t°:\ I\' ERSID AD E DES.\ 0 1).\ l" L 0

I:\STITl'TO DE FisIC.-\ IlE S..\O C.-\ RLOS

D EPART.\ \1 [:\'1'0 DE FisIC.-\ E 1:\FOR\t.\TI<: ..\

Modclaucm Molecular da Enzima•..Q.Iiccraldeido-3-fosfato desidroQ.enase~ •..

de,T. cruzi c Analise de Potenciais".i-'

lnibidores Espcci ficos ..

Disscrtac;50 3rr~s~ntada 30 Instituto d~Fisic3 d~ 550 Carlo~ da l:ni\ er~idad.: d~'Sao Paulo para :1 oblCnt;;lo do titulo d.:M c~;tn: em" F isic a A r11cad a '0 .

S.\ () C.\ Rl.O~199~

... 'V'(~u'" r~·· P.'C~·L· ,"vfECA E.,::)L'''.'''''''' &....0<' __ ~I •.•.•••

INFORIV Ac;.AO

IFSC Universidade de Sao PauloInstituto de Fisica de Sao Carlos Fone(0162) 72-6222

Fax (0162) 74-9151

Av. Dr. Carlos Botelho, 1465Caixa Postal 369CEP 13560·970 • Silo Carlos - SP

I'lEIlBRfiSM CfiIllSSM JUlfiAOORA DA IUSSERT~M1 fiE KES1RAOOfiE IBWlb. .-tat JlMlMtl APRE~flAn INsrirUiO BE FISICA Of s~ CARLOS, BA UNIVERSIBABE n£ s~ PAUlO, Ell 16/12/1994

--n c:::' he s-----~--~-~-~-----------Prnia.Dra.Rnseaary Sancnes

~LU/iJ

Dedico esta disserta~iio a meus pais,

irmiios e, especialmente, a Gisele.

AGRADECI:\IE~TOS

A minha mae Lucia e ao meu pai Horacio, peJo apoio, peJacompreensao, pelas valorosas discussoes que travamos e pelo carinho queme dedicaram e dedicam ainda hoje.

A minha esposa Gisele pelo amor, carinho, compreensao,com·panheirismo, pelas· corre~oes ortognificas e pelas calorosasdiscussoes.

Aos meus irmaos, Roberto, Luciano e Rodrigo (em ordemdecrescente de idade) pelo apoio e amizade.

A minha amiga Gabriela Castellano pelo companheirismo, pelafor~a .e pela amizade.

Ao Prof. Glaucius pela orienta~ao e amizade.Ao Prof. Richard pelas sugestoes, discussoes e amizade.Ao amigo Eduardo Horjales pelas otimas discussoes e pela amizade.A Profa. Yvonne pelo apoio e pelas discussoes.Aos Profs. Castellano e Julio pelas discussoes cristalognificas e

pela amizade.A mo~ada do grupo, Cristininha, Teresa, Valma, Bianca, Beatriz,

Ignez, Celia, Dulce, Paulao, Marcao, Rodrigo, Joao, Geraldo, Antonio,Jorge e Ednilson pela amizade, pelo companheirismo epelas discussoes.

A secretaria Maria Helena pela ajuda inestimavel e pela amizade.Ao Gert Vriend pelas discussoes computacionais.Aos tecnicos Augusto, Geraldo e Vanda pelo apoio e peJa amizade.As bibliotecarias pela presteza e simpatia.Aos funcionarios do Instituto de Fisica de Sao Carlos pela

eficiencia.Ao CNPq pelo suporte financeiro.

1. INTRODUCAO 5

1.1 DESENHO RACIONAL DE DROGAS 61.2 A DOEN~A DE CHAGAS 9

1.2.1 Glicolise em Trypanosoma cruz; e uma Possivel Proteina Alvo 101.3 ESTRUTURA E FUN~AO DE PROTE1NAS 12

1.3.1 Funfiio Das Prote inas 121.3.2 Estrutura de Proteinas 131.3.3 Estrutura e Funfiio de Proteinas 21

1.4 METODOS EMPtRICOS PARA A DETERMINA~AO DA ESTRUTURA MOLECULAR DE UMAPROTE1NA _. . . 22

1.4.1 Crista/ogra/ia de Proteinas 221.4.2 Ressondncia Magnetica Nuclear 24

1.5 METODOS SEMI-EMPtRICOS DE DETERMINA~AO DE ESTRUTURA 251.5.1 Previsiio de estrutura secundaria 261.5.2 Modelagem por hom%gia ================================ 271.6 ESTRUTURA GERAL DAS ENZIMAS GAPDH 32

2. MODELAGEM DA GGAPDH .__ . ._. 352.1 ALINHAMENTO 352.2 CONSTRU~AO E AVALIA~AO DO MODELO 372.3 SIMULA~OES COMPUTACIONAIS 45

2.3.1 Dindmica molecular 452.3.2 Minimizafiio de energia 45

2.4 COMPARA~AO DA GGAPDH DE TRYPANOSOMA CRUZ! COM A GAPDH HUMANA_ 46

3. INIBIDORES ESPECiFICOS PARA GGAPDH DE TRYPANOSOMACRUZI 48

3.1 COMPOSTO 1: 2-METIL ADENOSINA 483.2 COMPOSTO 2: 8-TIENIL ADENOSINA 503.3 COMPOSTO 3: 2'-DESOXI-2'-(3-METOXI BENZAMIDO) ADENOSINA____ 523.4 COMPOSTO 4: 2'-DESOXI-2'-(2H-CHROMEN BENZAMIDO) ADENOSINA 553.5 COMPOSTO 5: 2'-DESOXI-2'-(BENZOIMIDAZOL) ADENOSINA 56

4. UM PROGRAMA PARA VISUALIZACAO DE ESTRUTURAS DEPROTEiNAS 58---------------------- ----

4.1 INTRODU~AO . 584.2 USANDO 0 PROGRAMA . .__ • 59

S.CONCLUSOES 63-------------------_._---6. APENDICES 66_._._---_._---- _._-_._--- ------------6.1 ALINHAMENTO ENTRE 78 SEQU~NCIAS DE GLiCERALDE1DO-3-FOSFATO

DESIDROGENASES DE VARIAS ESPECIES 66

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS_. 71

LISTA DE FIGURASFIGURA 1: REACAO CATALISADA PELA GLICERALDE1DO-3-FOSFATO DESIDROGENASE 13FIGURA 2: A) FORMA GERAL PARA UM AMINOAcIDO, R REPRESENTA A CADEIA LATERAL. B)

LIGACAO PEPT1DICA ( Q=1800±20) E ANGULOS TORSIONAIS 4» E 'Y 14FIGURA 3: NOMENCLATURA DOS ATOMOS NA CADEIA LATERAL DE UM AMINOAcIDO ISFIGURA 4: HELICE A MOSTRANDO A DISPOSICAO DAS LIGACl>ES DE HIDROG.aNIO ENTRE OS

ATOMOS DA CADEIA PRINCIPAL , ,. 17FIGURA S: FOLHA B MOSTRANDO A ASSOCIACAO NA FORMA PARALELA (A ESQUERDA) E

ANTIPARALELA (A DIREITA) 19FIGURA 6: FLUXOGRAMA GENERICO PARA A CONSTRUCAo POR HOMOLOGIA DE UM MODELO 3-

D DE PROTE1NA 30FIGURA 7: REPRESENTACAO DOS DOIS DOMINIOS DE GAPDH: 33FIGURA 8: TETRAMERO DO MODELO DA GGAPDH DE TRYPANOSOMA CRUZI VISTO AO LONGO

DO EIXO Q.. (MODELO FINAL DO TRABALHO) 34FIGURA 9: MON6MERO DA GGAPDH DE TRTPANOSOMA CRUZI. As SETAS REPRESENTAM FITAS

B E AS ESPIRAIS HELICES A. FIGURA CRIADA COM 0 PROGRAMA MOLSCRIPTO 34FIGURA 10: ALINHAMENTO FINAL USADO NA CONSTRUCAO DO MODELO DA ENZIMA

GLiCERALDEiDO-3-FOSFATO DESIDROGENASE DE TRYPANOSOMA CRUZI 38FIGURA 11: DIAGRAMA DE RAMACHANDRAN SOBRE A ESTAT1STICA DO PROGRAMA PROCHECK41FIGURA 12: CADEIA PRINCIPAL DO MODELO NA REGIAO DA ALA 72 ANTES DE SER MODELADA

(LINHA TRACESADA) E DEPOIS (LINHA SOLIDA) 42FIGURA 13: CADEIA PRINCIPAL DO MODELO (LINHA TRACESADA) NA REGIAo DE ARG 11: A)

ANTES DA MODELAGEM E B) DEPOIS DA MODELAGEM 43FIGURA 14: DISTRIBUICAo DE Xl E x2 PARA 0 MODELO FINAL 44FIGURA 15: SUPERPOSICAO DOS MON6MEROS DE T. CRUZI E DA ENZIMA HUMANA 47FIGURA 16: 2-METIL ADENOSINA. CONSTANTE DE INIBICAo ICso = 700 MM 49FIGURA 17: Sino DE LIGACAO DO INIBIDOR 2-METlL ADENOSINA. As LINHAS FINAS

REPRESENT AM A PROTE1NA, AS GROSSAS 0 INIBIDOR E AS LINHAS TRACEJADASREPRESENTAM AS INTERACOES INIBIDOR/PROTEINA 50

FIGURA 18: SEGUNDO INIBIDOR: GRUPO TIENILA NA POSICAO 8 DO GRUPO ADENINA.CONSTANTE DE INIBICAO ICso = 500 MM 51

FIGURA 19: CONTATOS ENTRE 0 GRUPO TIENILA E A ENZIMA DE T. CRUZI MOSTRANDO ASINTERACOES COM LEU 112 E MET 38 52

FIGURA 20: TERCEIRO INIBIDOR: 2' DESOXI-2'(3-METOXI BENZAMIDO) ADENOSINA 53FIGURA 21: SUPERPOSICAo DAS ENZIMAS HUMANA EM ROSA E DE T. CRUZI EM AMARELO NA

REGIAO QUE COMPOE A FENDA HIDROFOBICA 54FIGURA 22: GRAFICO DOS FATORES DE AGITACAO TERMICA DA REGIAO DA FENDA

HIDROFOBICA. ESTAO GRAFICADOS OS VALORES PARA AS ESTRUTURAS DE T. BRUCEI,B. STEAROTHERMOPHILUS E HUMANA S5

FIGURA 23: 2'-DESOXI-2'-(2H-CHROMEN BENZAMIDO) ADENOSINA 56FIGURA 24: COMPOSTO 4 INSERIDO NA FENDA HIDROFOBICA DA ENZIMA DE T. CRUZI. As

LINHAS TRACESADAS DENOTAM AS LIGACl>ES DE HIDROGtNIO INIBIDOR-ENZIMA 56FIGURA 25: 2' -DESOXI-2' -(BENZOIMIDAZOL) ADENOSINA 57FIGURA 26: A ENZIMA DE T. CRUZI EO INIBIDOR ESTAO COM A SUPERF1cIE DE VAN DER

WAALS REPRESENTADA, MOSTRANDO A EFICItNCIA DO EMPACOTAMENTO 57FIGURA 27: JANEL A DO PDBV MOSTRANDO AS JANELAS PRINCIPAL E DE RAMACHANDRAN E OS

MENU S 59FIGURA 28: ESQUEMA GERAL PARA 0 TRABALHO DE DESENHO RACIONAL DE DROGAS 64

LISTA DE TABELASTABELA 1: PROGRAMAS GRAFICOS PARA MODELAGEM MOLECULAR E BASES DE DADOS

DISPONtVEIS 6TABELA 2: ETAPAS NO PROCESSO DE DESENVOL VIMENTO DE UMA NOVA DROGA 7TABELA 3: CLASSIFICAl;AO E NOMENCLATURA DOS AMINOAcIDOS 14TABELA 4: CLASSIFICAl;AO DAS VOLTAS 20TABELA 5: ALINHAMENTO ENTRE DUAS SEQUtNCIAS IMAGINARIAS 29TABELA 6: RELAl;AO DAS PROTEINAS HOM6LOGAS A ENZIMA GGAPDH DE TRYPANOSOMA

CRUZ] COM ESTRUTURA RESOLVIDA 35TABELA 7: DIFERENl;AS ENTRE GGAPDH DE TRYPANOSOMA CRUZ] E GAPDH HUMANA 46

RESUMOFoi construido 0 modelo tridimensional da enzima gliceraldeido-3-

fosfato desidrogenase de Trypanosoma cruzi, 0 causador da doen~a de

Chagas, usando tecnicas computacionais de modelagem por homologia. 0

modelo foi comparado a enzima muscular hom610ga de humanos quanto as

diferen~as no sitio de liga~ao do cofator NAD+.

Sobre 0 modelo da enzima de T.cruzi foram construidas moleculas

anaJogas ao grupo adenosina do cofator NAD+ como tentativa de se obter um

inibidor seletivo a enzima do parasita e nao efetivo quanto a enzima de

humanos. Alguns dos compostos haviam sido ensaiados quanto a afinidade

pela enzima analoga de Trypanosoma brucei.

Foi escrito um program a de visualiza~ao grafica de modelos

moleculares que permite a analise dos parametros esteroquimicos com

rapidez e simplicidade.

The threedimensional model of the glycossomal enzyme

gliceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi, the

causative agent of Chagas disease, was built using homology modelling

computational techniques. The model was compared against the human

muscle homologous enzyme with regard to the diferences in the NAD+

binding site.

Adenosine analogs were designed based on the model of the T.cruzi

enzyme as an attempt to build selective inhibitors of the parasite enzyme

with no activity against the human enzyme. Some of the compounds were

previously tested for their affinity for the homologous enzyme from

Trypanosoma brucei.

A graphical program was written that allows the representation and

analysis of stereochemical parameters of molecular models with ease and

speed.

1. INTRODU~AO

o avan~o recente na tecnologia computacional, tanto em "hardware"

quanta em "software", tem provido os cientistas com ferramentas quase

imprescindiveis para 0 seu trabalho. A area de biologia molecular, que trata

do estudo do funcionamento de sistemas biologicos a nivel molecular, tem se

beneficiado desta nova situa~ao para desenvolver e planejar de forma mais

eficiente seus experimentos e modelos teoricos.

Existem atualmente a disposi~ao de qualquer cientista inumeros bancos

de dados com informa~oes que vao desde sequencia de aminoacidos de

proteinas ate as estruturas tridimensionais das mesmas. Estes bancos de

dados sao mantidos por programas e computadores dedicados e podem ser

acessados interativamente atraves de uma rede' de computadores que cobre

todo 0 planeta usando um computador pessoal conectado a esta rede. Hoje em

dia pode-se descobrir, em aproximadamente 10 minutos, se uma determinada

proteina ja teve sua estrutura resolvida e transferir as informa~oes

pertinentes da base de dados pesquisada para 0 seu proprio computador

pessoal. Nestes mesmos 10 minutos pode-se ainda vasculhar um banco de

dados de sequencias de proteinas usando como sonda uma proteina recem

sequenciada e obter como resultado uma lista das 200 sequencias mais

parecidas a sequencia problema.

Por outro lado, a analise de dados experimentais e de model os te6ricos

tambem ficou bastante facilitada com 0 avan~o computacional. Computadores

dedicados a representa~ao grafica tridimensional sao usados para visualizar e

alterar a estrutura tridimensional de uma biomolecula qualquer bem como

submete-Ia a simula~oes computacionais. Atualmente os programas de

modelagem molecular permitem desde a simples visualiza~ao de uma

estrutura determinada experimentalmente ate a constru~ao por metodos ab-

initio de uma estrutura tridimensional de uma proteina ficticia. Na Tabela 1

estao listados alguns dos programas graficos dedicados a este tipo de

trabalho.

6Em particular, os grupos ligados a pesquisa de novas drogas

desenvolveram uma linha de pesquisa que faz uso desta tecnologia para guiar

o desenho de novos farmacos de forma mais objetiva, chamou-se a esta linha

de pesquisa de desenho raciona/ de drogas. 0 desenho racional de drogas

po de ser usado quando esta disponivel a estrutura tridimensional de alguma

proteina (proteina a/va) relacionada a causa da doen~a, seja ela de um virus,

de uma bacteria ou uma proteina defectiva do proprio organismo portador da

doen~a.

Esta disserta~ao tem por objetivo 0 estudo de inibidores para a enzima

glicosomal gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase de Trypanosoma cruzi, que

e 0 causador da doen~a de Chagas, testados por experimentos bioquimicos na

enzima homologa de Trypanosoma brucei. Este estudo envolvera a constru~ao

do modelo tridimensional da proteina e dos inibidores bem como da

constru~ao do complexo do modelo da proteina com cada um dos inibidores.

Tambem serao construidos modelos do complexo entre os inibidores e a

estrutura cristalografica da enzima homologa humana. Os complexos serao

avaliados quanto as intera~oes inibidor-enzima de modo a comparar 0 modo

de liga~ao destes inibidores na enzima de T. cruzi e na enzima homologa

humana.

Tabela 1: Programas graficos para modelagem molecular e bases de dadosdisponiveis.

ProgramaTo~tJ)t

WHATIp3>tO(5)t

PDBVt

INSIGHr<8)~

Base de DadosOWL(2)

SwissProt(4)PIR(S)

PDB(7)

GenBank(9)

NRL-3D(10)

1.1 Desenho Racional De Drogas

o processo padrao para se encontrar uma nova droga consiste de urn

cicIo de tentativa e erro que come~a com uma sele~ao de possiveis drogas de

urn banco de dados de moleculas sinteticas e naturais. Estas moleculas

(aproximadamente 100.000) sao testadas in v itro contra 0 causador da doen~a

SERVICO Dc. B!BLI?TECA EINFORrvACAO

7e as que nao passam pelo limite minima de atua~ao sao descartadas. As que

sobram sao submetidas a testes pre-clinicos com cobaias e as que passam por

estes testes sao entao submetidas a testes clinicos com humanos. A Tabela

2(11) resume as etapas envolvidas no desenvolvimento de uma nova droga com

uma estimativa de tempo de conclusao de cada etapa.

Etapas no processo de desenvolvimento de uma novadroga.

Etao8Descobrimento do composto de partidaOtimiza9ao do composto de partidaTestes in vitro e in vivoTestes toxico16gicosTestes de seguran~a para humanosTestes de eficacia oara humanosTempo total de desenvolvimento

Temoo (anos)1-21-21-21-31

1-26-12

o tempo total de desenvolvimento de uma nova droga bem como 0

custo envolvido neste processo tem sido significativamente reduzido com a

crescente utiliza~ao da nova tecnologia de desenvolvimento racional de

drogas baseado em estruturas. Este processo e usado quando alguma proteina

(chamada de proteina alvo) relacionada a causa de determinada doen~a tem a

sua estrutura tridimensional elucidada. Existem varios metodos que podem

ser empregados na obten~ao de compostos de partida, a partir dos quais sao

feitos refinamentos ate que se obtenha a forma final do medicamento que

podera ser comercializado.

Um dos metodos parte de uma varredura inicial de uma base de dados

de compostos de interesse farmaceutico usando como parametro de exclusao

um teste de inibi~ao da proteina alvo com cada um dos possiveis candidatos a

droga. Este metoda tem a vantagem de lidar com compostos de partida para

os quais, geralmente, ja se conhece 0 comportamento in vivo, isto e, a

toxicidade no organismo, biodisponibilidade, cinetica de absor~ao e

elimina~ao, etc. Uma industria farmaceutica pode vasculhar uma base de

100.000 compostos em aproximadamente 3 meses com 0 auxilio de tecnologia

rob6tica.

8Outro metoda usa os cofatores e/ou substratos naturais de cada enzima

que sao computacionalmente modificados usando-se a estrutura da proteina

alvo como guia(12). A vantagem do uso de cofatores e/ou moleculas de

substrato como compostos de partida e que estes sao muito bem aceitos pelo

organismo. 0 composto assim obtido deve ser testado para atividade

inibitoria contra a proteina alvo.

Um terceiro metodo parte da constru~ao de novo de mole cuIas a partir

da conforma~ao da proteina alvo usando um banco de fragmentos de

moleculas na constru~ao de um composto de partida(13,14). Estas moleculas

devem, como no caso anterior, ser testadas in vitro para atividade de inibi~ao

contra a proteina alvo.

Uma vez encontrados os compostos de partida que apresentam uma

constante de inibi~ao razoavel, estes devem passar para a etapa de

otimiza~ao. Esta etapa envolve a determina~ao da estrutura do complexo

proteina alvo-inibidor para que se possa estabelecer qual 0 modo de liga~ao

do inibidor no complexo. Uma vez conhecido 0 modo de liga~ao do inibidor

com a proteina alvo podem-se fazer modifica~oes do inibidor inicialmente

proposto de modo a aumentar a especificidade e a constante de liga~ao desta

pequena rnolecula para com a proteina.

Urn born exemplo da eficiencia do desenho racional de drogas foi

apresentado por Colman e colaboradores(15) num trabalho que envolveu a

coopera~ao entre uma universidade e uma empresa farmaceutica. 0 trabalho

reporta a obten~ao de drogas capazes de inibir a replica~ao in vitro e in vivo

dos virus da gripe, influenza A e B. Estes virus tem a capacidade de

promover muta~oes nos residuos expostos de suas enzimas antigenicas numa

taxa muito elevada de modo que 0 sistema imune do hospedeiro nao possa

criar defesas com eficiencia. A estrutura cristalografica da enzima viral

neuraminidase, critica para a movimenta~ao do virus na mucosa do trato

respiratorio e para a sua evasao de celulas ja infectadas, submetida as

tecnicas acima descritas, permitiu 0 desenvolvimento de dois inibidores que

atuam em uma regiao do sitio ativo.

1.2 A Doen~a de Chagas

A doen~a de Chagas foi descoberta pelo cientista Carlos Chagas que

por volta de 1909 encontrou formas epimastigotas de um flagelado no

intestino de um inseto hematefago conhecido como barbeiro (Triatoma

infestans, Panstrongylus megistus e Triatoma sordida entre outros) que

infestava as moradias das areas rurais de Minas Gerais. Em seguida, Chagas

provou que estes flagelados eram infectantes para sagiiis, caes e roedores.

Mais tarde identificou 0 flagelado, que foi batizado de Trypanosoma cruzi,

no sangue de uma crian~a que vivia em uma casa infestada pelo barbeiro

providenciando assim 0 primeiro exemplo de uma doen~a descoberta primeiro

no transmissor da doen~a e depois no ser humano. Foi constatado que mais de

190 especies de mamiferos e invertebrados sao portadores do T. cruzi

mostrando que a reserva natural do tripanossomo e praticamente inesgotavel

sendo portanto inexequivel qualquer tentativa de erradica~ao dos

tripanossomos.

A infec~ao pelo Trypanosoma cruzi nao ocorre durante a picada do

barbeiro, mas sim quando 0 individuo picado co~a a regiao atingida levando

para dentro do orificio recem-aberto as fezes do barbeiro que contem os

metatripanossomos fazendo com que estes alcancem a corrente sangiiinea.

Uma vez na corrente sanguinea, os tripanossomos invadem as celulas do

hospedeiro e passam para a forma amastigota. A forma amastigota multi plica-

se por divisao binaria e pode permanecer na celula por longos periodos de

tempo. Durante 0 cicIo de vida do T. cruzi as formas amastigotas

transformam-se em tripomastigotas (formas providas de flagelo) e vao para a

corrente sangiiinea levando a infec~ao para outras celulas do organismohospedeiro. (16)

A doen~a manifesta-se de forma nao muito severa, entre duas a tres

semanas apes a infec~ao, podendo levar a quadros de miocardite e

meningoencefalite em crian~as muito jovens, esta ultima sendo fatal em

aproximadamente 50% dos casos. As piores complica~oes da doen~a de

Chagas desenvolvem-se de 10 a 20 anos apes a infec~ao, e sao caracterizadas

por cardiopatia cronica (27% dos infectados), complica~oes cronicas

10digestivas (6%) e neurol6gicas (3%). Os pacientes com graves doen~as

cronicas vao se tornando cada vez mais debilitados ate a morte, geralmente

por falha do cora~ao. A Organiza~ao Mundial da Saude estima que entre

16 e 18 milhoes de pessoas estao infectadas com 0 Trypanosoma cruzi,

destes, aproximadamente 2 a 3 milhoes ja devem ter desenvolvido as

complica~oes cronicas, enquanto que 3 mil hoes ou mais ainda estao no

estagio de incuba~ao e poderao desenvolver a doen~a no futuro. Ocorrem por

consequencia da doenya de Chagas aproximadamente 45.000 mortes por ano

(estimativa baseada em estudos longitudinais para 0 bienio 1991-1992). (17)

1.2.1 Glic6lise em Trypanosoma cruz; e uma Possfvel Proteina Alvo

A forma intravertebral (sanguinea) do Trypanosoma cruzi possui urn

mitocondrio inativo fazendo com que 0 flagelado seja completamente

dependente da via glicolitica para as suas necessidades energeticas, isto e,

todo 0 ATP sintetizado pelo T. cruzi e obtido a partir da conversao de glicose

em piruvato. De acordo com Opperdoes(18,19), 0 T. cruzi tern uma organela

chamada glicossomo, caracteristica da familia tripanossomatida, que contem

nove enzimas envolvidas nas reayoes da via glicolitica. Esta

compartimentaliza~ao faz com que a glic6lise proceda a uma taxa superior it

observada em qualquer outro organismo. Foi mostrado por ensaios in vitro e

in vivo(20) que a inibi~ao da glic6lise causa 0 desaparecimento dos

tripanossomos da corrente sanguinea do hospedeiro mamifero. Foi observado

que a enzima glicossomal gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (gGAPDH)

que participa da glic6lise na etapa em que 0 gliceraldeido-3-fosfato e

convertido em 1,3-bisfosfoglicerato tern tambem urn papel importante no

controle do fluxo de metab6litos na interface glicossomo-citossol(21).

Visto que 0 bloqueio da via glicolitica no Trypanosoma cruzi causa a

sua morte, investigou-se quais enzimas poderiam servir como proteina alvo

para desenho racional de drogas. A enzima glicossomal gliceraldeido-3-

fosfato desidrogenase mostrou-se adequada ao trabalho pelos seguintes

motivos:

111. foram verificadas diferenyas de afinidade pelo cofator entre as

enzimas humana e de T. cruzi,

2. urn estudo comparativo entre a sequencia de Trypanosoma cruzi e as

estruturas das enzimas humana e de Bacillus stearothermophilus

evidenciou diferenyas na regiao do sitio de ligayao do NAD+,

3. estavam disponiveis estruturas cristalograficas de enzimas

homol6gas (ver Tabela 6) e

A constatayao de que a enzima GAPDH humana apresenta uma

afinidade por NAD+ 5 a 10 vezes maior que a afinidade da gGAPDH de

T. cruzi pelo mesmo cofator implica diferenyas na estrutura 3-D do sitio de

ligay8.o do cofator entre as duas proteinas.

o objetivo de urn trabalho de desenho racional de drogas e a obtenyao

de urn inibidor que seja 0 mais especifico possivel para a enzima alvo. Deste

modo a existencia de diferenyas em regioes importantes para a enzima (como,

por exemplo, a regiao de ligayao do cofator NAD+) e fundamental para urn

melhor desempenho do inibidor. No Apendice 6.1 encontra-se 0 alinhamento

completo das 78 sequencias de GAPDH de diferentes especies encontradas no

Banco de Dados SwissProt. Neste alinhamento as colunas demarcadas com

fundo cinza representam posiyoes para as quais 75% das sequencias

apresentam 0 mesmo aminoacido. 0 alinhamento mostra que estas enzimas

foram bastante conservadas durante 0 processo evolutivo, sendo este urn

ponto nao muito favoravel quando se esta procurando uma proteina alvo para

desenho de drogas. Entretanto, urn estudo comparativo entre a estrutura

cristalografica da GAPDH human a e a sequencia da enzima hom6loga de

Trypanosoma brucei evidenciou diferenyas na regiao do sitio de ligayao do

NAD+ confirmando a viabilidade desta enzima como alvo para um trabalho de

desenho racional de drogas(22).

12A disponibilidade de estruturas cristalognificas de enzimas hom610gas

a proteina alvo e imprescindivel para a criay80 de urn modelo tridimensional

da macromolecula.

A disponibilidade da enzima em quantidade para a eXeCUy80de testes

de atividade e para a determinay80 da estrutura cristalognifica do complexo

com os inibidores e imprescindivel para que 0 cicIo do desenho racional de

drogas possa ser completado.

1.3 Estrutura e Fun~io de Proteinas

1.3.1 Fun~io Bas Proteinas

Proteinas S80 usadas por organismos vivos na fOrmay80 de tecidos

conjuntivos (colageno e queratina), no transporte de pequenas moleculas

atraves do organismo (hemoglobina e mioglobina) e na catalise de reayoes

quimicas (GAPDH, anidrase carbonica, rodopsina e tirosina quinase entre

outras). Em virus as proteinas existem para formar a capsula viral e na forma

de enzimas chave na infesta~80 das celulas e posterior repliCayRo. As

proteinas que catalizam algum tipo de rea~ao sao chamadas de enzimas e

formam a classe de proteinas que apresenta maior variabilidade funcional e

conformacional.

Estas enzimas associam-se ao substrato (molecula que sofrera a rea~80

quimica) e opcionalmente a algum cofator (molecula que participa da reay80

de alguma maneira) diminuindo a energia de ativa~80 de uma determinada

reay80. Oentre os cofatores mais comuns esHio 0 NAO+ (nicotinamida

adenosina difosfato), FAD (flavina adenosina difosfato), 0 ATP (adenosina

trifosfato) e 0 GTP (guanosina trifosfato). Em particular, as

gliceradeido-3-fosfato desidrogenases S80 enzimas que catalizam a rea~ao de

oxidorredu~80, mostrada na Figura I, que consiste na transfOrmay80 de

gliceraldeido-3-fosfato em 1,3-bisfosfoglicerato usando como cofator uma

molecula de NAO+.

o funcionamento e as caracteristicas de uma proteina S80 regidos por

sua conforma~80 tridimensional. Oeste modo, para que seja possivel a

modificay80 das propriedades de determinada enzima ou a Criay80 de uma

13proteina com funlt0es diferentes ou a elaboraltio de uma molecula pequena

capaz de inibir uma determinada enzima deve-se, primeiro, entender a

organizaltio a nivel atomico das estruturas protei cas.

NAD+ NADHHH 0 \J HH 0opot-t-t-t + Pi ..•••••. OP03

2--t-t-t + H+I I \ 1 I I \ 2-H OH H H OH OP03

GAPDH

Rea~io catalisada pela gliceraldefdo-3-fosfatodesidrogenase.

Proteinas sio macromoleculas formadas por aminoacidos que ligam-se

uns aos outros numa cadeia linear atraves da formaltio de ligaltoes

peptidicas. Estes aminoacidos sio formados por uma parte constante (em

negrito na Figura 2A) e uma parte variavel (a cadeia lateral, simbolizada por

R na Figura 2A). A sequencia dos aminoacidos em uma proteina e chamada

de estrutura primaria. Esta estrutura primaria se enovela de modo a formar

a estrutura terciaria, que e a conformaltio tridimensional de uma fita

continua de proteina. A conformaltio adotada pela associaltio de duas ou

mais cadeias de proteina recebe 0 nome de estrutura quaternaria. A parte

constante e responsavel pela formaltio das ligaltoes peptidicas da cadeiaprincipal.

I ?.....c-~ I ?

InN -&-c-E7cR I 4> I 0/ .•..

R

H,ca!R

A) Forma geral para um aminoacido, R representa a cadeialateral. B) Liga~io peptidica ( Q=1800±20) e ingulostorsionais C1> e 'P.

As cadeias laterais R silo escolhidas de um elenco de 20 aminoacidos

os quais silo classificados por sua natureza quimica de acordo com a Tabela

CaracteristicaQuimicaalifaticos GLICINA

PROLINAALANINAVALINA

1S0LEUCINALEUC1NA

FEN1LALANINATIROSINA

TRIPTOFANOMETlONINA

CISTEfNASERINA

TREONINAASPARTATO

ASPARAG1NAGLUT AMATOGLUTAM1NA

LIS1NAARGININAHISTIDINA

CodigoTres letras

GLYPROALAVAL1LELEUPRETYRTRPMETCYSSERTHRASPASNGLUGLNLYSARGHIS

CodigoUma letra

GPAVIL

FYW

MCS

T

DNE

QKRH

as atomos da cadeia lateral silo identificados atraves de uma

nomenclatura padrao definida pel a "IUPAC". A primeira letra do nome do\

atomo define 0 tipo do atomo, a segunda letra e do alfabeto grego e define a

distancia deste atomo com rela~ilo ao carbono alfa (CA) em termos do

numero de liga~oes covalentes e a terceira letra distingue atomos Ii mesma

15distancia de ligayoes do carbono alfa quando existe ramificayao da cadeialateral.

+ +H N -Ca-COO H N -CA-COO

3 I 3 IC ~ ••••-- ••- C 8I I

Cy CGI Ics co

/ " / \0&1 0 &2 0 E1 0 E2

Nomenclatura dos atomos na cadeia lateral de umaminoacido.

A conformayao das cadeias laterais e definida pelos angulos diedros Xn

(1 :5;n:5;5)exceto para os aminoacidos glicina e alanina que nao possuem

atom os suficientes para definir angulos torsionais na cadeia lateral.

A conformayao da cadeia principal de uma proteina e completamente

caracterizada por tres angulos diedros: os angulos ~ (formado pelos atomos

Ci-l, Ni, Cai e Ci), 'V (Ni, Cai, Ci e Ni+d e n (Cai, Ci, Ni+l e Cai+d mostradosna Figura 2B.

o angulo n contem a ligayao peptidica e e restrito a (180±20)O devido

a conjugayao dos eletrons 1t da ligayao C=O com 0 par de eletrons nao ligado

do nitrogenio. Os angulos ~ e \II tambem sao restritos, porem devido a

impedimentos estericos entre os atomos da cadeia lateral e os atomos da

cadeia principal(23). As excessoes sao a prolina e a glicina, a prolina por ter 0

angulo ~ restrito em aproximadamente -640 devido a ligayao covalente entre

o Co da cadeia lateral eoN da cadeia principal e a glicina por nao

apresentar restriyoes aos angulos ~ e \II devido a ausencia de cadeia lateral.

Verificou-se que 0 interior de proteinas hidrossoluveis era formado

quase que exclusivamente por aminoacidos hidrof6bicos, isto levou ahip6tese de que a principal forya motriz que leva uma proteina hidrossoluvel

a enovelar-se e a tendencia de agrupar as cadeias laterais hidrof6bicas no

interior da proteina deixando as cadeias hidrofilicas para fora. 0 problema

do agrupamento de cadeias hidrof6bicas no interior da proteina e que a

16cadeia principal tambem deve acomodar seus grupos polares (carbonila e

amino) neste interior hidrof6bico. A natureza resolveu este problema com 0

uso de estruturas secundarias. A estrutura secundaria aparece entre a

estrutura primaria e a estrutura terciaria e e 0 elemento estrutural que forma

o chamado esqueleto da proteina. Os elementos de estrutura secundaria sao

trechos da estrutura primaria que adotam uma conformayao onde todos os

aminoacidos tern aproximadamente os mesmos angulos cI> e \II e quase todos os

grupos carbonila e amino formam ligayoes de hidrogenio com outros grupos

amino e carbonila da cadeia principal. Este padrao de ligayoes de hidrogenio

resolve assim 0 problema de grupos carregados inseridos num ambiente

hidrof6bico.

Atualmente as estruturas secundarias sao classificadas como helice a.,

helice 310, helice 1t, fita ~ e voltas. Estas estruturas secundarias sao

caracterizadas por angulos cI>e \11 e por padroes de ligayao de hidrogenio.

As helices a. sao responsaveis por aproximadamente metade dos

elementos de estrutura secundaria ate agora determinados, sendo formadas

atraves da repetiyao de angulos cI>--600 e \11--500 num determinado trecho da

cadeia polipeptidica. Esta repetiyao propicia urn arranjo ideal para a

formayao de ligayoes de hidrogenio entre os grupos carbonila e amino da

cadeia principal. Mais precisamente, 0 oxigenio da carbonila do residuo n faz

uma ligayao de hidrogenio com 0 amino do residuo n+4. Dada a natureza

peri6dica da helice a. pode-se definir 0 numero de aminoacidos por volta (3,6

aa/volta), a altura de uma volta completa (5,4 A) e 0 deslocamento por

residuo ao longo do eixo da helice (1,5 A).

Helice a mostrando a disposi~io das liga~oes dehidrogenio entre os atomos da cadeia principal.

As helices a sao em sua maioria de mao-direita, isto e, olhando-se ao

longo do eixo da helice no sentido N-C terminal os aminoacidos "giram" no

sentido horario. Helices a de mio-esquerda sio menos provaveis porque

existem choques entre as cadeias laterais e os grupos carbonila da cadeia

principal. As helices a ocorrem geralmente em tamanhos que via de 5 a 10

aminoacidos podendo chegar a 40 aminoacidos.

o arranj 0 peri6dico de aminoacidos numa helice alfa faz com que todas

as liga90es de hidrogenio da cadeia principal estejam na dire9io do eixo da

helice alfa, como mostra a Figura 4, produzindo urn dipolo na helice alfa que

gera uma carga parcial positiva na extremidade N-terminal e uma carga

parcial negativa na extremidade C-terminal. A presen9a de carga e de grupos

NH livres na extremidade N-terminal de uma helice alfa propicia urn

ambiente ideal para a liga9io de moleculas com carga negativa, como por

exemplo, ATP e NAD+ que contem grupos fosfato. Entretanto, raramente sio

encontrados Iigantes positivos na extremidade C-terminal de uma helice a,

em contrapartida os aminoacidos com cadeia lateral positiva (LYS e ARG)

"fecham" estas extremidades negativas.

18As helices 310 nao SaDtao comuns e nem tao extensas quanto as helices

alfa. As liga~oes de hidrogenio ocorrem entre 0 residuo n e 0 residuo n+3

com os angulos cP--49° e 'V--26°. As liga~oes de hidrogenio nas helices 310

nao SaD alinhadas como na helice alfa e a geometria desta helice provoca

mais choques entre as cadeias laterais e a cadeia principal, desfavorecendo

assim esta estrutura secundaria.

A helice 1t e ainda mais rara que a helice 310, os angulos que definem

sua cadeia principal SaD cP--57° e 'V--70° fazendo com que as liga~oes de

hidrogenio ocorram entre 0 residuo n e 0 residuo n+5. Este tipo de estrutura

possui uma cavidade no interior, ao longo do eixo da helice, que diminui as

intera~oes de van der Waals.

A fita 13 e responsavel pela forma~ao das folhas 13, a segunda estrutura

secundaria que ocorre com maior freqo.encia entre as estruturas resolvidas de

proteinas. A fita 13 e caracterizada pela repeti~ao dos angulos cjl--64° e

'V-+ 1700• Ao contrario das helices, as fitas 13 nao compoe por si so urn

elemento de estrutura secundaria, elas devem se associar a outras fitas 13

atraves de liga~oes de hidrogenio para formar a folha 13. Duas fitas 13 podem

se associar de forma paralela ou antiparalela como mostra a Figura 5.

A associayao na forma paralela ocorre quando as duas fitas estao

orientadas com suas extremidades N-terminal fazendo liga~ao de hidrogenio

uma com a outra. A associa~ao antiparalela ocorre quando 0 N-terminal de

urna fita faz ligayoes de hidrogenio com 0 C-terminal da outra fita.

N N C\ \ ICa Ca CaI I \

O=C ••O=C N-H\ .•••••_4#- \ IN-H'" N-H·------O=CI I \

Ca Ca Ca\ \ IC=0._ C=0 ·------H-NI -""-..... I \

N -H-N C=O\ \ ICa Ca CaI I \

O=C ••O=C N-H\ ...-_..-- \ IN-H·" N-H·------O=CI I \

Ca Ca Ca\ \ I

c\ /c\ /Associa~oParalela

Associa~oAntiparalela

Folha ~ mostraodo a associa~io oa forma paralela (aesquerda) e aotiparalela (a direita).

As folhas J3 ocorrem ou somente com fitas paralelas, ou com fitas

antiparalelas, ou com uma mistura de fitas paralelas e antiparalelas, sendo

esta ultima modalidade mais incomum que as duas primeiras. Todas as folhas

J3 tem uma tory80 de mao-direita sendo que as toryoes de mao-esquerda nao

foram encontradas ate hoje.

As conexoes entre os elementos de estrutura secundaria sac feitas por

voltas ou por "loops". As voltas tem sempre quatro aminoacidos

(i, i+ 1, i+2 e i+3) sendo que a distancia entre Cai e 0 Cai+3 deve ser menor

que 7 A e os residuos (i+l e i+2) nao podem ter conformayao de helice a.

De acordo com estas restriyoes, as voltas podem ser classificadas em termos

cP e \II como sendo dos tipos I, 1', II e 11'(24) (existem outras classificayoes

mas estas quatro sac as mais frequentes). Algumas voltas tern preferencia por

certos aminoacidos como mostra a Tabela 4.

Tipo I II I' II' Resto

Ocorrencia 41 % 26 % 6% 6% 27

Preferencia NENHUMA Gem i+2 Gem i+2 G em i+l NENHUMA

Os loops sao trechos da sequencia com comprimento de 5 a 40

aminoacidos que ficam geralmente expostos ao solvente e por isso tern uma

quantidade maior de residuos hidrofilicos. Os grupos carbonila e amino

geralmente nao fazem ligayoes de hidrogenio entre si e por isso ficam

disponiveis para faze-Ias com mole cui as de agua do solvente, ions ou outras

moleculas presentes. Por estarem os loops expostos e por nao terem ligayoes

de hidrogenio regulares entre atomos da cadeia principal sao geralmente mais

flexiveis que os elementos de estrutura secundaria. Foi verificado que as

regioes de inseryao e/ou deleyao presentes em urn alinhamento entre

proteinas homologas ocorrem quase que exclusivamente nas regioes de loops.

A variabilidade em tamanho e conformayao dao aos loops tambem uma

variedade de funyoes que vao desde a simples conexao de dois elementos de

estrutura secundaria ate a ligayao de proteinas inteiras (imunoglobulinas), de

ions (calmodulina) e formayao de sitios-ativos (enzimas).

Com 0 grande numero de estruturas de proteinas resolvidas foi possfvel

desenvolver uma classificayao para os arranjos que determinados grupos de

elementos de estrutura secundaria adotam. Estes arranjos levam 0 nome de

dominios e geralmente caracterizam uma funyao, por exemplo, as lactato

desidrogenases e as gliceraldefdo desidrogenases que sao protefnas que ligam

nucleotideos tern no dominio de ligayao urn enovelamento de Rossmann,

descrito na seyao 1.6, que apresenta-se ideal para fazer a ligayao destes

nucleotideos.

o enovelamento de Rossmann contem varios motivos do tipo f3af3,

estes motivos ocorrem com frequencia em varios tipos de domfnios, como por

exemplo nos barris af3. Dois outros motivos encontrados em proteinas sao 0

a.-loop-a. e 0 J3-loop-J3.

21Uma proteina e geralmente formada por mais de um dominio, por

exemplo, a piruvato quinase contem tres dominios, urn "sanduiche" de fitas 13

antiparalelas, urn barril a.f3 e uma folha de fitas paralelas formada por

motivos 13a.13.

Usando os elementos de estrutura secundaria pode-se classificar as

proteinas em tres grupos, das proteinas que contem somente helices a., das

que contem somente fitas 13 ou das que contem helices a. e fitas 13. Esta

classifica~ao mostrou-se util, pois, associada a experimentos de dicroismo

circular, pode ajudar a preyer a quantidade relativa de helices a., fitas f3 e

estruturas aleat6rias (loops e voltas), fornecendo assim informa~oes sobre a

estrutura da proteina.

1.3.3 Estrutura e Fun~io de Proteinas

A rela~ao entre a estrutura tridimensional e a fun~ao de uma proteina

fica evidente no caso da anemia falciforme. Nesta doen~a congenita ocorre

uma muta~ao onde 0 GLU da posi~ao 6 das cadeias 13 do tetramero a.2132 da

hemoglobina e trocado por uma VAL, esta muta~ao cria uma regiao

hidrof6bica na proteina que se encaixa perfeitamente em um bolso

hidrof6bico de outra hemoglobina provocando uma "polimeriza~ao" de

hemoglobinas. A polimeriza~ao reduz drasticamente a solubilidade da

hemoglobina desoxigenada levando a forma~ao de precipitados fibrosos

dentro das celulas vermelhas, 0 que causa a sua deforma~ao provocando uma

anemia cronica que pode levar 0 individuo a morte.

E interessante notar que esta doen~a ocorre apenas nos portadores

homozigotos do gene que codifica a hemoglobina defeituosa, os portadores

heterozigotos nao apresentam qualquer sintoma. Uma pesquisa revelou que

aproximadamente 40% dos negros africanos apresentam a condi~ao de

heterozigoto para 0 gene defeituoso, isto e explicado evolutivamente pela

resistencia que individuos heterozigotos apresentam contra a forma mais letalde malaria naquela regiao.(27)

Dutro exemplo indicativo da rela~ao estrutura-fun~ao em proteinas e

encontrado na familia das serino-proteases. As serino-proteases contem a

22chamada triade catalitica. Este conjunto de tres aminoacidos essenciais a

catalise da quebra da liga~ao peptidica nunca varia nao importando a

especificidade da rea~ao. Das estruturas de serino-proteases resolvidas ate

hoje a enzima subtilisina nao apresenta qualquer semelhanca de sequencia ou

estrutura 3-D com as outras enzimas, nao obstante, os aminoacidos

importantes a liga~ao do substrato e a catalise estao praticamente na mesma

conforma~ao montando um sitio ativo igual ao das outras serino proteases.

Este exemplo alem de ressaltar a importancia da estrutura para uma

determinada fun~ao tambem fornece um exemplo de evolu~ao convergente,

isto e, a natureza modificou enzimas sem nenhuma rela~ao previa para que

hoj e em dia seus sitios ati vos fossem praticamente identicos. (25)

1.4 Metodos empiricos para a determina~io da estrutura molecular deuma proteina

Existem duas tecnicas para se determinar a estrutura, a nivel atomico,

de uma proteina, a difra~ao por raios-X ou neutrons e a espectroscopia de

ressonancia magnetica nuclear. Embora as tecnicas de difra~ao necessitem de

quantidades grandes de proteina, num estado de altissima pureza, para que

possa ser obtido um cristal de proteina adequado aos experimentos de

difracao, ela nao tem limites quanto ao tamanho da proteina. A tecnica de

espectroscopia de ressonancia magnetica nuclear (R.M.N), embora nao

necessite de cristais de proteina, tem seus limites no tamanho da proteina da

qual se quer obter a estrutura tridimensional. Esta tecnica tem sido usada na

obten~ao de estruturas de proteinas com ate 25 KDa de Massa molecular com

qualidade comparavel as estruturas cristalograficas de 2,0 A de resolu~ao(26).

1.4.1 Cristalografia de Proteinas

A maior parte das estruturas tridimensionais de proteina vem do

resultado de experimentos de difra~ao de raios-X. A tecnica se baseia na

absor~ao e emissao de raios-X pelos eletrons da proteina. Quando estes

eletrons estao dispostos num arranjo peri6dico ordenado, como em um

monocristal, a interferencia entre os raios-X emitidos por cada eletron

23espacial ao qual 0 cristal pertence e da molecula que esta causando 0

espalhamento dos raios-X.

A experiencia de difra~ao de raios-X de um cristal qualquer resulta

num conjunto de dados que contem os indices (h, k e I) das "reflexoes", suas

respectivas intensidades espalhadas (I) e um erro associado Ii medida de cada

reflexao. Para se chegar a um mapa da densidade eletronica do cristal, a

partir do qual se constroe 0 modelo tridimensional da molecula, e necessario

fazer uma transformada de Fourier usando as intensidades coletadas e suas

respectivas fases. 0 problema surge porque as fases de cada reflexao nao

podem ser medidas experimentalmente. Para contornar este problema foram

desenvolvidas as tecnicas de substitui~ao isomorfa multi pIa e substitui~ao

molecular que permitem uma estimativa inicial das fases para cada reflexaohkl.

A tecnica de substitui~ao isomorfa multipla requer a produ~ao de

cristais com a proteina nativa e cristais (com 0 mesmo grupo espacial e

dimensoes de cela unitaria) com derivados de atomos pesados. Os cristais saG

coletados e com 0 uso do metodo de Patterson pode-se ohter uma estimativa

das fases iniciais.

A tecnica de substitui~ao molecular pode ser usada quando se sabe de

antemao que a proteina da qual se quer resolver a estrutura e

tridimensionalmente parecida com uma proteina que ja tenha estrutura

resolvida. Esta estrutura-sonda e entao colocada na cela unitaria do cristal,

rotada e translacionada ate que se encontre uma orienta~ao adequada que

forne~a a estimativa inicial das fases para cada reflexao hkl.

o resultado final de uma determina~ao de estrutura de proteina usando

a tecnica de difra~ao de raios-x e um arquivo contendo uma lista dos atomos

da proteina com cinco valores experimentais, as coordenadas x, y e z, um

fator de agita~ao termica B e opcionalmente um fator de ocupa~ao Occ.

Grosso modo, 0 fator de agita~ao termica e uma medida da agita~ao do

atomo dentro do crista!. Este valor pode ser uti! para se determinar quais

regioes de uma proteina SaGmais flexiveis e quais SaGmais rigidas. 0 fator

24de ocupayao e uma medida estatistica da distribuiyao de conformayoes para

urn determinado atomo. 13 comum encontrar uma estrutura com duas

conformayoes para urn mesmo aminoacido (variando por exemplo no angulo

Xl). a conformayao mais frequente leva urn fator de ocupayao maior enquanto

que a menos frequente leva urn fator de ocupayao menor. A soma dos fatores

de ocupayao para urn mesmo atomo deve ser sempre igual a 1.

1.4.2 Ressonincia Magnetica Nuclear

A espectroscopia de ressonancia magnetica nuclear pode ser conduzida

em substancias que possuam atomos com momenta nuclear magnetico.

geralmente estes atomos tern massa atomica impar (por exemplo IH. lIB. 13C,

15N, 19p. 31p. etc). 0 proton pode ser considerado como uma unidade de carga

que gira em torno de seu proprio eixo. como toda carga que gira este proton

cria urn pequeno campo magnetico ao longo do seu eixo de rotayao.

Se este nucleo for agora colocado sob a influencia de uma campo

magnetico externo, ele ira precessionar em torno da direyao do campo

magnetico de forma paralela ou antiparalela definindo os niveis de energia

inferior e superior respectivamente. A energia entre estes dois estados e

caracteristica do tipo de nucleo e do campo magnetico externo experimentado

pelo mesmo. A aplicayao de urn pulso de radio-frequencia apropriado a uma

coleyao destes nucleos induz a uma transiyio entre os dois estados que por

sua vez gera uma magnetizayio transversal detectavel experimentalmente. 0

valor da tecnica de ressonancia magnetica nuclear vem do fato de que 0

campo magnetico experimentado pelo nucleo e a soma do campo magnetico

externo e dos pequenos campos magneticos gerados pelos atomos vizinhos ao

nucleo que esta sendo medido. 0 mesmo nucleo sob 0 mesmo campo

magnetico externo pode entao gerar diferentes picos no espectro resultante

devido aos diferentes vizinhos, esta diferenya e chamada de deslocamento

quimico.

Existem essencialmente dois tipos de experimentos de R.M.N.

bidimensionais que produzem informayoes bastante diferentes. No primeiro,

chamado de espectroscopia correlacionada ("correlated spectroscopy" -

25COSV), 0 experimento resulta num mapa bidimensional onde os plCOS

definem conectividades entre protons separados por nao malS que tres

liga~oes covalentes. Estes mapas tambem fornecem informa~oes sobre

angulos diedros. No segundo, chamado de espectroscopia bidimensional de

melhoramento nuclear Overhauser ("2D nuclear Overhauser enhancement

spectroscopy" - NOESY), 0 experimento fornece um mapa bidimensional

onde os picos representam distancias entre pares de protons separados por

menos de 5 A. A intensidade de um pica fornece a distancia entre os protons

que deram origem ao pico.

o resultado final para esta tecnica e tambem um arquivo contendo uma

lista dos litomos e de suas coordenadas. Neste caso entretanto nao sao

definidos os fatores de agita~ao termica e nem os fatores de ocupa~ao.

Frequentemente os arquivos de estruturas resolvidas por esta tecnica

apresentam nao apenas uma conforma~ao para a estrutura da proteina mas

sim um conjunto de conforma~oes que estao de acordo com os valores

mensurados. A representa~ao grafica da superposi~ao de todas as

conforma~oes definidas no arquivo permite, assim como no caso do fator de

agita~ao termica, encontrar quais regioes sao mais flexiveis.

1.5 Metodos Semi-Empiricos de Determina~io de Estrutura

Os metodos semi-empiricos estao baseados nos resultados anteriores de

experimentos de determina~ao de estrutura, cinetica enzimatica, dicroismo

circular, mutagenese sitio-dirigida e outros. 0 conhecimento sobre estruturas

de proteinas e seu funcionamento, adquirido com 0 passar dos anos e apos

muitos e variados experimentos, foi compilado numa serie de regras que

permite, hoje em dia, fazer a predi~ao da estrutura tridimensional de uma

proteina partindo apenas da sua sequencia de aminoacidos.

A regra principal sobre a qual esta apoiada a tecnica de modelagem

molecular pode ser resumida na frase:

"A estrutura tridimensional de umaproteina, no seu ambiente natural, e[umyao de sua estrutura primaria. "

26Este fat 0 foi evidenciado ap6s experimentos de desnatura~ao

(destrui~ao da estrutura terciaria e secundaria) e renatura~ao da ribonuclease

bovina(27). Experimentos de desnatura~ao e renatura9ao de proteinas tem

mostrado que tais moleculas, naturais ou artificiais, podem ser

reversivelmente enoveladas e desenoveladas(28) sem a ajuda de outras

enzimas. Estes experimentos implicam que em determinados ambientes, a

sequencia de aminoacidos e, por si s6, suficiente para definir a estrutura

tridimensional da proteina. Nao obstante, existem proteinas que nao sao

capazes de chegar a sua conforma~ao final sem 0 auxilio de enzimas

especiais que ajudam na fase final do seu enovelamento. Estas enzimas

especiais sao as chaperoninas que ligam proteinas globulares de ate90 KDa(29,30).

Existem duas formas de se fazer a predi9ao da estrutura terciaria para

uma sequencia de aminoacidos, a primeira parte da informa~ao compilada a

partir das estruturas de proteina contidas no PDB resolvidas

experimentalmente, a segunda usa as pr6prias estruturas experimentais como

base na proposi~ao do modelo para a estrutura terciaria.

o resultado de analises bioquimicas e biofisicas, especificas para a

proteina de interesse, podem fornecer indica~oes importantes para a

constru~ao do modelo da proteina. Por exemplo, experimentos de dicroismo

circular podem fornecer as propor~oes relativas entre os elementos de

estrutura secundaria, experimentos de mutagenese sitio-dirigida podem

ajudar na localiza9ao de aminoacidos importantes a catalise e experimentos

de cinetica quimica indicam como esta agindo um determinado inibidor

proposto por desenho racional.

1.5.1 Previsio de estrutura secundaria

No metodo de previsao de estrutura secundaria as informa~oes contidas

no PDB sao compiladas num conjunto de regras de modo a fornecer a

probabilidade de ocorrencia de cada aminoacido em cada uma das estruturas

secundarias existentes (helice alfa, fita beta ou volta). A proteina problema e

27entio analisada de acordo com as regras acima para prever qual a provavel

estrutura secundaria associada a cada trecho da sequencia problema.

Embora a amostragem estatistica aumente dia-a-dia melhorando a

confiabilidade do metodo, 0 processo de constru~ao deste conjunto de regras

e degenerativo, isto e, existe uma perda de informa~io quando os dados de

uma estrutura terciaria sio compilados para informa~io de estrutura

secundaria. Por exemplo, duas fitas 13 com conforma~oes tridimensionais

diferentes sio classificadas no conjunto de regras simplesmente como fitas 13.

Com esta informa~io em mios, tenta-se encontrar 0 melhor arranjo

espacial entre os elementos de estrutura secundaria que respeite a

distribui~ao de aminoacidos para uma proteina de sua classe, a geometria

comumente observada para distancias e angulos, contatos atomicos, etc. A

estrutura da enzima interleucina-4 humana foi proposta a partir da predi~io

de sua estrutura secundaria com 0 auxilio de experimentos de dicroismocircular. (31)

1.5.2 Modelagem por homologia

o metodo de modelagem por homologia nao parte de urn conjunto de

regras elaborado a partir do PDB mas sim diretamente do PDB, ou seja, nao

existe a perda da informa~io original das estruturas no processo de

constru~io do modelo.

o processo de constru~io de urn modelo por homologia e baseado na

hip6tese de que a estrutura tridimensional e mais conservada que a estrutura

primaria. Isto equivale a dizer que dois trechos de proteina com sequencia de

aminoacidos semelhantes, mas nio identicos, devem ter uma conforma~ao

tridimensional semelhante. 0 alinhamento e a suposi~ao de que sequencias

parecidas implicam em estruturas tridimensionais parecidas sao os pontos de

apoio da modelagem molecular por homologia.

Como as proteinas nio trazem consigo a arvore geneal6gica de seus

antepassados, deve existir uma maneira de se identificar as rela~oes de

homologia entre duas proteinas partindo apenas de suas sequencias de

aminoacidos. 0 parametro usado para saber se duas proteinas sao hom610gas

28entre si e 0 grau de identidade, que e obtido a partir de uma compara~ao

entre as sequencias das proteinas de interesse.

A compara~ao entre as sequencias de proteinas e feita com 0 programaMULTALIGN(32)que usa 0 metodo de Needlemann e Wunsch(33) para encontrar

partes equivalentes entre duas ou mais sequencias de proteinas, 0 resultado

deste estudo e chamado de alinhamento. a alinhamento pode ser ententido

como uma tabela onde cada linha representa uma sequencia e cada coluna, os

aminoacidos topologicamente equivalentes. au seja, se todas as estruturas

tridimensionais correspondentes as sequencias alinhadas pelo programa

fossem superpostas todos os aminoacidos de uma mesma coluna ocupariam a

mesma posi~ao espacial.

Se 0 alinhamento e feito apenas com sequencias sem estrutura

tridimensional disponivel, 0 programa deve encontrar sozinho os pontos de

inser~ao e dele~ao, podendo desta forma fornecer urn alinhamento erraneo

com inser~oes e/ou dele~oes nas regioes do esqueleto da proteina ou ainda

desalinhando aminoacidos importantes para a fun~ao da enzima.

Quando estao disponiveis as estruturas tridimensionais de uma ou mais

proteinas hom610gas, 0 alinhamento e feito com base na superposi~ao das

estruturas(34), ou seja, primeiro encontram-se as posi~oes espacialmente

equivalentes (ou topologicamente equivalentes) e depois constroe-se 0

alinhamento. a alinhamento construido desta forma e chamado de

alinhamento tridimensional. Este alinhamento tridimensional e manti do fixo

enquanto que a sequencia problema e alinhada contra 0 alinhamento

tridimensional. Desta forma evita-se a cria~ao de inser~oes e/ou dele~oes nas

regioes do esqueleto da proteina.

A identidade entre duas proteinas e a razao entre 0 numero de pares de

aminoacidos identicos, encontrado no alinhamento entre as duas sequencias,

pelo numero total de aminoacidos alinhados. Por exemplo, na Tabela 5 0

numero de pares de aminoacidos identicos e 7 e a quantidade de aminoacidos

alinhados e 14, logo a identidade entre as sequencias A e B e 50% ou 7/14.

Alinhamento entre duas sequencias imaginarias

Se uencia A A G I I K E K M E P WIDSequencia BAG V I R M N P W L V D

Dada a defini~ao para 0 grau de identidade, podemos definir os pontos

limitantes de urn trabalho de modelagem por homologia em fun~ao da

identidade entre a sequencia da proteina problema e a sequencia da proteina

de base. As diferen~as entre as estruturas tridimensionais da proteina

problema e da proteina de base aumentam com 0 decrescimo da identidade

sequencial, em consequencia a confiabilidade do modelo diminui. Tambem

foi verificado que a qualidade da estrutura de base influi na qualidade da

estrutura model ada, ou seja, usar uma estrutura de base com resolu~ao de 1,5

A e melhor que usar uma estrutura resolvida a 3,5 A.

OS desvios entre 0 modelo contruido por homologia e a estrutura real

determinada por raios-X varia ao longo da sequencia da proteina. De um

modo geral, as maiores diferen~as ocorrem nos loops da superficie da

proteina, enquanto que os trechos de estrutura secundaria e 0 esqueleto

hidrof6bico da proteina apresentam os menores desvios.

o metodo para se criar urn modelo por homologia varia conforme a

identidade entre a sequencia problema e a estrutura de base. De urn modo

geral 0 esquema apresentado na Figura 6 mostra os passos necessarios para se

obter urn modelo. 0 primeiro passo na constru~ao do modelo consiste na

obten~ao do esqueleto da proteina. A partir do alinhamento e da analise das

estruturas de base 0 esqueleto pode ser obtido avaliando-se quais sao as

regioes estruturalmente conservadas, geralmente estas regioes sao compostas

pelos elementos de estrutura secundaria que compoem 0 esqueleto da

proteina e por alguns loops importantes a estrutura.

A segunda etapa consiste da modelagem dos loops. Se existir algum

loop hom610go em alguma das proteinas de base 0 procedimento para a

incorpora~ao deste loop consiste primeiramente na superposi~ao local dos

trechos anteriores e posteriores ao loop que se deseja incorporar, e

esta~Oogr6fica

estruturasdebase

Alinhamento3-D

alinhamentofinal

obten9C10do esqueleto

modelagemde loops

substitui<;;Oodas

cadeias laterais

minimiza<;;Oodeenergia

Fluxogramagenerico para a constru~io por homologia deum modelo 3-D de proteina.

finalmente na c6pia das coordenadas deste loop incorporando-o ao arquivo do

modelo.

Os loops que nao forem encontrados em nenhuma das estruturas de

base devem ser obtidos a partir do banco de dados PDB usando 0 metoda

desenvolvido por Jones e Thirup(35) que se baseia na conforma~ao da cadeia

principal do trecho anterior e posterior ao loop que se deseja construir.

Uma vez modelados 0 esqueleto da proteina e os loops, 0 pr6ximo

passo consiste na coloca~ao das cadeias laterais de cada aminoacido. A

substitui~ao de cadeias laterais pode ser feita por diferentes metodos dos

quais os mais comuns sao:

31l.calculo da posi~io dos novos atomos gerando uma cadeia lateral com

angulos X = 1800 (rotinas REPLACE e REFI do programa TOM),

2.aproveitamento dos atomos da cadeia lateral original como um guia no

calculo da posi~io dos atomos da nova cadeia lateral, diminuindo assim

problemas de choque com 0 restante da proteina (rotina MUTATE do

programa WHATIF),

3.procura de rotameros(36) especificos para a cadeia principal local (rotina

DGMUT do programa WHATIF).

Qualquer mudan~a usando um dos metodos aClma descritos deve ser

seguida de uma analise para a verifica~ao de choques da nova cadeia lateral

com 0 restante da proteina. Caso seja necessario, a cadeia lateral e ajustada

manual mente (op~io TORS do programa TOM e do programa WHATIF).

A terceira op~io tem se revel ado mais confiavel que as duas primeiras

visto que 0 desvio quadratico medio entre a cadeia lateral modelada e a

cadeia lateral determinada cristalograficamente e menor que os desvios

obtidos quando sao us ados os metodos 1 e 2. Neste metodo a nova cadeia

lateral e pesquisada no banco de estruturas de proteina levando-se em conta

dois criterios, a conforma~ao da cadeia principal que se estende desde dois

aminoacidos anteriores ate dois posteriores ao residuo que sera trocado (num

total de 5 residuos) e 0 tipo do aminoacido que devera ser colocado nolugar. (37,38)

Uma vez terminada a substitui~io dos residuos e feita uma

minimiza~ao de energia de toda a estrutura para se fazer um "ajuste fino" da

geometria e das intera~oes nio ligadas.

Feito isso 0 modelo da proteina esta pronto. Em casos de baixa

homologia quando a constru~ao do alinhamento nao e totalmente confiavel, e

recomendavel submeter 0 modelo a diversos programas que checam a

realidade e a confiabilidade da estrutura proposta. Um destes programas e 0

PROCHECK(50) que compara os parametros da estrutura (desvio padrao do

comprimento de liga~oes, angulos de liga~ao, quiralidade, angulos torsionais,

32etc) a panlmetros equivalentes de estruturas de aha resolucao. 0 modulo

QUALITy(39) do programa WHATIF realiza urn exame do ambiente de cada

aminoacido da estrutura e compara este ambiente com aqueles encontrados

nas estruturas de aha resolu~ao do PDB. Os indices de qualidade para cada

aminoacido sao graficados numa escala em que val ores abaixo de

determinado limite estao garantidamente (pelo autor do programa) errados.

Tambem urn valor medio para todo 0 modelo e fornecido que, se abaixo de

urn certo limite, indica que a proteina esta erroneamente modelada.

1.6 Estrutura geral das enzimas GAPDH

As gliceraldeido-3-fosfato desidrogenases sao constituidas de urn

homotetramero com cada subunidade pesando entre 35 e 40 KDa. A Figura 8:

Tetramero do modelo da' gGAPDH de Trypanosoma cruzi visto ao longo do

eixo Q.. (Modelo final do trabalho)

Figura 9 mostra 0 enovelamento do monomero da GAPDH com a

moIecula de NAD+ ligada. As quatro subunidades estao agrupadas segundo 3

eixos de simetria molecular de ordem 2 como mostra a Error! Reference

source not found. criando tres tipos de interface entre as subunidades.

Seguindo a nomenclatura descrita para a estrutura da GAPDH de Bacillus

stearothermophilus(43) as subunidades recebem os c6digos 0, P, Q eRe os

eixos que relacionam estas subunidades sao chamados de P, Q. e R.

Cada monomero e formado por dois dominios(40), 0 dominio de liga~ao

do NAD+ e 0 dominio catalitico. 0 dominio de liga~ao do NAD+ compreende

dois trechos da cadeia polipeptidica, do residuo 1 ao 165 e do 335 ao 359 e

possui uma estrutura terciaria semelhante ao enovelamento de Rossmann. A

topologia do dominio de liga~ao do NAD+ esta mostrada na Figura 7:1. Este

dominio e composto de onze fitas 13 (131, 132, .. ' e (311) das quais nove

formam uma folha f3 e cinco helices alfa (a1, a2 e as de um lado da folha e

a3 e a4 do outro lado).

Representa~io dos dois dominios de GAPDH:

I) dominio de liga~io do NAD+;

II) dominio catalitico.

o dominio catalitico (Figura 7:II) se estende do residuo 166 ao 334 e e

formado por uma folha 13 com sete fitas (131', 132', ... e 137') e quatro helices

alfa (ai', a2', a,3' e a4' todas de urn mesmo lado da folha).

Das tres interfaces, a relacionada pelo eixo P (Q/R e P/O) e a que

promove a maior parte das intera~oes entre dois monomeros. 0 eixo P

promove a forma~ao de urn "sanduiche" entre duas folhas 13 de dois dominios

cataliticos como po de ser visto na Error! Reference source not found ..

A interface formada pelo eixo R (O/R e P/Q) envolve a forma~ao de

contatos nas imedia~oes do sitio de liga~ao do NAD+.

o eixo Q. (P/R e Q/O) promove apenas alguns contatos em suas

interfaces, sendo que nenhum deles corresponde a regioes de interesse para 0

presente trabalho.

Figura 8: Tetramero do modelo da gGAPDH de Trypanosoma cruzivisto ao longo do eixo Q.. (Modelo final do trabalho)

Figura 9: Monomero da gGAPDH de Trypanosoma cruzi. As setasrepresentam fitas f3 e as espi~~is helices Cl. Figura criada

--..a'_..•_._._. ._~ __ "_. _,'I ~ f" S C - SERV!<;::O DC: BIBLIOTECA EI INFOR!VAC;:AO

2. MODELAGEM DA gGAPDH2.1 Alinhamento

o primeiro pas so na modelagem por homologia da enzima gGAPDH de

Trypanosoma cruzi e a obten~ao de um alinhamento entre as sequencias com

estrutura resolvida e a sequencia da enzima problema, para isto foi

necessario recuperar as estruturas resolvidas do banco de dados PDB. A

busca no banco de dados PDB resultou numa lista de seis enzimas hom6logas

a enzima de T. cruzi com estrutura resolvida mostradas na Tabela 6. Das seis

estruturas encontradas, as quatro primeiras foram resolvidas com 0 cofator

NAD+ e as duas ultimas foram resolvidas sem 0 cofator.

Tabela 6: Rela~io das proteinas homologas a enzima gGAPDH deTrypanosoma cruz; com estrutura resolvida.

Codigo da Origem da Enzima Numero de Identidade Resolu~io FatorEnzima (especie) aminoac:idos com (A) R(PDB) T.cru:i

IGGA(42) Trypanosoma 359 324/359 3,2 0,176brucei

I GD I (43) Bacillus stearo- 334 175/334 1,8 0,177thermophilus

1GPD(44) Homarus 333 199/333 2,9americanus

HUMANA(4S) Homo sapiens 334 176/334 2,3 0,332GDI (<16) Bacillus 334 175/334 2,5 0,177

stearothermophilus4GPD(47) Homarus 333 199/333 2,8 0,218

americanus

o alinhamento da sequencia de Trypanosoma cruzi contra as

sequencias das enzimas hom6logas encontradas no banco de dados PDB foi

feito em tres etapas.

A primeira etapa consistiu numa superposl~ao aproximada das

estruturas de base. Estas superposi~oes foram feitas mantendo-se a estrutura

de Trypanosoma brucei im6vel enquanto a segunda estrutura era rotacionada

e transladada de modo a superpor-se a primeira estrutura. Esta superposi~ao

inicial foi feita com a rotina MOTlVS(48) do programa WHA TIF que identifica

trechos estruturalmente equivalentes entre duas estruturas.

36Na segunda etapa a superposiyio inicial foi analisada e as regioes que

faziam parte do esqueleto da proteina (as regioes estruturalmente

conservadas) foram selecionadas para a superposiyao. Estas rotinas de

superposi~io usam 0 metoda descrito por Kabsch(49) que encontra a melhor

matriz de rota~io para colocar um conjunto de vetores sobre um segundo

conjunto de vetores atraves da minimizayao da soma dos quadrados das

diferenyas entre pares equivalentes de coordenadas. Esta superposiyio e

usualmente feita com os litomos Ccx pertencentes aos trechos de estrutura

selecionados.

Com as estruturas superpostas fez-se uma analise detalhada da

superposiyio entre a estrutura de T. brucei com a estrutura de

B. stearothermophilus e depois da superposiyio com a estrutura da enzima

humana. Desta analise determinou-se os pares de aminoacidos

topologicamente equivalentes entre as estruturas e contruiu-se entio 0

alinhamento tridimensional.

o ~linhamento tridimensional foi entio fixado nas regioes de estrutura

secundaria e contra este alinhamento foi alinhada a sequencia da gGAPDH de

Trypanosoma cruzi. 0 alinhamento final que foi usado para a construyio do

modelo esta mostrado na Figura 10.

o alinhamento consiste de seis blocos de quatro linhas cada donde a

primeira linha refere-se a sequencia de T. cruzi, a segunda de T: brucei, a

terceira refere-se a sequencia da enzima humana e a quarta a enzima de

B. stearothermophilus. Neste alinhamento as regioes demarcadas com uma

onda triangular definem as regioes de helices alfa e as regioes demarcadas

com uma caixa cinza definem os trechos de fita 13. As posiyoes do

alinhamento demarcadas com um asterisco denotam as diferenyas entre a

sequencia da gGAPDH de T. cruzi e de T. brucei.

Com 0 alinhamento em mios foi construida a Tabela 6 que resume as

relayoes entre as varias enzimas hom610gas de estrutura resolvida com a

enzima de Trypanosoma cruzi. Na primeira coluna esta 0 c6digo PDB da

estrutura (exceto para a estrutura humana obtida via uma comunica~io

37pessoal), na segunda coluna esta a especie da qual foi extraida a enzima, na

terceira coluna esta 0 numero de aminoacidos da enzima, na quarta coluna

esta a identidade com rela~ao a enzima de T. cruzi expressa como a razao

aminoacidos-identicos/aminoacidos-alinhados, na quinta coluna esta a

resolu~ao da estrutura e na sexta coluna 0 fator R para a estrutura.

Os valores das colunas cinco e seis definem a qualidade da estrutura,

ou seja, baseando-se nestes valores pode-se optar por um determinado trecho

de uma estrutura em detrimento de outra que apresenta Menor confiabilidade.

2.2 Constru~io e Avalia~io do Modelo

Toda a numera~io de aminoacidos sera feita de acordo com 0

alinhamento da Figura 10 que e a mesma para a estrutura de Trypanosoma

brucei.

Avaliando 0 alinhamento da Figura 10 optou-se por escolher a estrutura

de baixa resolu~ao de Trypanosoma brucei como base para 0 modelo da

enzima de Trypanosoma cruzi. Esta escolha foi feita por dois motivos,

primeiro, a estrutura de T. Brucei, embora de baixa resolu~ao, nio

apresentava inser~oes e/ou dele~oes com rela~ao a sequencia de T. cruzi,

segundo estava disponivel a estrutura de aha resolu~ao de Bacillus

stearothermophilus que mantem uma aha identidade com a enzima de

T. cruzi, deste modo a estrutura de aha resolu~io de B. stearothermophilus

foi usada como guia para tomar decisoes em regioes incertas.

1 3

10* * 1° !~fO * ~o *GRMVFQALCEDGLLGTEIDVVAVVDMNTDAEYFAYQMRYDTVHGKFKGRMVFQALCDDGLLGNEIDVVAVVDMNTDARYFAYQMKYDSVHGKFKGRLvTRAAF----NSGKvDIvAINDPFIDLHYMvYMFQYDSTHGKFHGRNVFRAAL----KNPDIEVVAVNDLTA-ANTLAHLLKYDSVHGRLD

i:;:;:::::;:::;::::::w-::;:.;~:::~::::.:::::::::::~j ~ 1:::::::::::::1

a2 ~3 f342

~o TO tOo t1t-1 * *LVVNGHRILCVKAQRNPADLPWGKLGVEYVIESTGLFTAKAAALVVNGHRILCVKAQRNPADLPWGKLGVEYVIESTGLFTVKSAAGTVK ED--------G LVIDGKAITIF-QERDPENIKWGDAGTAYVVESTGVFTTMEKAAEV NG--------N VVNG~EIIVK-AERDPENLAWGEIGVDAYYESTGRFTKREDA

:::::;:::;::.::::::::::::::::: ;:::;:::::;::::::::::::::::::: +&.:::::;:::::;:::::.<;:::::::::;:;:::;:;:::1 ~ ~

l35 l36 l37 l38 a3

T.cruzi MPIT.brueei - TIHumana GKVB.stearo. - A V

T.eruziT.brueeiHumanaB.stearo.

T.eruziT.brueeiHumanaB.stearo.

T.cruziT.bruceiHumanaB.stearo.

T.eruziT.brueeiHumanaB.stearo.

reruziT.brueeiHttmanaB.stearo.

120 130 140 150 160 170I I I * ** * * I .... I *EGHLRGGARKVVISAPASGGAKTLVMGVNHHEYNPSEHHVVSNAI' TNCLAPIVHVLVKEGHLRGGARKVVISAPASGGAKTFVMGVNHNNYNPREQHVVSNA ,.:TNCLAPLVHVLVKGAHLKGGAKRIVISAPSAD-APMFVMGVNHFKY-ANSLKIISNA S TNCLAPLAKVIHDAKHLEAGAKKVIISAPAKVENITIVMGVNQDKYDPKAHHVISNA; TNCLAPFAKVLHE~ '."...:.:.:.:.:.:.::.:.:.:,::,:.:.:' '.".:.:.:.:.' ••.. . ~

a3 l39 1310 tUl at'3

180 190 200 I 210 220 230I *. t· I + I • t 1EGFGVQTGLMTTIHSYTATQKTVDGVSVKDWRGGRAAAVNIIPSTTGAAKAVGMVIPSTQEGFGISTGLMTTVHSYTATQKTVDGVSVKDWRGGRAAALNIIPSTTGAAKAVGMVIPSTQH-FGIVEGLMTTVHAITATQKTVDSPSGKLWRGGRGAAQNLIPASTGAAKAVGKVIPELDQ-FGIVRGMMTTVHSYTNNQRILDLPHK-DLRGARAAAESIIPTTTGAAKAVALVLPELK

i.:.·::.:::::~::::;::::::~~h):.:::;·::::::::;:;:::~~:::::::::::::::;:;::::;::;:::::, f~···~::;::-::;:::::·:;:::;::j •

l31' l32'

240 250 260 270 280 290I * 1* 1** * I * IGKLTGMSFRVPTPDVSVVDLTFTAARDTSIQEIDAALKRASKTYMKGILGYTDEELVSADGKLTGMAFRVPTADVSVVDLTFIATRDTSIKEIDAALKRASKTYMKNILGYTDEELVSADGKLTGMAFRVPTANVSVLDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKEASEGPLKGILGYTEDEVVSDDGKLNGMAMRVPTPNVSVVDLVAELEKEVTVEEVNAALKAAAEGELKGILAYSEEPLVSRD

i::;·;·::::::: ·;::·:::::::::·:·:::-:·;:;::·:::·::::;::-::::;.:1 1:::::·:-:·:::;:.;.;.:.:;:.:.:.:::.:.:::::::::::::::.:::::.:::::.:~.:::::, ~ '.:;;.;:::::::;;:.:::'.:::::.:.;:;'

(33' (34' a2' l35'

300 310 320 330 340 3501 * * I 1* I I 1** * *FINDNRSSIYDSKATLQNNLPKERRFFKIVSWYDNEWGYSHRVVDLVRHMASKDRfARLIFISDSRSSIYDSKATLQNNLPNERRFFKIVSWYDNEWGYSHRVVDLVRHMAARDR KLFNGSNHSSIFDAGAG--IEL--NDTFVKLVSWYDNEFGYSERVVDLMAHMASKEYNGSTVSSTIDALST--MVI--DGKMVKVVSWYDNETGYSHRVVDLAAYIASKGL

iti;.;.;.:.::·:;:.:;.:.;:;.' 1::::;·:::·:·:·:-::;·:·:1 i:.::·.;.;.;.:.:.;.:.:.·.:.:::.:.;.:.:.:.;::.~:.;.;.;.;.;.:.:.:.:.j

~' ~7' l3~ a4

Figura 10: Alinhamento final usado na constru~io do modelo da enzimagliceraldeido-3-fosfato desidrogenase de Trypanosoma crud.

If SC SERV!C;:O DC: B18L10 Ir:.";.L\.. I'.

INFOR!\/ AC;AO --=

39Embora 0 alinhamento da Figura 10 mostra-se uma identidade de 90 %

entre a sequencia de T. brucei e de T. cruzi sugerindo que a cadeia principal

de 1GGA pudesse ser adotada de forma integral como ponto de partida para a

constru~ao do modelo, constatou-se apos uma analise das estruturas de base

na esta~ao grafica e usando 0 programa PROCHECK a necessidade de corre~oes

em quatro pontos da cadeia principal da estrutura 1GGA que apresentava

angulos ~/\jI nao permitidos.

Os trechos que necessitavam de corre~oes compreendiam os

aminoacidos 2, 10-11, 70-72 e 357. Os aminoacidos 2 e 357 foram modelados

usando a rotina TORS do program a TOM.

Os aminoacidos 10 ao 11 foram model ados com a estrutura 1GD 1 de

aha resolu~ao atraves de uma superposi~ao local dos trechos polipeptidicos

anterior e posterior a regiao em quesHio.

Os aminoacidos 70 ao 72 nao apresentavam loops equivalentes nas

estruturas de base e portanto foram modelados com a rotina DGLOOP do

programa TOM.

Apos a corre~ao da cadeia principal foi feita a mudan~a das 35 cadeias

laterais que diferiam da estrutura de base (1 GGA) para os aminoacidos

correspondentes da enzima de T. cruzi. Esta etapa foi realizada usando-se a

rotina MUTATE do programa WHATIF. A rotina MUTATE calcula as posi~oes dos

atomos da nova cadeia lateral usando os atomos da cadeia lateral original

como guia.

A terceira etapa consistiu do ajuste manual de cada cadeia lateral

trocada com a rotina TORS do programa TOM. 0 objetivo deste ajuste e

acomodar a nova cadeia lateral dentro do modelo, removendo na medida do

possivel todos os choques que tenham resultado da troca dos aminoacidos.

A quarta etapa consistiu da coloca~ao do cofator NAD+ no modelo do

monomero. 0 modelo do cofator foi obtido da estrutura de Trypanosoma

brucei.

40Feito isto 0 modelo do monomero estava pronto e passou-se a etapa

seguinte que envolveu a cria~ilo do tetramero para ajustar as cadeias laterais

envolvidas nas interfaces monomero-monomero. Para construir 0 tetramero

foram feitas quatro copias do modelo do monomero e cada uma delas foi

superposta a uma das cadeias 0, P, Q e R da estrutura de Trypanosoma

brucei.

o modelo foi avaliado quanto a qualidade estereoquimica usando 0

programa PROCHECK(50). Este programa avalia a distribui~ilo dos angulos ~/\jJ

de acordo com uma estatistica feita sobre um conjunto de estruturas de alta

resolu~ilo extraidas do banco de dados PDB. Os angulos silo graficados num

diagx:ama equivalente ao de Ramachandran onde as regioes de maior

probabilidade para os angulos ~/\jJ silo sombreadas. Neste diagrama os

residuos de glicina silo representados por triangulos e todos os outros silo

representados por quadrados.

A distribui~ilo dos angulos ~/\jJ para 0 modelo final no diagrama de

Ramachandran (Figura 11) mostrou que dentro dos limites impostos a tecnica

de modelagem e a resolu~ilo da estrutura de base (3,2 A) existem apenas

alguns aminoacidos fora das regioes permitidas.

45...-r:/'.)Cl)

~bO 0Cl)

"'0

'-".-r:/'.)Q.;

-45

-45 0 45Phi (degrees)

Figura 11: Diagrama de Ramachandran sobre a estatistica doprograma PROCHECK

o aminoacido ILE 2 (cP - -45, \fI - -60; 32 % de conserva~ao no

alinhamento do Apendice 6.1) originalmente em posi~ao nao permitida

(cP - 45, \fI - -80) foi modelado para uma regiao aceitavel de modo a manter

as liga~oes de hidrogenio e fazer com que a isoleucina originalmente exposta

ao solvente fosse colocada para dentro de um bolso hidrof6bico.

Figura 12: Cadeia principal do modelo na regiio da ALA 72 antes deser modelada (linha tracejada) e depois (linha solida).

o aminoacido C-terminal ALA 357 (cj)- 45, 'V - 140; 8 % de

conserva~ao no alinhamento da 6.1) foi model ado para uma regiio permitida.

o aminoacido ALA 72 (cj)- 67, 'V - -80) esta localizado em uma

inser~io (residuos 67 ao 74 da Figura 10, exclusivo as enzimas de

Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei) que compoe um loop exposto e

flexivel. A liga~io peptidica entre os residuos 71 e 72 foi modelada de modo

a corrigir 0 angulocj) da ALA 72. A Figura 12 mostra a cadeia principal desta

regiio antes (linha tracejada) e depois (linha solida) da modelagem. Este

loop foi modelado com a rotina DGLOOP do programa TOM.

o aminoacido VAL 254 (cj)- 94, 'V - 142; 88 % de conserva~io no

alinhamento da 6.1) e 0 ultimo residuo de um loop de cinco aminoacidos

(conserva~ao media para os cinco residuos e de 82,5 % de acordo com 0

alinhamento da 6.1) que conecta as fitas beta (33' e (34'. Estas fitas (3 estio

no segundo dominio e fazem parte dos contatos intermonomeros. A mesma

conforma~ao de cj)e 'V e observada na estrutura de alta resolu~io de Bacillus

stearothermophilus e portanto nao foi feita nenhuma modelagem para este

residuo.

43A regiao da cadeia principal do residuo ARG 11 (95 % de conservayao

no alinhamento da 6.1) que estava originalmente em uma regiao nao

permitida (eI> - 50 e 'V- 60) foi modelada e apresenta agora angulos

permitidos. Esta modificayao tambem colocou 0 amino deste residuo em

posiyao favoravel para fazer ligayoes de hidrogenio com urn grupo fosfato do

cofator 0 que nao acontecia na estrutura de Trypanosoma brucei. Esta ligayao

de hidrogenio ocorre em todas as outras estruturas resolvidas com 0 cofator.

A Figura 13 mostra a conformayao deste trecho de peptideo antes (A) e

depois (B) da modelagem ressaltando a ligayao de hidrogenio com 0 cofator

NAD+. A linha salida representa a estrutura de Bacillus stearothermophilus e

a linha tracejada representa 0 modelo.

o residuo treonina 282 (6 % de conservayao no alinhamento da 6.1)

esta calizado em uma regiao de muitos contatos e nao pode ser modelado. A

posiyao correspondente no alinhamento da 6.1 apresenta 0 residuo glicina em

90 % das sequencias.

Figura 13: Cadeia principal do modelo (Hnha tracejada) na regiio deARC 11: A) antes da modelagem e B) depois da modelagem

44de base para a estrutura do modelo visto que foram feitas apenas algumas

mudan~as de cadeias laterais.

o diagrama da Figura 14 mostra a distribui~ao destes angulos para 0

modelo final. As cruzes tracejadas que aparecem na Figura 14 representam

combina~oes de Xl e X2 para as quais os choques entre a cadeia lateral e a

cadeia principal sao minimos. Deve-se esperar portanto que os residuos

apresentem seus angulos Xl e X2 ao redor destas posi~oes.

A distribui~ao dos angulos omega, que definem a planaridade das

liga~oes peptidicas, nao apresenta desvios significativos conferindo um

desvio medio quadnitico de 5,00 para toda a molecula. Nenhum carbo no alfa

apresentou quiralidade errada.360

..-.. 240CI.)a,)

~00a,) 180~

"-"C'I

I.~...s:::U 120

60 1?O 1RO ')AO 300Chi-l (degrees)

Distribui~io de Xl e XZ para 0 modelo final.

45A quantidade de choques entre ~itomos nao ligados esta dentro da faixa

estatisticamente aceitavel para estruturas resolvidas a ate 2,0 A de resoluyao

segundo 0 programa PROCHECK.

2.3 Simula~oes Computacionais

o modulo DISCOVER do programa INSIGHTII utilizado para realizar as

minizayoes de energia e dinamica molecular contem restriyoes quanta ao

numero de atomos do sistema a ser calculado, de modo que as simulayoes de

energia foram realizadas utilizando-se apenas 0 monomero da gGAPDH e nao

o tetramero como seria ideal.

o sistema simulado consiste de uma molecula do monomero de

gGAPDH e uma camada de moleculas de agua de 3 A ao redor da molecula.

Uma quantidade maior de moleculas de agua nao pode ser adicionada devido

as restriyoes do programa.

2.3.1 Dinimica molecular

o tetramero da gGAPDH de T. cruzi contem varios contatos

intermonomeros que sao parte essencial para a estabilizayao da estrutura

quaternaria e das estruturas secundarias de interface da estrutura. Urn

experimento de dinamica molecular com 0 monomero conduzido em

condiyoes amenas levaram ao desenovelamento das estruturas secundarias

localizadas nas regioes intermonomeros mostrando que seria necessario

adicionar restriyoes especiais para estas regioes. Como ja era sabido que urn

dos pontos de interesse localizava-se numa regiao intermonomeros, e que 0

program a era restrito e nao permitia a conduyao de uma dinamica molecular

com 0 tetramero, decidiu-se por abandonar este tipo de simulayao.

2.3.2 Minimiza~io de energia

A minimizayio de energia foi conduzida usando-se a expressao para 0

campo de foryas CVFF(51) (Campo de Foryas de Valencia Consistente) que

contem parametros gerais (para qualquer molecula organica pequena) e

especificos para aminoacidos. Na primeira etapa a minimizayio foi

controlada pela tecnica de "steepest descent" (derivada mais ingreme) que

remove contatos interatomicos, distancias e angulos grosseiros.

46Na ultima etapa a minimiza~ao pas sou a ser controlada pela tecnica de

"conjugate gradient" (gradiente conjugado) que conduz a minimiza~ao por

caminhos mais coerentes levando a estrutura a urn ponto de menor energia.

2.4 Compara~io da gGAPDH de Trypanosoma cruzi com a GAPDHhumana

As maiores diferen~as entre as sequencias da gGAPDH de Trypanosoma

cruzi e da GAPDH humana localizadas no alinhamento da Figura 10 sao as

inser~oes 1 (23-25) e 2 (67-74) que formam loops expostos ao solvente e que

nao fazem contatos intermoleculares.

As diferen~as mais importantes ocorrem na regiao de liga~ao do NAD+.

As intera~oes do grupo adenosina com a gGAPDH de Trypanosoma cruzi sao

diferentes das que ocorrem com a enzima humana. Na Tabela 7 estao listadas

as diferen~as entre as estruturas da enzima humana e 0 modelo da estrutura

do T. cruzi. A quarta co luna e usada para identificar os sitios explorados na

constru~ao de cada inibidor, estes sitios estao denotados no alinhamento da

Figura 10 por setas numeradas.

Diferen~as entre gGAPDH de Trypanosoma cruzi eGAPDH humana.

Posi~iot T.cruzi Humana Sitio36 VAL ASN 138 MET PRO 3112 LEU VAL 2205 VAL PRO 3

t De acordo com 0 alinhamento da Figura 10

Para se fazer a avalia~ao das diferen~as entre as enzimas de T. cruzi e

a enzima human a foi necessario fazer uma superposi~ao entre as estruturas

usando as coordenadas dos grupos NAD+ da enzima humana e as

cooredenadas do NAD+ da estrutura de Trypanosoma cruzi.

Dos aminoacidos que fazem contato com 0 grupo adenina, 0 residuo 36

apresenta uma muta~ao nao conservativa da enzima human a (ASN; 95 %

conservada de acordo com 0 alinhamento da se~ao 6.1) para a enzima de

Trypanosoma cruzi (VAL). Esta muta~ao muda a caracteristica do bolso que

47interage com a posi9ao 2 do anel da purina criando na enzima de T. cruzi urn

bolso hidrofobico e na enzima humana urn bolso hidrofilico.

A segunda regiao de interesse na elabora9ao de urn inibidor seletivo

encontra-se na posi9ao 112 do alinhamento da Figura 10. A estrutura da

enzima human a apresenta uma valina nesta posi9ao enquanto que a estrutura

de Trypanosoma cruzi apresenta uma leucina. Embora a diferen9a nao seja na

caracteristica quimica da cadeia lateral (ambos sao hidrofobicos), a leucina

apresenta uma cadeia lateral maior que a valina fazendo com que a regiao

proxima ao NAD+ fique mais fechada.

Uma terceira regiao que pode ser explorada na tentativa de se obter urn

inibidor compreende a interface criada pelo eixo P. A enzima humana

apresenta esta interface mais fechada que a regiao correspondente na enzima

de Trypanosoma cruzi.

Figura 15: Superposi~ao dos monomeros de T. cruz; e da enzimahumana.

483. INIBIDORES ESPECiFICOS PARA GGAPDH DE TRYPANOSOMACRUZI

Baseados na estrutura da GAPDH de T.brucei, Hol e colaboradores

(comunica~ao pessoal) tem proposto alguns compostos de partida, planejados

sobre a estrutura do grupo adenosina da molecula de NAD+. Neste trabalho

buscamos analisar estes compostos quanta a sua potencial utiliza~ao na

inibi~ao da enzima de T. Cruzi.

A estrutura 3-D dos inibidores foi criada com 0 program a INSIGHTII a

partir das coordenadas do cofator NAD+ da estrutura de Trypanosoma brucei.

Primeiro foram removidos os atomos dos grupos nicotinamida, ribose (da

nicotinamida) e fosfato. Para cada um dos inibidores foram adicionados os

grupos correspondentes seguido de uma regulariza~ao de geometria. Os

inibidores foram entao colocados dentro do modelo da enzima de

Trypanosoma cruzi atraves da superposi~ao dos atomos dos grupos ribose e

adenina.

Para poder acomodar cada um dos inibidores da melhor forma possivel

foram necessarios ajustes dos angulos torsionais dos inibidores e de algumas

cadeias laterais envolvidas na liga~ao do NAD+.

3.1 Composto 1: 2-metil adenosina

A primeira diferen~a a ser explorada entre a estrutura da GAPDH

humana e a gGAPDH de Trypanosoma cruzi ocorre na posi~ao 36 do

alinhamento da Figura 10. 0 aminoacido ASN da enzima humana aparece com

uma conserva~ao de 92 % de acordo com 0 alinhamento da se~ao 6.1.

Nesta posi~ao a enzima humana apresenta uma ASN que e substituida

na enzima de T. cruzi por uma VAL. A presen~a de uma VAL nesta posi~ao

cria um bolso hidrof6bico na enzima de T. cruzi que nao existe na enzima

humana. As consequencias da mudan~a da caracteristica quimica de uma

cadeia lateral ja foram vistas para 0 caso da anemia falciforme na se~ao

1.3.3.

Este bolso contem residuos que participam da liga~ao do grupo adenina

do NAD+. Neste caso, a adi~ao de um grupo metila na posi~ao 2 do anel do

49grupo adenina (Figura 16) promoveria uma maior intera~ao do inibidor com a

gGAPDH de T. cruzi que com a GAPDH humana atraves de urn aumento dasintera~oes de van der Waals.

Figura 16: 2-metil adenosina. Constante de inibi~io ICso = 700 J.1M.

A coloca~ao do grupo metila na posi~ao 2 sem 0 deslocamento da

adenosina gera choques entre ~itomos os quais sao removidos fazendo-se urn

rearranjo do inibidor no sitio de liga~ao. Este rearranjo faz com que as

intera~oes originais adenosina/enzima fiquem enfraquecidas nas duas

proteinas. A Figura 17 mostra 0 inibidor no sitio de liga~ao. Deve-se notar

que as liga~oes de hidrogenio entre 0 grupo ribose e a cadeia lateral do

residuo ASP 37 (linhas tracejadas na Figura 17) sao mantidas emboralevemente distorcidas.

Neste caso explora-se a diferen~a da caracteristica quimica de um

aminoacido importante para a liga~ao do cofator a. enzima. Este inibidor

apresenta uma constante de inibi~ao ICso = 700 J.1M

Figura 17: Sftio de Iiga~io do inibidor 2-metil adenosina. As Iinhasfinas representam a proteina, as grossas 0 inibidor e asIinhas tracejadas representam as intera~oesinibidor/proteina.

3.2 Composto 2: 8-tienil adenosina

o segundo ponto a ser explorado ocorre na posi~ao 112 do alinhamento

da Figura 10. De acordo com 0 alinhamento da se~ao 6.1 a regiao

correspondente a posi~io 112 (110-114) da Figura 10 apresenta uma

conserva~ao media de 88 % para os aminoacidos THR, GL Y, VAL, PHE e THR

da enzima humana sendo que a valina da posi~ao 112 apresenta uma

conserva~ao de 74 %. A enzima de T. cruzi apresenta os aminoacidos THR,

GLY, LEU, PHE e THR neste trecho, diferindo portanto em apenas um dosaminoacidos.

Apesar das duas enzimas apresentarem aminoacidos hidrof6bicos nesta

posi~ao, a enzima de T. cruzi contem uma cadeia lateral de leucina maior que

a cadeia lateral da valina na enzima humana. A coloca~io de um anel

hidrof6bico (tienila, Figura 18) na posi~io 8 do grupo adenina cria mais um

contato hidrof6bico entre este inibidor e a cadeia lateral da LEU na enzima de

T. cruzi. 0 mesmo contato nao e observado na enzima humana porque a

cadeia lateral da valina nio alcan~a 0 grupo tienil.

HO OH

Figura 18: Segundo inibidor: grupo tienila na posl~ao 8 do grupoadenina. Constante de inibi~io ICso = 500 f.1M.

A Figura 19 mostra 0 contato com a LEU 112. Note-se que 0 grupo

tienila alem de fazer interayoes com a leucina 112 tambem faz contatos

hidrof6bicos com a cadeia lateral da metionina 38. A metionina 38 e

responsavel por varias interayoes entre 0 anel adenina e a enzima. Na

proteina humana a metionina 38 e substituida por uma prolina que nio faz

contatos com 0 grupo tienila.

A colocayio deste grupo na posiyio 8 nio gera distilrbios nas

interayoes originais entre 0 grupo adenosina e a proteina aumentando assim a

eficiencia do inibidor que pode ser verificada na constante de inibiyio

ICso = 500 f.1M para a enzima hom6loga de Trypanosoma brucei.

Figura 19: Contatos entre 0 grupo tienila e a enzima de T. cruz;mostrando as intera~oes com LEU 112 e MET 38.

3.3 Composto 3: 2'-desoxi-2'-(3-metoxi benzamido) adenosina

o terceiro ponto a ser explorado consiste de uma regiio inter-

monomeros. Esta regiio e composta dos trechos que vio de 38 a 40 (do

monomero 0) e de 205 a 207 (do monomero R). A regiio de 38 a 40

apresenta uma conserva~io media de 70 % para os aminoacidos PRO, PHE e

ILE da enzima humana. Na enZlma de T. cruzi os aminoacidos

correspondentes sio MET, ASN e THR. A regiio de 205 a 207 apresenta

conserva~io media de 57 % para os aminoacidos PRO, SER e ALA da enzima

humana. A regiio equivalente na enzima de T. cruzi apresenta os residuosVAL, SER e VAL.

HO NH

o

o'cH

3Figura 20: Terceiro inibidor: 2' desoxi-2'(3-metoxi benzamido)

adenosina

Esta regiao compoe uma fenda hidrof6bica em todas as GAPDHs com

estrutura resolvida ate hoje. Na enzima de T. cruzi esta fenda apresenta-se de

forma mais pronunciada permitindo a acomoda~ao de um grupo hidrof6bico.

Esta me sma fenda na enzima humana e praticamente inexistente devido a uma

diferen~a no curso do loop definido pelos aminoacidos 38 ao 40 conforme

pode ser visto na Figura 21.

A enzima humana apresenta uma prolina na posi~ao 39 que impede 0

recuo do loop nao permitindo a acomoda~ao de um grupo hidrof6bico nesta

fenda. 0 composto 2'-desoxi-2'-(3-metoxi) benzamido adenosina preenche a

fenda hidrof6bica em T. cruzi de forma que 0 grupo benzamido fica entre a

cadeia lateral da valina 205R e a cadeia lateral da metionina 380 fazendo

extensas intera~oes de van der Waals com estes residuos.

Ao mesmo tempo sao mantidas as liga~oes de hidrogenio,

originalmente entre os oxigenios 2' e 3' do grupo ribose da adenosina do

cofator e 0 residuo de acido aspartico 37 sem maiores a1tera~oes dos angulos

X deste aminoacido. 0 oxigenio do grupo metoxi faz uma liga~ao de

hidrogenio com a cadeia lateral do residuo asparagina 39 enquanto que 0

metil aponta para um bolso hidrof6bico.

Figura 21: Superposi~ao das enzimas humana em rosa e de T. cruziem amarelo na regiao que compoe a fenda hidrof6bica.

As interayoes entre 0 composto 3 e a enzima podem ainda ser vistas na

Figura 27 da seyao 4.1.

A Figura 22 mostra uma comparayao dos fatores de agitayao termica da

cadeia principal da enZlma humana e das enZlmas de base

B. stearothermophilus e T. brucei na regiao da fenda hidrof6bica. A regiao

marcada com 0 fundo cinza delimita os residuos que formam a fenda. Pode-se

notar que na regiao demarcada, a enzima de T. brucei apresenta valores

maiores que as outras duas enzimas. As regioes ao redor das caixas cinzas

apresentam valores companiveis. A aha nos fatores de temperatura para

enzima do tripanossomo pode ser explicada estruturalmente pela glicina 204

que corresponde a uma serina na enzima humana e na enzima do bacilo.

Os valores de agitayao termica mais elevados na enzima de T. brucei

na regiao do sitio de ligayao do cofator, e tambem 0 fato do sitio de ligayao

do cofator se apresentar estruturalmente mais accessivel por causa do recuo

do loop 38-41, podem explicar a menor afinidade desta enzima pelo NAD+. A

55menor afinidade desta enzima pelo cofator deve ser uma das causas do born

desempenho da via glicolitica no T. brucei e no T. cruzi.

--- Trypanosoma bruce;- - - Bacillus stearothermophilus..... Humana

.•.. ' \,\I\,f

....., .•.. ./.... ./.•..

. ,., •• t." I, "• I ~

I II,~

i Iii i i I i

200 205i i i Iii i i I

210 215

Figura 22: Grafieo dos fatores de agita~ao termiea da regiao da fendahidrof6biea. Estio grafieados os val ores para as estruturasde T. brucei, B. stearothermophilus e humana.

3.4 Composto 4: 2'-desoxi-2'-(2H-ehromen benzamido) adenosina

o composto 4 explora a mesma fenda hidrofobica que 0 composto 3.

Como pode ser visto na Figura 24, os oxigenios sio responsaveis por urn

aumento das liga~oes de hidrogenio entre 0 inibidor e a enZlma.

Especificamente, os oxigenios 1 e 2 fazem liga~oes de hidrogenio com 0

acido aspartico da posi~ao 37 enquanto que 0 oxigenio 3 uma liga~ao de

hidrogenio com a cadeia lateral da asparagina 39.

As intera~oes de van der Waals entre 0 inibidor e os residuos MET 380

e VAL 205R sio intensificadas pela presen~a de urn anel hidrof6bico maior.

HO NH

o

OHFigura 23: 2'-desoxi-2'-(2B-chromen benzamido) adenosina.

T fFigura 24: Composto 4 inserido na fenda bidrofobica da enzima de

T. crud. As linbas tracejadas denotam as liga~oes debidrogenio inibidor-enzima.

3.5 Composto 5: 2'-desoxi-2'-(benzoimidazol) adenosina

o composto 5 (Figura 25) tambem atua na fenda hidrof6bica como os

compostos 3 e 4. Neste caso 0 nitrogenio N do anel substituinte faz liga~oes

de hidrogenio com 0 residuo de acido aspartico 37 e 0 nitrogenio NH do

mesmo anel faz uma liga~io de hidrogenio com a cadeia lateral da asparagina

39. 0 anel hidrof6bico deste composto apesar de conter menos atomos para

57fazer ligayoes de hidrogenio com a enZlma, realiza as mesmas com uma

geometria melhor que 0 composto 4. As interayoes de van der Waals podem

ser vistas na Figura 26 na forma dos contatos entre as superficies

pontilhadas.

(N N

Figura 26: A enzima de T. cruz; e 0 inibidor estao com a superficiede van der Waals representada, mostrando a eficiencia doempacotamento.

4. UM PROGRAMA PARA VISUALIZA(::AO DEPROTEINAS

58ESTRUTURAS DE

4.1 Introdu~ao

A falta de espayo em disco rigido e a inabilidade dos program as

graficos, disponiveis ate entio, de mostrar uma estrutura rapidamente sem a

necessidade de criar arquivos temporarios enormes levou ao desenvolvimento

deste programa.

Este program a grafico, especifico para computadores da Silicon

Graphics™, permite a visualizayao e mensurayao de uma estrutura de

proteina descrita em urn arquivo no formato PDB. Podem ser feitas rotayoes,

translayoes, zoom, seley8.o de atomos, medidas de distancia, angulos diedros,

anotayoes, etc.

o program a foi escrito em linguagem C numa plataforma UNIX e esta

atualmente com aproximadamente 6.000 linhas de c6digo. Neste programa os

dados de cada atomo da proteina S8.0lidos e armazenados numa estrutura que

compreende os seguintes campos: nome do atomo (char[5]), tipo de atomo

(int), nome do residuo (char[4]), tipo do residuo (int), numero interno do

residuo (char[5]), identificador de cadeia (char), identificador de conformero

(char), coordenadas xyz (float[3)), fator de ocupayio (float) e fator de

agitay8.o termica (float).

As funyoes definidas no programa S8.0 agrupadas quanto a sua

utilizay8.o. Existem funyoes dedicadas a entrada e saida de dados, funyoes

para busca de informay8.o da estrutura de dados, funyoes de construy8.o de

objetos graficos, funyoes de calculo e funyoes de interay8.o maquina/usuario.

o programa faz usa da biblioteca grafica ("Graphics Library") da

workstation permitindo maior rapidez grafica interativa. 0 programa utiliza

todo 0 "hardware" especifico ("geometry engines") para manipulay8.o do

espayO tridimensional. Atualmente 0 equipamento permite a realizay8.o de

"depthcueing", "antialiasing" e "z-buffer" que S8.0 tecnicas para 0

melhoramento da percepy8.o tridimensional do objeto grafico. 0 depthcueing

permite que uma determinada cor perca brilho a medida em que e deslocada

59para longe do usuario. 0 z-buffer e uma memoria da coordenada z de cada

pixel que foi desenhado na tela. Antes de desenhar qualquer pixel na tela 0

computador checa a coordenada z deste pixel e se a coordenada z do novo

pixel estiver "atras" da coordenada z antiga entio 0 pixel nio e desenhado.

Em outras palavras, este equipamento e responsavel pela remo~ao de

superficies/linhas escondidas. 0 antialiasing e uma tecnica usada para

suavizar 0 serrilhado das linhas que surge devido ao tamanho dos pixels.

A Figura 27 mostra a janela principal do programa e uma janela

auxiliar onde esta representado 0 diagrama de Ramachandran. Na janela

principal pode-se ver 0 composto 3 no sitio de liga~ao do NAD+ e as

intera~oes do inibidor (linhas grossas) com a enzima (linhas finas).

4.2 Usando 0 programa

As rota~oes sobre X e Y sao realizadas atraves da movimenta~ao da

seta ("mouse") quando 0 botao do meio e mantido pressionado. A transla~ao

no plano XY e obtida quando todos os bot6es sao pressionados

~ClnrID:Nw.I':We--_:c

r_:Dr """':0T-.'fi'!'J9: ' ••.••r_m

~Ftl~ .~ .- .c---. .•••••••• •z- •-- .T_ •&tJ/l--' •_1tI JIdIw

u---..&pdbJldlw___ ltIpdIw_/IJgtI

r~:,.

Il'Ft:c .•••rl'2:_rF3:z-r Ff:SpIw6rrl5:_r,.:~r F1 :~c ..•••

.,;."r.

Figura 27: Janela do PDBV mostrando as janelas principal e deRamachandran e os menus.

simultaneamente ao movimento do mouse. 0 zoom pode ser obtido

movimentando-se 0 mouse com os dois botoes da esquerda pressionados.

60Para selecionar-se um atomo, deve-se levar a ponta da seta sobre algum

atomo e apertar/soltar (clique) 0 botao da esquerda. Feito isto aparecera 0

nome do aminoacido e numero do aminoacido ao lado do atomo se 0 atomo

for urn Ca, caso contrario aparecera 0 nome do atomo e numero do

aminoacido selecionado. A seleyao de um residuo quando solicitada pelo

programa e feita pela escolha de qualquer atomo do aminoacido.

o programa mantem uma memoria dos ultimos 4 atomos selecionados

com 0 nomes PICK1, PICK2, PICK3 e PICK4, sendo que 0 ultimo atomo

selecionado e 0 PICK1. Sobre estes 4 atomos sao realizadas todas as

operayoes do programa.

Apos a leitura do arquivo PDB 0 programa cria automaticamente quatro

objetos graficos pre-definidos, F1 :trayo dos carbonos a, F2:cadeia principal,

F3 :todo 0 conteudo do arquivo PDB e F7: trayo dos carbonos a suporte. Estes

objetos podem ser ligados e desligados atraves das teclas de funyao

correspondentes. Estes objetos podem ainda ser alterados durante a sessao de

trabalho com funyoes especificas aos objetos. Isto propicia ao usuario urn

meio rapido de estudar a estrutura sem perder tempo criando os objetos

manual mente como ocorre com outros program as do genero.

Alem dos objetos graficos pre-definidos, existem ainda mats tres

objetos especiais que podem ser facilmente criados, apagados ou alterados

durante a sessao de trabalho, sao eles: F4:esfera de residuos, F5:cadeias

laterais e F6:residuos.

o objeto F1 pode ser redefinido da seguinte maneua, apaga-se 0 seu

conteudo ( menu: [C-alfas]-> [Erase all] ), seleciona-se 0 residuo inicial

(PICK1 ou PICK2) e final (PICK2 ou PICK1) do trecho a ser adicionado ao

objeto. e adiciona-se 0 objeto (menu:[C-alfas]->[Add]). 0 mesmo pode ser

feito com os objetos F2 (menu:[backbone]) e F3 (menu: [zones]).

o objeto F7 nao pode ser alterado nunca (pode apenas ser desligado)

pois e usado como suporte para a seleyao de aminoacidos.

61o objeto F4 (esfera de residuos) compreende urn conjunto de tipos de

~itomos (8) que estao a determinada distancia (R) de urn atomo da estrutura

(PICK1). 0 conjunto de atomos 8 pode ser: 1° qualquer atomo a distancia R

de PICKI (menu: [Sphere]->[atoms]), 2° todo residuo com pelo menos urn

atomo a distancia R de PICKl (menu:[Sphere]->[residues]) ou 3° a cadeia

lateral de todo residuo com pelo menos urn atomo a distancia R de PICK 1

(menu: [Sphere ]->[sidechains]).

o programa permite ainda graficar todos os angulos c/>/\JI da estrutura

(menu:[Ramachandran]) em uma janela a parte podendo-se escolher como

fundo para 0 diagrama entre estatistica de PROCHECK ou as regioes

teoricamente permitidas. Urn aminoacido pode ser escolhido e ter seus

angulos graficados ou 0 par de angulos pode ser escohido do diagrama para

se saber a qual residuo pertence. Dentro da jane1a do diagrama de

Ramachandran existe urn menu diferenciado que permite customizar a

aparencia do grafico. E ainda possivel conectar pontos suscecivamente

selecionados por linhas, 0 que pode ajudar a classificar os tipos de voltas.

o programa e ainda capaz de criar linhas, retangulos e elipses de

diferentes tipos de linha, espessura e cor. Textos aleatorios podem ser

inseridos em qualquer lugar da tela usando varios tipos de letra com

acentua~ao.

Para facilitar a localiza~ao sao permitidas 10 memorias de Ioealiza~ao

( ctrl ou shift + teclas 0 a 9 no teclado numerico) que permitem voltar ao

mesmo ponto depois de varias rota~oes.

o program a permite ainda a grava~ao e posterior leitura de urn arquivo

de texto (alteravel pelo usuario) que eontem tudo 0 que foi feito durante uma

se~ao de trabalho.

o arquivo gravado contem uma se~ao em que se podem eriar 10 objetos

diferentes (teclas 0 a 9 no teclado numerico). Cada objeto destes pode conter

ate 50 instru~oes para criar objetos graficos de proteina. Cada instru~ao ecomposta pelos seguintes campos: residuo inicial, residuo final, tipo (zone,

62c-alfa, backbone), cor (por ~itomo, ou uma cor qualquer), tipo de linha

(solida, tracejada ou pontilhada) e espessura de linha.

Este programa esta em constante desenvolvimento e suas fun~oes e

caracteristicas sao determinadas pela necessidade de todos os componentes

do grupo de pesquisa.

i;I ',"~'. t· :\1 ,\ J----- _.~--------_.'

Foi construido 0 modelo 3-D da enZlma gliceraldeido-3-fosfato

desidrogenase de Trypanosoma cruzi.

A analise deste modelo quando comparada a estrutura da enZlma

hom610ga humana indica diferenyas estruturais significativas que podem ser

exploradas no desenho de drogas de maior afinidade e especificidade pela

enzima do parasita.

Os compostos descritos foram desenhados na tentativa de explorar as

diferenyas estruturais entre as duas enzimas. Destaca-se 0 composto 3 que foi

sintetizado (Prof. J.Perrier, Universite Paul Sabatier, Toulouse, Franya e

Prof. P. Herdewijn, Universidade de Leuven, Belgica) e testado quanta a

afinidade e constante de inibiyao pela enzima hom610ga de Trypanosoma

brucei, apresentando uma afinidade 45 vezes maior pela enzima do paras ita

que pela enzimahumana(52).

Este resultado e muito animador quanta a possibilidade de utilizayao

deste composto como molecula de partida no desenvolvimento de uma droga

para a doenya de Chagas.

Como resultado deste trabalho de simulayao computacional temos

varias propostas para compostos com potencial ayao inibit6ria. No entanto, 0

processo de planejamento e produyao de drogas dificilmente e linear, em

verdade 0 processo se desenvolve num cicIo (como 0 apresentado na Figura

28) em que sao necessarios varios refinamentos ate a obtenyao da forma final

da droga.

Como pode ser visto na Figura 28, nao obstante foram criados 0

modelo da enzima e desenhados os potenciais inibidores, testados os

inibidores quanta a sua afinidade e atividade inibit6ria contra 0 parasita, se

faz necessario fechar 0 cicIo com a determinayao experimental da estrutura

do complexo desta enzima com os inibidores propostos para se saber

exatamente se 0 modo de ligayao real concorda com aquele proposto na

modelagem. 0 conhecimento exato do modo de ligayao permite continuar 0

cicIo na tentativa de se otimizar os compostos ja propostos.

Ensaiosemhumanos

Ensalosin vivo

Varredura Varredurabioquimica computacional

de composto de compostos

Compostosde partida

Ensaiosin vitro

Otimiza~Oodo inlbidor

baseadonaestrutura docomplexo

+Estrutura

experimentalenzima-inibidor

Sintesedo novoinibidor

Figura 28: Esquema geral para 0 trabalho de desenho racional dedrogas.

o trabalho de determina~ao da estrutura da enzima do Trypanosoma

cruzi ja esta em andamento no Grupo de Cristalografia de Proteinas do

Instituto de Fisica de Sao Carlos. A enzima gGAPDH de T. Cruzi foi

clonada(53) e a expressao em grande quantidade foi feita neste laboratorio. A

enzima ativa foi purificada e recentemente cristalizada (A.P.D.Arailjo e

D.H.F. Souza, trabalho de doutoramento).

Destacamos como aspectos importantes deste trabalho 0 completo

dominio de todas as eta pas envolvidas na nova tecnologia de desenho

racional de drogas baseado em estrutura. E importante ressaltar que 0 Grupo

de Cristalografia e Modelagem Molecular de Proteinas do Instituto de Fisica

de Sao Carlos ja esta estabelecendo colabora~oes com outros grupos de

pesquisa em doen~a de Chagas no Brasil, com 0 objetivo de estudar outros

potenciais alvos proteicos para 0 desenho de inibidores.

65Ressalta-se tambem 0 desenvolvimento de uma ferramenta de software

gnifico, 0 programa PDBV descrito no capitulo 4 0 qual tem sido usado

extensivamente pelos outros membros do grupo em seus projetos de pesquisa.

Como perspectivas futuras para a continua~ao deste trabalho vemos a

possibilidade de otimiza~ao dos presentes compostos, em particular foi

verificado que a adi~ao de um grupo etila na posi~ao 4 do anel aromatico do

grupamento benzamido no composto 3, 4 ou 5 aumetaria as intera~oes de vancler Waals inibidor/enzima.

6.1 Alinhamento entre 78 sequencias de gliceraldeido-3-fosfatodesidrogenases de varias especies. Desenhado pelo programa ALSCRIPT(54)

M.(II~".kic"lIf,.,.Iv,.. •• "MI,,..,J ••I'.wt",~,TJo.lvor,/T.cftalT~.,iti,"f'T""'l,,,,,,.JUC.~'",",";n,"B.I,,,,,nllvr.8.con~lJa,.,D.Jflhlililn.lIfI~tW~"JUIt

.~.cn,","flMP.ch"I""porl.",AAi.tpfN ••.•U_ydi.A.bi~pt'W'"C.,I",.,,,,,.,,,lolM,T,h",i"KilC.,lttnvillcfIC.llUMlnC."",,,,,,,,,,,_'.tJfIJ~,intJF..niJrJ ••••T.AtHlin,ilM."ltuetJ •••c." •••••R",","",,_S .•«o{dJI..tap;'tUG.,nll ••C.c.Jnp ••• lt:n/I.It"."'"D.-In •••"", ••0.-1_".., ••D./ryJIIl'"""nk'.,..C,II.,,,,.,C.~/llalUC.,I,(tflUC.~/"dlUC."",,_C.l>ti,,_S.MtIlVOrri

C.nUp •••S",I""IIJhnl/nMAJI"",mtJdri4D.cntynPhyll ••"',Iiliijln,nM.crptnll_11_;••R.M''-'11.v.lta"1f.••1,..,.1..-.,.,PJtyhr;J"P",trtiwl'"P.ai,,,••,,,I'..,ylv'l(ruP.p.,,,.P.in/II'tUtISLn-rvu;a~S.c~iI;.S,ct'u'lIuitV1./.',.Z.ro,uiiT.h.Iv ••••1L.maicnnnF..coliA.lINidbiluS.oI,r,,'1IA.•.• ,itrltf/uRApltMI'fIUlnF..cfJ1i/l.wu..J>iluLco/I

M.ffWlff;ci~tI"./tf.J • .,..,.i'M /"""" ••, ••• ,,,,,.1·(lJ."'W41T~",,'T.".,..,;1ItII1_'W1lk ••••

(:.f'••",,,,;r ••,,,IJ.II,,.,,,,""'.IlolOd,WtnunJldJl,luIJJM,tIIl,i.",S"c"".lfU/fW

l'.<hry.",porl.",AAup'"",U_yJuA.bup ••••C.,t"""pt>rIDlM.TJnnln8/;C."..,...illc:.C.t""",,,C.N •• ,,,,,,,,,_I'.•ft.~,inttE",IJ.,_T.";,.,;;M.",..,c"tuC·8'wUN.lllWW8-S ..•,rtr/.IIJ"I'ieruO,8""uC.c.JoponwII..•"";,,..O.••••,.ItD8",,1rO.-l.ItD~O./ry"II-~C.«#,tllUC.e1I,a,.,C.lllttllU

C.",8"1UC.",./88 ••••C·"";88-SJMlUoniC.<riIpuS .• ,,,,AJMI;.,.AJI"",m"l",hIOurynployll ••M.MlifI., ••M.<ry ••011"., ••A"""j ••R.tICt'r

11,"'8-II.Yllt,,,,..l......,..I'JoylwiJ4l'oIilliwurtp,uu".".1',qIw1l,1I1'_P.in{'."'"S.("nnu;a..fl,,";";a,S.c"nuIMK.' ••.•ulJtHU;;T.b."''''''''-""Aic.,.F..<ollA.,,,,,,,hilll$""1" •. #,,A.wuiflhi/ilR ..•pIo_mWuEal;A.•••,ioItIJIIE.coII

m rn ~ ~ m rn m m ~I I I I I I I I I

R R L P R K I. P I V V /) C T P 'WO I 'jj A K N X ROT Y I X M:C': I. it:A T , Q 0 0 B X II D Q I 0 I. 8' N 8 '8 NY II:D VI 0 X D Y A R V v'if :'c::::Ni':T 0 t::C R T I. N PIN D I. CO I KII 1I1.'.J!KI.1I1 vVPCTrll'll/ G AKNK/lOTYRXMll LIC:AI 'QOORKII/lcl/ QI.SI'NII'SNYNDVIOKDYARVVS' C'NT:TOL'CRTLNP I NDLC~I ItII /) MI. /) I~ A " I V I /) I: 'r , 11'11I (J A It N •• X MY X II K " I It A I I' f' II 1111X III! II I <II. II I' N II I. II NY /l I! S Y <I K D Y T R V V II C N T'T G I. CRT L K r L 111111, G I K.14 _.JU,_IJ! ..K.V_II_I_I_v_ll.A.:r ..r_I}_'!..M.'i ._JU~J'Cjr...'.L....J..~ULK-A.IJ.-Y..JL\ J J' ..Q. IJ.'UUL\JL ,(-A.f) _'(....ILL. '(.A I) .AJ'u' ..r._A..AJ...9.K...I'.•Y-YJ\_V_V.J~ '.:.r.u:.I-"v.....YJ\.LJJ!-A---'-A.II_Y_-._'LII-Ii ,. A II L ,. W'; X L II V Il Y V 1 Jl II 'r Ill. I' T V X II A A II I, II L K II I, A:K K V V I Ii A 1'." Il (J (J A X 'r " V M G V N II Ii Ii Y N ,. R 1\ (~ II V V ,~ N "S I; T T N CI. A J' L V II V L V K I! Il " I. I Il1L1'..A.IU,-LW.!J.K..'<-IJ-YJLY.•YJ-IULUi I, Ll:1U{AAA)LIL'1.1..JUl..!LA:R-'C.V~'l...1J •.At.:.A""L.!L!!.A.K ..:t.__ J...Y.M.f..xlt.'UIJ\ IN I' Ii B IU~T~U..!U<" , I V 1!'y--.L-Y-K..!UP'_c:', •.Y.!l.,"PIIK'.rWKIIL<lV/I/,VI Y.ST(IVI'KNRP.XAI!LIII.c~A(J AKKYI LTAPAKGIl/)1 T VVI C;C'NIIDQLXPIl IITII Ii.CA5".C·( ..T.NSI.AP.1 VKV: LUIlKPGJ vIII'KIII PWAIIA'IV(JVVIIl,S'r(;V/,T'IIAIIKAXAIILKua AKKVII TA','AKOIl/l1 T I VMQVNIIBAV:DI'SRUnll SN'AIlCTT,N8L'AP'VMKV LIlIlAI'C;VI!)1 ,. .K:'f."-,, ..WA " " N_V.IIJ_V_~rP..~' ;~.G P I'..T•..'I_A.N_AA.-".A.II LIl.A./.J _A.Jt.IC..:vv.' .. t.';A .••...A.S---"'_Il_IJ..AJ'-'-r .•..y-9...vv... N.I'-Il_S_~P_PJl..lUI.Jf_V_I_5.:.1l..ft •.II_I;_T.JJ"LI;..I,Jt.P.;,'tA •.IC...:v_"-'-"LIl~_tJ.'~I"'.)1 r ):J'J.A .•W'uu.:..cUiJu_v_v II .)." II eLK JUUI..AAK .ltlJl..A ..I)--A.1'. K.. ..LwtAJ'.AJl,.NJUtJ_·f-l_X-Mt)._v JI.'J .•".J(J _"J'...K.A./IJI_V_U.1'! .tl..,_~..:r_l..l'l-f:_U..r..Y...A." V.-l •.•II.K.'l.,P_ tl.Lv_N·I"IlNLAWtll~1 UV/Il v,Y':"s 1·i~IIII.·rxKI!/lA:AX)t1.IlACJ A:K ••.-v..II./I.AI':AXVIINI·r V VMlfV'/'i cl II KYcIl A/IA 1111VI 8NAII.C.T'r'.CLAA'·AIIV. 1.lI'll /'1111 vD P:A K I. 8 WIl K QUV I! I V:V)I:S::,t',:(I" JI::.'r,.XR A /I .Ai:A II:lie I. B A:O: A.'K 1I:::\":lI::,.S::4)'::A N Illl /I I T I :Y~IG:·V.N'B D KY':D A A Nil D V I S ..N A.S::CT,TN::C L,AP:P AX,V: L N II K'.G I K

~P1~~~~~~~.~.X~~,[:~:~:::::fm~~;.i~~~~~.!~~~tt~~~!~~~:~::~H~.::~~::~~: B : ~"~f ~v::~~:~~,~:~:~.ig:~~~N ~ ~~!~.~%:~.:~i}!~·~:t:,{~:rt~~:t ~&.~~ gt.:~D ••.·,\ N I I' ""0 II V ·tj'A r. Y I :V:·lfS:::T':'~ V I"T:T T B K'A.'S A 'Il'L X 0 V C lOl::V::1 :l:;::S::'KP:'8A D A P:M P :V:C .0:'\''''''1. D A:Y::DII It Y It V IS'N'.A$'::C":t.:1'N:C,t:':A.r:,'L AICV, I 1111K P G r,v"P:A A I I' WO S VelA II Y V:V:IlIl?r:u V 'T:'r I D XA'8 A U1. K O:G'A:KKv,:v-r:::S::A.P'8 A D A PM YVC U·1:N'L D It:Y:N P X D l' 1 I BN'AS'::C'r'':t'NC:L:'A:T I. A:ICY·: I liD NY G I V

I.V "":'I':,T MB X:'\;'O AUL X 0'1;1' '''':'K:R:'''''I J::''',:~:l'!';8 A D A P.:M

!~lm;iHlmllii.l.m=iiA Jl:'M

ii-IEA.p"MA.P,'MA)'::,MAP',:MAP.::MAP::MAP',MA~fMA r:'M

N l'.1l1l I PWU R T :aA R P V':'l('iK~tt:GIV'lr!i~ ~ ~ ~~:~ ~ !~!-~~:!J. ~~.!it:i!Jr!i:~:t:! ~ ~ H::5 p i:V(r,V.tiK ij iV:K S if I II i V sHisicTTNCLAPL AICV: I N DKJ' G IV

AJ",:MAP,:MAP::MAP.:'MA r"MAt:::MAp:,MAP::MAij::MAP:,MAP:'M

.'__ _ ... ,,' ._.___ _ _ .',',_...._. ., . , ._..;. ... ,', . A ':~M •.;.•.::••.•"':::.•,,:.•~::•• " -: ~".•••..- -.. •. -,·•..:I~;._.;._.·._ •...• :--.~ ;- .._ ...•.•..•.. - •.• ,-" - - - -DP':AN I. P WAil I. N I J) I A I DSYI':'OV I'::XX I. D T:A:.Q KII:! D A:Il: .A'.X..K:.",::V.(.::TA::P:88 T A ':M P'V:MG.:.V,N:B B K.:(:T II D I. K I VS:N':A:S,:C ..T:.TN·C::a;.A P I. AII:Y: I N DA PO IIID .I'.::AN I. P .WCI 8 I. KID V A':I(.:Ds:':'r:.G V '.::It B I. D T:A::Q K .IU D A :(l' ;Ai'" /t'.Y::V r:. T 4.r:8 II 8 A l'::M , ·V,VQ;:VN·:II T KY·:T P D It It I VS.;'N:ASJ:l.T·:T::N'C.L:APL A/tV: I N DA , Ol./l

g~':~~t ~~~~~~'~g~H,::!'iiij'!r ;::~::: ~~!:snit! :.g: f,:!~:~::H:!~i:j!~!D ~ ;1:5 ~~'~!i~:j~i'!~r~:~~:~~:~e![!~·~;:::~:~.!}:·a·gt:i~~:tf~:b i~~1fHi;D po:AN I. X WD B I 0 V Il V V:Y'1l:S.:.T:(J I. It:L T Q B T :'\:11 X IU I! A ·G. A:R RV::V ~IT 0 p:r X D D T p.':M P "':MG':V':H:II T TY,'IC 0 Q I' 1 1 S'HKS':C,j::.T,!f"C:'I/A'P':LAJC:V: V II B II:Y G I:' VUPA N I. K WD Il V Q V U V V AII;:A.T::I; I. "I. T D E T ·",:R X 11:1 T A a: 4'X'KV:Y MT Q "'8 ICD N T p'M , V It C'AN:r D ICY'A 0 Q D I V B.NAS'::C.T'l'1'f·C:,L':'A:r:::L AICV: I II D N P G I: IN r:A /l I. P WII K LIlA D Y Y:V::K"IFT::G I. 1'.:f:'D 8 B (1.":S It III. Q .1.0: A'X R .V:I (8::AP:T X D P D R.V a T I. I.. V O'Y:N'II D I. p. D P 8 ICD V 1 Y SNA.s·:·c:f1·N'C L:API A II:V: 1 II D II' G L T 0\N P."V II I. P WII D M'II:I D I. VI ,B"I;'T::O V I'::V D R D O:A:U X 11·1.Q A .0. A:X.It.:Y:L .(:::T .1..1',:0 It G D 1 P:T y;v:v O.TN:B I! 0·1(:'T II A D l' I 1 S.N.AS,::C.:T:T..J'C,C LA.P:P V It v: I. D ~ It, 0 I 1N l":r. NL P WXB WB.I D I. 1 1 ll:,Ji;::!I\GV P':;t::8 It I! O'A'L xn:VNV.O. A:JC:II::::V::L1:::TA,:;1'::OXN I! D G T P:V,IQ:,V:N:IIUD'J(.::D UN V liB 1 I S:N.4'S:&T'T.NC'.LAP.:a A.K.V.: I. N D Kyat 1 00II P'A B I. I' WA a'v D MA Mll"C'T':G I 'mT XI! X:.A;:AA II:L Q N:9: AiJl:'R:'V.'L V..S:::A:'P::CD GA D R T I :V:YC:V;:il,/::IIA T I. T AD D I. V VS:'H.::A:s:::c;?r/r.)(C:,L::8:P::VA K'v,i I. II D'A I 01 AR A K N 1 r WX A xa A R 1 1 :V.B'C:T·O P Y T:'S P B K 8 Q A UL D A 0' "':K'X'V:L l:'S::'AP::A 0 B ~IK T 1 V;:Y N.'1'?l'tD D T I. DON D T 1 V's,:v A:1J:':C}I'/t::"i::c::Li::'A'.P:~f.AX·A I. II DS 1":'<;1 BIt P:R D V P WK D P G V /I I. V I. Irc 8 (J K r::. T PAT I. DrY' It R G: v Q ICV) Y A AP:V X B B A I. N 1 ,.,'MG::V:)(D Y 1.t'::B P B It II D I. I. TAA'S:i:f'l':TN':C::L::A::P:V V It V:' I II E 0 I. G I ItII I. Q8 L' .,,~ II 1.(lV D VYL D C,T:,q Y 08 R II UO I All'. AA.a: A:,KJ/;::Y,:LP.::·:D,.::08 N D I. D A T vY'Y.cntlf::QD QL RA B ua 1 V':If::A'8:':I:::T"T:::"':~::1 II'::v I &1.' I. D P'A Y ill B

~f:~I~~nfl~::';:~::~::il:i:'iC;:~i:vJ'i,":ik'i'.i;8 A D

~'~I~.I~lni:ji~i.~lli~i

M.f,w""d('"..M.bry_iiMf'"~"p.';/1,,,,.1TJol>.wl/T«, •.dT.mnr,/i"."Th1",'I~,.,r..,/lf/",ni, ••••II~",.",,"""R.I""~I"'"''n..•.,,.','hn,,,.,(n,,,I,,,,.S.c-n"."."NP.Irry.onpori.",A.hisp",,"IIJMy,li.A..hi·fJlwUIC.•lo~ol,,,,rloU..T.1orti,,(,iC.ptlnu.k.C.IItllWGC."""",,,.,,_1'.,.",,,;1ttIf..ltillll/"",T.Jn"1"611-11ft

•••• , ••·xrWUI

- JltIfV"kw~~'~ crtJ/"C#'J' Jnl,i,,..

',6,,11••e-::t t.•.jop'IfIIca

I ~:=~:,dIt.li.Mn"" ••••PAyk'".DIfI,rlnuwur.II""IU,'C."'6"'"1C.""6·'"!,C.,/".,.,C.MiU_tC.Ni,,1tI1~""."'0IIi,C.trUp ••~",I1,.:AJha/IIJIIIIt 14.11"",,",,1 •. 111D.ttJtyophyll ••M./i1ii{lo,.101•• ')111"" ••••

. A,Jftdj_-:R.•. ,,.H.>o1rr-1(·>016_Z.-ryoP.ltyMiJ.1'.,6111;",'"

:p.nu". ••PoIyI",,"m

i 1'.JHfInu

f' PJit/,."",S,<'''''UUN

m i~~::::I :::=.~

T.b./woc./LJrtnicdlfll

F..J:P11,4."",;","116S.o/"tIC'/!(f

A••• ,iohUIlRoIph •• ",iJuE.ttJ1IA._lMiIuE.cuII

MlD",,;ticwlltM.~i1M,f,."iJ •••',VII'W,liTJo.", ••. .,T,Lt,,1IT,,",,,,,imaT""II""'(''''r.."••lttlftit''''''H ..II~.ntlte,.B.cthfRJdru1l.J"b,iU.",""~nI"i••",S.cnmllfUIVP .cllryIfJlpo"'"AJoilpot'"U.-)wilAJoupot •••C·I'",••·potloiM'T.~ltIi"t'iC'I·tnlllic.C./ftlltlltl

C.J"",o""'PWP..,.,n'''''E.niJullllUT.J,lfti",iiM.llfwctll.

C'P"'"R.-wlkwSoler"' ••H..•."ilruG.,..II ••C.<.j"l""'Ql'..•np;nuD.IffII""",tUlWn.".,I""",,...,.O./oy.vl11.-,,",,-C-<I.,.. •••C.• I'I'·IUc."~(",,,C.t4,I""'C·"'/U-C.hriUId'.f.-•••••••C.,","'"S .••I""AJWittIMA./ft.",,,, ••I,,,,.O-"tyoployll ••M.liliifl ••",M.<ryllIIII_A.-j ••R_••lI.wI,,,,,lI.•fOl_

Z'"""l'.hyltrlJ41'..II1t;VI""P.a/,pN'"I' .•yI ••• irlI1'."." ••••I'.inf ••••••SJU,"U;MS.c"ftliliMS.cIff'VuiM1(./ ••.• /'Z""...i/T.1I.", ••. ,11Jv.r_£.coliiI.••••,1DI>i/1IS.IJl..-.A.Wt'WtiU,N.•pIo""",'M,~:.<••"A•••••,...,"£.<oil

:If:B 0 :t:,o S ,'I':A B P M B YAK B LOR.' R N D L ,i(R I 0 V WB B S L N I V 0 0 R L Y Y MQ A I II Q ifs D V V P B N V:i(A I RAM L B MB D N P S K SIB I: T N K A M G I LOBO:J;:::TS'r:AOPMIYAKOLORSRNDL:P:'BI OVWBBSLNI V DOBLYYMQAI JlQltSOVVPBNVD:AI RAMLBMBNOPSI:SI QI:TNKAMGI LI! 0 O:Ii:T S :i:A B I ME Y A I: R LOR S R N D L:••:'B I P V WR B SHT V V 0 N B I Y Y MQ A V B Q IS D I V P B N VD.:A V R A I L B MB EDit Y It SIN I: T N K A MN I L Q

~~~~t~A_CLI-...LP..J'.-AJUU,JllU"".!!.'!J~I.JJ'_1l I A Y WU •••UllLV_K -f,..1L1LIcLLJ-2.A..Y.J.uvrs p V lJJJlJ •..JlALJLA.1'tlJ'....LA-1LJU!JLLLJt It T N It /I L q ILKKNI::L<ly·rUIIRI.V.II:AU,.,1 II 1111RII.III YU/I K.A::TLQNNLPNIlRltJl:.,K:1 VILWYPNIlW<lY.SIIRVVU.I,.VItIlMAAItVItAAKL-:Hi'f":4H-~~::-:H...:LH~}}H-Hl.~;-t~",}'~+~,:g;'~~I~v-Hc}~~~~-:t-V-~·H.J~{·;~C.'rHt·HIHr-~,-P,,-,R ••••.S•.•ALIlRuL,,-----_---------'K:IH:,:L':A V:T.K b I! I Y:.L.ltO;:1 V Mil P II Si(lV.II:.A;; K L T K A L:'I.I N MYK:V PA.WY.b·N:]lWU:Y:A N It ~r.:Avl;::v E L V L R K 0 V

_~.'JlX. ..I0-'Y+!LP,-JU'J •.•y;~fLP.,J-YJ.l.\""'UU;.1WS: "':1!;:.~0': 9 L T K V SON T~V .·V V~'!.Ll~Jf.;.~GJ'..;;I.£.VJJJ.JJl L V A S 0 A L N-,-J(9J,,-I~'U'-!ULLU:,UI!JL.U!..2.LL'LlJ..::U...Ll!~..l!....:U".LLI! 9 IUJ.·· .V-YL.WXJ).J!../t..Ut ..'t:..ULlLm[:li.:A.JL"LLA.LK9.IWL •••- ---------------'

:K(H.I'·A Y:8 , 1\ r "\';'1 R N Y N (I Ii 'r V IlIJi::T I V:I . L S T M V I D (J A M ..:vvnVY""D':N:1l T .U:Y.S IIIlV,V A L:A A Y I N A K 0 LKo'::'a;·:o Y'II K K P I. 'V:if':9:b,'Y N II N K N 8:IJi,:T I U"': L 8 T ~IV MB 0 S nV:K:V IS:Wl'o,ul's .G:I'"lIN ll:v,vlfL,A A Y I A K K G LK (I ,,:'Ii:ll Y:/1 II II P I. V:II;:fl II;Y N II N I N SH:T I P,A:' LilT ~IV MH 0 N MVKV I ·II·.WY:D NIl:SO.Y:,'N R VV UJ.."A Q Y I A A K G L:K(/.l'::l;':U., :l':U II S V V,$"T .11,,1'T 0 A N B 6:,8,1 :,:\I:S K'A"G:J.:;·AI S I: Ill':'v' It:L I A WY:DI'Ul,WO:Y·S··R RV'CD.:L·:L V Y A A K Q D GAL

.:i\~:i;\i,~::~~:~iii~~~:ill~:i:liri~~si:I!~rii::~;I~:~[l:\ii:'l~~::~~~ii:~i:t~~,:~i:!:S:!.E~:~::i:~~I~:~i:i··t!~~~i!!~~~0 I,ICJI,V:&"AV:'t" II II 0 V V,>'J,:TIJ,MI 0 N P N 1J:\9:;:Jlqg(: K:4:'O '.,,'8 IfN N N ,:,:y,""'L v·s:;::wr:.D'N£:W.Q·;Y::fR .::V::L :P:J<':LA II V A I: V D ASKK:G'V'a;:A YT:O 0 D V VS:,SU:ML 0 N T N ,i'S'1 :V.DJ. 1t,4,'O:I':,S L::N It Nl()':K'L VS'Wl':D.:N'Z:WO·:YS:'R R.•••LD).:L All V A I: V D ASK!C:llVL.:A YT:I! V I) V VI'/:,TP:MN GNP N 11:11.1:lfll.·A:: K:II;::O[",S L::N 0 II l'.:,y:K,L VII.W:Y,P:N·I:,WO'Y'S::R RYLDL:I S Il V A K V D G N AII (lV.L:ll YTII D D 1 V.T TD:L N 0 P N R $.'.1 :,.·11.\:, K:II;:,O1"'S L::N K N 'W,lt,L VII::.Wy,D:,N:Il:WQ:Y:S:'RIl:V:L .II:I.'L V Y I A It 1 II G 1'1A

:S:~:~;:ti~~j~·::!:~:i··~:iitS~: ~: :::1·,: j:.!.~: 5·j::Uiii ~::S : S!::r:iltH·,$i":i::a:!·;:~~::i::=:':$,·t!i:f·:~i!~:~~i~i~K Grl"AYT:R 0 VI V'''':TD',I L T II P IIS':II"TP:n:A; It·""o .t,' A 1i':N It N P:J~::K,v M8,WY.D·N:"'YO:Y:S':R R:VVD:L:;1 V Y V S K K V 11.0 QII:oLL:O Y'rl! b Il V ."'S'C v:p N S 1'1.' 1I1l::8:"T.'.IJ:);,' o:A:::OHA.L::H D N ttW:a:,L 1 8.:WY:VN:£'Y:(A'YS'N aV,v:IU/MA V MA S K EIt (I (LO Y.'r.R D Q V "'s:cu,p N S V II 11118:'T )~U:A;: ox;o :tA li:N 0 N P::YJC:L 1 "S:.\VYb:NIl'p ,O:\":S.:N ItV,V:U:L:MA Y MA S K R:ltO [::,L,O Y::T,II V Il V y)I::CII:P N IJ N II II 6.:II,T :••.::0.A;: O:/!,:,O:1,:,11.1.(1'1 0 NI ..:V::K:LI S:,WY:D:N:R::Y:a:Y.IJ.:N R,.V::V.D.J.:'MAY MA SKI

~.~.!.·i.~.f~UHf..1i!mm~.~1.1illU.m m.~.iL.~.Wi'i~t,.~",15"-'~"""~LM...~~'~i,-,j.....,t....i;::::::::::::::::::::::::::::::::::;,:PuH'L:.'~V I! K V "vlTO.p L II II T H.8~~~~IJA:: K:t.otrs1l:N 0 K~~,6it'~"I'<lY:;1JN lVI :C Bit Y MQ II K b

:Il:o:v 1",0 Y'l':R II A V VS,:II ,n::p LOP T II A 8::1 :".IJ'A:i II :A::,or::'Q I:;::S Pit P:"YJtL 1 :8:WY:D)(Jl,Y,G'Y:S:A .:YYIi" L) I V V A It A.1(N.VVtJV·'r:R II II vVII.'II·II:P L OP T 1I11::T,I :PIJ);" s:,,"oEQL,:S P Kp::,:a::v V A.WYIJ·NIl'Y:O:Y:S:B a:v:v:D::Jf:VB IlV A:!C(Ua.:flY'rR V b V VS:SIJP L OD AII5::S::1 .V.IJ'It.:: A"A'O'VIl I,:T P T":"··IC,L V:S:\vY:·IJ::/,fB.,p:d'i":S::T a.::V::V·IJ:L"VI BV AItS AIt IJI ..',.:flY.V,) II R 1 va:,s,),:I N GI P L T 1I.:,V:••.·.O:,\:: R:A":OJ::S I,:,N 0 NP.WKL VS':WY::D:N:Il:T:G:.'i":JfN XY-'II·D.L:'I AIlI Tit

.ii,f:tj~~"~;!: :~;··:::ti'ii ~~i~~i.::i:lf·i~!::i, ~,i:·~~~~::S : : i';'i·t ~~:s~::;':e:il~~i~:!:!~i,~:t.i.:tl~t: l : ~1\:1:G L"I.::II V COR' L Y:.S.•:I :n:.:. R C T 0 V lI::;IJ::T1 D:S S L T MV MOO 0 M:V::Il:'VI A WY::D:'N'.B,wa:::Y:,s':QR::V:V:D':L,:A0 I V A N It WQ AK 01·1 •.0 Y:II R I. II LY".:IlD:Y Il OT PA ,l,:8:~1 V..»:4.·: 8 L T L V MO NO L'VX:V Mil. wvn·N:r.,w..Q:T:::S:QR:V:L'D"I/A B L V A R It WV"GV I. III' 'r T II , N V 11'1'/'11:1' If 1111P IIIJIFV·Jt'l1 M II Q T K V Mil II R MV It I L 8,WY IJ N:lfwll:P8,N aMA D:T A V A MO R L LNKII ...,(IYTDIIIlI " •.,:110:11 flSIlPflS:V'V:D:A, TIlTHI TAVO OI.llLVICTVAWYPNIl:VO:I'.VTltLI RTLEltpAKLIlIII LOYIII!KPLVH.I U:YItVv,as's:11 0 .• : LSTMVVO ITQ,VKI LAWYDl'fRW!H',VHRMVRL:ARItVALSLItHOI. V DTT I L P LT"',V D,P l'f liD P D':,AI VP:O T QT 1\ V. 0 AIlL J Jt:T LV~C.D.If.r.,W.(J:P Al'f.r.:MLD.,T T LAMA T VA P a

1Referencia do programa TOM2 Bleasby AJ., Wootton J.C., Proto Engng. 3(3) (1990) 153-159.3 Vriend G., J. Mol. Graph. 8 (1990) 52-56.4 Bairoch A, Boeckman B., Nucleic Acids Res. 19 (1991 - Apr 25) 2247-2249.5 Jones T.A, Zou J-Y, Cowan S.W. e Kjeldgaard M., Acta Cryst. A47 (1991) 110-119.6 Sidman K.E., George D.G., Barker W.C., Hunt L.T., Nucleic Acids Res 16(5) (1988 Mar 11)

1869-1871.7 Bernstein F.C., Koetzle T.F., Williams G.JB., Meyer E.F.Jr, Brice M.D., Rodgers JR,

Kennard 0., Shimanouchi T., Tasumi M., J. Mol. Bioi. 112 (1977) 535-542.8 Dayringer H.E., Tramontano A, Fletterick RJ., J. Mol. Graph. 4 (1986) 82-87.9 Benson D., Lipman D.J., Ostell J., Nucleic Acids Res. 21(13) (1993 - Jull) 2963-2965.10 Pattabiraman N., Namboodiri K., Lowrey A, Gaber B.P., Protein Seq. Data Anal. 3(5)

(1990 - Oct) 387-40511 Kuntz J.D., Science 257 (1992) 1078-1082.12 Bohm HJ.,J. Comput. Aided Mol. Des. 6 (1991) 61-78.13 Goodford P.J, J. Med. Chem. 28 (1985) 849-857.14 Shoichet B.K., Bodian D.L., Kuntz ID., J. Compo Chem. 13:3 (1992) 380-397.15 Itzstein M. Et ai, Nature 363 (1993) 418-42316 Antonio R L. Teixeira, Doen~a de chagas e outras doen~as por tripanossomos. Brasilia,

E<iitora Universidade de Brasilia, 1987.17 Alvaro Moncayo, Chagas Disease, em: Annual Report of Tropical Diseases Research,

1993-199218 Opperdoes F.R, Borst P., FEBS Letters 80 (1977) 360-364.19 Opperdoes F.R, Ann. Rev. Microbiol. 41 (1987) 127-151.20 Fairlamb A.H, Opperdoes F.R, Borst P., Nature 265 (1977) 270-271.21 Clarkson A.B., Brohn F.H, Science 194 (1976) 204-206.22 Stein S., Opperdoes F.R., Eur. J. Biochem. (1990).23 Ramachandran G.N., Sassiekharan V., Adv. Proto Chem. 28 (1968) 283-437.24 Wilmot C.M., Thornton J.M., J. Mol. Bioi. 203 (1988) 221-232.25 Wells JA., et ai, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 52 (1987) 647-652.26 Clore G.M., Gronenborn AM., Protein Science, 3 (1994) 372-390.27 Stryer L., Biochemistry, pg.32, 3m edition, W.H.Freeman and Company, New York (1988)28 Schulz G.E., Schirmer RH., Principles of Protein Structure (1979), Springer-Velag29 Martin 1., Hartl F.U., Structure 1 (1993) 161-164.30 Ellis RJ, Nature 366 (1993) 213-214.31 Ring C.S., Cohen F.E., The FASEB Journal 7 (Junho de 1993) 783-790.32 Barton G.J., Sternberg M.J.E., J. Mol. Bioi. 198 (1987) 327-337.33 Needleman S.B., Wunsch C.D., J. Mol. Bioi. 48 (1970) 443-453.34 Barton G.J. e Sternberg M.J.E., Proto Eng. 1 (1987) 89-94.35 Jones T.A, Thirup S., EMBO J. 5 (1986) 819-822.36 Vriend G., Sander C., Stouten P.F.W., Prot.Engin. 7 (1994) 23-29.37 Dunbrack R.L., Karplus M.,J. Mol. BioI. 230 (1993) 543-574.38 Vriend G., Sander C., Stouten F.W., Proto Engin. 7:1 (1994) 23-29.39 Vriend G. e Sander C.,J. Appl. Cryst. 26 (1993) 47-60.40 Rossmann M.G., Liljas A., J. Mol. BioI. 85 (1974) 177-181.

.1 Kraulis P.J., J. Appl. Cryst. 24 (1991) 946-950 .• 2 Hol W.G.J. et aI, Proc. Natl. Acad Sci. 90 (1993) 2355-2359 .• 3 Skarzynski T., Moody p.e.E., Wonacott A.J., J. Mol. BioI. 193 (1987) 171-187 .•• Moras D., Olsen K.W., 8abesan M.N., Buehner M., Ford G.C., Rossmann M.G.,

J. BioI. Chem. 250:23 (1975) 9137-9162.-45 eomuni~io pessoal do Dr.H.e. Watson.46 Skarzynski T., WonacottA.J.,J.Mol.Biol. 203 (1988) 1097.• 7 Murthy M.RN., Garavito RM., Johnson J.E., Rossmann M.G., J.Mol.Biol., 138 (1980)

859.048 Vriend G., Sander C., Proteins 11 (1991) 52-58 .•9 Kabsch W., Acta Cryst. A32 (1976) 922-923.50 Laskowski R.A,J. Appl. Cryst. 26 (1993) 283-291.51 Dauber-Qsguthorpe P., Roberts V.A., Osguthorpte D.J., Wolff J., Genest M., Hagler A.T.,

Proteins: Structure Funtion and Genetics, 4 (1988) 31-47.52 Verlinde C.L.M.J. et al., e Hol W.G.J., Structure, 2 (1994) 577-587.53 Hannaert V. , Opperdoes F.R e Michels P.AM., Protein Expression and Purification

(1994), submetido a publica~io.M Barton G.J., Protein Engineering 6:1 (1993) 37-40.