BIOLOGICAS TESIS CIENCIAS - dspace.unitru.edu.pe

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Universidad Nacional de Trujillo

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Académico Profesional de Ciencias Biológicas

TESIS

Efecto reparador del extracto acuoso del fruto de

Morinda citrifolia L. en el índice mitótico de Vicia faba L.

expuesto a tartrazina.

Autora: Br. Romy Natali Guevara Veneros

Asesor: Dr. Raúl Antonio Beltrán Orbegoso

TRUJILLO- PERÚ

2015

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.

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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

RECTOR

Dr. Orlando Gonzáles Nieves

VICE-RECTOR DE INVESTIGACIÓN

Dr. Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas

VICE-RECTOR ACADÉMICO

Dr. Rubén Vera Véliz

JEFE DE LA OFICINA DE REGISTRO TÉCNICO

Dr. Carlos Alberto Minchón Medina

DECANATO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIÓLÓGICAS

Dr. José Mostacero León

SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. William Zelada Estraver

DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIÓLÓGICAS

Dr. Freddy Peláez Peláez



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MIEMBROS DEL JURADO

Dr. Freddy Mejía Coico

PRESIDENTE

Dr. Eloy López Medina

SECRETARIO

Dr. Raúl Beltrán Orbegoso

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ASESOR

El que suscribe, profesor asesor de la presente investigación,

declara que esta ha sido ejecutada de conformidad con su

correspondiente proyecto y con las debidas pautas orientadas al

estudiante. En cuanto al informe, este ha sido revisado y acoge

las observaciones y sugerencias correspondientes.


Asesor



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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del Jurado

Dictaminador, declaran que la presente tesis ha cumplido los

requisitos formales y fundamentales siendo aprobada por

unanimidad.

Dr. Freddy Mejía Coico

PRESIDENTE

Dr. Eloy López Medina

SECRETARIO


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DEDICATORIA

A Dios quien me dio la fe, fortaleza

necesaria para salir siempre

adelante pese a las dificultades,

por colocarme en el mejor camino,

iluminado cada paso de mi vida, y

por darme la salud y la esperanza

para culminar este trabajo.

A mis padres Marco Guevara y

Rosa Veneros por ser los

mejores y estar conmigo

incondicionalmente, sin ellos y

sus enseñanzas no estaría

aquí. Me han dado todo lo que

soy como persona, mis valores,

mis principios, mi

perseverancia y mi empeño, y

todo ello con una gran dosis de

amor y sin pedir nunca nada a

cambio. Por todo eso y más les

doy gracias.

Dedico a mi hijo Aarón,que bajo del cielo

para llenar de alegría mi vida, gracias

porque eres mi gran inspiración y mi

fortaleza, una sonrisa tuya ilumina mi

mundo y me das las fuerzas necesarias

para luchar y conseguir mis metas.

Romy



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Dedico de manera especial a mi

hermano Mikhail pues él fue el

principal cimiento para la

construcción de mi vida profesional,

sentó en mi las bases de

responsabilidad y deseos de

superación, en él tengo el espejo en

el cual me quiero reflejar, pues sus

virtudes y su gran corazón me llevan

a admíralo cada día más.



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AGRADECIMIENTO

Expreso mi más sincero agradecimiento a mi asesor el Dr. Raul

Beltrán Orbegoso, por su apoyo desinteresado, sus acertados

consejos, correcciones e inestimables aportes para cumplir con

los objetivos programados en la tesis.

En general quisiera gradecer a todas y cada una de las personas

que han vivido conmigo la realización de esta tesis, y creo

necesario nombrar porque tanto ellas como yo sabemos que

desde lo más profundo de mi corazón les estoy muy agradecida,

gracias por haberme brindado todo el apoyo, colaboración, ánimo

y sobre todo cariño y amistad.

Romy Natali Guevara Veneros



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PRESENTACIÓN

Señores Miembros del Jurado:

Cumpliendo con el reglamento interno de la Facultad de Ciencias

Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, para la

obtención de grados y títulos, someto a vuestra consideración y

elevado criterio la tesis titulada: Efecto reparador del extracto

acuoso del fruto de Morinda citrifolia L. “noni” en el índice

mitótico de Vicia faba L. expuesto a tartrazina, con la que

pretendo obtener el Título de Biólogo.

Trujillo, agosto del 2015.

_____________________________ Br. Romy Natali Guevara Veneros



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CONTENIDO

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ii

MIEMBROS DEL JURADO iii

ASESOR iv

APROBACIÓN v

DEDICATORIA vi

AGRADECIMIENTO viii

PRESENTACIÓN ix

LISTA DE TABLAS Y FIGURAS xi

ABSTRACT xii

RESUMEN xiii

INTRODUCCIÓN 1

MATERIAL Y MÉTODOS 6

RESULTADOS 12

DISCUSIÓN 27

CONCLUSIONES 35

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 36

ANEXOS 40



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LISTA DE TABLAS Y FIGURAS

Figura 1. Diseño experimental usado en el trabajo 10

Tabla 1: Tratamientos y promedios de los Índices Mitóticos (%) e Indices de fases (%) en meristemos radiculares de Allium cepa.L (IM= índice mitótico;II=índice interfasico; IP=índice profásico; IMe=índice metafásico; IA=índice anafásico ;IT=un índice telofásico ) 12

Tabla 2: ANOVA 15

Tabla 3: Subconjuntos homogéneos 16

Figura 2: Tratamientos y Promedios de Indice Interfasico, Indice Mitotico, Indice Profasico, Indice Metafásico, Indice Anafásico e Indice telofásico en meristemos radiculares de allium cepa L., expuextos a tartrazina 11

Figura 3: Microfotografia de meristemos radiculares de Allium cepa .L en profase,metafase, anafase y telofase en el tratamiento control 14

Figura 4: Microfotografía de meristemos radiculares de A.cepa L. expuestas al 0,5% de tartrazina, testigo positiivo (400X) 16

Figura 5: Microfotografía de meristemos radiculares de Allium cepa L. expuestas al 5% M.citrifolia L. durante 4 horas(400X) 17

Figura 6 : Microfotografía de meristemos radiculares de A. cepa L. expuestas al O,1% tartrazina mas 5% M.citrifolia.L durante 4 horas (400X) 18

Figura 7: Microfotografía de A. cepa L. a 0,3% tartrazina mas M.citrifolia.L expuestas al 5% durante 4 horas (400X) 18

Figura 8: Microfotografía de meristemos radiculares de A. cepa L. expuestas al 0,3% tartrazina más M.citrifolia L al 5% durante 4 horas (400X) 19

Figura 9: Microfotografía de meristemos radiculares de A. cepa L. al 0,5% tartrazina mas de M.citrifolia L al 5% por 4 horas (400X) 19



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ABSTRACT

Morinda citrifolia L. "noni" is a popular consumer plant in Peru whose fruit

is nutritious and healing attributed beneficial properties; however, few

studies to determine, experimentally, the beneficial effect of fruit in the

structure and dynamics of the cell subjected to chemicals likely toxicity. In

that sense, the aim of the thesis was to determine the effect of aqueous

extract of the fruit of Morinda citrifolia L. "noni" in repairing the mitotic

index (MI) of the root meristem of Vicia faba L. seed "bean" tartrazine dye

exposed to 0.1%, 0.3% and 0.5%.

The seeds of V. faba L. and M. citrifolia L. fruit were bought in a

supermarket in the city of Trujillo. The experimental research was

conducted at the Laboratory of Cell Biology at the National University of

Trujillo. Multivariable experimental design, consisting of a negative control

with water, a positive control with 0.5% tartrazine, a positive control with

"noni" 5% three experimental groups 0.1%, 0.3% and 0 was used,

tartrazine 5% more "noni" by 5%. Rootlets of seeds were subjected to the

technique Tjio and Levan (1968), performing a count of mononuclear 1500

average per raicilla meristem cells.

It was found that the positive control with 0.5% Tartrazine induces an MI of

36.8%, the positive control "noni" generates a 5% IM 19.4%. Likewise, the

three experimental groups 0.1%, 0.3% and 0.5% tartrazine more "noni"

5% 21.0% inducieron IM, 25.2% and 31.2%, respectively.

The results show a restorative effect noni fruit in the IM of V. faba L.

subjected to tartrazine, suggesting that the fruit components present

participate in the repair of certain cellular processes.

Key words: Cellular repair, Morinda citrifolia L. , Vicia faba L. , tartrazine



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RESUMEN

Morinda citrifolia L. “noni”, es una planta de consumo popular en Perú a

cuyo fruto se le atribuyen propiedades benéficas nutritivas y curativas; sin

embargo, son pocos los estudios orientados a determinar, en forma

experimental, el efecto benéfico del fruto en la estructura y dinámica de la

célula sometida a productos químicos de probable toxicidad. En ese

sentido, el objetivo de la tesis fue determinar el efecto del extracto acuoso

del fruto de Morinda citrifolia L. “noni” en la reparación del índice mitótico

(IM) de los meristemos radiculares de la semilla de Vicia faba L. “haba”

expuestos al colorante tartrazina al 0,1%, 0,3% y 0,5%.

Las semillas de V. faba L. y el fruto de M. citrifolia L. fueron adquiridos en

un supermercado de la ciudad de Trujillo. La investigación experimental

fue realizada en el Laboratorio de Biología Celular de la Universidad

Nacional de Trujillo. Se usó el diseño experimental multifactorial,

constituido por un testigo negativo con agua, un testigo positivo con

tartrazina 0,5%, un testigo positivo con “noni” 5% y tres grupos

experimentales 0,1%, 0,3% y 0,5% de tartrazina más “noni” 5%. Las

raicillas de las semillas fueron sometidos a la técnica de Tjio y Levan

(1968), realizándose un recuento de 1500 células meristemáticas

mononucleadas promedio por raicilla.

Se halló que el testigo positivo con tartrazina 0,5% induce un IM de 36.8

%, el testigo positivo con “noni” 5% genera un IM de 19.4%. Así mismo,

los tres grupos experimentales 0,1%, 0,3% y 0,5% de tartrazina más

“noni” 5%, inducieron IM de 21,0%, 25,2% y 31,2%, respectivamente.

Los resultados evidencian un efecto reparador del fruto del noni en el IM

de V. faba L. sometido a tartrazina, lo cual sugiere que el fruto presentaría

componentes que participarían en la reparación de ciertos procesos

celulares.

Palabras clave: Reparación celular, Morinda citrifolia L., Vicia faba L., tartrazina.



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INTRODUCCIÓN

Morinda citrifolia L., denominada comúnmente “noni”, “gunábana

cimarrona”, “fruta del diablo” o “mora de la India” es una planta de la

familia de las rubiáceas; originaria del sudeste asiático, ha sido

introducida a India y Polinesia. El noni es un arbusto o árbol pequeño,

perennifolio, de fuste recto y largo, recubierto de corteza verde brillante;

las hojas son elípticas, grandes, simples, brillantes, con venas bien

marcadas. Florece a lo largo de todo el año, dando lugar a pequeñas

flores blancas, de forma tubular; estas producen frutos múltiples, de forma

ovoide, con una superficie irregular de color amarillento o blanquecino.

Contiene muchas semillas, dotadas de un saco aéreo que favorece su

distribución por flotación. Cuando madura, posee un olor penetrante y

desagradable (Mahattanadul y col., 2011).

En M.citrifolia L.,se han identificado el ácido octoanoico, potasio,

vitamina C, terpenoides, alcaloides, antraquinonas tales como el

nordamnacantal, la morindona, la rubiadina, la rubiadina-1-metil éter y el

glicósido de antraquinona. Entre sus componentes también se incluyen el

betasitosterol, el caroteno, la vitamina A, ácido linoleico, alizarina,

aminoácidos, acubina, L-asperulósido, ácido caproico, ácido caprílico,

ácido ursólico, rutina y una posible proxeronina (Levand y Larson, 1979).

M.citrifolia L. es actualmente utilizado en la medicina popular por sus

diversas propiedades analgésica, sedante, hipotensora, inmunológica,

antibacteriana, antiviral, antitumoral y antihelmínticas. Incluso se ha

reportado su uso en el tratamiento anticancerígeno; hallándose que el

jugo, a concentración del 10 %, inhibió la iniciación capilar en explantes

de tumores mamarios humanos y en explantes tumorales (Heinicke,

1985).

En relación con la actividad antitumoral de M.citrifolia L., se reportó

la actividad anticancerosa del precipitado de alcohol del jugo del fruto del

"noni", sobre carcinomas pulmonares de Lewis implantados en ratas,



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prolongándole la vida hasta en un 75% en comparación con el grupo

control. Afirmándose que la supresión del crecimiento tumoral podría

deberse indirectamente a la estimulación del sistema inmune. También se

demostró, en otro estudio, que al combinarse el noni con dosis subóptimas

de los agentes quimoterapéuticos adriamicina, cisplastina y vincristina,

mejoran los efectos curativos y el tiempo de supervivencia (Hirazumi y col.,

1996).

De otro lado, a nivel mundial una de las sustancias químicas más

usadas en la industria alimentaria es el colorante tartrazina el cual

pertenece a la familia de los colorantes azoicos, dicho sustancia confiere

a los alimentos y bebidas un tono amarillo-naranja, dependiendo de la

cantidad añadida, adicionalmente se emplea para obtener colores verdes

al mezclarlo con colorantes azules (Kapor., 2001).

Dicho colorante es ampliamente utilizado desde 1916 en productos

de repostería, derivados cárnicos, sopas preparadas, conservas

vegetales, salsas, helados, postres, caramelos y otras golosinas; también

se utiliza para colorear bebidas refrescantes, rehidratantes de naranja y

limón; su uso es masivo en más de sesenta países evidenciándose un

amplio espectro de utilización (Autoridad Europea de Seguridad

Alimentaria, 2008). Ante una serie de reportes sobre sus efectos

secundarios en seres vivos, han recomendado el uso de productos

sustitutos a fin de reducir el consumo de dicho producto (Kapadia, 1998).

Sin embargo, a pesar de una serie de evidencias sobre efectos

citotóxicos de la tartrazina, el hombre sigue utilizándolos mayoritariamente

en la producción de numerosos productos comestibles industrializados. El

2013, el Code of Federal Regulations (Código de Regulaciones

Federales),

declaró que el problema se acrecienta porque las etiquetas de dichos

productos no advierten sobre los riesgos para la salud que representa el

consumo frecuente; causando reacciones alérgicas como asma, tipo de



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angioedema, tos espasmódica, urticaria, rinitis y shock anafiláctico.

Siendo la población más vulnerable los niños, ya que puede causar

hiperactividad en algunos, ocasionando cambios en el comportamiento, lo

que incluyen la pérdida de concentración y actividad impulsiva y fuera de

control. Según los especialistas esta sustancia afecta directamente la

conducta de los niños por dos vías: despierta una reacción

pseudoalérgica en el organismo y la consecuente liberación de histamina.

Este es un compuesto presente en todas las células del organismo y, en

una situación normal, es liberada como respuesta del sistema

inmunológico ante una inflamación o una alergia (Rimblas, 2004).

En la medida que el inicio de consumo sea a temprana edad, los

procesos alérgicos será más intensos, porqué el sistema inmunológico de

los menores está en proceso de formación y es más susceptible a

sustancias químicas como la tartrazina. Esta sustancia química se ha

ligado a otros problemas de salud, incluyendo la visión borrosa, migraña,

fatiga y ansiedad. También puede causar daño cromosomal, aunque esto

no ha sido estudiado adecuadamente o documentado (Restrepo, 2006).

Se afirma que basta ser un consumidor habitual, por ejemplo de

zumos artificiales, para que los síntomas se presenten. Un niño que toma

zumos envasados a diario, poco a poco va cambiando su conducta; le

cuesta prestar atención en clases, quedarse quieto y presenta intensos

dolores de cabeza. Se sostiene, además, que la relación entre el

consumo de colorante y el aumento en los niveles de histamina, es

directamente proporcional. Se han descrito, además, en niños, algunos

casos de hiperquinesia relacionados con la tartrazina. Por estudios en

animales con altas dosis, se ha relacionado este elemento con tumores en

la glándula tiroides y al riñón (Domingo, 2000; Fennema, 1993; Rimblas,

2004).



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Precisamente, la presente tesis se orienta a investigar los probables

efectos del químico tartrazina, así como el probable efecto reparador que

tendría el noni en una población celular modelo sometida a dicho producto

químico. Las investigaciones en sistemas celulares modelos o

denominados también sistema biológicos de pruebas han experimentado

en los últimos años una gran importancia, no solo por el número de

estudios que en ellos se vienen realizando, sino también por la calidad de

información que han generado en la identificación de sustancias químicas,

citotóxicas (sustancias que alteran el ciclo celular), genotóxicas

(sustancias que alteran el material genético de las células) y cancerígenas

(sustancias que inducen malformaciones y cuadros malignos en la célula).

Por ejemplo existen los sistemas biológicos de pruebas procariotas y

eucariotas. En los procariotas destaca por ejemplo el Test de Ames, el

cual identifica y evalúa el potencial mutagénico y/o toxicidad de

compuestos químicos en cultivos bacterianos (Beltrán, 1996; Castillo y

col., 2000; Fiskesjö, 1993; Gonzales y Beltrán, 1997).

En los sistemas biológicos de pruebas eucariotas destaca Allium

cepa L. (2n=16), el cual se ha constituido en un sistema mundial de

investigación de citotoxicidad y genotoxicidad, denominado Test Allium

(Andrioli y col., 2006; Beltrán, 1996, Castillo y col., 2000; Fiskesjö, 1993;

Gonzales, 1994). Así mismo es muy utilizado en investigaciones

citológicas el eucariota vegetal Vicia faba L. (2n=12), el cual por tener un

genoma diploide de solo 12 cromosomas (2 cromosomas metacéntricos y

10 cromosomas acrocéntricos), de gran tamaño pero de alta sensibilidad,

lo ha convertido

también en un excelente biomonitor de citotoxicidad, de bajo costo que

permite tener una visión especifica de la toxicidad de diversos productos

químicos (Beltrán, 2013; Bianco y Pimpini, 1990).

De igual manera V. faba L. es utilizada también en investigaciones de

biorremediación. Habiéndose reportado por ejemplo que V. faba L,

acumula arsénico y cadmio en sus diferentes órganos, en las diferentes

etapas del desarrollo del cultivo. También V. faba. L es un buen indicador



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de contaminación atmosférica, debido a su alto requerimiento de

humedad, lo que genera una apertura de las estomas que permite un

mayor ingreso de los contaminantes en el cuerpo de la planta. (Beltrán,

2009; Fiskesjö, 1997, Garrido y col., 2005; Gómez y col., 1997; Prieto,

2005).

En la región La Libertad, V.faba L. se ha usado para determinar

genotoxicidad química del río Moche y de las aguas servidas crudas de

Trujillo usadas en el riego de hortalizas mediante biomonitoreo de esta,

así como para la evaluación del potencial genocontaminante productos

químicos usados en la agricultura regional usando como sistema

bioindicador dual a Vicia faba L. y Artemia sp (Beltrán, 2013).

En ese sentido se planteó el problema ¿Cuál es el efecto reparador

del extracto acuoso del fruto de Morinda citrifolia L. “noni” al 5% en el

índice mitótico de células meristemáticas radiculares de Vicia faba L.

“haba” expuestas a tartrazina a las concentraciones de 0,1%, 0,3% y

0,5%?

El objetivo de la presente tesis fue determinar el efecto reparador del

extracto acuoso del fruto de Morinda citrifolia L. “noni” al 5% en el índice

mitótico (IM) de los meristemos radiculares de Vicia faba L. “haba”

expuestas a la tartrazina a las concentraciones de 0,1%, 0,3% y 0,5%.



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MATERIAL Y MÉTODOS

Material biológico

Se adquirió 5 Kg de Vicia faba L. en estado seco, envasado en un

supermercado en la ciudad de trujillo (La Libertad). Así mismo se compró

2 Kg de frutos de Morinda citrifolia L. “noni” en el mercado Zonal Palermo

de la ciudad de Trujillo (La Libertad). Las semillas de V. faba L y los frutos

de M. citrifolia L. fueron identificados y reconocidos por el Herbarium

Truxillensis (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo.

Material químico

50g del colorante tartrazina “Suman” fueron adquiridos en un centro de

expendios de productos químicos en la ciudad de Trujillo.

Selección y Adecuación del sistema biológico de pruebas

La selección y adecuación del material biológico se realizó en el

laboratorio de Biología Celular del departamento de Ciencias Biológicas

de la Universidad Nacional de Trujillo. De los 5 Kg de semillas de Vicia

faba L adquiridos, se seleccionaron 200 semillas, de buena turgencia, de

2 cm de longitud promedio y sin magulladuras.

Las semillas se colocaron en recipiente de vidrio conteniendo algodón

húmedo (anexo 1). A las 120 horas (5 días) germinó la semilla

formándose la raicilla principal de V. faba L. (anexo 2). A las 216 horas (9

días), la raicilla principal presentaba raicillas secundarias de 2 cm de

longitud (anexo 3). En este momento se inició la etapa experimental de la

investigación.



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Preparación del extracto acuoso de Morinda citrifolia L. “noni”

De los 2 Kg de M.citrifolia L., se seleccionaron seis frutos maduros de

aspecto turgente, sin magulladuras, color grisáceo, 8 cm de longitud. Los

frutos fueron lavados, desmenuzados y sometidos a un licuado suave,

luego se filtró dos veces el licuado para descartar todo tipo de materia

grosera y extraña.

Del filtrado se tomaron 5 g, los cuales fueron diluidos en 1000 ml de agua

destilada, para obtener una solución madre de M. citrifolia L. De esta

solución se preparó la dilución experimental del “noni” al 5%.

Preparación de las soluciones de tartrazina

El colorante tartrazina fue preparado en las siguientes diluciones 0,1%,

0,3% y 0,5%. Para la obtención de dichas diluciones se tuvo que diluir 0,1

mg, 0,3 mg y 0,5 mg de tartrazina en 100 mL de agua destilada,

respectivamente.

Diseño experimental

Las semillas seleccionados de V. faba L., fueron agrupados al azar para

conformar los grupos testigos y los grupos experimentales.

Los grupos testigos estuvieron conformados por tres tratamientos (T):

a) Tratamiento 1 (T1), formado por tres semillas de V. faba L.

con sus respectivas raicillas secundarias mantenidas en

agua destilada durante cuatro horas.

b) Tratamiento 2 (T2), formado por tres semillas de V. faba L.


solución de tartrazina 0,5% durante cuatro horas.

c) Tratamiento 3 (T3), formado por tres semillas de V. faba L.


extracto acuoso del fruto de M. citrifolia L. 5% durante cuatro

horas.



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Los grupos experimentales estuvieron conformados por tres tratamientos

(T):

a) Tratamiento 4 (T4), formado por tres semillas de V. faba L. con sus

respectivas raicillas secundarias mantenidas en solución de

tartrazina 0,1% durante cuatro horas. Luego fueron expuestas al

extracto acuoso de M. citrifolia L. 5% durante cuatro horas más.

b) Tratamiento 5 (T5), formado por tres semillas de V. faba L. con sus

respectivas raicillas secundarias mantenidas en de tartrazina 0,3%

durante cuatro horas. Luego fueron expuestas al extracto acuoso

de M. citrifolia L. 5% durante cuatro horas más.

c) Tratamiento 6 (T6), formado por tres semillas de V. faba L. con sus

respectivas raicillas secundarias mantenidas en solución de

tartrazina 0,5% durante cuatro horas. . Luego fueron expuestas al

extracto acuoso de M. citrifolia L. 5% durante cuatro horas más

(Figura 1).

Disección y fijación de las raicillas

Finalizado los tiempos de exposición mencionado en la figura 1 y 2, se

seccionaron al azar tres raicillas por semilla, por cada repetición, por cada

tratamiento. Las raicillas disectadas fueron lavadas dos veces en agua

destilada para luego fijarlas en la solución de Carnoy’s.

Coloración, obtención y observación de preparados citológicos

Las raicillas fueron retiradas de la solución fijadora de Carnoy´s y se

lavaron tres veces con agua destilada para retirar los restos del fijador

Luego se pasaron a secar con papel toalla para eliminar los restos de

agua de la superficie.



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Posteriormente fueron depositadas sobre una luna de reloj para su

respectiva coloración con orceína acética al 2% y HCl 1N, de acuerdo a la

técnica de Tjio y Levan.

Luego las raicillas fueron sometidas a la técnica del aplastamiento o

squash. Finalmente las células fueron observadas en el microscopio de

campo claro, a 400x y 1000x.

Criterios de evaluación:

Para determinar la reparación celular de M. citrifolia. L, se tomó como

criterio de evaluación, los índices mitóticos obtenidos en los tratamientos

experimentales T4, T5 y T6, al ser comparados con los tratamientos

testigos T1 Y T2.

Tratamiento Estadístico

Las medias de los porcentajes del Índice Mitótico de Vicia faba L. fueron

sometidas a la prueba de ANAVA para determinar diferencias en algún

tratamiento. Posteriormente los promedios fueron sometidos a la prueba

de comparaciones múltiples de TUKEY para determinar en cuál o cuáles

de los tratamientos estaría la diferencia estadísticamente significativa.

Análisis citológico y evaluación de efecto

Se realizó un recuento de 1500 células meristemáticas de cada uno de los

tratamientos, para establecer el índice mitótico y de fases, según las

fórmulas correspondientes. Así mismo, se determinó la presencia de

aberraciones cromosómicas como desorden anafásico, puentes

anafásicos, micronúcleos y anafases retrasados en cada tratamiento.



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GRUPOS TESTIGOS

Figura 1. Diseño experimental para determinar el efecto reparador del extracto acuoso del fruto de Morinda citrifolia L. “noni” en el

índice mitótico de los grupos testigos de Vicia faba “haba”

L. expuestos a tartrazina.

3 semillas de Vicia

faba L. “haba” con

raicilla

3 semillas de Vicia


raicilla

3 semillas de Vicia


raicilla

Agua destilada

durante 4

horas.

Solución de

tartrazina 0,5%;

durante cuatro

horas

Extracto acuoso

de Morinda

citrifolia L.

“noni” 5%

durante cuatro

horas.

T1 T2 T3



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GRUPOS EXPERIMENTALES

Figura 2. Diseño experimental para determinar el efecto reparador del extracto acuoso del fruto de Morinda citrifolia L. “noni” en el

índice mitótico de los grupos experimentales de Vicia faba

“haba” L. expuestos a tartrazina.

T4 T5 T6

3 semillas de Vicia


raicilla

germinada

3 semillas de

Vicia faba L.

“haba” con

raicilla

3 semillas de

Vicia faba L.

“haba” con

raicilla

Solución de

tartrazina 0,1%;

durante cuatro

horas.

Solución de

tartrazina 0,3%

durante cuatro

horas.

Solución de

tartrazina 0,5%;

durante cuatro

horas.

Extracto acuoso

de Morinda

citrifolia L.

“noni” 5%,

durante cuatro

horas.

Extracto acuoso

de Morinda

citrifolia L.

“noni” 5%,

durante cuatro

horas.

Extracto acuoso

de Morinda

citrifolia

L.,“noni” 5%,

durante cuatro

horas.



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RESULTADOS

Los resultados sobre el Índice Mitótico de los meristemos radiculares de Vicia faba .L obtenidos en la presente tesis se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Tratamientos y porcentajes del Índice Mitótico (IM), índice Interfásico

(II) e índice de fases (IP=índice profásico; IMe=índice metafásico; IA=índice anafásico ; IT=un índice telofásico ) de V. faba L.

Tratamientos Repetición II IM IP IMe IA IT

T1

Testigo negativo

Agua destilada

1 85.3 14.7 71.1 12.3 6.5 10.1

2 83.0 17.0 67.8 14.2 9.7 10.9

3 83.0 17.0 63.4 13.9 7.4 12.7

X SD 83.8 1.33

16.21.33

67.4

3.86

13.5

1.02

7.9

1.65

11.2

1.33

T2

Testigo positivo A

Tartrazina

0,5%

1 64.2 35.8 98.4 0.8 0.5 0.3

2 61.4 38.6 94.0 2.2 1.2 2.6

3 63.9 36.1 94.9 2.7 0.5 1.9

X SD 63.2

1.54

36.8

1.54

95.8

2.32

1.9

0.98

0.7

0.40

1.6

1.18

T3

Testigo positivo B

Noni

5%

1 80.2 19.8 70.7 11.2 6.9 11.2

2 81.1 18.9 70.7 11.4 6.5 11.4

3 80.4 19.6 71.1 10.8 7.3 10.8

X SD 80.6

0.47

19.4

0.47

70.8

0.23

11.1

0.31

7.0

0.4

11.1

0.31

T4

0,1% Tartrazina

+ 5%noni

1 78.5 21.5 76.6 8.6 6.2 8.6

2 79.4 20.6 76.2 8.9 6.0 8.9

3 79.0 21.0 76.0 8.2 6.1 9.7

X SD 79.00.45

21.00.45

76.30.31

8.50.35

6.10.1

9.10.57

T5

0,3% Tartrazina

+ 5%noni

1 75.8 24.2 84.2 5.3 5.8 4.7

2 74.8 25.2 84.4 4.8 6.2 4.6

3 73.8 26.2 84.5 4.4 6.4 4.7

X SD 74.8 1 25.2 1 84.40.15

4.80.45

6.10.31

4.70.06



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T6

0,5% Tartrazina

+ 5%noni

1 70.4 29.6 98.6 0.7 0.7 0

2 67.4 32.6 98.5 0.9 0.6 0

3 68.7 31.3 99.1 0.7 0.2 0

X SD 68.81.50

31.21.50

98.70.32

0.80.12

0.50.26

0 0



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Figura 3. Comparación de promedios de los Índices Mitóticos (%) y de fases (%) en meristemos radiculares de Vicia faba L. “haba” expuestas a tartrazina.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Po

rcen

taje

pro

med

io

Tratamientos

T1 T2 T3 T4 T5 T6II 83.8 63.2 80.6 79 74.8 68.8IM 16.2 36.8 19.4 21 25.2 31.2IP 67.4 95.8 70.8 76.3 84.4 98.7IMe 13.5 1.9 11.1 8.5 4.8 0.8IA 7.9 0.7 7 6.1 6.1 0.5IT 11.2 1.6 11.1 9.1 4.7 0

VALORES PROMEDIOS POR TRATAMIENTO

II

IM

IP

IMe

IA

IT



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Los resultados hallados en la presente tesis y que son mostrados en la Figura 2 y figura 3, se sometieron al tratamiento estadistico mediante la prueba de ANOVA para corroborar la significancia de los promedios de los Indices Mitoticos. Los resultados de la prueba de ANOVA se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2. Prueba de ANOVA comparando los promedios de los seis tratamientos

La tabla 2 nos permite concluir que los promedios de los Indices IM, IP, Ime, IA, IT son estadísticamente diferentes debido a que el Pvalor es menor que el margen de error (0.05), por tanto se rechaza H0 y se acepta Ha. Solamente en el Indice Interfásico (II), se aceptó H0. Al obtener estos resultados, pasamos a realizar la prueba de comparaciones mutliples de Tukey para identificar en que tratamientos se manisfiesta la diferencia significativa entre los índices IM, IP, Ime, IA, IT. Los resultados de la prueba de Tukey se presentan en la tabla 3.

ÍNDICE PROBABILIDAD (P valor)

Margen error=5%

Decisión

II 0.050430509 α=0.05 P>0.05 Se acepta Ho

IM 3.11281E-10 α=0.05 P<0.05 Se acepta HA

IP 2.41628E-10 α=0.05 P<0.05 Se acepta HA

IMe 5.07951E-11 α=0.05 P<0.05 Se acepta HA

IA 5.25604E-08 α=0.05 P<0.05 Se acepta HA

IT 7.98389E-10 α=0.05 P<0.05 Se acepta HA



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Tabla 3. Prueba de comparaciones múltiples de Tukey

Figura 4. Índices interfásicos e índices mitóticos en los seis tratamientos

T1 (16.2) a

T2 (36.8) b

T3 (19.4) C

T4 (21.0) d

T5 (25.2) e

T6 (31.2) f

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

T1 T2 T3 T4 T5 T6

ÍNDICE MITÓTICO

ÍNDICE INTERFÁSICO



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Figura 5. Índices de fases mitóticas en los seis tratamientos

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Índice telofásico

Índice anafásico

Índice metafásico

Índice profásico



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(IN)

(PN)

(AN)

Figura 6. Células meristemáticas de Vicia faba L.

mantenidas en agua destilada. IN=interfase normal; PN=profase normal; AN=anafase normal. 400X.

Figu

(MN)

(AN)

(TN)


mantenidas en agua destilada. MN=metafase normal; AN=anafase normal; TN=telofase normal. 400X.



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(TN) (AN)

Figura 8. Células meristemáticas de Vicia faba L. mantenidas en agua destilada TN=teloase normal; AN=anafase normal. 400X.

(IN) (PN)

(TN) (MeAN)


mantenidas en solución de tartrazina 0,5%: IN=interfase normal; PN=profase normal; TN=telofase normal MeAN=metafase anormal. 400X.



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(AN) (MeAN)

Figura 10. Células meristemáticas de Vicia faba L. mantenidas en solución de tartrazina 0,5%: I=interfase; AN=anafase normal; MeAN=metafase anormal. 400X.

(MeAN) (PN)


mantenidas en solución de tartrazina 0,5%:; MeAN=metafase anormal; PN=profase normal. 1000X.



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(MeAN)


mantenidas en extracto acuoso del fruto de M. citrifolia L. 5%: MeAN=metafase anormal. 400X.

(AC) Figura 13. Células meristemáticas de Vicia faba L.

mantenidas en extracto acuoso del fruto de M. citrifolia L. 5%: AC=aberraciones cromosómicas. 400X.



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(PN)

(AC)


mantenidas en solución de tartrazina 0,1%, más extracto acuoso de M. citrifolia L. 5%: PN=profase normal; AC=aberraciones cromosómicas. 400X.

(AAN)

(MeAN) (IN)

(AC)

Figura 15. Células meristemáticas de Vicia faba L. mantenidas en solución de tartrazina 0,1%, más extracto acuoso de M. citrifolia L. 5%: AAN=anafase anormal, MeAN= metafase anormal; IN=interfase normal; AC=aberraciones cromosómicas. 400X.



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(AC)


mantenidas en solución de tartrazina 0,1%, más extracto acuoso de M. citrifolia L. 5%: AC=aberraciones cromosómicas. 400X.

(AAN) Figura 17. Células meristemáticas de Vicia faba L.

mantenidas en solución de tartrazina 0,1%, más extracto acuoso de M. citrifolia L. 5%: ANA=anafase anormal. 1000X.



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(PN) (PAN)

Figura 18. Células meristemáticas de Vicia faba L. mantenidas en solución de tartrazina 0,1%, más extracto acuoso de M. citrifolia L. 5%: I=interfase; PN=profase normal; PAN= profase anormal. 1000X.

(PN)

(MeAN)

(TN)


mantenidas en solución de tartrazina 0,1%, más extracto acuoso de M. citrifolia L. 5%: PN=profase normal; MeAN=metafase anormal; TN=telofase anormal. 1000X.



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Figura 20. Células meristemáticas de Vicia faba L. mantenidas en solución de tartrazina 0,3 %, más extracto acuoso de M. citrifolia L. 5%: 400X.

(AC)


mantenidas en solución de tartrazina 0,5%, más extracto acuoso de M. citrifolia L. 5% mostrando: AC=aberraciones cromosómicas. 400X.



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(CMD) (MeAN)


mantenidas en solución de tartrazina 0,5%, más extracto acuoso de M. citrifolia L. 5%: CMD=células meristemáticas deshidratadas;; MeAN=metafase anormal. 400X.



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DISCUSIÓN

En la tabla 1 de resultados se observa que la población meristemática

de Vicia faba L. del tratamiento uno (T1) (anexo11), testigo negativo, usado

como base para la posterior comparación y análisis de los datos, presenta

un índice mitótico (IM) de 16.2%; índice interfasico de 83.8; índice profásico

(IP) de 67.4%; índice metafásico (IMe) de 13.5%; índice anafásico (IA) de

7.8% e índice telofásico (IT) de 11.3%.

El tratamiento T1 permite observar las diferentes fases de la mitosis

(figura 6 y 7), que fueron tomadas como base para la comparación y

análisis de las aberraciones cromosómicas que se presentaron en los

tratamientos restantes. Los índices de fases hallados en el presente trabajo

son similares a los determinados por Beltrán (2013). Esto evidencia que las

proporciones celulares y la dinámica celular de las raicillas de V. fava L.

usados en el presente estudio son adecuadas.

En la misma tabla 1, vemos que la población meristemática de Vicia

faba L. del tratamiento dos (T2) (anexo 12), testigo positivo de tartrazina

0.5%,



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presenta un índice mitótico (IM) de 36,8% lo cual indica un incremento

ligeramente superior al doble con respecto al tratamiento uno (T1), testigo

negativo. Así mismo, al calcular los índices de fases mitóticos vemos que el

índice profásico (IP) es de 95.8%; lo cual señala un alto efecto citostático

de la tartrazina a esta concentración. Esto se muestra en la figura 9, en

donde se observa que casi todas las células mitóticas están en profase.

Este resultado evidencia un fuerte efecto citostático de la tartrazina al 0,5%

debido probablemente a que la tartrazina bloquea el paso de las células de

profase a metafase al actuar sobre las moléculas de ciclina que “ordenan”

la progresión de la profase (Beltrán,2009).

Esto explicaría que la tartrazina ,estaría actuando a nivel del segundo

punto de control en el ciclo celular (G2), impidiendo la formación de

complejos CdK1-ciclina B;las cuales forman a su vez el Factor Promotor de

la Mitosis (FPM),que permite el paso a través de este punto hacia el

periodo M (Alberts y col;2002).Esto traería como consecuencia que las

células no transiten normalmente de la fase G2 hacia las mitosis;

deteniéndose entonces en interfase y consecuentemente disminuyendo el

número de células en división (Shimotohno y col; 2003).



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En el tratamiento T2, como es de esperarse, se observa una drástica

disminución de los índices metafásicos, anafásicos y telofásicos llegando

los valores a 1.9%, 0.7% y 1.6%, reducciones que se explican porque el

efecto citostático en el Índice Profásico es muy alto 95.8% (figura 9 y 10).

El intenso efecto citotástico de la tartrazina en profase se explicaría porque

el colorante estaría inhibiendo la disgregación de la envoltura nuclear o

carioteca. El fundamento de la citoxicidad estaría relacionado con los dos

radicales SO3, que presenta la tartrazina en su estructura química (Anexo

1), la cual estaría conllevando a una inhibición de la perdida de fósforo

(Alberts y col., 2002; Lodish y col., 1999).

El incremento del IP en los tratamientos expuestos a la tartrazina, se

debería probablemente a que dicha sustancia al inactivar la formación de

los complejosCdK1-Ciclina B; traería como consecuencia que los procesos

de condensación del material genético y de polimerización de microtubulos

para la formación del huso se vean afectados; por lo que las células no

transitarían normalmente desde la profase hacia metafase (Hyman y

Karsenti, 2003; Losada y Hiranol, 2001; Mitchison y Kirshner, 1999). La

disminución del Índice Metafásico, se deberia a que la tartrazina al inhibir el

complejo CdK1-Ciclina B, actúa cobre los centros de organización de



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microtúbulos, disminuyendo el ensamblaje del uso mitótico. Ello

desencadenarían un cambio súbito en la funcionalidad de los cinétocoros,

dejando de inducir la polimerización de microtúbulos que se elaboran

perpendicularmente al eje mayor del cromosoma y se anclan por una de

sus extremidades en el cinétocoro, logrando solo pasar a metafase un

número reducido de células ( Hayles y Nurse, 2001; Lodish y col; 1999;

Pierce, 2006).

La disminución en el IA, estaría ocurriendo debido a que el aumento

del número de células en profase generó una disminución en metafase y

por ende una disminución en anafase. Por otro lado, la tartrazina actuaría

inhibiendo la actividad catalítica de las cohesinas, MAPs y catastrofinas; las

cuales a su vez se encargan de llevar a cabo el proceso de segregación de

cromátidas hermanas no permitiendo entonces, que las células transiten

normalmente hacia anafase y hacia telofase ( Alberts y col; 2002; Lodish y

col; 1999; Garcia y col; 2000).



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Los resultados obtenidos en el tratamiento tres (T3) evidencian que el

Índice Mitótico (IM) de 19.4 %, tiende a ser similar con el tratamiento

testigo, igual sucede con los Índices de Fases respectivos (70.8%, 11.1 %,

7.0 % y 11.1%) (anexo 13). Esto significaría que el extracto de noni al 5 %

no tendría efecto citostático como el observado con la tartrazina. Estos

resultados corroboran que el “noni” al 5 % si podría tener un efecto

reparador en el daño de la dinámica celular de la población celular mitótica

de V. faba L. (figura 12 y 13).

Los tratamientos T4, T5 Y T6 constituyen los sistemas experimentales

clave en la presente tesis, pues las raicillas de V. faba L. se están

enfrentando al citotóxico tartrazina y luego al probable agente reparador de

daño citotóxico como es M. citrifolia “noni”. Si se compara T2 en donde las

raicillas han sido sometidas a la tartrazina al 0.5%, vemos que el IM es de

36.8% +/- 1.54; sin embargo, en T6 en donde las raicillas de V.faba L. se

han enfrentado a la misma concentración de tartrazina (0.5%) y luego al

5% de noni, vemos que el IM se ha reducido a 31.2% +/- 1.5 con lo cual se

evidencia que el noni al 5%, a pesar de hallarse en un medio con 0.5% de

tartrazina, se nota cierta reparación del daño citotóxico porque el IM ha

disminuido hacia su probable valor ideal de 16.2% +/- 1.33 (anexo 16).



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La razón por el cual no se obtuvo un IM menor se debe a que las

raicillas de V.faba L. al ser enfrentadas simultáneamente a dos agente

extraños (tartrazina y noni), han sufrido un impacto severo en sus

estructuras y fisiología, por lo que reparación no se evidencia plenamente.

Lo afirmado anteriormente se demuestra en T4 y en T5 donde las

raicillas de V.faba L. han sido sometidas también simultaneamente a los

dos agentes extraños, pero en donde la concenracion del citotoxico

tartrazina ha sido menor (0.1% en T4 y 0.3% en T5). En ambos

tratamientos se obtuvo un IM notablemente cercano al IM ideal (21.0% +-

0.45 en T4 y 25.2% +- 1.00 en T5) (anexo 14 y 15).

Retomando el tratamiento 6 (T6), observamos en la tabla 1 y en la

figura 3 que el IMe, IA e IT los valores alcanzan sus menores expresiones

como son 0.8% +/- 0.12; o.5% +/- 0.26 y 0%, respectivamente (anexo16).

Esto se explica porque como se manisfesto anteriormente las racillas de

V.faba L. se han enfrentado simultáneamente a los dos agente tartrazina y

noni, lo cual ha afectado a la dinámica celular. Esto sugiere que la

concentración del noni ideal para un posterior trabajo de investigación seria

del 3% o 4%.



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Asi mismo en el tratamiento 6 (T6), no solamente se encontró un

fuerte efecto citotóxico, sino también efectos genotóxicos con la presencia

de aberraciones cromosómicas, asi mismo se obrsevo una severa

deshidratación de las células evidenciados por los bordes irregulares de las

mismas (figura 22).

Empiricamente, se observa en la tabla 1 que hay diferencias entre los

promedios de los diversos indices de fase de V.faba L. Sin embargo, para

demostrar la significancia estadistica de los promedios de los seis

tratamientos se sometieron los resultados a la prueba de analisis de

varianza (ANOVA). En la tabla 2 se puede observar que solo en los

promedios de los indices inetrfasicos el P valor es mayor que el margen de

error del 5%; por tanto solamente en el índice interfásico se acepta H0, o

sea que los promedios no son estadísticamente diferentes. Sin embargo en

los índices restantes ( IM, IP, IMe, IA e IT) los P valor son numericamente

muy pequeños respecto al margen de error del 5%, por tanto en estos

promedios se acepto la hipótesis alterna que los promedios son

significativamente diferentes.



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Al ser sometidos los promedios de los índices a la prueba de

comparaciones multiples de Tukey ( tabla 3) (anexo 23), observamos que

hay diferencia estadisticamente significativa al 0.05 en los seis

tratamientos. Por tanto los indices promedios de los seis tratamientos son

producto del tratamiento con la tartrazina, con el noni y con la tartrazina

mas noni y no es un efecto del azar; con lo cual se corrobora que los

resultados hallados en la presente tesis si han ocurrido por un verdadero

efecto de los agentes sobre

los indices de fases y que asi se comportarian en la realidad con una

aproximacion del 95%.



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CONCLUSIONES

Morinda citrifolia L. “ noni” 5% presenta un efecto reparador en células

meristematicas de V. faba L sometidas a la tartrazina.

Los resultados evidencian un efecto reparador del fruto del noni en el IM

de V. faba L. sometido a tartrazina, lo cual sugiere que el fruto presentaría

componentes que participarían en la reparación de ciertos procesos

celulares.

.



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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=21163341&dopt=Abstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=21163341&dopt=Abstract

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ANEXOS



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Anexo 1: Estructura química de la tartrazina



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Anexo 2: Metodología usada para la obtención de células

meristemáticas de Vicia faba L. y el protocolo de Tjio y Levan. A= semillas de V. faba L. en soporte húmedo para su germinación, B=adecuación del sistema biológico de pruebas, C=tinción de raicillas, D=calentamiento de las raicillas teñidas, E=squash, F= laminas listas para observar al microscopio.

C

E F

A B



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Anexo 3: Selección de frutos maduros de M.

citrifolia L. ”noni”

Anexo 4: Vista macroscópica de una semilla de V.

faba L. germinada, mostrando la raicilla principal.



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Anexo 5: Vista macroscópica de una semilla de V. faba L. germinada, mostrando la raicilla principal y las raicillas secundarias usadas en la presente tesis.

Anexo 6: Reactivos usados para el desarrollo de la presente tesis.



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Anexo 7: Observación de láminas montadas, conteo y análisis citológico de las células meristemáticas de V. faba L. tratadas con tartrazina y noni.



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Donde: IM= Índice Mitótico NCM= Número Células en Mitosis NTC= Número Total de Células Observadas

Anexo 8: Fórmula para determinar el indice mitotico

Según Tjio y Levan.



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Dónde: IF= Índice de Fase. A= Número Células de la fase Respectiva. B= Número Total de Células en Mitosis

Anexo 9: Fórmula para determinar el índice de fases Según Tjio y Levan



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Anexo 10: Vista panorámica de las semillas de V.faba L. sometidas al noni y a la tartrazina.



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Anexo 11: Porcentaje del tratamiento 1 (T1) Testigativo negativo, evidenciando

las diferentes fases de la mitosis en meristemos radiculares de Vicia faba L. mantenidas en agua destilada.

Anexo 12 : Porcentaje del tratamiento 2 (T2) Testigativo positivo A,

evidenciando las diferentes fases de la mitosis en meristemos radiculares de Vicia faba L. mantenidas en solución de tartrazina 0.5%.

0

20

40

60

80

100

II IM IP IMe IA IT

83.8

16.2

67.4

13.5 7.9 11.2

PO

RC

ENTA

JE

PR

OM

EDIO

Tratamiento 1 (T1)-Testigo negativo

0

20

40

60

80

100

II IM IP IMe IA IT

63.2

36.8

95.8

1.9 0.7 1.6

PO

RC

ENTA

JE

PR

OM

EDIO

Tratamiento 2 (T2)-Testigo positivo A



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Anexo 13: Porcentaje del tratamiento 3 (T3) Testigativo positivo B, evidenciando las diferentes fases de la mitosis en meristemos radiculares de Vicia faba L. mantenidas en extracto acuoso del fruto de M.citrifolia L. 5%.

Anexo 14: Porcentaje del tratamiento 4 (T4), evidenciando las diferentes fases

de la mitosis en meristemos radiculares de Vicia faba L. mantenidas en solución de tartrazina 0.1%, luego expuestas al extracto acuoso del fruto de M.citrifolia L. 5%.

0

20

40

60

80

100

II IM IP IMe IA IT

80.6

19.4

70.8

11.1 7 11.1

PO

RC

ENTA

JE

PR

OM

EDIO

Tratamiento 3 (T3)-Testigo positivo B

0

10

20

30

40

50

60

70

80

II IM IP IMe IA IT

0.0

21.0

76.3

8.5 6.1 9.1

PO

RC

ENTA

JE

PR

OM

EDIO

Tratamiento 4 (T4)



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0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

II IM IP IMe IA IT

74.8

25.2

84.4

4.8 6.1 4.7

PO

RC

ENTA

JE

PR

OM

EDIO

Tratamiento 5 (T5)

0

20

40

60

80

100

II IM IP IMe IA IT

68.8

31.2

98.7

0.8 0.5 0

PO

RC

ENTA

JE

PR

OM

EDIO

Tratamiento 6 (T6)



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Anexo 17: Análisis de varianza del Índice Interfásico

Anexo 18: Análisis de varianza del Índice Mitótico

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Promedio de los cuadrados F Probabilidad

Valor crítico para F

Entre grupos 784.011667 5 156.802333 3.09665039 0.05043051 3.10587524 Dentro de los grupos 607.633333 12 50.6361111

Total 1391.645 17


Suma de cuadrados

Grados de libertad



Entre grupos 909.496111 5 181.899222 141.311437 3.1128E-10 3.10587524 Dentro de los grupos 15.4466667 12 1.28722222

Total 924.942778 17



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Anexo 19: Análisis de varianza del Índice Profásico

Anexo 20: Análisis de varianza del Índice Metafásico


Suma de cuadrados

Grados de

libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad



Total 2572.56278 17


Suma de cuadrados

Grados de libertad




Total 396.751111 17



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Anexo 21: Análisis de varianza del Índice Anafásico

Anexo 22: Análisis de varianza del Índice Telofásico


Suma de cuadrados

Grados de libertad




Total 163.209444 17


Suma de cuadrados

Grados de libertad




Total 366.565 17



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Anexo 23: Prueba de comparaciones múltiples de Tukey

INDICE INTERFASICO

q alfa= 4.75

607/12= 50.6

N=5

Calculamos ahora HSD:

HSD= qα √

= 4.75√

= 4.53 √ = 4.75 ( 3.18) = 15.1

INDICE MITÓTICO

q alfa= 4.75

15.4/12= 1.28

N=5

Calculamos ahora HSD:

HSD= qα √

= 4.75√

= 4.53 √ = 4.75 ( 0.10) = 0.48

A(15) B(13.3) C(11) D(10.7) A(15) 1.7 4.0 4.3 B(13.3) 2.3 2.6 C(11) 0.3 D(10.7)



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Todas las comparaciones de medias del índice Mitótico de los seis tratamientos son estadísticamente significativos al 0.05%. Por tanto:

T1 (16.2) T2 (36.8) T3 (19.4) T4 (21.0) T5 (25.2) T6 (31.2) T1 (16.2) 20.6 3.2 4.8 9.0 15 T2 (36.8) 17.4 15.8 11.6 5.6 T3 (19.4) 1.6 5.8 11.8 T4 (21.0) 4.2 10.2 T5 (25.2) 6 T6 (31.2)

T1 (16.2) a T2 (36.8) b T3 (19.4) c T4 (21.0) d T5 (25.2) e T6 (31.2) f



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Anexo 24: Base de datos de la presente tesis.



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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DR. RAÚL BELTRÁN ORBEGOSO

FICHA DE REGISTRO DE DATOS DE INVESTIGACIÓN EN CITOTOXICIDAD Y GENOTOXICIDAD EN Vicia faba L.

Título de la Tesis: Efecto reparador del extracto acuoso del fruto de Morinda citrifolia L. “noni” en el índice mitótico de Vicia faba L. expuesto a tartrazina.

Autora: Romy Natali Guevara Veneros Asesor: Dr. Raúl Beltrán Orbegoso Fecha: 20/04/15 Hora: 8.00 am

Tratamiento: T1 Testigo negativo Agua destilada Repetición: n° 01 Ambiente: Laboratorio de Biología Celular

N° de campo micros-cópico

N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )

Índice interfásico

( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)

N° de células en Telofase

(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100

Aberraciones cromosómicas

1 132 29 161 22 2 2 3 2 127 23 150 14 3 2 4 3 131 28 159 21 4 1 2 4 126 13 139 6 3 2 2 5 129 26 155 20 2 1 3 6 133 22 155 15 3 3 1 7 139 17 156 11 3 1 2 8 141 16 157 11 3 0 2 9 138 29 167 23 3 2 1 10 126 25 151 19 2 1 3 ∑ 1322 228 1550 85.3 % 14.7 % 162 28 24 23 71.1 % 12.3 % 6.5 % 10.1 %



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Título de la Tesis: Efecto reparador del extracto acuoso del fruto de Morinda citrifolia L. “noni” en el índice mitótico de Vicia faba L. expuesto a

tartrazina.

Autora: Romy Natali Guevara Veneros Asesor: Dr. Raúl Beltrán Orbegoso Fecha: 20/04/15 Hora: 4.00 pm



N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100


1 141 27 168 15 5 4 3 2 123 23 146 14 3 2 4 3 118 34 152 26 4 2 2 4 136 22 158 7 6 4 5 5 124 20 144 10 5 2 3 6 145 29 174 19 4 3 3 7 129 33 162 26 2 2 3 8 132 34 166 26 4 2 2 9 137 21 158 11 2 3 5 10 126 25 151 16 3 2 4 ∑ 1311 268 1579 83 % 17 % 170 38 26 34 63.4 % 14.2 % 9.7 % 12.7 %



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N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100


1 117 22 139 15 4 1 2 2 109 25 134 18 3 2 2 3 128 34 162 26 5 1 2 4 135 20 155 13 2 2 3 5 123 28 151 18 3 3 4 6 137 22 159 13 6 1 2 7 119 32 151 23 3 3 3 8 124 26 150 19 2 1 4 9 132 27 159 17 3 2 5 10 136 22 158 13 5 3 1 ∑ 1260 258 1518 83.0 % 17.0 % 175 36 19 28 67.8 % 13.9 % 7.4 % 10.9 %



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tartrazina.


Tratamiento: T2 Testigo positivo A Tartrazina 0,5% Repetición: n° 01 Ambiente: Laboratorio de Biología Celular

N° decampo mcros-cpico

N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100


1 74 35 109 34 1 0 0 Se observaron anafases y telofases anormales

2 68 45 113 44 0 1 0 3 59 35 94 33 2 0 0 4 62 31 93 30 0 1 0 5 89 44 133 44 0 0 0 6 77 39 116 39 0 0 1 7 68 46 114 45 0 0 0 8 83 38 121 38 0 0 0 9 72 41 113 41 0 0 0 10 58 42 100 42 0 0 0 ∑ 710 396 1106 64.2 % 35.8 % 390 3 2 1 98.4 % 0.8 % 0.5 % 0.3 %



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N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 58 47 105 45 1 1 0 3 52 47 99 43 1 1 2 4 73 37 110 36 0 0 1 5 79 43 122 42 1 0 0 6 68 41 109 37 1 1 2 7 65 42 107 38 0 1 3 8 61 38 99 37 1 0 0 9 75 41 116 39 0 0 2 10 72 39 111 36 2 1 0 ∑ 667 419 1086 61.4 % 38.6 % 394 9 5 11 94.0 % 2.2 % 1.2 % 2.6 %



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N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 58 40 98 38 0 1 1 3 77 34 111 32 2 0 0 4 68 48 116 46 0 0 2 5 84 34 118 29 3 0 2 6 72 48 120 46 1 0 1 7 87 45 132 43 0 1 1 8 73 39 52 38 1 0 0 9 66 38 104 37 1 0 0 10 75 43 120 41 1 0 1 ∑ 734 415 1149 63.9 % 36.1 % 394 11 2 8 94.9 % 2.7 % 0.5 % 1.9 %



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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DR. RAÚL BELTRÁN ORBEGOSO




Tratamiento: T3 Testigo positivo B Noni 5% Repetición: n° 01 Ambiente: Laboratorio de Biología Celular

N° decampo micros-cópico

N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100


1 127 26 153 20 4 1 1

2 124 36 160 22 3 1 10 3 131 33 164 25 3 3 2 4 123 24 147 14 5 2 3 5 121 27 148 20 2 3 2 6 126 23 149 18 4 1 0 7 117 36 153 21 3 3 9 8 124 25 149 17 5 2 1 9 115 39 154 31 2 3 3 10 126 35 161 27 3 2 3 ∑ 1234 304 1538 80.2 % 19.8 % 215 34 21 34 70.7 % 11.2 % 6.9 % 11.2 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

65







N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100


1 123 21 144 14 2 2 3

2 121 18 139 11 1 2 4 3 116 31 147 26 2 1 2 4 124 27 151 20 2 2 3 5 113 35 148 23 6 2 4 6 115 25 140 20 1 1 3 7 120 23 143 13 4 2 4 8 119 29 148 23 2 2 2 9 114 29 143 23 1 2 3 10 107 35 142 20 10 2 3 ∑ 1172 273 1445 81.1 % 18.9 % 193 31 18 31 70.7 % 11.4 % 6.5 % 11.4 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

66




tartrazina.




N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100


1 109 37 146 25 4 2 6

2 122 30 152 22 3 2 3 3 116 33 149 18 6 2 7 4 120 28 148 21 2 3 2 5 113 27 140 21 3 2 1 6 124 23 147 16 2 2 3 7 122 21 143 13 2 3 3 8 117 33 150 26 3 2 2 9 123 27 150 21 3 2 1 10 108 27 135 20 3 1 3 ∑ 1174 286 1460 80.4 % 19.6 % 203 31 21 31 71.1 % 10.8 % 7.3 % 10.8 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

67




tartrazina.


Tratamiento: T4 0,1 % Tartrazina + 5% noni Repetición: n° 01 Ambiente: Laboratorio de Biología Celular


N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100


1 114€ 26 140 21 1 2 2 Se observaron anafases y telofases anormales

2 102 15 117 12 1 1 1 3 109 19 128 12 2 2 3 4 87 17 104 9 2 3 3 5 114 32 146 28 1 2 1 6 92 34 126 27 3 2 2 7 75 37 112 23 7 1 6 8 98 41 139 32 5 2 2 9 102 29 131 24 1 1 3 10 124 28 152 25 1 1 1 ∑ 1017 278 1295 78.5 % 21.5 % 213 24 17 24 76.6 % 8.6 % 6.2 % 8.6 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

68







N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 97 40 137 29 4 2 5 3 96 38 134 28 3 2 5 4 102 20 122 14 2 1 3 5 113 26 139 21 1 1 3 6 115 24 139 19 2 2 1 7 111 30 1141 24 2 2 2 8 98 31 129 27 1 2 1 9 110 19 129 12 2 2 3 10 116 30 146 21 7 1 1 ∑ 1082 281 1363 79.4 % 20.6 % 214 25 17 25 76.2 % 8.9 % 6.0 % 8.9 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

69







N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 102 15 117 9 2 1 3 3 109 19 128 14 1 2 2 4 87 12 99 6 1 3 2 5 114 32 146 26 1 2 3 6 92 34 126 24 4 2 4 7 75 31 106 25 2 2 2 8 98 41 139 27 8 1 5 9 102 29 131 24 1 1 3 10 114 28 142 25 1 1 1 ∑ 1007 267 1274 79 % 21 % 203 22 16 26 76.0 % 8.2 % 6.1 % 9.7 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

70




tartrazina.


Tratamiento: T5 0,3% Tartrazina + 5%noni Repetición: n° 01 Ambiente: Laboratorio de Biología Celular


N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 114 21 135 19 1 1 0 3 98 40 138 35 2 1 2 4 121 31 152 29 0 2 0 5 104 42 146 39 1 2 0 6 11 27 138 24 1 1 1 7 97 44 141 30 3 4 5 8 89 43 132 32 3 3 5 9 122 36 158 31 0 1 2 10 114 30 144 25 2 3 0 ∑ 1073 342 1415 75.8 % 24.2 % 288 18 20 16 84.2 % 5.3 % 5.8 % 4.7 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

71







N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 107 42 149 28 4 4 6 3 96 41 137 36 2 1 2 4 102 37 139 34 1 1 1 5 113 30 142 27 1 1 1 6 115 36 151 33 1 1 1 7 111 42 153 35 2 3 2 8 98 38 136 33 1 3 1 9 110 43 154 31 4 6 2 10 116 39 155 36 1 1 1 ∑ 1102 371 1473 74.8 % 25.2 % 313 18 23 17 84.4 % 4.8 % 6.2 % 4.6 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

72







N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 101 33 134 30 1 1 1 3 87 42 129 32 2 5 3 4 106 39 145 34 2 2 1 5 95 36 131 32 1 2 1 6 114 29 143 25 1 1 2 7 108 28 136 24 2 1 1 8 99 41 140 27 3 6 5 9 107 37 144 32 2 2 1 10 105 42 147 39 1 1 1 ∑ 1018 362 1380 73.8 % 26.2 % 306 16 23 17 84.5 % 4.4 % 6.4 % 4.7 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

73

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILL FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICS ESCUELA DE CIENCIAS BIOLÓGICS DR. RAÚL BELTRÁN ORBEGOSO






N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 107 36 143 35 0 1 0 3 110 43 153 41 2 0 0 4 86 49 135 48 0 1 0 5 102 44 146 44 0 0 0 6 95 39 134 39 0 0 0 7 97 47 144 47 0 0 0 8 104 39 143 38 0 1 0 9 113 45 158 45 0 0 0 10 106 49 155 49 0 0 0 ∑ 1024 430 1454 70.4 % 29.6 % 424 3 3 0 98.6 % 0.7 % 0.7 % 0 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

74







N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 98 39 137 38 0 1 0 3 101 43 144 42 1 0 0 4 99 49 148 49 0 0 0 5 108 45 153 44 1 0 0 6 97 53 150 53 0 0 0 7 88 52 140 51 0 1 0 8 96 47 143 47 0 0 0 9 105 57 162 56 1 0 0 10 102 49 151 48 0 1 0 ∑ 998 482 1480 67.4 % 32.6 % 475 4 3 0 98.5 % 0.9 % 0.6 % 0 %



BIBL

IOTE

CA DE

CIENCIA

S BI

OLOGIC

AS

75







N° de células

en interfase

( I )

N° de células

en mitosis ( M )

N° de células

total ( T )


( I I )

II =

x100

Índice mitótico

(I M)

IM=

x100

N° de células

en Profase

(P)

N° de células

en Metafase

(Me)

N° de células

en Anafase

(A)


(Te)

Índice profásico

( IP) IP=

x100

Índice metafásico

( IM ) IM=

x100

Índice anafásico

( IA) IA=

x100

Índice telofásico

( IT) IT=

x100



2 103 39 142 38 1 0 0 3 92 41 133 41 0 0 0 4 97 54 151 53 0 1 0 5 110 42 152 42 0 0 0 6 104 41 145 41 0 0 0 7 101 38 139 37 1 0 0 8 95 54 149 54 0 0 0 9 89 49 138 49 0 0 0 10 106 42 148 41 1 0 0 ∑ 994 452 1446 68.7 % 31.3 % 448 3 1 0 99.1 % 0.7 % 0.2 % 0 %



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CA DE

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S BI

OLOGIC

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76



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