Biologia Molecular
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS AGRONOMÍA TRABAJO AUTONOMO DE BIOLOGÍA MOLECULAR - GRUPO#5 DRA. LORENA PULGAR INTEGRANTES: -ALEJANDRA GALLARDO -SALOMON VERA -DAVID PEÑAFIEL -VANESSA MOREIRA -LIVIO ROMERO -CAROLINA BRIONES PRIMERO “A” SEGUNDO SEMESTRE SEDE GUAYAQUIL PERIODO LECTIVO 2014-2015
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trabajo investigativo sobre la estructura molecular
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
AGRONOMÍA
TRABAJO AUTONOMO DE BIOLOGÍA MOLECULAR -
GRUPO#5
DRA. LORENA PULGAR
INTEGRANTES: -ALEJANDRA GALLARDO
-SALOMON VERA
-DAVID PEÑAFIEL
-VANESSA MOREIRA
-LIVIO ROMERO
-CAROLINA BRIONES
PRIMERO “A” SEGUNDO SEMESTRE
SEDE GUAYAQUIL
PERIODO LECTIVO
2014-2015
INDICE
Contenido1. INTRODUCCIÓN.....................................................................................................3
2. OBJETIVOS.............................................................................................................4
2.1 OBJETIVO GENERAL....................................................................................4
2.2 OBJETIVO ESPECÍFICO...............................................................................4
3. DESARROLLO DEL TEMA..................................................................................5
3.1 La inducción de una proteína recombinante PRÁCTICA #10.....................5
3.2 MARCO TEORICO.........................................................................................9
3.3 La separación de proteínas por la electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida PRÁCTICA #11..........................................................................12
3.4 MARCO TEÓRICO.......................................................................................18
4 RESUMEN..............................................................................................................19
5 CONCLUSIÓN.......................................................................................................21
6 BIBLIOGRAFÍA.....................................................................................................22
Trabajos citados.............................................................................................................22
7 Anexo.......................................................................................................................23
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Vector de expresión procarionte........................................................................5Figura 2: Mapa del vector pGex........................................................................................8Figura 3: Electroferesis....................................................................................................14
1. INTRODUCCIÓN
Para poder tener una buena investigación debemos tener en claro estas dos
investigaciones ya que hablaremos de: la inducción de una proteína
recombinante y la separación de proteínas por la electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida ya que estos dos temas fueron sacados de
breves prácticas de laboratorio y se concluyó lo siguiente.
Gracias a los avances de la Biología Molecular es posible producir grandes
cantidades de proteínas seleccionadas, por la tecnología del ‘ADN
recombinante’. Se prepara al insertar el gen que queremos expresar en un
vector, para luego transferirse en una célula huésped. Donde será insertada.
Este método ha ayudado a diferentes procesos en la medicina e industrias.
Un vector de recombinación es la molécula que resulta de la unión de un DNA
vector con el DNA de interés.
Un DNA vector es un vector de clonación que permite introducir en una célula
hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula
hospedera el vector se replica y expresa, en su caso
La electroforesis es una técnica de separación basada en la migración
diferencial de especies cargadas en un medio conductor, el cual se encuentra
bajo la influencia de un campo eléctrico. Las proteínas se separan comúnmente
sobre un soporte sólido de poliacrilamida. Los geles formados por
polimerización de acrilamida tienen gran poder de resolución para proteínas de
pequeño a moderado tamaño
2. OBJETIVOS
2.1OBJETIVO GENERAL
Analizar como actúa la inducción de una proteína recombinante y observar que
vamos a obtener de la separación de proteínas por la electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida
2.2OBJETIVO ESPECÍFICO
Explicar los componentes y el requerimiento de las expresiones de las
proteínas recombinantes.
Entender el sistema de expresión, aplicada en las células procariotas
Recopilar información secundaria acerca de la desnaturalización de las
proteínas mediante geles.
Reconocer que la electroforesis es fundamental en la desnaturalización
de las proteínas.
3. DESARROLLO DEL TEMA
3.1 La inducción de una proteína recombinante PRÁCTICA #10
Podemos decir que con la ayuda de la tecnología hemos podido descubrir
muchas cosas de las cuales podemos decir que una proteína recombinante es
una forma manipulada de una proteína por lo cual se genera de varios modos
para producir grandes cantidades de proteína por lo tanto modificar secuencias
genéticas y hacer productos comerciales útiles ya que así podemos decir que
la formación de la proteína recombinante se lleva a cabo en vehículos
especializados llamados vectores. Además que en los últimos años se han
hecho breves estudios del mismo porque la tecnología recombinante es el
proceso involucrado en la formación de la proteína recombinante.
Figura 1: Vector de expresión procarionteFuente: es.123rf.com/imagenes-de-archivo/antibiotico.html
Normalmente en las materias relacionadas con la genética se analiza la
estructuración, composición y acción que realizan las proteínas además
actualmente, se es capaz de crear enormes cantidades de conjuntos
de aminoácidos específicos utilizando la tecnología de la
recombinación. Mayormente un ADN hibrido o recombinante se dispone
al incluir el gen que queremos manifestar por lo tanto en un vector será
su fuente de llegada a dicho individuo por lo tanto se cede al interior de
una célula lo cual hospedera o host donde la proteína que queremos es
sintetizada ya por lo tanto esta técnica ha sido empleada en la
elaboración de grandes cantidades de proteínas con intenciones para
mejorar la salud ya que así podemos experimentar con ellas y también
ayudar e avances a la industria
Por lo tanto se ha podido concluir que las células bacterianas han sido
ampliamente empleadas como células que habitan para la fabricación
de proteínas hibridas con grandes modelos de los cuales diremos que
os genes clonado que incluyen el encargo para la proteína va integrada
dentro de un vector de manifestación que tiene todos los
ordenamientos de observación transcripcional y traduccional
Ya que además podemos decir que la tecnología de ADN recombinante es un
modo de estudiar las funciones e interacciones de la proteína por lo que en la
actualidad se la usa con frecuencia pero esto se hace aislando la secuencia
objetivo de ADN y luego transfiriéndola a un vector de clonación que tenga la
capacidad de autorreproducirse ya es de suma importancia saber que el ADN
del vector de clonación van a interactuar con el ADN objetivo y produce un
nuevo prototipo de información de gen llamada ADN recombinante ya que así
sabremos que el ADN recombinante se transfiere al ARN, que a su vez
produce la proteína recombinante.
Ya que que por eso podemos decir que el desarrollo de dicha tecnología ha
servido para el buen uso de la ingeniería genética en las últimas décadas ha
favorecido el avance de la industria biotecnológica aplicada a la sanidad
humana y animal y consecuente mejora de la calidad de vida. La utilización de
proteínas recombinantes como productos terapéuticos, como vacunas y como
herramientas en ensayos de diagnóstico está siendo cada vez más extendida.
Gracias a los avances de la Biología Molecular, se es posible producir grandes
cantidades de proteínas seleccionadas, por la tecnología del ‘ADN
recombinante’. Se prepara al insertar el gen que queremos expresar en un
vector, para luego transferirse en una célula huésped. Donde será insertada.
Este método ha ayudado a diferentes procesos en la medicina e industrias.
Un vector de recombinación es la molécula que resulta de la unión de un DNA
vector con el DNA de interés.
Un DNA vector es un vector de clonación que permite introducir en una célula
hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula
hospedera el vector se replica y expresa, en su caso.
Reactivos y procedimiento
MATERIALES REQUERIDOS
- Matraces Erlenmeyer de 100 mL y 250 mL estériles
- Microcentrífuga
- Termoblock
- Incubadora a 37° C con agitación
- Espectrofotómetro y celdas de espectrofotometría
- Congelador -20oC
- Mechero de Bunsen
- Micropipetas y puntas de 1,000 y 200 L
- Tubos de 1.6 mL
- Bacterias de E. coli DH5α transformadas con el vector pGEX-6P o similar
- Medio LB, preparado en la Práctica No. 2
- Ampicilina (100 mg/ml; preparada en la Práctica No.2
- Hielo/contenedor
- IPTG (100mM)
- Buffer de carga para proteínas
SOLUCIONES
Utilice bata y guantes en todo momento para preparar las soluciones.
- Solución stock SDS 10% (p/v) (10 mL) Preparada en la Práctica No1
- Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 (100 mL) PMTris 121.14
Disolver 6.05 g de Tris base en 60 mL de agua Milli-QTM. Ajustar a pH de 6.8 agregando HCl 6 N. Dejar enfriar la solución a temperatura ambiente. Ajustar el volumen a 100 mL. Almacenar a 4° C. Antes de usar el ácido clorhídrico, consulte la sección de “Seguridad en el laboratorio de Biología Molecular”.
- Solución stock de azul de bromofenol 0.5% (p/v) (10 mL)
Disolver 0.05 g de azul de bromofenol en 10 mL de agua destilada. Guardar a temperatura ambiente. Antes de usar el azul de bromofenol, consulte la sección de “Seguridad en el laboratorio de Biología Molecular”
Buffer de carga para proteínas
- Agua Milli-QTM 3.55 mL
- Tris/HCl 0.5 M pH 6.8 1.25 mL
- SDS 10% (w/v) 2.00 mL
- Glicerol 2.50 mL
- Azul de bromofenol 0.5 % (w/v) 0.20 ml
Guardar a temperatura ambiente. Agregar 50 L de β-mercaptoetanol a 950 L del buffer de carga justo antes de su uso.
Solución de IPTG 100 mM
Figura 2: Mapa del vector pGexFuente: www.aquarico.com/web.../GPEx%20Brochure.pdf
Experimento:
El día anterior a la práctica:
1. Inocular con la cepa bacteriana 20 mL de medio LB con ampicilina a 100 g/ml en un matraz Erlenmeyer de 100 mL estéril y dejar por 14-16 horas a 37° C en agitación (150 rpm).
El día de la práctica:
Antes de iniciar la Práctica, consulte las recomendaciones de seguridad especificadas para cada sustancia utilizada (ver “Seguridad en el laboratorio de Biología Molecular” al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
1. Agregar 0.25 mL del cultivo bacteriano a 25 mL de medio LB con ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 250 mL estéril (es muy importante la aireación).
2. Incubar en agitación a 37° C hasta alcanzar una A600 de entre 0.6 a 1.0.
3. Tomar una muestra de 1.5 mL del cultivo bacteriano (sin inducción) y mantenerla en hielo hasta su procesamiento posterior.
4. 4. Agregar el IPTG al cultivo (concentración final de 1 mM). Incubar en agitación a 37° C por al menos 2 h.
5. 5. Tomar una muestra de 1.5 mL del cultivo bacteriano (con inducción) cada hora y mantenerlas en hielo. A la par, medir la densidad óptica.
6. 6. Centrifugar las muestras a 13,000 rpm por 3 min a 4° C.7. 7. Decantar y resuspender las pastillas con 100 L de buffer de
carga.8. 8. Hervir las muestras por 4 min a 95° C9. 9. Centrifugar a 13,000 rpm por 3 min a 4° C.10.10. Colectar el sobrenadante en nuevos microtubos.11.11. Almacenar las muestras a -20° C hasta su análisis por
electroforesis.
3.2 MARCO TEORICO
Inducción de una proteina
recombinante
ADN hibrido
PromotorGen recombinante
Gen resistente
Indu
cció
n de
una
pr
otei
a re
com
bina
nte
ADN hibrido: El ADN híbrido tambien se lo conoce con el nombre de ADN es una molécula de ADN formada por la unión de dos moléculas heterólogas es decir de diferente origen
Promotor: Un promotor es una región de ADN que controla la iniciación de la transcripción de una determinada porción del ADN a ARN
Gen Recombinante: Es una célula de ADN artificial integrada de manera deliberada in vitropor la desunión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que normalmente no se encuentran juntos
Gen resistente: La resistencia antibiótica es la capacidad de un microorganismo para resistir los efectos de un antibiótico. La resistencia se produce naturalmente por selección natural a través de mutaciones producidas por azar
Las proteínas recombinantes son aquellas que obtenemos a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original.
La proteína se obtiene por la expresión de un gen clonado en esa línea celular que nos interesa.
Los sistemas biológicos donde se pueden producir proteínas recombinantes son: las Bacterias como la E. coli o la B. subtilis, también las Células eucariontes como los Hongos en los que están incluidas las Levaduras ejemplo: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y otros metilotróficos. En general se utilizan las Células animales en cultivo, Células de insecto en cultivo o las Plantas.
Lo que se necesita para llevar a cabo la clonación del DNA, es saber la secuencia del DNA que se desea clonar, el vector de clonación, el organismo huésped y la selección de vectores.(Solís, 2010)
(GARCÍA, 2014)
Se trata de aislar el RNA mensajero que codifica
para una proteína concreta y obtener su
correspondiente DNA complementario (cDNA)
Este cDNA, previamente amplificado por PCR, se
inserta en un vector génico que, replicado en una célula
huesped
Una vez transformadas con el vector las células del huésped (en
general bacterias -Escherichia coli-, o levaduras -Pichia pastoris-), el cultivo se hace crecer hasta que
alcanza unos niveles de producción adecuados de la proteína
recombinante
3.3 La separación de proteínas por la electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida PRÁCTICA #11
Podemos decir que la electroforesis de proteínas en geles van a tener una
matriz de poliacrilamida del cual es denominada electroforesis en
poliacrilamida del cual es sin duda alguna una de las técnicas usadas para
mezclar complejas de proteínas ya que además la electroforesis en
poliacrilamida se trata de un método conveniente, rápido y económico ya que
requiere sólo cantidades de microgramos de proteína.
Las proteínas que se van a encontrar presente con una carga eléctrica neta
van a poseer un pH diferente al de su punto isoeléctrico y su propiedad se
someterán a un campo eléctrico ya además posee una velocidad de migración
es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa.
Los geles de poliacrilamida se preparan con acrilamida, que actúa como el
radical libre de polimerización y N,N-metilen-bis-acrilamida, que es el agente
entrecruzante. La cual es controlada por un sistema iniciador de catálisis;
persulfato de polimerización que se descomponen espontáneamente formando
radicales de sulfato. El TEMED es otro catalizador que forma radicales estables
en presencia de radicales sulfato, esto contribuye a que la reacción de
propagación no se extinga.
Puede llevarse al cabo en dos condiciones:
Condiciones no desnaturalizante: la separación depende de la carga y el
tamaño
Condiciones desnaturalizante: se pierde la estructura tridimensional de las
proteínas debido a los agentes desnaturalizantes que despliegan y brindan
una carga uniforme.
El agente desnaturalizante es el detergente dodecil sulfato sódico (SDS) que
rompe las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria para producir cadenas
polipepticas lineales cubiertas con moléculas de SDS cargadas negativamente.
El SDS se une a regiones hidrofóbicas de las proteínas desnaturalizadas en
una relación constante.
Además todos los complejos tendrán carga negativa y migrarán en el mismo
sentido, también se utiliza un agente reductor de enlaces disulfuro el β-
mecaptoetanol, que asiste en el proceso de desnaturalización proteica.
Otra variante es la electroforesis en geles discontinua, tienen 2 capas una
inferior o gel separador y una superior o gel concentrado. Este es el sistema
más utilizado porque permite la formación de bandas altamente concentrada
s de muestra en el gel superior y mayor resolución de los componentes de la
muestra en el gel inferior.
El gel es preparado entre dos placas de vidrio que están separados por
espaciadores, lo que permite un grosor uniforme. En la parte superior se
colocará un peine plástico que permitirá formar los pozos para colocar las
muestras. Posteriormente el gel se coloca en una cámara vertical entre dos
reservorios. El reservorio superior usualmente contiene el cátodo(-) y el inferior
un ánodo (+). Como las proteínas no tienen color, se suele agregar azul de
bromofenol a la muestra, colorante que permite monitorear la electroforesis. Al
final, las proteínas en los geles de poliacrilamida pueden teñirse de azul.
Figura 3: ElectroferesisFuente: biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm
MATERIALES REQUERIDOS
Muestras de proteínas totales obtenidas en la Práctica No. 9
• Marcador de peso molecular
• Para proteínas
• Micropipetas y puntas de 1,000, 200, 20 y 2
• Cámara de electroforesis vertical (los volúmenes para la preparación de los
geles en esta práctica están calculados para una cámara Mini-Protean Tetra
Cell de la marca Bio-rad)
• Módulo de ensamble, vidrios con
• Separador y peine (Mini-Protean
• Tetra Cell de la marca Bio-rad)
• Fuente de poder
• Agitador para teñir geles
• Transiluminador de luz blanca
• Hielo/contenedor
• Charolas para tinción
• Agua destilada
• Acrilamida/bis-acrilamida 30:8
• Tris-HCl 1.5 M pH 8.8
• Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
• Solución SDS 10% (p/v)
• N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina
• (TEMED)
• Persulfato de amonio (PSA)al 10% (p/v)
• Buffer de carga para proteínas
• Buffer de corrida
• Solución de Coomassie
• Solución desteñidora
• Termoblock a 95 °C (o baño maría)
Procedimiento
1. Verificar que los vidrios (con separadores de 1.5 mm), el peine y el
módulo de ensamble se encuentren limpios y secos.
2. Con ayuda del profesor, colocar los vidrios en el módulo de
ensamble.
Después acomodar el peine y hacer una marca sobre el vidrio a 0.5 cm por
debajo de los dientes del peine.
3. Preparar la siguiente solución monomérica del gel separador
combinando los siguientes ingredientes mezclar suavemente para evitar la
formación de burbujas:
i.Agua destilada 4.045 mL
ii. Acrilamida/bis-acrilamida 3.3 mL
iii. Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 2.5 mL
iv. Solución SDS 10% 0.1 mL
v. PSA 10% 50 µL
vi. TEMED 5 µL
La acrilamida y la bis-acrilamida son extremadamente tóxicas. Antes
de usarlas, consulte la sección de “Seguridad en el laboratorio de
Biología Molecular”.
El TEMED debe agregarse hasta el final, e inmediatamente continuar
con el siguiente paso, puesto que una vez que se añade, se inicia la
polimerización. Antes de usar el TEMED, consulte la sección de “Seguridad
en el laboratorio de Biología Molecular”.
4. Con una micropipeta, agregar poco a poco la solución al espacio entre
los vidrios, hasta la marca previamente realizada.
5. Cubrir la solución monomérica con un poco de agua,
agregarla lentamente.
Se debe evitar la presencia de oxígeno en la solución del gel separador,
porque inhibe la polimerización al bloquear los radicales libres.
6. Esperar a que el gel solidifique (45-60 min).
En este punto el gel puede ser almacenado a temperatura ambiente toda la
noche, agregando 5 ml de una dilución 1:4 de solución B para mantenerlo
hidratado.
7. Secar con papel filtro el agua añadida en el paso 5. Cuidar de no dañar
el gel.
8. Preparar la solución monomérica del gel concentrador combinando
los siguientes ingredientes mezclar suavemente para evitar la formación de
burbujas.
El TEMED debe agregarse hasta el final, e inmediatamente continuar
con el siguiente paso.
9. Con una micropipeta, agregar poco a poco la solución al espacio entre
los vidrios, hasta llegar al borde.
10. Colocar el peine (de 10 dientes, grosor 1.5 mm), cuidando de no atrapar
ninguna burbuja, porque pueden provocar distorsión en la superficie del gel.
11. Esperar a que el gel solidifique (30-45 min).
12. Retirar cuidadosamente el peine y lavar los pozos con agua destilada.
13. Con ayuda del profesor, colocar el gel en la cámara de electroforesis.
14. Llenar la cámara superior con buffer de corrida hasta cubrir el gel
(∼3 mm por encima del gel) y la cámara inferior hasta la señal marcada.
15. Utilizando la micropipeta, cargar lentamente el marcador de peso
molecular en el pozo correspondiente al primer pozo del gel (aprox. 10-30
g). Dependiendo de la marca del marcador de peso molecular, puede
requerir que se caliente a 95-100° C antes de cargarse. Evitar
burbujear con la micropipeta mientras se coloca la muestra para que ésta no
se salga del pozo.
16. De la misma forma, cargar 35 L de cada una de las muestras de
proteínas totales obtenidas en la práctica previa (registrar el orden de las
muestras en los pozos). En los pozos restantes cargar el mismo
volumen de buffer de carga para proteínas. Si un pozo se queda vacío, la
muestra adyacente se extenderá lateralmente. El volumen de muestra que
puede aplicarse en cada pozo depende del tamaño del mismo (en este
caso, máximo 60 L).
17. Con ayuda del profesor, cerrar la cámara de electroforesis y aplicar una
corriente de 200 V.
Si la cámara se coloca adecuadamente, se observará la
formación de burbujas en los electrodos.
18. Cuando el colorante haya migrado lo suficiente (aprox. 35 min), apagar
la fuente de poder y sacar el gel de la cámara.
19. Teñir el gel con la solución de Coomassie durante 30 min en agitación.
Usar un volumen suficiente para cubrir el gel.
20. Retirar la solución de Coomassie y cubre ahora el gel con la
solución desteñidora. Después de 30 min en agitación, retirar esa solución y
cubrir nuevamente con más solución desteñidora. Dejar en agitación por otros
30 min.
21. Visualizar las proteínas en el gel con la luz blanca del transiluminado
3.4 MARCO TEÓRICO La electroforesis en poliacrilamida puede llegar a ser un método conveniente, rápido y económico en todos los aspectos de muestra ya que se necesitan sólo cantidades del orden de microgramos de proteína. Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta (carga total/masa) entre proteínas. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas. (VELEZ, 2000)
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Condiciones no desnaturalizante: la separación depende de la carga y el tamaño
Condiciones desnaturalizante: se pierde la estructura tridimensional de las
proteínas debido a los agentes desnaturalizantes que despliegan y
brindan una carga uniforme.
4 RESUMEN Por lo tanto se ha puede decir que la inducción de una proteína
recombinante han sido ampliamente empleadas como células que habitan
para la fabricación de proteínas hibridas con grandes modelos de los
cuales diremos que os genes clonado que incluyen el encargo para la
proteína va integrada dentro de un vector de manifestación que tiene
todos los ordenamientos de observación transcripcional y traduccional
Ya que además podemos decir que la tecnología de ADN recombinante es un
modo de estudiar las funciones e interacciones de la proteína por lo que en la
actualidad se la usa con frecuencia pero esto se hace aislando la secuencia
objetivo de ADN y luego transfiriéndola a un vector de clonación que tenga la
capacidad de autorreproducirse ya es de suma importancia saber que el ADN del
vector de clonación van a interactuar con el ADN objetivo y produce un nuevo
prototipo de información de gen llamada ADN recombinante ya que así sabremos
que el ADN recombinante se transfiere al ARN, que a su vez produce la proteína
recombinante.
Ya que que por eso podemos decir que el desarrollo de dicha tecnología ha
servido para el buen uso de la ingeniería genética en las últimas décadas ha
favorecido el avance de la industria biotecnológica aplicada a la sanidad humana
y animal y consecuente mejora de la calidad de vida. La utilización de proteínas
recombinantes como productos terapéuticos, como vacunas y como herramientas
en ensayos de diagnóstico está siendo cada vez más extendida.
Podemos decir que la electroforesis de proteínas en geles van a tener una matriz
de poliacrilamida del cual es denominada electroforesis en poliacrilamida del cual
es sin duda alguna una de las técnicas usadas para mezclar complejas de
proteínas ya que además la electroforesis en poliacrilamida se trata de un método
conveniente, rápido y económico ya que requiere sólo cantidades de microgramos
de proteína.
Las proteínas que se van a encontrar presente con una carga eléctrica neta van a
poseer un pH diferente al de su punto isoeléctrico y su propiedad se someterán a
un campo eléctrico ya además posee una velocidad de migración es proporcional
a la relación entre las cargas de la proteína y su masa.
Ya que además podemos decir que cuanto mayor carga por unidad de masa será
más rápida la migración ya que además Empleara geles de sílice o de acetato de
celulosa del cual va a aplicar las proteínas en una zona estrecha en torno a los
electrodos ya que se pueden determinar diferencias de carga neta del cual
podemos decir que son: carga total y masa donde solo se utilizaran entre
proteínas.
Podemos afirmar que este método se va a denominar electroforesis zonal por lo
cual podemos decir que será la matriz de poliacrilamida no será un buen soporte
para este método ya que la migración de las proteínas no sólo es proporcional a la
carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas...
Podemos destacar que una ventaja de suma importancia será los geles de
poliacrilamida que son químicamente inertes, transparentes y estables además
van a poseer un rango de pH, temperatura y fuerza iónica.
Características de la electroforesis en geles de poliacrilamida son:
Geles de poliacrilamida son los que van a formar por la polimerización de la
acrilamida ya que existen acciones de agente entrecruzador también llamados
cross-linking' ya que además un iniciador se suele utilizar TEMED N,N,N,N'-
tetrametilnediamina ya que como catalizador el ión persulfato se añadirá en forma
de persulfato amónico
Aquí van actuar las soluciones de acrilamida lo cual van a desgasificar el oxígeno
es un inhibidor de la polimerización ya que durante la polimerización se libera calor
que provocaría la formación de burbujas en el seno del gel.
La velocidad de polimerización viene determinada por la concentración de
persulfato que son catalizadores y TEMED es el iniciador
La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y
bis-acrilamida, siendo menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida se
use.
5 CONCLUSIÓN
Aquí concluiremos que la inducción de una proteína recombinante se ha puesto en
el mercado de PR producidas por bacterias ya que es muy importante a nivel
mundial porque Las ventajas de la producción de PR sobre otros organismos
alienta la investigación para superar las desventajas de sistemas microbianos,
como lograr modificaciones post–traduccionales y producir proteínas de elevado
peso molecular. Los avances recientes en este campo, mantienen vigente el
interés en lograr sistemas de expresión y de cultivo bacteriano cada vez más
eficientes. La ingeniería metabólica y un mejor entendimiento de la fisiología de la
bacteria durante la expresión y bajo condiciones de producción industrial
permitirán sin duda incrementar los rendimientos y abrirán nuevas opciones de
procesamiento de PR.
Además podemos concluir que la separación de proteínas por la electroforesis en
geles desnaturalizantes de poliacrilamida se pudo obtener lo siguiente:
- Las condiciones desnaturalizantes en la separación de las proteínas por
electroforesis en geles de poliacrilamida es el método más utilizado a nivel
de laboratorio para la elaboración y extracción ya se puede obtener buenos
resultados.
- La separación electroforética depende de la densidad de carga de las
moléculas y su tamaño.
- La desnaturalización es un proceso que se puede mediante geles como el
poliacrilamida, el cual descompone en todas sus estructuras.
6 BIBLIOGRAFÍA
Trabajos citadosBIOQUIMICA. (22 de 12 de 2014). PROTEINA RECOMBINANTE (EN LÍNEA).
Recuperado el 22 de 12 de 2014 Consultado y modificado por grupo de Biologia molecula, de Primera fuente: http://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/induccion-de-proteina-recombinante.ppt
CUA. (18 de 12 de 2014). MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR (EN LÍNEA). Recuperado el 18 de 12 de 2014 Consultado y modificado por grupo de biologia molecular, de http://www.cua.uam.mx/pdf/Manual%20de%20Prácticas%20de%20BM.pdf
GARCÍA, R. R. (2014). UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID. Obtenido de http://pendientedemigracion.ucm.es/info/otri/complutecno/fichas/tec_rrodriguez1.htm
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SIRIO. (19 de 12 de 2014). MANUAL DE PRACTICA DE BIOLOGIA MOLECULAR (EN LÍNEA). Recuperado el 19 de 12 de 2014 Consultado y modificado por grupo de biologia molecular, de http://sirio.uacj.mx/ICB/cqb/licenciaturaenbiología/Documents/Manuales/avanzado/BIOLOGIA%20MOLECULAR.pdf
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VELEZ, A. (2000). UPRM. Obtenido de http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/poli.htm
7 Anexo
Anexo 1: Estructura de la poliacrilamidaFuente: http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/electro_def.html
Anexo 2: ElectroferesisFuente : http://www.sapd.es/revista/article.php?file=vol33_n3/03
