Aproximación al Estudio

Diagnóstico Genético

PARTE 2

Dr. Esteban A. San Martín L.

Residente Genética Clínica

Universidad de Chile

CERPO

Centro de Referencia Perinatal Oriente

Facultad de Medicina, Universidad de Chile

Temario

• INTRODUCCIÓN

• FISH

• MLPA

• ARRAY CGH

• SECUENCIACIÓN DE SANGER

• SECUENCIACIÓN DE SIGUIENTE

GENERACIÓN

S. Down - citogenética

• Trisomía 21 libre 95%

47,XX,+ 21

• Trisomía por traslocación 3%

46,XX,der(14;21)(q10;q10),+21

65% de novo

46,XY, der(21;21)(q10;q10),+21

85% de novo

• Mosaico de trisomía 2%

47,XY,+21(10)/46XY(20)

46,XY, der(21;21)(q10;q10),+21 45,XY,der(21;21)(q10;q10)

Down S. De por translocación Padre portador balanceado de la translocación RIESGO DE TENER HIJOS DOWN =100%

Anomalías cromosómicas:

riesgo de recurrencia

Translocaciones robertsonianas:

Translocación Origen

materno paterno

t(14;21) 10-15% 2-5%

t(21;22) 10% 2%

t(21;21) 100% 100%

INTRODUCCIÓN

• Se ha visto que alteraciones

cromosómicas son responsables de

trastornos del desarrollo y

malformaciones

• Aunque el cariotipo ha sido el gold

standard:

– La resolución es limitada (5-10 Mb)

– Consume tiempo (producción y análisis)

– Requiere de gente muy entrenada Vermeesch et al. Hum Mutat 33: 906-15. 2012

Miller DT et al. Am J Hum Genet. 2010; 86:749-64

Caso Clínico • RN: E.A.C.B.

• F. Nac. : 20 – 04 – 2016

• Sexo: Femenino

• Edad Madre: 29

• Edad Padre: 29

• Embarazo controlado

• Exámenes control prenatal normales. VDRL y VIH (-)

• Eco 12 semanas:

– LCF (+)

– TN: 9.9 mm.

– Hueso nasal presente.

– Higroma quístico.

Caso Clínico

• Eco CERPO: – Gestación única, RCIU, OHA

– Tetralogía de Fallot

– Hipoplasia del hueso nasal

– Imagen de doble burbuja

– Quiste renal izquierdo

– Doppler fetal alterado

• Ecocardiografía prenatal informa: – Tetralogía de Fallot con Obs. DSVD tipo Fallot

– Cayado aórtico Derecho amplio

• Se ofrece Cariograma en L.A. y FISH para del

22q11.2

CONCEPTO

La hibridación in situ permite visualizar una secuencia de ADN o ARN justo en el sitio físico en el que se encuentra, permitiendo analizar su distribución en cromosomas, células y tejidos.

FUNDAMENTO

Se basa en la complementariedad de las bases que componen los ácidos nucleicos: G con C (ADN y ARN) y A con T (ADN), o U (ARN).

Se diseña una sonda marcada que hibride con la secuencia a detectar.

FISH

Este sistema permite estudiar la distribución in situ de una

determinada secuencia de interés:

Las que revelan la presencia de algún patógeno

Asociadas a enfermedades de origen genético

Las que se han asociado a desarrollo de ciertos tumores o las que se emplean como indicadores de alteraciones numéricas del conjunto de cromosomas de un individuo

FISH en núcleo interfásico

• Detección de mosaicos

• Detección de: trisomía,

traslocación críptica

• Detección de

microdeleciones

• Detección de

traslocaciones en

leucemias y tumores

• Diagnóstico Prenatal

FISH

Indicaciones de FISH

• Tejidos extraídos, células en cultivo, tejidos

fijados, células embebidas en parafina

• Indicaciones:

• Ayuda en estudios citogenéticos

• Fenotipo sugerente de una microdeleción

• Descartar mosaicismo si el fenotipo es

característico de un síndrome conocido

• Identificación de una aberración

cromosómica críptica

Indicaciones de FISH

Indicaciones:

• Descartar anomalías cromosómicas numéricas

en estudios prenatales cuando el ultrasonido

revela alteraciones específicas o tamizaje en

embarazos de alto riesgo para no disyunción

cromosómica

• Oncología: linfocitos periféricos, médula ósea,

ganglios, tumores sólidos, efusiones pleural,

ascitis,..

Indicaciones: diagnóstico y seguimiento de la

enfermedad

Diagnóstico: S.Turner

Cariotipo: mos 45,X/ 46,X,+mar

Síndrome Prader Willi/ Angelman

Síndrome Miller-Dieker

15p11.2 Green 15q11-q13 Orange

15q22 Orange

17p13.3 Orange

17q21.1 Green

Normal Deletado

Síndrome Di George/VCF

Blefarofimosis, hipoplasia discos ópticos,

coloboma, cataratas, cardiopatia

22q11.2 TUPLE 1

Orange

22q13 ARSA

Green

Normal Deletado

¿Y SI EL ESTUDIO HUBIESE

RESULTADO NEGATIVO?

Array CGH

• El uso del aCGH supera limitaciones

del cariograma:

– Sólo requiere ADN

– Análisis hasta en menos de 5 días

– Mayor resolución (hasta 0.5Kb o 500 pb)

– Mayor grado de automatización

– Actualmente es primer examen a pedir

para estudio de RDSM, DI y TEAs

Vermeesch et al. Hum Mutat 33: 906-15.

2012

Miller DT et al. Am J Hum Genet. 2010;

86:749-64

aCGH

• La hibridación genómica comparativa permite un análisis

exhaustivo de múltiples ganancias y pérdidas de ADN en

genomas enteros dentro de un solo experimento

• El ADN genómico del tejido a investigar, y el ADN normal de

referencia están marcados diferencialmente y, simultáneamente,

se hibridan.

• Mediante la comparación de las intensidades de fluorescencia de

ADN de prueba y control, los cambios en la intensidad de la señal

causadas por desequilibrios se pueden identificar.

• Los métodos anteriores son altamente limitados y apuntan a un

gen específico o una región cromosómica a la vez y dejan a la

mayoría del genoma sin examinar. La ventaja del aCGH la da su

inespecificidad.

Array CGH

Microarreglos (Microarray, Array)

• Experimento que se basa en la síntesis o fijación de moléculas (o sondas) sobre un sustrato sólido de manera ordenada, y que se expone a moléculas diana que se quieren estudiar

• Tamaño de sondas de ADN pueden variar de 25pb a cientos Kb

Theisen A. Nature Education 2008; 1(1)

Agilent Technologies

Utilidad Clínica

• Usos:

– Neoplasias, especialmente

hematológicas

– Diagnóstico Genético Preimplantacional

– Diagnóstico prenatal de Malformaciones

Congénitas

Methods Mol Biol. 2013;973:1-13

Clin Lab Med 31 (2011) 581–594

1.- Pre-tratamiento (en caso de ser necesario)

Neutralización

Tratamiento con solventes orgánicos

2.- Lisis celular

Disrupción mecánica

Agentes químicos

3.- Purificación de ADN Precipitación

Matrices (kits comerciales)

Método de extracción de ADN

¿Y SI EL ESTUDIO HUBIESE

SEGUIDO RESULTADO

NEGATIVO?

PCR

• La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por

sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica

de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis.1 Su

objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento

de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir

de una única copia de ese fragmento original, o molde.

• Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad

es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con

una muy alta probabilidad, virus o bacteriasntes de

una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o ADN

amplificado.

¿Qué Necesitamos?

1. Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo

ADN.

2. Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada

uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de

entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de dieciocho a veintidós, que

permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar enfrentados y no a mucha

distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los

nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

3. Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente

como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. También se puede

emplear manganeso (Mn2+). Actúan como cofactores de la polimerasa.

4. Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento

de la ADN polimerasa.

5. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima

alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).

6. ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

7. Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las

etapas que conforman un ciclo.

https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU

MLPA • Es una variación de la reacción en

cadena de la polimerasa múltiple que permite la amplificación de blancos múltiples con un solo par de cebadores.

• Cada sonda consta de dos oligonucleótidos que reconocen sitios diana adyacentes en el ADN. Un oligonucleótido sonda contiene la secuencia reconocida por el cebador directo, el otro contiene la secuencia reconocida por el cebador inverso. Sólo cuando ambos oligonucleótidos de sonda se hibridan a sus respectivos objetivos, pueden ser ligados en una sonda completa.

MLPA

La ventaja de la división de la sonda en dos partes es que sólo los oligonucleótidos ligados, pero no los oligonucleótidos sonda no unida, se amplifican. El producto de amplificación dependerá del número de sitios diana presente en la muestra DNA.

Cada sonda completa tiene una longitud única, de modo que sus amplicones resultantes se pueden separar y se identificaron por electroforesis (capilar.

Debido a que el cebador directo usado para la amplificación sonda está marcada con fluorescencia, cada uno de amplificación genera un pico de fluorescencia que puede ser detectada por un secuenciador capilar.

Comparando el patrón de pico obtenido en una muestra dada con el obtenido en varias muestras de referencia, la cantidad relativa de cada amplicón se puede determinar. Esta relación es una medida de la proporción en la que la secuencia diana está presente en la muestra de ADN.

MLPA Actualmente se encuentra disponible el estudio con MLPA para el Sd. De

DiGeorge

Tiene un costo similar

Tiene mayor sensibilidad con respecto al FISH

Entrega información sobre el segmento deletado

Casos Clínicos

• Eco CERPO 1: – Gestación única, RCIU, OHA

– Estenosis pulmonar

– Hipoplasia del hueso nasal

– Quiste renal izquierdo

– Doppler fetal alterado

• Eco CERPO 2: – Gestación única, RCIU

– Encefalocele occipital

– Polidactilia en 4 extremidades

– Riñones displasicos

NGS • El desarrollo en los últimos años de las

denominadas tecnologías de secuenciación

masiva permite actualmente obtener millones

de secuencias de ADN a una velocidad sin

precedentes y a un coste cada vez más

reducido.

• Estas tecnologías están permitiendo la

consecución de logros científicos

trascendentales, con la identificación de nuevos

genes y la resolución de las bases genéticas de

enfermedades mendelianas a la cabeza.

• Su potencial ha permitido el desarrollo de

nuevas aplicaciones y pruebas biológicas que

van a revolucionar, en un futuro próximo, el

diagnóstico postnatal y prenatal de

enfermedades genéticas.

CONCLUSIONES

En los últimos años se han producido grandes avances tecnológicos que permiten el uso de nuevas herramientas de estudio molecular para múltiples enfermedades genéticas.

Cada vez existen más compañías que ofrecen servicios de estudio genético con costos más accesibles.

Todas estas tecnologías pueden ser aplicadas en el periodo prenatal.

En Chile existen iniciativas que están buscando la implementación de estas técnicas a nivel nacional.

Su complejidad radica en la interpretación de la información obtenida, y las implicancias que esta pueda tener para el paciente y su familia, siendo necesaria la formación de equipos multidisciplinarios.

Reunión CERPO

Gracias