apuntes

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Los productos recombinantes son expresados usualmente en microorganismos, principalmente bacterias y levaduras para alcanzar altos rendimientos debido la alta velocidad de crecimiento de estos. Saccharomyces cerevisiae, la levadura de “panaderos o de fabricantes de cerveza”, está en la lista de microorganismos “Generalmente Reconocidos Como Seguros” ya que carece de endotoxinas detectables y por su largo historial de uso en alimentos y farmacéuticos. Este es un microorganismo clave en laboratorio e industria ya que puede sintetizar una variedad de proteínas fúngicas y mamíferas que pueden ser problemáticas al producirlas en bacterias. Al contrario de sistemas huésped bacterianos, S. cerevisiae es más tolerante a bajos pH, altas concentraciones de azúcar y etanol, y altas presiones osmóticas, lo cual la hace adecuada para fermentaciones industriales. Finalmente, la expresión en levaduras puede permitir una liberación extracelular natural de proteínas por un sistema de secreción que es similar a eucariotas superiores, lo que hace que estos productos biológicamente activos secretados sean más fáciles de recuperar que los producidos por bacterias recombinantes. Además, el nivel de las proteínas endógenas secretadas es sólo de un 0,5%-1,0%; por lo tanto, la purificación y recuperación de la proteína deseada es más simplificada. ------------ La utilización de varias fuentes de carbono por la levadura Saccharomyces cerevisiae requiere un complejo patrón de regulación de genes. En general, los genes necesarios para la utilización de una cierta fuente de carbono son reprimidos cuando un sustrato más favorable está disponible. Desde que los sustratos fermentables tales como glucosa son metabolizados más fácilmente que los azucares alternativos (galactosa), se puede observar una jerarquía de fuentes de carbono utilizadas con éxito. ---- Esta levadura puede crecer en galactosa como única fuente de carbono. La galactosa es transportada a la célula por una galactosa permeasa y es convertida a glucosa-1-fosfato por la acción secuencial de tres enzimas, galactoquinasa, a-D-galactosa-1-fosfato uridil-transferasa, y uridina difosfoglucosa-4-epimerasa. ------- Sin embargo la acción de estas tres enzimas es reprimida al crecer la levadura en glucosa.

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Los productos recombinantes son expresados usualmente en microorganismos, principalmente bacterias y levaduras para alcanzar altos rendimientos debido la alta velocidad de crecimiento de estos.

Saccharomyces cerevisiae, la levadura de panaderos o de fabricantes de cerveza, est en la lista de microorganismos Generalmente Reconocidos Como Seguros ya que carece de endotoxinas detectables y por su largo historial de uso en alimentos y farmacuticos.

Este es un microorganismo clave en laboratorio e industria ya que puede sintetizar una variedad de protenas fngicas y mamferas que pueden ser problemticas al producirlas en bacterias.

Al contrario de sistemas husped bacterianos, S. cerevisiae es ms tolerante a bajos pH, altas concentraciones de azcar y etanol, y altas presiones osmticas, lo cual la hace adecuada para fermentaciones industriales.

Finalmente, la expresin en levaduras puede permitir una liberacin extracelular natural de protenas por un sistema de secrecin que es similar a eucariotas superiores, lo que hace que estos productos biolgicamente activos secretados sean ms fciles de recuperar que los producidos por bacterias recombinantes. Adems, el nivel de las protenas endgenas secretadas es slo de un 0,5%-1,0%; por lo tanto, la purificacin y recuperacin de la protena deseada es ms simplificada.------------La utilizacin de varias fuentes de carbono por la levadura Saccharomyces cerevisiae requiere un complejo patrn de regulacin de genes. En general, los genes necesarios para la utilizacin de una cierta fuente de carbono son reprimidos cuando un sustrato ms favorable est disponible.

Desde que los sustratos fermentables tales como glucosa son metabolizados ms fcilmente que los azucares alternativos (galactosa), se puede observar una jerarqua de fuentes de carbono utilizadas con xito.----Esta levadura puede crecer en galactosa como nica fuente de carbono. La galactosa es transportada a la clula por una galactosa permeasa y es convertida a glucosa-1-fosfato por la accin secuencial de tres enzimas, galactoquinasa, a-D-galactosa-1-fosfato uridil-transferasa, y uridina difosfoglucosa-4-epimerasa.-------

Sin embargo la accin de estas tres enzimas es reprimida al crecer la levadura en glucosa.Si las levaduras se dejan creciendo en glucosa y luego son cambiadas a galactosa, GAL1, GAL7, y GAL10 se inducen coordinadamente hasta 1000 veces al nivel de la transcripcin.---Las bases para la induccin por galactosa han sido descritas antes de la represin (Figura 1):

1. La protena GAL2 permite entrada de galactosa a levadura.

2. GAL4p se une a los promotores del gen GAL y activan la transcripcin.

3. GAL80p inhibe la habilidad de la GAL4p de activar la transcripcin al unirse a su dominio de activacion transcripcional (UAS).

4. Un inductor producido desde galactosa, junto a GAL3p, inhiben la funcion del GAL80p.

Las bases para la represin de la expresin de genes GAL por glucosa se volvieron claras ms tarde. El crecimiento en glucosa inhibe la funcin del Gal4p en tres vas distintas (Figura 1).

Primero, la glucosa reduce el nivel de inductor funcional en la clula por:

(i) reprimir la transcripcin de la galactosa permeasa codificada por GAL2,

(ii) inactivar las molculas de permeasa preexistentes (posiblemente por protelisis), y

(iii) reprimir la transcripcin de GAL3. La reduccin resultante en los niveles del inductor funcional reduce la funcin de Gal4p al incrementar la actividad del Gal80p.

Segundo, el crecimiento en glucosa causa que la protena Mig1 reprima la expresin de GAL4. Los bajos niveles de Gal4p resultantes llevan a una menor transcripcin de genes GAL.

Tercero, a travs de una secuencia de represin corriente-arriba (URS, upstream repression sequence) en el promotor GAL1 media la inhibicin de la funcin de Gal4p, nuevamente va el represor Mig1p.

Estos tres mecanismos juntos son responsables de la represin ms de 1000 veces de la expresin del gen GAL durante el crecimiento en glucosa.