Apuntes de Laboratorios – Microbiología

Laboratorio 1. Tinciones

Tipos

Simples: utilización de un solo tinte con el cual podemos evaluar solamente la morfología.

Compuestas ó especiales: constituidas por 2 ó más tintes o reactivos y sirven para

clasificar las bacterias u observar sus características especiales.

Positivas: se observa teñida la célula sobre un fondo claro.

Negativas: El fondo se tiñe de oscuro para observar la célula o estructuras refringentes.

Tinciones compuestas.

Tinción de Gram

Principio: Composición de la pared celular de las bacterias, las bacterias G+ está compuesta por

varias capas de peptidoglicanos, las bacterias G- tienen una membrana externa con un

componente estructural único que son los lipopolisacáridos.

Las bacterias G+ retienen el cristal-violeta después de la decoloración y aparecen de color azul

intenso (purpura), las bacterias G- no son capaces de retener el cristal-violeta después de la

decoloración y son teñidas de rojo con safranina.

Pasos:

1) Preparar la extensión del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, y con un asa

bacteriológica colocar una pequeña cantidad de la colonia bacteriana.

a. Muestra solida: colocar solución salina previamente a colocar la colonia, igual en

muestra semisólida.

b. Muestra liquida: colocar la colonia directamente.

2) Dejar secar al aire, luego fijar la preparación

pasando la placa rápidamente por el mechero (2 ó

3 veces)

3) Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos

(Colorante primario), enjugar con agua

seguidamente.

4) Agregar yodo gram durante 40 a 60 segundos

(mordente), enjuagar con agua seguidamente

5) Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua

inmediatamente (decoloración, disuelve lípidos de

la pared de G- )

6) Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar

con agua seguidamente.

*Mordente: compuesto químico intensificador de color.

Tinción de Moeller (esporas)

Se suspende una bacteria del genero Bacillus,

evidencia capsula incolora en un contraste

morado.

1) Se prepara el extendido de la muestra

2) Se deja secar y se fija con calor

3) Se tiñe con carbol-fuschina hasta llenar

por completo el portaobjetos

4) Pase un mechero por debajo de la placa

calentando hasta que vea que se emiten

vapores y sin dejar que hierva por 3

minutos. Si la placa se va secando, ir

agregando mas tinte hasta cumplir el

tiempo. (Se calienta el tinte para que

penetre la espora que contiene

dipecolinato de calcio)

5) Se enjuaga con agua y se coloca acido

sulfúrico al 1% por 2 minutos (decolorante para retirar el carbol-fuchina)

6) Se enjuaga con agua y se tiñe finalmente con azul de metileno por 1 minuto

7) Dejar secar

Tinción de Anthony (cápsula)

Es una tinción negativa en donde vemos la cápsula no teñida sobre un fondo morado y se visualiza

la bacteria en el centro de la cápsula, esta pude ser de glicoproteínas o polisacáridos.

1) Colocar leche descremada al 20% o leche litmus en un extremo del portaobjetos

2) Agregar la muestra de bacteria en la leche del borde

3) Realizar un extendido con la ayuda de

otro portaobjetos

4) Se deja secar al aire (no se fija con calor

ya que la leche se pega al portaobjetos)

5) Teñir por 2 minutos con violeta-cristal.

6) Lavar con sulfato de cobre.

7) Se deja secar al aire.

Laboratorio 2. Cultivo de Bacterias y morfología colonial.

Medios de cultivo, según composición química:

Nutritivos: puede crecer cualquier bacteria, ej.: BHI

Selectivo: solo crecen determinadas bacterias, ej.: McConkey (solo bacterias G-)

Son inhibidores de G+, contienen sales biliares y violeta-cristal

Diferencial: ej: McConkey(bacterias fermentadoras y no fermentadoras)

Contienen rojo neutro que indica cambios de pH, G- fermentadores se tiñen de rosado, los

G- NO fermentadores son transparentes.

Enriquecidos: agregados nutrientes extras ej: agar sangre(agregamos sangre)

Medios de cultivo, según composición física:

Sólidos ej.: agar

Líquidos ej.: caldo

Semisólidos: consistencia gelatinosasolo se inocula con aguja sembrando en el fondo

entrando y saliendo en línea recta, verifican motilidad, ej.: SIM

Medios de cultivo, según aspecto físico:

Inclinado: Se usa una aguja o asa bacteriológica y se hace un estriado en el plano

inclinado(pico de flauta)

Profundo e inclinado: Se usa solo una aguja bacteriológica, se inserta hasta el fondo y al

sacarle se hace un estriado sobre el plano inclinado ej.: TSI

Como Cultivar:

1) Usar un asa bacteriológica

2) Tomar el plato con agar y proceder a poner la cantidad de colonia en un extremo y estrié

hasta la mitad del plato, incinerar el asa

3) Tomar la última porción del primer estriado y continuar con estrías mas separadas hasta

cubrir un cuarto del plato, incinerar el asa

4) Tome la última porción del segundo estriado y continúe con el último cuarto del plato

haciendo estrías mas separadas, incinere el asa antes de guardar.

Evaluación de las colonias:

Tamaño: pequeña (1-5mm), mediana (5-8mm), grande (mayor de 8mm)

Se aíslan colonias en un tejido

para ver las morfologías

individuales.

Laboratorio 3. Efectos de los agentes físicos y químicos sobre las bacterias

Antiséptico: sustancia que elimina bacterias sobre personas

Asepsia: proceso diseñado para evitar que los microorganismos lleguen a un ambiente protegido

Desinfectante: sustancia que elimina bacterias inhibiendo su crecimiento, usado sobre

superficies inertes

Desinfección: empleo de agentes químicos para destruir microorganismos patógenos con eficacia

variable.

Esterilización: destrucción de toda forma viviente

Pasteurización: utilización del calor para matar las formas vegetativas de las bacterias.

Métodos de desinfección físicos:

Autoclave: el calor húmedo permite la desnaturalización rápida de proteínas y se utilizan

parámetros de presión (15 lb), temperatura (121°) y tiempo de exposición (15 minutos).

Horno: el calor seco requiere de una temperatura de 160° y de 2 horas de exposición.

Rayos UV: requiere de exposición directa, produce la perdida de la capacidad para

replicarse, tiempo de 10 a 15 minutos, tiene poco poder de penetración.

Filtración: usado para líquidos, agentes más pequeños que los poros logran atravesar.

Métodos de desinfección químicos:

Los alcoholes actúan desnaturalizando las proteínas, disolviendo las capas lipídicas y como

agentes deshidratantes. Lesionan la membrana celular de los microorganismos y

desnaturalizan proteínas celulares. Desorganizan la estructura fosfolipídica. No destruyen

esporas y tienen una acción germicida lenta.

Fenol y compuestos fenólicos son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana

citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. Esto causa

filtración de compuestos celulares, inactivación de enzimas y lisis.

Cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y

ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos,

indoles y al hidroxifenol de la tirosina.

Antisépticos: peróxido de hidrogeno, yodofóro

Características del desinfectante ideal:

Actividad antimicrobiana a baja concentración

Solubilidad

No ser tóxico para personas y animales

No combinarse con materia orgánica extraña

Actividad a temperatura ambiente o del cuerpo

Capacidad de penetración

No ser corrosivo ni teñir

Poder desodorante

Disponible y barato

Pruebas de sensibilidad (antibiogramas)

Se usa el agar Mueller Hinton, es un agar nutritivo, porque esta estandarizado y el antibiótico

difunde sin ningún problema.

Difusión en plato ó método de Kirby-Bauer

Colocar una pequeña cantidad del cultivo en solución salina y llevar la turbidez

hasta hacerla equivaler con el tuve 0.5 de la escala de McFarland (1.5 x 108

UFC/ml) (contiene acido sulfúrico y cloruro de bario, la función de esta escala es la

estandarización del inoculo)

Sembrar en agar Mueller-Hinton (baja concentración de iones divalentes. Medio

recomendado por la NCCLS, no contiene timina o timidina, profundidad en el orden

de 4 mm., pH: 7.2 y 7.4)

Usar hisopo esteril impregnado de la suspensión anterior y difuminar varias veces

incluso por los bordes.

Colocar discos de antibióticos, alejados unos de otros

Incubar a 37° por 24 horas. Se leen los halos de inhibición midiendo el diámetro y

se comparan con las tablas disponibles.

A mayor efecto de antibiótico, mayor halo de inhibición

E-Test (epsilon test): Técnica que combina los métodos de difusión en agar y dilución para

determinar la CIM. La sistemática es similar al método de difusión en agar pero en lugar

de discos utiliza tiras de E-test.

Estas tiras contienen un gradiente del antimicrobiano en la superficie inferior que

difunde en el agar estableciendo un gradiente continuo del mismo a lo largo de la tira.

Después de la incubación se forma una zona elíptica de inhibición del crecimiento y la CMI

corresponde con el punto donde el área de inhibición del crecimiento intersecciona con la

tira.

CIM (concentración inhibitoria mínima): menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir

el desarrollo de una cepa bacteriana dada.

CBM (concentración bactericida mínima): menor concentración de antimicrobiano capaz de

destruir una cepa bacteriana dada.

Laboratorio 4. Flora Normal y del ambiente.

Se conoce como la Flora Indígena, es una colección de organismos que se encuentra

habitualmente en el individuo sano normal y que coexisten en forma comensal. Conformada por: hongos, bacterias y parasitos. La colonización del cuerpo humano empieza en el

nacimiento, se adquiere a través de la leche materna. La flora normal microbiana en humanos

está confinada especialmente a la piel y las mucosas

División del cuerpo en áreas (según presencia o ausencia de F. Normal):

• Libres de agentes o estériles

– L.C.R, tejidos, órganos, zonal pleural, pericardio

• Posibles presencias

– Sangre, liquido linfáticos, orina

• Altamente pobladas

– Piel, boca, nariz, conjuntiva, faringe, intestinos delgado, Int. grueso, regiones

urinarias y anales.

Tipos de Flora normal

• La Flora basal: Son agentes que están siempre presente en un sector.

– S. epidermidis: en la piel

– E. coli : en el intestino

• La Flora transitoria: Son agentes que colonizan de forma intermitente un determinado

sector.

– S. aureus – Enterobacterias y Acinetobacter en axilas e ingle.

Importancia de la Flora normal:

• Es una barrera biológica contra la

colonización de agentes patógenos.

• Contribuye a la respuesta inmune:

– aumenta la producción de

anticuerpos e interferones

– estimula la fagocitosis.

• Producción de bactericidas

– bacteriocinas, colicinas (M.

sec. y baja O2).

• Consumo de compuestos esenciales

• Producción de vitaminas (K, B)

La vaginosis bacteriana es una infección cervicovaginal muy común dentro de la consulta

ginecológica. Se caracteriza principalmente por un incremento del fluido vaginal, lo cual origina

malestar en las pacientes. En esta patología se ha observado un aumento importante en la

concentración de microorganismos, sustancialmente de Gardenerella vaginalis y los anaerobios

presentes en la vagina. Se conoce también con el nombre de vaginitis no específica, nombrada así

por los médicos que al no encontrar ni tricomonas ni levaduras. Otros sinónimos son vaginitis

anaeróbica o vaginosis anaeróbica.

Localización Ejemplos

Piel (zonas de piel con mas flora: cuero

cabelludo, cara, oído, axila, región urinaria y

anal, plantas y espacios interdigitales de los

pies)

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus aureus Streptococcus

Boca Streptococcus mitis Streptococcus mutans

Streptococcus sanguis Streptococcus salivarus

Vagina (pre-pubertad) Staphylococcus Streptococcus

Difteroides Echerichia Coli

Vagina (post-pubertad, pH 4-4.5) Lactobacillus o lactobacilos Donderlein Candida albicans

Thichomona vaginalis (pH 5.5)

Nariz Staphylococcus aureus(20% población)

Staphylococcus epidermidis Micrococcus

Streptococcus

Difteroides Intestino Grueso Bacteroides sp

Fusobacterium sp Enterococo faecalis

Enterobacterias (E. Coli, Klebsiella sp, Salmonellas) Lactobacillus

Pseudomonas

Eubacterias Bifidobacterias

UCF=

IC=

IC= Índice de contaminación

IC menor que 1 es bueno, IC de 1 a 3 es regular, IC mayor de 3 es malo.

Laboratorio 5. Cocos Gram + de importancia medica

Prueba de Catalasa (peróxido de hidrogeno)

Observa un burbujeo es +

No se observa burbujeo es –

Prueba de Coagulasa (Staph Plus)

Si se observa un coagulo es coagulasa +

No se observa coagulo es coagulasa –

Prueba de manitol-sal (indicador rojo fenol)

Color amarillo +

Color rojo ó rosa –

Prueba de Biliesculina

Color negro oscuro +

Color verde oliva -

Prueba de CAMP

La interacción del factor CAMP de Streptococcus agalactiae con β-lisinas de Staphylococcus aureus potencia la hemolisis de S. agalactiae formando la zona de hemolisis en forma de flecha.

El desconocido se siembra perpendicular al S. aureus si es S. agalactiae se formara la flecha.

Clasificación de Lancefiel, Rebeca Lancefield, basada en los carbohidratos de la pared celular

(antígenos de membrana), Grupos A-G

Clasificación por hemolisis en agar sangre:

Alpha-color verde

Beta-Transparente

Gamma-Nada

Laboratorio 9. Microbiología de aguas y alimentos

Enfermedades de transmisión alimentaria (ETA) pueden darse por el consumo de sustancias

toxicas o microorganismos patógenos.

Tipos de contaminación

Física ej.: pedazos de vidrio

Química ej.: insecticidas

Microbiana ej.: virus, bacterias, hongos

Como suceden:

Enfriamiento inadecuado (principal causa de ETA)

Calentamiento o recalentamiento a T° inadecuadas que no eliminan las bacterias

Agregan ingredientes crudos o contaminados a los alimentos

Mala higiene

Descomposición y almacenamiento (descongelar y volver a congelar)

Contaminación cruzada (alimentos crudos contaminan a los listos para comer)

Ingerir alimentos de alto riesgo (muy manipulados, crudos)

Requerimientos de producción de bacterias en alimentos: Humedad, nutrientes, tiempo, pH,

temperatura

Laboratorio 10. Bacilos Gram -: fermentadores y no fermentadores

Características relevantes:

Amplia distribución en el tracto gastrointestinal (TGI)

Reducción de nitratos

Fermentadores de glucosa (excepto Pseudomona sp)

Citocromo oxidasa negativo (excepto Pseudomona sp)

Medios de cultivo

EMB (Eosina azul de metileno)

Este medio es selectivo y diferencial para el aislamiento de bacilos entéricos que permite una

diferenciación entre las colonias de microorganismos fermentadores de lactosa y aquellos que no

la fermentan. La presencia de sacarosa permite para ciertos miembros del grupo coliforme,

fermentarla con más facilidad que a la lactosa. Las colonias lactosa positivas son verdes con

brillo metálico o poseen centros oscuros con periferias transparentes incoloras. Mientras que

aquellas que son negativas en lactosa o sacarosa son rosa pálido translucidas.

McConkey

La inhibición de los microorganismos Gram positivos se obtiene mediante la mezcla de sales

biliares y cristal violeta. La acción diferencial del medio se basa en la fermentación de la lactosa.

Esta fermentación baja el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando

colonias rosa intenso con halo de inhibición precipitación. Los microorganismos no fermentadores

de la lactosa dan colonias de color ámbar o transparentes.

Salmonella-Shigela (SS)

La inhibición de microorganismos Gram positivos se debe a su contenido de sales

biliares, verde brillante y citratos. La diferenciación de los microorganismos

entéricos se logra por la incorporación de lactosa en el medio. Los microorganismos

que fermentan la lactosa producen ácido, el cual al reaccionar con el indicador rojo

neutro, forma colonias de color rojo. Los microorganismos no fermentadores de

lactosa forman colonias incoloras. Este último grupo contiene la mayoría de los

microorganismos patógenos intestinales incluyendo Salmonella y Shigella. El

tiosulfato de sodio y el citrato férrico, facilitan la detección de sulfuro de

hidrógeno, manifestándose por colonias con centros negros.

Pruebas Bioquímicas

Citrato: para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única

fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su

metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias

estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella,

Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia,

Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos

nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio

contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de

nitrógeno respectivamente y azul

de bromotimol como indicador de

pH. Sólo las bacterias capaces de

metabolizar el citrato podrán

multiplicarse en este medio y

liberarán iones amonio lo que, junto

con la eliminación del citrato

(ácido), generará una fuerte

basificación del medio que será

aparente por un cambio de color del

indicador de pH, de verde a azul.

TSI (triple azúcar hierro): es un medio nutriente y diferencial que permite

estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y

lactosa en un único medio. También permite la detección de la producción de H2S.

Sirve para la identificación de enterobacterias según la fermentación de tres

azúcares (lactosa[10 g/l], sacarosa[10 g/l] y dextrosa[1 g/l, se va al fondo]) y

producción de sulfhídrico. El sulfato férrico sirve como indicador y el rojo fenol

como indicador del pH.

Pico alcalino/fondo alcalino K/K

No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no

fermentadoras como Pseudomonas sp.

Pico alcalino/fondo ácido K/A

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo negro K/A H2S+

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de

ácido sulfhídrico. Salmonella spp.

Pico ácido/fondo ácido A/A

Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli A/A H2S +

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej.

A/AgH2S-.

*NUNCA va a haber A/K

Urea: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos

moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es

característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para

diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo

retardado. La urea será

degradada por aquellos

microorganismos capaces de

producir el enzima ureasa

produciendo amoniaco que

hará variar el color del

indicador de amarillo a rojo.

Se cultiva el microorganismo

en slant en agar urea de

Christensen. El indicador es

el rojo fenol.

MR-VP (Rojo metilo_Voges-Proskauer): estas dos pruebas forman parte del

IMVIC de las colimetrías y permiten la diferenciación dentro de las

enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Se cultiva el microorganismo en caldo

RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días

como mínimo y 5 como máximo.

Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución

indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la

coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece

amarillo.

Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:

0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico

absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso.

0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el

aspecto lechoso y se agita fuertemente.

Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-

violáceo, más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo.

Si la prueba es negativa no aparece coloración alguna.

SIM: se mide la producción de sulfuro, la producción de

indol (con revelador) y la movilidad de la bacteria. Se pulla

el agar en tubo hasta el fondo sin mover. Si el tubo sale

turbio hay movilidad (caminito es -), si queda negro hay

producción de sulfuro y si tiene un anillo rojo arriba hay

producción de indol. Ni B. magaterium ni B. subtillis son

móviles (-).

Fenilalanina: determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido

fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina

desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es

característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por

lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias. Se cultiva el

microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con

abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml

(3 gotas) de una solución de cloruro férrico (FeCl3) al 10% de manera que inunde

todo el crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se

manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-

azulado.