ASIGNATURA: GENÓMICA PRÁCTICA: PCR CUANTITATIVA · 2018-10-17 · PCR CONVENCIONAL . REPETIR...
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Inespecíficos Sybr Green, Sybr gold
Específicos sondas Taqman, Beacon
CLASES DE MARCADORES FLUORESCENTES
TIPOS DE PCR CUANTITATIVA: ABSOLUTA Y RELATIVA
Cuantificación absoluta: se utiliza para conocer el número exacto de copias amplificadas del blanco o la concentración precisa de ácidos nucléicos en una muestra. Ej. Medir la carga viral o bacteriana de una muestra. Cuantificación relativa: se utiliza para evaluar los cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos. Estos cambios se basan en los niveles de ARNm del gen blanco con un gen de referencia (housekeeping), que no cambia su expresión a pesar de que los estados fisiológicos se modifiquen por diversas causas.
TIPOS DE PCR CUANTITATIVA: RELATIVA
UMBRAL
C C C C C C
El Ct es el ciclo de PCR en el que los valores de fluorescencia superan un umbral previamente establecido
Ejemplo de un gen con expresión diferencial entre muestras
UMBRAL
C C C C C C
TIPOS DE PCR CUANTITATIVA: RELATIVA
El Ct es el ciclo de PCR en el que los valores de fluorescencia superan un umbral previamente establecido
Ejemplo de un gen sin expresión diferencial entre muestras
RESULTADOS GEN ZP1
MACHOS HEMBRAS MACHOS HEMBRAS
ZP1 CT ZP1 CT B-ACTINA CT B-ACTINA CT
1 24,96 2 18,55 3 20,41 4 20,42
1 26,45 2 18,35 3 20,77 4 20,58
1 25,48 2 17,82 3 20,83 4 20,63
1 24,55 2 18,49 3 20,98 4 20,42
1 25,76 2 18,56 3 20,55 4 20,52
1 24,84 2 17,93 3 20,32 4 20,67
1 24,74 2 17,38 3 20,65 4 20,86
1 24,69 2 18,42 3 20,47 4 20,74
1 26,21 2 18 3 20,63 4 20,92
1 25 2 18,4 3 20,57 4 20,64
En esta práctica vamos a evaluar los niveles de expresión de 9 genes relacionados con la diferenciación gonadal entre machos y hembras del esturión Acipenser naccarii. Estos genes son: genes de la Zona Pelúcida (ZP1), Calcium-binding (CB), Ferritina (FER), Lipoproteína lipasa (LIPO), Arylsulfatasa (ARYL), gen Doublesex and mab-3 related transcription factor 1 (DMRT1), Steroidogenic factor (SF), Protein wnt9 (WNT) y maternal protein (MP). El gen de referencia (house-keeping) que utilizaremos es el gen de la β-actina (βACT).
PCR CUANTITATIVA RELATIVA
Para cada uno de los genes vamos a analizar: 3 muestras de machos (M1-3), 3 muestras de hembra (F1-3) y pondremos un control negativo (agua). 5μl de cDNA (100ng/μl) 2μl del primer directo 2μl del primer reverso 15 μl de “SYBR® Green PCR master mix” de Bio-Rad 6μl agua libre de RNasas hasta completar un volumen final de 30 μl. Las condiciones de amplificación son: 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 45 segundos de temperatura de annealing (60ºC) y 45 segundos de extensión a 72ºC.
PCR CUANTITATIVA RELATIVA
(diseñados) específicamente para cada gen (10pM/μl)
RESULTADOS GEN CB
MACHOS HEMBRAS MACHOS HEMBRAS
CB CT CB CT B-ACTINA CT B-ACTINA CT
1 31,01 2 21,9 3 20,41 4 20,42
1 31,2 2 21,89 3 20,77 4 20,35
1 30,89 2 21,56 3 20,51 4 20,63
1 30,53 2 20,99 3 20,98 4 20,42
1 30,85 2 20,94 3 20,55 4 20,52
1 30,21 2 21,54 3 20,32 4 20,67
1 30,34 2 21,67 3 20,65 4 20,86
1 30,46 2 21,81 3 20,47 4 20,74
1 30,61 2 21,63 3 20,63 4 20,92
1 30,96 2 21,12 3 20,57 4 20,64
RESULTADOS GEN FER
MACHOS HEMBRAS MACHOS HEMBRAS
FER CT FER CT B-ACTINA CT B-ACTINA CT
1 30,54 2 30,54 3 20,41 4 20,42
1 31,2 2 30,69 3 20,77 4 20,35
1 30,59 2 31,01 3 20,51 4 20,63
1 31,01 2 30,69 3 20,98 4 20,42
1 30,96 2 30,79 3 20,55 4 20,52
1 30,94 2 31,03 3 20,32 4 20,67
1 31,02 2 30,75 3 20,65 4 20,86
1 30,63 2 30,84 3 20,47 4 20,74
1 30,87 2 30,99 3 20,63 4 20,92
1 30,65 2 31,01 3 20,57 4 20,64
RESULTADOS GEN LIPO
MACHOS HEMBRAS MACHOS HEMBRAS
LIPO CT LIPO CT B-ACTINA CT B-ACTINA CT
1 28,36 2 28,47 3 20,41 4 20,42
1 28,64 2 27,89 3 20,77 4 20,35
1 28,42 2 28,54 3 20,51 4 20,63
1 27,96 2 28,68 3 20,98 4 20,42
1 28,12 2 28,75 3 20,55 4 20,52
1 28,23 2 28,79 3 20,32 4 20,67
1 28,41 2 28,64 3 20,65 4 20,86
1 28,69 2 28,47 3 20,47 4 20,74
1 27,94 2 28,24 3 20,63 4 20,92
1 28,53 2 28,01 3 20,57 4 20,64
RESULTADOS GEN ARYL
MACHOS HEMBRAS MACHOS HEMBRAS
ARYL CT ARYL CT B-ACTINA CT B-ACTINA CT
1 22,36 2 27,03 3 20,41 4 20,42
1 21,89 2 26,57 3 20,77 4 20,35
1 22,45 2 26,35 3 20,51 4 20,63
1 22,23 2 26,54 3 20,98 4 20,42
1 22,21 2 27,05 3 20,55 4 20,52
1 22,68 2 26,34 3 20,32 4 20,67
1 21,79 2 26,85 3 20,65 4 20,86
1 22,68 2 26,64 3 20,47 4 20,74
1 21,96 2 26,69 3 20,63 4 20,92
1 21,63 2 26,87 3 20,57 4 20,64
RESULTADOS GEN DMRT1
MACHOS HEMBRAS MACHOS HEMBRAS
DMRT1 CT DMRT1 CT B-ACTINA CT B-ACTINA CT
1 20,68 2 23,76 3 20,41 4 20,42
1 20,54 2 23,84 3 20,77 4 20,35
1 20,64 2 23,69 3 20,51 4 20,63
1 20,98 2 23,54 3 20,98 4 20,42
1 20,78 2 23,27 3 20,55 4 20,52
1 20,89 2 23,63 3 20,32 4 20,67
1 20,36 2 22,99 3 20,65 4 20,86
1 20,47 2 23,05 3 20,47 4 20,74
1 20,55 2 23,03 3 20,63 4 20,92
1 20,48 2 23,54 3 20,57 4 20,64
RESULTADOS GEN SF
MACHOS HEMBRAS MACHOS HEMBRAS
SF CT SF CT B-ACTINA CT B-ACTINA CT
1 20,26 2 25,96 3 20,41 4 20,42
1 20,54 2 26,03 3 20,77 4 20,35
1 20,14 2 25,89 3 20,51 4 20,63
1 20,3 2 26,04 3 20,98 4 20,42
1 20,31 2 26,36 3 20,55 4 20,52
1 20,34 2 26,34 3 20,32 4 20,67
1 20,36 2 26,34 3 20,65 4 20,86
1 20,47 2 26,14 3 20,47 4 20,74
1 20,17 2 26,13 3 20,63 4 20,92
1 20,48 2 26,69 3 20,57 4 20,64
RESULTADOS GEN WNT
MACHOS HEMBRAS MACHOS HEMBRAS
WNT CT WNT CT B-ACTINA CT B-ACTINA CT
1 33,65 2 31,01 3 20,41 4 20,42
1 33,56 2 31,21 3 20,77 4 20,35
1 33,45 2 31,03 3 20,51 4 20,63
1 33,69 2 31,23 3 20,98 4 20,42
1 33,54 2 31,36 3 20,55 4 20,52
1 33,68 2 31,21 3 20,32 4 20,67
1 33,49 2 31,14 3 20,65 4 20,86
1 33,45 2 31,13 3 20,47 4 20,74
1 33,69 2 31,21 3 20,63 4 20,92
1 33,84 2 31,01 3 20,57 4 20,64
RESULTADOS GEN MP
MACHOS HEMBRAS MACHOS HEMBRAS
MP CT MP CT B-ACTINA CT B-ACTINA CT
1 29,89 2 28,34 3 20,41 4 20,42
1 29,97 2 28,21 3 20,77 4 20,35
1 29,89 2 28,65 3 20,51 4 20,63
1 30,01 2 28,41 3 20,98 4 20,42
1 29,84 2 28,56 3 20,55 4 20,52
1 30,12 2 28,51 3 20,32 4 20,67
1 29,87 2 28,36 3 20,65 4 20,86
1 30,05 2 28,78 3 20,47 4 20,74
1 29,93 2 28,45 3 20,63 4 20,92
1 29,86 2 28,75 3 20,57 4 20,64