%
3 horas
Metanol 2 ml de sangre 5 ml de tejido
1 ml de CO3K2 3,3 ml de SO3HNa 0,15M
3 horas
Fenoles 2-4 ml de sangre 5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de NaOH 0,1N
3 horas
Sulfuro 2-4 ml de sangre 5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de NaOH 0,1N
3 horas
Camarade
Conway
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TTéécnica de espacio de cabezacnica de espacio de cabeza1. La muestra se deposita en un vial
cerrado con tapón perforable, en el que se deja una cámara de aire.
2. Se calienta a 60ºC durante 30 min.3. Se extrae con una jeringa para
gases una muestra de la parte superior del frasco para inyectarla en un cromatógrafo de gases.
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos gaseososxicos gaseosos
• Se denominan tóxicos gaseosos a todas aquellas sustancias que a temperatura ambiente se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo: CO, HCN, SH2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br2.
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos gaseososxicos gaseosos
• Las técnicas son: -La extracción de gases en sangre se basa en leyes físicas, según las cuales su solubilidad disminuye elevando la temperatura o disminuyendo la presión.-Mediante las mismas técnicas que para los tóxicos volátiles.
-Cromatografía de gases
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Cromatografía de gases (GC)
Técnica de separación. Se basa en la diferente velocidad con que se mueven los solutos a través de un medio poroso arrastrados por un disolvente en movimiento.
TTéécnicascnicas cromatogrcromatográáficasficasVolatilización
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CromatografCromatografíía de gasesa de gases
*Line Base *Altura del Pico*Pico Cromatográfico *Anchura del Pico*Base del Pico *Anchura del Pico a la mitad de la altura*Área del Pico
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Ventajas e inconvenientes• Costoso.• Personal especializado.• Técnica muy sensible, fiable y rentable para
determinaciones cualitativas (casi la totalidad de los tóxicos) y cuantitativas (límite de sensibilidad 1-5 µg/ml.) .
• Posibilidad de derivación (obtener un compuesto intermedio a partir de una sustancia no volátil) hace su aplicación prácticamente universal.
CromatografCromatografíía de gasesa de gases
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MMéétodos detodos de microextraccimicroextraccióónnen fase sen fase sóólidalida
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos
Sustancias orgánicas y no volátiles. Se incluyen:
*Tóxicos de origen vegetal (glucósidos, aceites esenciales, alcaloides, etc)
*Productos de síntesis (medicamentos).
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos
Las técnicas son: -Con disolvente polar (etanol): técnica de Stas-Otto.- Con disolventes apolar: los más frecuentes son: éter etílico, cloroformo y diclorometano. Puede ser:
*Directa: sólo aplicable a muestras biológicas limpias como la orina *Previa purificación de la muestra (eliminación de proteínas).
Fraccionamiento del extracto antes de su análisis:Debido a la gran variedad de tóxicos orgánicos conocidos es
necesario un fraccionamiento del extracto.
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos
Clasificación de tóxicos orgánicos en:
1. Ácidos: débiles (por ejemplo barbitúricos) o fuertes (por ejemplo salicilatos), unos y otros extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido.
2. Básicos: extraíbles con disolventes orgánicos en medio básico (alcaloides, antidepresivos tricíclicos, etc.)
3. Neutros: extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido o básico.
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos
Las técnicas son: -Método de electrodiálisis: se basa en la propiedad que tiene la corriente eléctrica de descomponer las sales de los tóxicos orgánicos, yendo la base hacia el polo negativo y el resto al polo positivo.-Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgánicas son absorbidas por la resina y luego son eluidos con solventes apropiados.
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Extracción en fase sólida
MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos minerales o xicos minerales o
inorginorgáánicosnicos
Estos tóxicos se encuentran en el organismo firmemente unidos a albúmina, lípidos o glúcidos, siendo requisito la destrucción de la materia orgánica para poder realizar su análisis.
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de tn de tóóxicos xicos minerales o inorgminerales o inorgáánicosnicos
1. Mineralización: proceso por el cual se produce la destrucción de la materia orgánica y la consiguiente liberación del tóxico.
a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica empleando ácido nítrico o mezclas de ác. nítrico-agua oxigenada, etc.b) Destrucción de materia orgánica por vía seca (calcinación).c) Formación de complejos y posteriormente se separa con disolventes orgánicos.
Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, para obtener una muestra más apropiada.
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MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de tn de tóóxicos xicos minerales o inorgminerales o inorgáánicosnicos
Existen métodos que no precisan la destrucción de la materia orgánica como:
*Diálisis.*Ultrafiltración.*Electrodiálisis.*Desproteinización.
2. Marcha posterior de extracción
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DetecciDeteccióón e identificacin e identificacióónndel tdel tóóxicoxico
Dos etapas:
1. Rastreo o detección rápida: -Técnicas de inmunoensayo-Cromatografía en capa fina
2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas.-Técnicas cromatográficas.
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TTéécnicascnicas inmunoensayo inmunoensayo
Fundamento:
Reacciones antígeno-anticuerpo.
Se aplica especialmente para drogas de abuso y psicofármacos.
Tóxico libre
TTóóxico marcadoxico marcado
+ AC Tóxico libre-AC
TTóóxico marcadoxico marcado
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TTéécnicascnicas inmunoensayo inmunoensayo
1. Radioinmunoensayo (RIA): isótopo radioactivo.
2. Enzimoinmunoensayo: enzima.-ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas-EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas
3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluoróforo.
4. Inmunoanálisis por interacción cinética de partículas (KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar agregados de micropartículas.
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TTéécnicascnicas inmunoensayo inmunoensayo
•Su aplicación es cualitativa y cuantitativa (con patrones de concentración).
•Técnicas rápidas, y sensibles.
•Posibilidad de reacciones cruzadas.
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TTéécnicascnicas cromatogrcromatográáficasficasCromatografía en capa fina (CCF)
Fase movil Fase estacionaria Aplicaciones Cloroformo/acetona 80:20
Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30 min/10 cm
Todos los tipos
Isopropanol/cloroformo Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30 min/10 cm
Barbitúricos
Cloroformo/acetona 90:10
Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30-45 min
Anticonvulsionantes Sedantes no babitúricos
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DetecciDeteccióón e identificacin e identificacióónndel tdel tóóxicoxico
2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas.-Técnicas cromatográficas.
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TTéécnicascnicas espectrofotomespectrofotoméétricastricas
Fundamento: capacidad que tienen las moléculas y los átomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda utilizando la energía de dichas radiaciones para producir cambios energéticos en su estructura (en los átomos transiciones electrónicas y en las moléculas movimientos electrónicos)
Aplicaciones Técnicas Compuestos Análisis
Espectrofotometría UV visible Orgánicos Cuali/cuantitativo Espectrofluorimetría Orgánicos Cuali/cuantitativo Espectrofotometría infrarroja Orgánicos Cualitativo Espectrofotometría de absorción atómica Metales Cuali/cuantitativo Espectrometría de masas Orgánicos Cualitativo
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EspectrofotometrEspectrofotometríía de absorcia de absorcióón n atatóómica (EAA)mica (EAA)
E*
E
Luzincidente Fluorescencia
emitida
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EspectrofotometrEspectrofotometríía de a de absorciabsorcióón atn atóómicamica
EspectrofotometrEspectrofotometríía de a de absorciabsorcióón atn atóómicamica
Sistemadetector
Lámpara de cátodo hueco Sistema
atomizadorSistema
monocromadorSistemadetector
La emisión de una energía electromagnética de longitud de onda determinada, se hace incidir sobre un átomo libre en estado fundamental, este átomo absorbe la energía y con lo que pasa a un estado excitado.
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Ventajas e inconvenientes• Costoso.• En la interpretación de resultados considerar:
contaminación en la toma y mantenimiento de las muestras, etc.
• Personal especializado.• Técnica muy sensible, fiable y rentable. Su
sensibilidad permite identificar y cuantificar metales en niveles de traza.
EspectrofotometrEspectrofotometríía de absorcia de absorcióón n atatóómicamica
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EspectrofotometrEspectrofotometríía dea de emsiemsióónnatatóómica (EEA)mica (EEA)
E*
E
Luz emitida
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EspectrofotometrEspectrofotometríía a de masas (EM)de masas (EM)
Técnica cualitativa y cuantitativa.Separa partículas moleculares o atómicas según su masa.
Volatilización
Ionización
2.Aceleracióniones
3. Separación
4. Detección
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EspectrofotometrEspectrofotometríía de masasa de masas
Técnica cualitativa y cuantitativa.Análisis de fragmentos moleculares. Determinación de la estructura molecular.Su principal aplicación es la identificación de sustancias desconocidas
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Ventajas e inconvenientes• Costoso.• Personal especializado.• Acoplamiento a GC (o HPLC): método
más efectivo para la identificación de tóxicos y sus metabolitos.
• ICP-MASAS
EspectrofotometrEspectrofotometríía de masasa de masas
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ICPICP--MasasMasas
ICP: Plasma deacoplamiento inducido
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TTéécnicascnicas cromatogrcromatográáficasficas
Cromatografía de líquidos
Cromatografía de gases
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TTéécnicascnicas cromatogrcromatográáficas ficas Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
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Ventajas e inconvenientes• Costoso.• Personal especializado.• No destruye la muestra, lo que permite la detección por
distintos sistemas en serie.• Requiere mínima preparación y pequeñas cantidades. • Mayor precisión que GC. En general se aplica a
compuestos de alto peso molecular y polar mientras que GLC se aplica a gases permanentes y sustancias volátiles.
• Mejor resolución y menor tiempo de análisis.
CromatografCromatografíía la lííquida de alta quida de alta resoluciresolucióón (HPLC)n (HPLC)
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Gracias por su atenciGracias por su atencióónn