Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé
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Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé
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Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé. Objetivos. -Biotecnología -Subcloning -Vectores 3 Modulos Ligación : fragmento + vector Transformacion de E coli Selección por resistencia, crecimiento y ensayo de transfomantes Opcional ; Extraccion de DNA Plasmido El Vector: pUC8, 2700pb - PowerPoint PPT Presentation
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Biol 3030 – Lab DesarrolloJA Cardé
Objetivos
-Biotecnología
-Subcloning-Vectores
-3 Modulos1)Ligación : fragmento + vector2)Transformacion de E coli3)Selección por resistencia, crecimiento y ensayo de transfomantes4)Opcional ; Extraccion de DNA Plasmido
El Vector:pUC8, 2700pbSitio para Eco R1 en M13 mp en el fragmento de LacZ
pUC8 – 2665 bp
Contiene parte del gen lac ZCodifica para ß galactosidasaMetabolismo de galactosidosOperon de lactosa α fragment del gene de lacZ
- E coli mutada en lac Z- Su cromosoma tiene el
fragmento Ω de lac Z- Cuando α y Ω interactuen lac
Z sera funcional- α complementation
- Operon de lac- Represores (lac)- Activadores (CAP+ cAMP)- Inductores (IPTG) atrapan al
represor
- Sustratos para ß galactosidasa- Lactosa- X-Gal, hidrolizado se pone azul- PLT transformantes con pUC
donde lacZ sea funcional seran azules!
- ONPG – sustrato para ßgal pero amarillo espectrofoto
MCR/MCS
MCS insertado dentro del lac Z gene pero no interfiereInsertos caeran en el MCS y si interrumpen el lac Z genePLT transformantes con el inserto seran color no azul… blancas
Ligacion:Vector linearizadoT4 DNA ligasaFragmentos de DNAMg+2Enlace fosfodiester 5’-3’37 C vs 4-22 C
RecircularizacionConcatamerizacion
Alk Phosph
Orientacion de la ligacion
Transformacion
Celulas competentes (JM109)-No resistencia-No plasmids-No enzimas de restriccion
Eficiencia de la transformacion-supercoiled > circular > lineal10 ngs es suficiente100 ngs inhibe1/10000 celulas se transforma
Se define 3 de transformantes por µg de DNA
10 ng para 1ml de celulasSalen 100 colonias = 1000 transformantes/ml1000transf/0.01ug = 1x10^5
Screening Blue/White-Resistencia ayuda a seleccionar (Amp)-Pero de las que crecen cuantas tienen el gen?-Azules vs Blancas- Azules lacZ+ ONPG amarillo-Blancas lacZ- ONPG no
Study Questions
Resultados
• Recuerde discutir los resultados objetivo por objetivo.
• Cada objetivo tiene una pregunta de investigación, una hipótesis, alguna tabla o figura que los resume y su discusión y conclusión.
• Al final una conclusión general de todo el ejercicio.
