AUMENTO DE LA FRAGMENTACIÓN DEL DNA ESPERMÁTICO EN LOS FUMADORES TRAS LA CAPACITACIÓN MEDIANTE...

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A R T Í C U L O S Resumen: los hábitos tóxicos y su relación con la infertilidad masculina, ha sido objeto de investigación en los últimos años y dentro de los hábitos tóxicos más comunes dentro de la población está fumar el cigarrillo. Por otro lado, la fragmentación del DNA espermático ha sido relacionada con la infertilidad y disminución de la calidad embrionaria en trabajos previos. Este estudio se ha llevado a cabo con la finalidad de investigar la asociación entre el tabaco y la fragmentación del DNA espermático en muestras de semen fresco y capacitado en hombres infértiles que asisten para un tratamiento de reproducción. Un total de 99 pacientes proporcionaron una muestra de semen; se descartaron previamente otras causas de fragmentación del DNA mediante un cuestionario y se establecieron 3 grupos de acuerdo al consumo de tabaco: no fumadores, fumadores moderados (1-19 cigarrillos/día) y muy fumadores (20 cigarrillos /día). El análisis de la fragmentación se llevó a cabo mediante la prueba de la Dispersión de la Cromatina (SCD) antes y después del swim-up. No se observaron diferencias significativas en cuanto a la fragmentación del DNA según el hábito de fumar en las muestras en fresco; sin embargo, hubo un incremento significativo de células espermáticas con el DNA fragmentado en los hombres fumadores respecto a los no fumadores en las muestras luego del swim-up. Por lo que podemos concluir que el análisis de la fragmentación del DNA espermático después del capacitado es el que puede realmente detectar el efecto perjudicial producido por el tabaco sobre el espermatozoide. Este efecto nocivo altera el proceso de selección del swim-up en los fumadores, sin embargo, las bases moleculares y celulares de este fenómeno no han sido elucidadas, por tanto es recomendable que los hombres que buscan descendencia eviten el consumo de tabaco. Palabras clave: Fragmentación del DNA / Prueba de Dispersión de la Cromatina (SCD) / fertilización in vitro / cigarrillo/ espermatozoide Abstract: Toxic habits and its relation with male infertility has been a matter of investigation in the recent years and smoking is one of the commonest life-style toxic exposures to harmful substances. Sperm DNA fragmentation has been previously linked to infertility and low embryo quality in several works. This cross-sectional study was carried out to investigate the association between cigarette smoking and sperm DNA fragmentation in raw and capacitated sperm from infertile males undergoing assisted reproduction treatments (ART). A total number of 99 infertile males provided one semen sample, other causes of DNA fragmentation was discarded by a previous questionnaire and three groups were established according to the cigarette consumption: non-smokers, light smokers(1-19 cigarettes/day) and heavy smokers (20 cigarettes/day), then analyses of the sperm DNA fragmentation was carried out by the Sperm Chromatin Dispersion (SCD) test before and after swim-up treatment. We could observed no differences in the sperm DNA fragmentation in the raw semen samples regardless the smoking habits; nevertheless there is a significant increase in the incidence of sperm cells with DNA strand breaks in male smokers compare to non smokers after the evaluation of post swim-up samples. And we concluded that the analysis of sperm DNA fragmentation after capacitation can really detect the detrimental effect produced by tobacco. This deleterious effect alters the sperm swim-up selective process in smokers but molecular and cellular basis of this phenomenon remain to be elucidated, but based on these evidences, leaving smoking is advisable in males attending to reach parenthood. Key words: DNA fragmentation / sperm chromatin dispersion test (SCD) / In vitro Fertilization / cigarette smoking / sperm AUMENTO DE LA FRAGMENTACIÓN DEL DNA ESPERMÁTICO EN LOS FUMADORES TRAS LA CAPACITACIÓN MEDIANTE SWIM-UP. Sperm selection by swim-up in terms of DNA fragmentation as measured by the Sperm Chromatin Dispersion test (SCD) is altered in heavy smokers. Thamara Viloria, Nicolás Garrido , José Luis Fernández, José Remohí, Antonio Pellicer, Lourdes Muriel, Marcos Meseguer IVI Valencia, Universidad de Valencia. Sección de Genética y Unidad de Investigación, Hospital "Teresa Herrera," Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo, A Coruña, España. Departamento de Obstetricia y Ginecología Hospital Dr. Peset, Valencia, España. Peticiones de reimpresión: Dr. Thamara Viloria, IVI Valencia - Universidad de Valencia, e-mail: [email protected]. 15 Diciembre 2006 Vol. 11 • Nº2 1 1 1 2 2 3 1 1 2 1

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Resumen: los hábitos tóxicos y su relación con la infertilidad masculina, ha sido objeto de investigación en los últimos años ydentro de los hábitos tóxicos más comunes dentro de la población está fumar el cigarrillo. Por otro lado, la fragmentación delDNA espermático ha sido relacionada con la infertilidad y disminución de la calidad embrionaria en trabajos previos. Esteestudio se ha llevado a cabo con la finalidad de investigar la asociación entre el tabaco y la fragmentación del DNA espermáticoen muestras de semen fresco y capacitado en hombres infértiles que asisten para un tratamiento de reproducción.Un total de 99 pacientes proporcionaron una muestra de semen; se descartaron previamente otras causas de fragmentación delDNA mediante un cuestionario y se establecieron 3 grupos de acuerdo al consumo de tabaco: no fumadores, fumadoresmoderados (1-19 cigarrillos/día) y muy fumadores (≥20 cigarrillos /día). El análisis de la fragmentación se llevó a cabo mediantela prueba de la Dispersión de la Cromatina (SCD) antes y después del swim-up. No se observaron diferencias significativas encuanto a la fragmentación del DNA según el hábito de fumar en las muestras en fresco; sin embargo, hubo un incrementosignificativo de células espermáticas con el DNA fragmentado en los hombres fumadores respecto a los no fumadores en lasmuestras luego del swim-up. Por lo que podemos concluir que el análisis de la fragmentación del DNA espermático después delcapacitado es el que puede realmente detectar el efecto perjudicial producido por el tabaco sobre el espermatozoide. Este efectonocivo altera el proceso de selección del swim-up en los fumadores, sin embargo, las bases moleculares y celulares de estefenómeno no han sido elucidadas, por tanto es recomendable que los hombres que buscan descendencia eviten el consumo detabaco.

Palabras clave: Fragmentación del DNA / Prueba de Dispersión de la Cromatina (SCD) / fertilización in vitro / cigarrillo/ espermatozoide

Abstract: Toxic habits and its relation with male infertility has been a matter of investigation in the recent years and smoking isone of the commonest life-style toxic exposures to harmful substances. Sperm DNA fragmentation has been previously linked toinfertility and low embryo quality in several works. This cross-sectional study was carried out to investigate the associationbetween cigarette smoking and sperm DNA fragmentation in raw and capacitated sperm from infertile males undergoing assistedreproduction treatments (ART).A total number of 99 infertile males provided one semen sample, other causes of DNA fragmentation was discarded by a previousquestionnaire and three groups were established according to the cigarette consumption: non-smokers, light smokers(1-19cigarettes/day) and heavy smokers (≥20 cigarettes/day), then analyses of the sperm DNA fragmentation was carried out by theSperm Chromatin Dispersion (SCD) test before and after swim-up treatment. We could observed no differences in the sperm DNAfragmentation in the raw semen samples regardless the smoking habits; nevertheless there is a significant increase in theincidence of sperm cells with DNA strand breaks in male smokers compare to non smokers after the evaluation of post swim-upsamples. And we concluded that the analysis of sperm DNA fragmentation after capacitation can really detect the detrimentaleffect produced by tobacco. This deleterious effect alters the sperm swim-up selective process in smokers but molecular andcellular basis of this phenomenon remain to be elucidated, but based on these evidences, leaving smoking is advisable in malesattending to reach parenthood.

Key words: DNA fragmentation / sperm chromatin dispersion test (SCD) / In vitro Fertilization / cigarette smoking / sperm

AUMENTO DE LA FRAGMENTACIÓN DEL DNA ESPERMÁTICO ENLOS FUMADORES TRAS LA CAPACITACIÓN MEDIANTE SWIM-UP.

Sperm selection by swim-up in terms of DNA fragmentation as measured by the Sperm Chromatin

Dispersion test (SCD) is altered in heavy smokers.

Thamara Viloria, Nicolás Garrido , José Luis Fernández, José Remohí, Antonio Pellicer, Lourdes Muriel, Marcos Meseguer

IVI Valencia, Universidad de Valencia. Sección de Genética y Unidad de Investigación, Hospital "Teresa Herrera," ComplejoHospitalario Universitario Juan Canalejo, A Coruña, España. Departamento de Obstetricia y Ginecología Hospital Dr. Peset, Valencia,España.

Peticiones de reimpresión: Dr. Thamara Viloria, IVI Valencia - Universidad de Valencia, e-mail: [email protected].

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INTRODUCCIÓN

El término “Infertilidad” se definecomo la incapacidad de una pareja deconseguir un embarazo luego de rela-ciones sexuales regulares no protegi-das. Aproximadamente un 15% de lasparejas con deseo de gestación tienendificultad de concebir tras este perío-do. El factor masculino es por sí soloel causante de esa infertilidad en un20% de los casos y contribuye en otro30-40%, siendo las alteraciones en elsemen el origen de la misma(Rodríguez et al., 2005).

El sistema reproductivo es bastantecomplejo, sin embargo, los diseñosexperimentales de pruebas in vitro ein vivo nos pueden ser útiles para de-tectar algunas alteraciones. Por tanto,la reproducción asistida nos brinda unespacio ideal para estudiar algunosfactores que podrían estar afectandola calidad seminal y sus implicacionesa nivel reproductivo.

A lo largo de los años, muchos hansido los factores relacionados a la in-fertilidad masculina, como: infeccio-nes, varicocele (Pomerol, 2002), obs-trucciones y alteraciones en la pro-ducción espermática (Ballescá,2002), causas genéticas (Egozcue,2002) y muchas veces la causa esdesconocida y pueden afectar en ma-yor o menor medida a la calidad semi-nal. Sin embargo, su relación con loshábitos tóxicos ha sido motivo de in-vestigación en los últimos años, desus resultados se han descrito algunosagentes ambientales tóxicos que pue-den deteriorar la espermatogénesis,ejerciendo efectos nocivos a nivel pre-testicular, testicular o post-testicular(Oliva et al., 2001; Pflieger-Bruss et al.,2004). Uno de estos agentes es el con-sumo del tabaco; el cual está amplia-mente reconocido como un problemade salud pública y una de las mayorescausas de muertes prevenibles.Aproximadamente una tercera parte dela población mundial mayor de 15 añoses fumadora (World HealthOrganization, 1997). Así mismo, el taba-co afecta la salud reproductiva.El cigarrillo contiene algunos cientos

de compuestos (Dube and Green,

dios serios, objetivos y completos querevelen la acción que estos ejercen enel espermatozoide, principalmente enpoblación con deseos de gestación.

Con este fin, hemos aprovechado elconocimiento ganado en los trata-mientos de reproducción asistida(TRA) después de la introducción dediversos análisis como la prueba de laDispersión de la Cromatina (SCD) paraestudiar el efecto del tabaco sobre laintegridad del DNA de los espermato-zoides antes y después del swim-upen parejas que consultan por infertili-dad.

Este estudio introduce nuevos avan-ces respecto a las consecuencias deltabaco en la reproducción humana.

Fragmentación del DNA y tabaco:Se estima que un 25% de las cau-

sas de infertilidad son de origen idio-pático y la etiología de algunas de es-tas causas podría estar relacionadacon daño en el DNA de los esperma-tozoides.

La fragmentación de DNA en el es-permatozoide está siendo cada vezmás reconocida como una importantecausa de infertilidad, y aunque el ori-gen del daño a nivel del DNA no esclaro (Muratori et al., 2000; Sergerieet al., 2005), se han propuesto algu-nos mecanismos como: defectos en lacompactación de la cromatina duran-te la espermiogénesis, inducción de laapoptosis durante el proceso de es-permatogénesis e inducción de dañode DNA en espermatozoides diferen-ciados maduros por espermatozoidesinmaduros que producen niveles ele-vados de radicales libres (ROS)(Garrido et al., 2004).

Una causa potencial de la fragmen-tación de DNA es la exposición a toxi-nas ambientales; sin embargo, pocosdatos apoyan el concepto de un im-pacto negativo extenso de contami-nantes ambientales en los resultadosdel análisis del semen (Sun et al.,1997). Algunas de estas toxinas sepodían relacionar con el consumo detabaco.

1982). El tabaco consiste en su mayo-ría de carbohidratos y proteínas (aprox50%). Otro constituyente significanteson alcaloides (0,5-5%) con la nicoti-na como compuesto predominante(90-95% de los alcaloides totales), po-lifenoles (0,5-4,5%), fitoteroles (0,1-2,5%), ácidos carboxílicos (0,1-0,7%), hidrocarbonos aromáticos, al-dehídos, cetonas, aminas, pesticidas,etc (0,01-5%) y más de 30 compues-tos metálicos (Wynder and Hoffmann,1967; Internacional Agency forResearch on Cancer, 1986).

La nicotina, el principal alcaloide deltabaco, está presente en los cigarrillosen una cantidad que varía desde 0,8-1,8 mg/cigarrillo, dependiendo de lamarca y tamaño del mismo (Benowitzet al., 1983; Rosa et al., 1992). Tantocomo 1mg de nicotina puede ser ab-sorbido al fumar 1 solo cigarrillo. Estees un alcaloide muy tóxico que se ab-sorbe rápidamente por el tracto respi-ratorio, la mucosa bucal y la piel(Gandini et al., 1997).

La cotinina, su mayor metabolito, esun compuesto más estable que la ni-cotina, con un tiempo de vida mediade aproximadamente 20h (la vida me-dia de la nicotina es de unas 2h) y suconcentración no se ve influenciadapor otros factores como por ejemplo ladieta. En el hombre, la nicotina y/o co-tinina ha sido detectada en plasma se-minal de acuerdo al consumo de ciga-rrillos (Pacifi et al., 1993, 1995; Vineet al., 1993; Zenzes et al., 1999), loque indica el paso de estos metaboli-tos a través de la barrera hemato-tes-ticular.

Esto sugiere que ciertos componen-tes del tabaco interactúan, directa oindirectamente, afectando la funcióny viabilidad de los gametos; y el meca-nismo que envuelve este resultadoaún necesita ser elucidado.

El incipiente incremento del interéspúblico respecto al declive del poten-cial fértil masculino, y sobre todo, eldeseo de conocer el efecto que tienenlos componentes medioambientales yocupacionales, y los hábitos de la so-ciedad actual, hacen necesarios estu-

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La relación entre el cigarrillo y lafragmentación del DNA del esperma-tozoide ha sido establecida por algu-nos autores (Sun et al., 1997;Muratori et al., 2000; Zenzes, 2000).No obstante, Sergerie et al. (2005)han reportado una no asociación enhombres sanos fumadores y no fuma-dores; y Belcheva et al. encontraronque el daño en el DNA de los esper-matozoides de los fumadores estabaincrementado con respecto al de losno fumadores, pero esta diferencia noresultaba estadísticamente significati-va.

Uno de los mecanismos sugeridospodría estar relacionado con la inter-ferencia nicotínica sobre la organiza-ción de la membrana espermática ypor lo tanto en la reacción acrosómica(Arabi, 2004) inducida por ZP3, unaproteína de la zona pelúcida que des-empeña un papel fundamental duran-te la fertilización, funcionando comoun receptor específico para el esper-matozoide (Hinsch et al., 2005).

El propósito en este estudio es in-vestigar la asociación entre el taba-quismo y la fragmentación de DNA delespermatozoide en parejas infértilessometidas a tratamientos de repro-ducción asistida, utilizando el SCD an-tes y después del procedimiento deswim-up como técnica de capacita-ción espermática en hombres fuma-dores y no fumadores.

MATERIALES Y MÉTODOS

Población: La población objeto deestudio son pacientes infértiles queasisten a tratamientos de reproduc-ción asistida en nuestro centro, delcual se seleccionaron aleatoriamentelas muestras de semen de los maridosde parejas que asisten al laboratoriode andrología del IVI para un trata-miento de infertilidad con previo con-sentimiento de los pacientes, ya queson pruebas que no se realizan de ru-tina en el laboratorios. Un total de 99hombres proporcionaron 99 muestrasde semen para ser analizadas. El ran-go de edad fue de 26 a 49 años, conuna media de 36.

Posteriormente, el sobrenadante (0,1-0,5ml) fue separado en otro tubo.Luego, para la determinación de lafragmentación del DNA se tomaronalícuotas (entre 10 y 100µl) con con-centraciones entre 5-10 millones despz/ml de cada muestra de semen an-tes y después del swim-up para serprocesadas como describe Fernándezet al. (2003).

Se establecieron 5 patrones de SCD:a) Células espermáticas de halo gran-de (CHG): su anchura es similar omás grande que el diámetro menordel nucleoide; b) Células espermáti-cas de halo mediano (CHM): su haloestá entre aquellos con halo grande yhalo muy pequeño. Células espermá-ticas sanas (CS): este subgrupo inclu-ye las HG y HM, es decir, aquellas sinfragmentación de DNA; c) Células es-permáticas de halo muy pequeño(CHP): su espesor es similar o máspequeño que la tercera parte (1/3) deldiámetro menor del nucleoide; d)Células espermáticas sin halo (CSH);e) Células espermáticas degradadas(CD): son similares al grupo “d”, peroademás están débilmente o irregular-mente teñidas. Las células espermáti-cas de halo pequeño, sin halo y degra-dadas contienen DNA fragmentado.Finalmente los nucleoides que no co-rresponden a células espermáticasfueron separados del recuento.

Análisis estadístico: Las compara-ciones de la fragmentación del DNAcon respecto a los 3 grupos estudia-dos antes y después del swim-up, serealizaron por la prueba de análisis devarianzas (ANOVA) cuando los datosseguían una distribución normal,mientras que cuando estas seguíanuna distribución anormal se utilizó laprueba de Kruskal-Wallis (prueba noparamétrica). El análisis estadísticofue llevado a cabo usando elStatistical Package for the SocialSciences (SPSS Inc., Chicago, IL,USA). La significancia estadística seha definido como P<0,05.

RESULTADOS

Los resultados de la fragmentacióndel DNA de espermatozoides en las

Se les realizó el test de SCD, sin co-nocer, si eran fumadores o no.Posteriormente a los análisis, se pro-cedió a hacer una encuesta a los pa-cientes acerca de sus hábitos tabáqui-cos en el momento en el cuál fue rea-lizado el ciclo y los 3 meses anterio-res. Se estipularon tres grupos segúnel consumo diario de cigarrillo en losvarones: no fumadores (n= 51), fuma-dores moderados: de 1-19 cigarrillospor día (n= 21) y varones muy fuma-dores: más de 19 cigarrillos por día(n= 27); y se analizaron los datos.

Aquellos pacientes que hubieranconsumido drogas o alcohol en los 3meses previos a la realización del es-tudio, fueron incluidos. También éstosfueron excluidos, si tenían historia re-ciente de fiebre o exposición a gona-dotoxinas como quimioterapia, radio-terapia, pesticidas o exposición ocu-pacional a metales pesados. Además,se investigó acerca de la presencia devaricocele, torsión testicular, etc., parano incluirlos en los mismos.

Fragmentación del DNA espermático.Prueba de Dispersión de la Cromatina(SCD)

El SCD (Halosperm® kit, INDAS la-boratories, España) es una pruebadesarrollada recientemente, descritapor Fernández et al., (2003), basadaen el hecho de que en los espermato-zoides con las cadenas de DNA intac-tas se produce una descompactaciónde los bucles de DNA, empaquetadosen la matriz nuclear, tras haber sidoexpuesto a un tratamiento ácido, se-guido a un tratamiento con agentesreductores y detergentes. Esta des-compactación produce un halo alre-dedor de la matriz nuclear que sepuede visualizar por microscopía decampo claro usando tinciones habi-tuales como el Diff-Quick. Por el con-trario, si una de las cadenas de DNAestá dañada, no se produce halo, ob-servándose núcleos condensados.

Para el análisis de las muestras serealizó el estudio macro y microscópi-co del semen según lo descrito ante-riormente. Todas las muestras fueronprocesadas por swim-up.

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muestras de los pacientes antes deser procesadas por swim-up de acuer-do al número de cigarrillos fumadospor los varones, no revelaron diferen-cias significativas entre los 3 gruposestudiados dependiendo de la canti-dad de cigarrillos por día. Hombres nofumadores, fumadores moderados ymuy fumadores, tuvieron similar pa-trón de distribución entre las diferentescategorías de acuerdo al tamaño delhalo luego de hacer el SCD, es decir,porcentajes de células con CHG, CHM,CS, CHP, CSH y CD (Figura 1a y 2a).

Las Figuras 1b y 2b, muestran los re-sultados de la fragmentación del DNAde espermatozoides en las muestrasluego de ser procesadas por swim-upde acuerdo al número de cigarrillos fu-mados.

Comparaciones entre esos gruposmuestran diferencias significativas enlas CHP. Los porcentajes de CHP en losfumadores moderados se incrementa-ron respecto a aquellos que no fumaban(15,0 IC 95% [6,4-46,0] y 12,2 IC 95%[0,0-32,7]) (Pab=0,020), al igual que enlos hombres muy fumadores compara-do con el grupo de los no fumadores(19,2 IC 95% [0,9-46,0] y 12,2 IC 95%[0,0-32,7]) (Pac=0,013), demostrándo-se así un daño en la calidad del DNAentre fumadores en general (modera-dos y muy fumadores) y no fumadores.Además, los porcentajes de CHG y CSse vieron disminuidos en los dos gruposde hombres fumadores comparadoscon aquellos que no fumaban, aunqueestas diferencias no llegaron a ser signi-

nificativamente luego del swim-upenlos fumadores moderados y muy fuma-dores (Phb=0,001 y Pic<0.001 respec-tivamente) en comparación con aque-llos hombres sin este hábito, lo que in-dica una positiva selección de esper-matozoides con DNA fragmentado lue-go de la capacitación en los hombresfumadores. Particularmente en loshombres muy fumadores este incre-mento fue de más del 100%.

Incluso, en los hombres no fumado-res se observó una gran disminución delas CSH y CD (Pjk=0,007 y Plm=0,006respectivamente), lo cual supone unareducción de espermatozoides conDNA fragmentado luego del swim-upen este grupo, sin embargo esta dis-minución no fue significativa.

Por tanto, estos hallazgos en las alí-cuotas post swim-up sugieren que eltabaco altera selectivamente la habili-dad del proceso de selección espermá-tica en los hombres fumadores.

ficativas.

De igual forma, en los porcentajes deCSH y CD se observó que los daños enel DNA de los espermatozoides de losfumadores moderados estaban incre-mentados, pero las diferencias no re-sultaron estadísticamente significativas.

Posteriores comparaciones múltiplesentre la fragmentación del DNA de lasmuestras de semen antes y despuésdel swim-up de acuerdo al número decigarrillos fumados (comparaciones en-tre figuras 1a con 1b y 2a con 2b res-pectivamente), mostraron que en loshombres muy fumadores hubo una dis-minución significativa (aproximada-mente del 50%: 72,8 IC 95% [23,8-67,3] y 47,3 IC 95% [9,4-97,4]) de lasCHG (Pde=0,020), luego del swim-up.

No se encontraron diferencias signifi-cativas en las CHM entre los grupos an-tes y después de la capacitación.También, en los hombres muy fumado-res se encontró una disminución muymarcada en las CS (que son el total delas células no fragmentadas) luego delswim-up (Pfg<0,001) (78,7 IC 95%[44,4-95,3] y 60,0 IC 95% [15,4-98,7]); adicionalmente, se observó unincremento de este tipo de células es-permáticas (CS) en el grupo de hom-bres muy fumadores luego del procesa-miento por swim-up, pero este no fuesignificativo.

Por otra parte, en el mismo gráfico sepuede observar, desde otro punto devista que, las CHP incrementaron sig-

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Figura 1 Resultados de la fragmentación del DNA en muestras de semen antes y después del swim-up de acuerdo a la cantidad de cigarrillos fumados.

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DISCUSIÓN

Aunque muchos trabajos sugierenque existen agentes físicos y químicosen el ambiente, muchos de ellos hansido introducidos y propagados por laactividad humana, pudiendo afectarla fertilidad masculina (Oliva et al.,2001), sin embargo, el impacto delconsumo de tabaco en la fertilidadmasculina resulta un tema controver-tido (Vine et al., 1996).

Los resultados de este estudio sos-tienen que: (i) no hay diferencias enla fragmentación del DNA de los es-permatozoides en las muestras de se-men en fresco a pesar de los hábitos ta-báquicos; y (ii) hay un incremento sig-nificativo en la incidencia de células es-permáticas con las hebras de DNA ro-tas en los hombres fumadores luego deevaluar las muestras procesadas porswim-up.

Primero se realizó la prueba de SCDen las muestras de semen en fresco yel resultado de la fragmentación delDNA en los 3 grupos de hombres es-tudiados, de acuerdo al consumo decigarrillos por día, fue comparable.

Sergerie et al. (2005), describieron la noasociación entre tabaco y fragmenta-ción de DNA espermático en muestrasde semen en fresco de hombres sanos(no infértiles); y Saleh et al. (2002), es-tudiaron esta asociación en hombres in-fértiles y reportaron que las diferenciasentre fumadores y no fumadores no eraestadísticamente significativa.

No obstante, encontraron que lasmuestras de semen de los hombresinfértiles fumadores tenían altos nive-les de estrés oxidativo (OS) que en losno fumadores. Esto fortalece los re-sultados del presente trabajo y refuer-za la hipótesis que el efecto ejercido poralgunos factores perjudiciales, queafectan los gametos masculinos, podrí-an estar encubiertos en el eyaculado,siendo los mismos apreciables solo enla selección de espermatozoides porswim-up.

Se debe recalcar que las muestrasempleadas en cualquier TRA estánpreviamente procesada en el labora-torio con la finalidad de eliminar lascélulas no espermáticas y seleccionar

los mejores espermatozoides (mejormovilidad y morfología), imitando asílos procesos que ocurren en el tractoreproductor femenino en condicionesnaturales. Muratori et al., (2000) des-cribieron que hasta cierto punto lafragmentación del DNA estaba positi-vamente relacionada con una morfo-logía anormal en el espermatozoide yasociada con defectos en la cola;pero encontraron una correlación ne-gativa entre DNA roto y movilidadprogresiva.

Basándonos en trabajos previos,donde se encontró que las tasas defecundación y algunos indicadores decalidad embrionaria estaban relacio-nados con el alcance de la fragmenta-ción del DNA espermático post swim-up (Muriel et al., 2006); éstos en con-junto con los resultados del actual es-tudio, se puede concluir que la víapara determinar la fragmentación delDNA parece evidente que debería serevaluando las alícuotas tras el proce-samiento por swim-up.Con el fin de perfeccionar estos ha-

llazgos, se hicieron comparaciones

Figura 2 Representación del total de células sanas (no fragmentadas) en muestras de semen antes y después del swim-up de acuerdo a la cantidad decigarrillos fumados.

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múltiples entre los 3 grupos estudia-dos y los resultados antes y despuésdel swim-up; y diferencias significati-vas indican que los hombres fumado-res moderados y muy fumadores pre-sentan un número significativamentemayor de células espermáticas conDNA dañado luego del capacitadoque los no fumadores. Es más, loshombres no fumadores tuvieron unadisminución significativa de célulasespermáticas degradadas (CD) y engeneral menos espermatozoides conDNA deteriorado.

Estudios previos sobre fragmenta-ción del DNA espermático y consu-mo de tabaco, han sido realizadosen semen en fresco (Sergerie et al.,2000; Saleh et al., 2002) o semen ca-pacitado (Sun et al., 1997; Younglai etal., 2001; Belcheva et al., 2004) inde-pendientemente, pero no se ha es-tudiado un diseño como el de estetrabajo donde se han comparado lasmuestras antes y después del capa-citado e introduciendo un factor ex-terno.

Respecto al procesamiento en ellaboratorio, algunos estudios hananalizado la relevancia de la prepa-ración del semen en el porcentajede células con DNA fragmentado.

La técnica de swim-up para el ca-pacitado de espermatozoides móvi-les ha sido estudiada por Younglai etal. (2001), en hombres que asistena una clínica de infertilidad, con elfin de determinar si este procedi-miento puede ocasionar efectos per-judiciales en el DNA espermático; yencontraron que no existían diferen-cias significativas entre la fragmen-tación del DNA en la muestra frescay en la procesada por swim-up y porel método de swim-up directo (sincentrifugar); pero en el mismo, no seestudió ningún factor perjudicial exter-no como por ejemplo el consumo detabacoAl igual que en este estudio, Sun

et al. (1997) describieron un incre-mento en la fragmentación del DNA

espermático entre hombres infértiles(fumadores y no fumadores) luegodel procesamiento por swim-up quepudiera sugerir un posible vínculocon las toxinas ambientales. Otrosestudios llevados a cabo porBelcheva et al. (2004), en donantesnormozoospérmicos antes de la ca-pacitación por Percoll, concluyeronque la fragmentación del DNA en es-permatozoides de donantes sanos(no infértiles) fumadores permanecíadentro del rango normal. Sin embar-go, ellos observaron que el fumar ci-garrillos inducía un deterioro en lamembrana plasmática de las célulasespermáticas.

En conclusión, el análisis de lafragmentación del DNA en las mues-tras de eyaculado (en fresco) ocultael efecto perjudicial real del tabaco,ya que no se han encontrado dife-rencias con respecto al consumo detabaco, que apuntarían a la conclu-sión “errónea” que el mismo no in-fluye en la fragmentación del DNA.

Pero es luego del capacitado, don-de realmente se puede detectar elefecto perjudicial producido por eltabaco. Este efecto deletéreo estáafectando la selección espermáticapor la interferencia en el proceso delswim-up, demostrando que el taba-co, altera selectivamente la capaci-tación del semen por swim-up en loshombres fumadores. Las bases celu-lares y moleculares de este fenóme-no quedan aún por elucidar; pero sepueden plantear algunas posiblesopciones, como: a) que la fragmen-tación del DNA (como proceso conti-nuo) se produzca también luego deleyaculado, estando incrementado enlos pacientes fumadores y subse-cuentemente las células que estánalgo fragmentadas (halo mediano)terminen fragmentándose completa-mente tras la incubación durante 1hora aproximadamente en el procesode capacitado; b) además esta obser-vación luego del capacitado no signifi-ca que este proceso esté aumentandolos espermatozoides fragmentadas en

los fumadores, pero posiblemente siesté seleccionando mejor los esper-matozoides no fragmentados en losno fumadores.

La suma de ambos efectos se tradu-ce en esa diferencia significativa lue-go del swim-up. Basándonos en estasevidencias, es aconsejable que loshombres que son atendidos por infer-tilidad en TRA o que buscan descen-dencia eviten el consumo de tabaco.

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