Axón de jibia 9 de abril de 2009 Fisiología General 2009, Clases, AxondeJibia.ppt.
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Axón de jibia
9 de abril de 2009
http://einstein.ciencias.uchile.clFisiología General 2009, Clases, AxondeJibia.ppt
I, mA/cm2
t, ms
Voltage clamp de un axón de jibia
NaNaNaKKKm gpNgpNI 5494
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494
-60,8mV0mV
)0()0( NaNaKKm VGVGI
dtdV
CVVGVVGI mNamNaKmKm )()(
I, mA/cm2
t, ms
-60,8mV0mV
Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494 KtVKKK gpNI ),(94
Control
TTX
I, mA/cm2
Pulso -120 a 100 mV
Vm
El curso temporal del desarrollo de la corriente de potasio no sigue un curso exponencial.
Para estudiar la relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana se mide a diferentes potenciales.
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-150 -100 -50 0 50 100 150
Conductancia GK?
)( KmKK VVGI
Potencial de inversión, VK?
Vm, mV
I K, m
A c
m-2
Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.
Estrategia para buscar el potencial de inversión VK.
Sospecha: VK = -94 mV
Problema: alrededor de -94 mV no se registra inversión de la corriente. ¿Por qué?Porque los canales están cerrados a -94 mV.
Solución: 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.
Vm, mV
IK,
mA
/cm
2
Prepulso constante
Pulso de prueba variable
Vm
1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.
VK = -73,4 mV
Los canales de K cumplen la ley de Ohm.
)( KmKK VVGI
Sorpresa: El valor encontrado, -74 mV es menos negativo que el esperado según Nernst (-94mV).
Una explicación posible: los canales de K no son idealmente selectivos: pasa algo de Na.
Tarea: Calcular GK/GNa para estos canales
VK = -73,4 mV
El potencial de reposo es -60 mV, los potenciales de inversión de las corrientes de potasio y leak son -73 y -50 mV respectivamente. Calcule la razón GK/GLeak para el potencial de reposo.
Vm, mV
IK,
mA
/cm
2
VK=-73.4 mV
)( KmKK VVGI
VK=-73.4 mV
)( KmKK VVGI
Km
KK VV
IG
Vm, mV
I K,
mA
/cm
2
Vm, mV
GK/G
K,m
ax
Conductancia estandarizada en estado estacionario
Los canales de K son tetrámeros.
Cada monómero tiene su propio sensor de potencial: es el segmento S4 que tiene varios residuos de arginina.
Los sensores de potencial tiene dos estados: reposo y activo
Los sensores de potencial operan en forma independiente.
El canal se abre sólo cuando los cuatro sensores de potencial están activos.
Sea n la probabilidad de encontrar un sensor activo
La probabilidad de encontrar un canal abierto es... n4
)-V(VnNgI KmKK4 4nNgG KK
4
,
nG
G
maxK
K
Vm, mV
GK/G
K,m
ax
4nNgG KK
4
,maxK
K
GG
4
,
nG
G
maxK
K 4nNgG KK
Vm, mV
n
RT
VVzF m
e
n0
1
1
V0 = -46 mVz = 1.4
4
,
nG
G
maxK
K 4nNgG KK
Vm, mV
n
RT
VVzF m
e
n0
1
1
V0 = -47 mVz = 1.8
Errores pesados por 1/n
4nNgG KK 4
,
nG
G
maxK
K
Vm, mV
n
)-V(VnNgI KmKK4 4n
II
Kmax
K
RT
VVzF m
e
n0
1
1
V0 = -48 mVz = 1.2
Errores pesados por n
La curva n vs Vm no se ajusta bien a una función de Boltzmann.
Vm, mV
Cinética
ntennntn /)()0()()( KmKK -VVnNgI 4
KmKK -VVtnNgtI 4)()(
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
Caso n(0)=0, el curso temporal de la corriente es sigmoideo
Kmt
KK -VVenNgtI n4/1)()(
Caso n(∞)=0, el curso temporal de la corriente es exponencial
Kmt
KK -VVenNgtI n/4)0()(
Vm-140mV
0 mV -100mV
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
= 1.8 ms
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
= 1.8 ms = 4.7 ms
1
5001.0
10
50
mVm
n
e
V80
60
125.0mV
n e
ms-1
n
Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley 1952. Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.
Ngk = 35.3 mS/cm2 VK = -73,4 mV
Descripción completa de los canales de K del axón de jibia
nn
Kmt
KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(
1
5001.0
10
50
mVm
n
e
V80
60
125.0mV
n e
nnn
1
nn
nn
Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 5 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.
Calcular la fracción de canales de potasio abiertos si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV.
Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 1 ms de repolarizar desde 0 mV a -60 mV.
Calcular la probabilidad de encontrar canales con 0, 1, 2, 3, y 4 sensores activos, si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV.
Para una membrana con un solo canal, calcule el tiempo que tarda en abrirse el canal por primera vez al cambiar el potencial desde -60 mV a 0 mV.
Para una membrana con un solo canal, calcule el tiempo que tarda en abrirse el canal por primera vez al cambiar el potencial desde -160 mV a 0 mV.
Canales de sodio del axón de jibia
I, mA/cm2
t, ms
-60,8mV0mV
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494
La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.
KtVKKK gpNI ),(94NatVNaNaNa gpNI ),(54
-60 mV
0 mVVm
La corriente de Na presenta inactivación
Con el uso de TTX se puede aislar la fracción de la corriente llevada por los canales de sodio.
-60 mV
0 mVVm
La corriente de Na presenta inactivación
30 mV
Procedimiento para demostrar que los canales de sodio cumplen la ley de Ohm y encontrar el potencial de inversión de la corriente
VNa = 41.2 mV
Los canales de sodio cumplen la ley de Ohm
Figure 13.29. Ball-and-Chain Model for Channel Inactivation. The inactivation domain, or "ball" (red), is tethered to the channel by a flexible "chain" (green). In the closed state, the ball is located in the cytosol. Depolarization opens the channel and creates a negatively charged binding site for the positively charged ball near the mouth of the pore. Movement of the ball into this site inactivates the channel by occluding it. [After C. M. Armstrong and F. Bezanilla. J. Gen. Physiol. 70(1977):567.]
El modelo de bola y cadena para la inactivación de los canales de sodio
Topología de un canal de sodio membrana
http://nerve.bsd.uchicago.edu/Na_chan.htm
-60 mV
0 mV
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(
Tratando los axones con pronasa se puede estudiar la activación sin interferencia de la inactivación
-60 mV
0 mV
-40 mV
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(
Procedimiento para determinar la conductancia de los canales tratados con pronasa.
INa,max = -9.38 mAcm-2 a -40 mV
GNa,max = 116 mS cm-2
VNa = 41.2 mV
Corriente inicial de cola en los axones tratados con pronasa
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(
),( VpNa
-40 mV
0 mVVm
-60 mV
Cinética de la activación
x = 1Suma de cuadrados = 8.0
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x
Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(
La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial
elevada a la cuarta potencia.
x = 2Suma de cuadrados = 0.14
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x
Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(
La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial
elevada a la cuarta potencia.
x = 3Suma de cuadrados = 0.00
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x
Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(
La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. Lo simulamos usando una función exponencial elevada a la tercera potencia.
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa
ntemmmtm /)()0()()(
Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa
ntemmmtm /)()0()()(
Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.
m (0 mV) = 0.27 ms
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa
ntemmmtm /)()0()()(
Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.
m (0 mV) = 0.27 ms m (-40mV) = 0.48 ms
Tau m en función del voltaje
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(
),( VpNa
3)(tmpNa
Como ya sabemos la relación entre pNa y m podemos calular de m(∞)
m()
3 ),( VpNa
NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa
Como ya sabemos m y tau podemos calular alfa y beta
mmm
mm
mm
1
)(
m y m a diferentes voltajes
1
351.0
10
35
mV
mm
e
V
18
60
4mV
m e
Demostrar que m = 1 para el límite Vm -35 mV
La inactivación.
NamNaNa VVhmNgtI 3)(
La variable h representa probabilidad de que los canales NO estén inactivados.Para h = 1 los canales no están inactivados.(la pronasa hace h =1)Para h = 0 los canales están inactivados
La probabilidad de encontrar un canal conduciendo es m3h
-60 mV0 mV
NamNaNa VVhmNgtI 3)(
Procedimiento para determinar h infinito en función del voltaje-
Prepulso variable
Pulso variablede pruena fijo
Medir la corriente en el mínimo.
NamNaNa VVhmNgtI 3)(
NamNaNa VVhmNgtI 3)(
h()
-100 mV
-60 mV -40 mV-60 mV
Determinación de tau h mediante ajuste de curvas al curso temporal de la corriente de sodio
NamNaNa VVhmNgtI 3)( ntemmmtm /)()0()()(
htehhhth /)()0()()(
-100 mV
-60 mV -40 mV-60 mV
h = 3.4 ms
NamNaNa VVhmNgtI 3)( ntemmmtm /)()0()()(
htehhhth /)()0()()(
-60 mV -60 mV
0 mV 0 mV
Procedimiento para determinar tau h midiendo el curso temporal del escape de la inactivación
Procedimiento para determinar tau h midiendo el curso tempooral del escape de la inactivación
h = 8.2 ms
Procedimiento para determinar tau h midiendo el curso tempooral del escape de la inactivación
Tau h en función del voltaje
Como ya sabemos m y tau en función de Vm, podemos calcular alfa y beta
hhh
hh
hh
1
)(
20
60
07.0mV
h e
1
1
10
30
mVh
e
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
-150 -100 -50 0 50 100 150
)(3NamNaNaNa VVhmgNI
NNagNa = 120 mS/cm2
h
m
h, ms
m, ms
VNa = 41,1 mV
Vm, mV Vm, mV
Vm, mVVm, mV
Calcular la fracción de canales de sodio abiertos después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.
Calcular la fracción de canales de sodio inactivados si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 m.
Calcular la fracción de canales de sodio inactivados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.
Calcular la fracción de canales de sodio cerrados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.
Potencial de reposo y potencial de acción de
membrana
Vm
IK
INa
IL
IC
Im
CLNaKm IIIII En el potencial de reposo Im = 0 e IC = 0
LNaK III 0
Potencial de reposo
Vm
IK
INa
IL
IC
Im
LrLNarNaKrK VVGVVhmGVVnG 3max4max0
El problema tiene solución porque yo conozco n, m y h en función del potencial de la membrana.
La tarea ahora es buscar un Vr se satisfaga esta ecuación.
2-max
2-max
-2
mScm 0,3 -50.1mV
mScm 120 mV 41.1
mScm 36 -73.3mV
LL
NaNa
maxKK
GV
G V
GV
)(4KKKK VVngNI
)(3NaNaNaNa VVhmgNI
)( LLL VVGI
NKgK=36 mS/cm2 VK=-73,3 mV
NNagNa=120 mS/cm2 VNa = 41,1 mV
NLgL=0,3 mS/cm2 VL = -50,1 mV
Ecuaciones de Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol.117:500-544.
En : F. Bezanilla “El Impulso Nervioso” En: Biofísica y Fisiología Celular, Latorre et al ed. Universidad de Sevilla, Sevilla 1996.
Ecuaciones empíricas basadas en Hodgking y Huxley 1952. Las constantes y están en ms-1 y V en mV.
Vm ,(mV)
h
m
n
Celda Objetivo
Celda a ajustar para que la celda objetivo sea cero Solver:
Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero.
Solver:
Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero.
Este es el Potencial de Reposo.
Axón de jibia
VNa 41.1 mV GNa 6Scm-2
VK -73.3 mV GK 320Scm-2
VL-50.1 mV GL 330Scm-2
Vm
CM 1Fcm-2
Tarea: Calcular el potencial de reposo dadas estas conductancias y potenciales de inversión de las corrientes.
Potencial de acción de membrana.
-60,8 mV
En el potencial de reposo se cumple que Ii = 0
Vm, mV
Im, (
Acm
-2)
dt
dVCIII m
LNaK 0
0,5 ms @-80 mV
Al cambiar el potencial de la membrana inyectando corriente, Ii ya no es 0, es la corriente que necesito para ir a -80 mV.
¿Cuál será la trayectoria del potencial desconecto la corriente, es decir hago Im = 0.
Vm, mV
Im, (
Acm
-2)
0,5 ms @-80 mV
LNaKm
m IIIdt
dVC La trayectoria apunta a -60 mV
Vm, mV
Im, (
Acm
-2)
¿Cuál será la trayectoria del potencial desconecto la corriente, es decir hago Im = 0.
0,5 ms @-50 mV
¿Trayectoria esperada?
Vm, mV
Im, (
Acm
-2)
LNaKm
m IIIdt
dVC
1,0 ms @-50 mV
Vm, mV
Im, (
Acm
-2)
¿Trayectoria esperada?
LNaKm
m IIIdt
dVC
0,5 ms @-40 mV
¿Trayectoria esperada?
Vm, mV
Im, (
Acm
-2)
LNaKm
m IIIdt
dVC
Computación de la trayectoria
m
LNaKm
C
III
dt
dV
tdt
dVVtV m
mm )(
Vm, n, m y h son los valores iniciales de la trayectoria. Con estas corrientes se calcula la derivada dVm/dt
Ahora calculo el nuevo Vm
)(4KmKKK VVngNI
)(3NamNaNaNa VVhmgNI
)( LmLL VVGI
Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm a Vm(t) por t unidades de tiempo.
Computación de lo nuevos valores de n,m y h.
n, m y h infinito Tau de n, m y h (ms)
ntttt ennnn /)()( )(
n(t+t) es el nuevo valor de nn es el valor esperado para el nuevo Vm.(se lee del gráfico A)n(t) es el valor anterior de n.n es el valor de la constante de tiempo para el nuevo Vm. (se lee del gráfico B)
Vm Vm
A Bh
m
n
h
n
m
Computación de lo nuevos valores de n,m y h.
n, m y h infinito Tau de n, m y h (ms)
mtttt emmmm /)()( )(
m(t+t) es el nuevo valor de mm es el valor esperado para el nuevo Vm.(se lee del gráfico A)m(t) es el valor anterior de m.m es el valor de la constante de tiempo para el nuevo Vm. (se lee del gráfico B)
Vm Vm
A Bh
m
n
h
n
m
Computación de lo nuevos valores de n,m y h.
n, m y h infinito Tau de n, m y h (ms)
htttt ehhhh /)()( )(
h(t+t) es el nuevo valor de hh es el valor esperado para el nuevo Vm.(se lee del gráfico A)h(t) es el valor anterior de h.h es el valor de la constante de tiempo para el nuevo Vm. (se lee del gráfico B)
Vm Vm
A Bh
m
n
h
n
m
Computación de la trayectoria
m
LNaKm
C
III
dt
dV
tdt
dVtVtV m
mm )()2(
Vm, n, m y h son los valores actualizados.Con estas corrientes se calcula la derivada dVm/dt
Ahora calculo el nuevo Vm
)(4KmKKK VVngNI
)(3NamNaNaNa VVhmgNI
)( LmLL VVGI
Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm(t) a Vm(2t) por t unidades de tiempo.
Computación de la trayectoria
m
LNaKm
C
III
dt
dV
tdt
dVtVtV m
mm )2()3(
Vm, n, m y h son los valores actualizados.Con estas corrientes se calcula la derivada dVm/dt
Ahora calculo el nuevo Vm
)(4KmKKK VVngNI
)(3NamNaNaNa VVhmgNI
)( LmLL VVGI
Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm(2t) a Vm(3t) por t unidades de tiempo.
Así se continúa por toda la trayectoria...
Switch to MAPSHOW
Potencial de acción de membrana.
Tiempo, (ms)
Vm
, (m
V)
I m, (
mA
cm-2)
VK
VNa
Tiempo, milisegundos
Potencial de acción de membrana.
Tiempo, (ms)
Vm
, (m
V)
I Na,
(m
Acm
-2)
VK
VNa
INa
Potencial de acción de membrana.
Tiempo, (ms)
Vm
, (m
V)
I K, (
mA
cm-2)
VK
VNa
INa
IK