BIOQUÍMICA FARMACIA DE BIBLIOTECA

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

EFECTO IN VITRO DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICO DE

LAS INFLORESCENCIAS DE BEJARIA AESTUANS L. PURUM

ROSA FRENTE A STAPHYLOCOCCUS AUREUS,

ESCHERICHIA COLI Y CANDIDA ALBICANS

TESIS II

PARA OPTAR EL GRADO DE BACHILLER EN FARMACIA Y

BIOQUIMICA

AUTORES: RUIZ NORIEGA LUCIA DEL PILAR

REYES AVALOS ELDER MILER

TRUJILLO - PERU

2012

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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DEDICATORIA

A mi familia, ese bastión de fuerza y

amor, siempre impulsándome, a mi

lado en cada decisión tomada. A

pesar de las dificultades, creyendo en

mi. Son los que siempre estarán y a

quienes les debo todo.

LUCÍA DEL PILAR RUIZ NORIEGA

Para mis padres, por su

comprensión y ayuda en los

momentos buenos y malos. Me

han enseñado a encarar las

adversidades sin perder nunca la

dignidad ni desfallecer en el

intento. Me han dado todo lo que

soy como persona, mis valores,

mis principios, mi perseverancia y

mi empeño, y todo ello con una

gran dosis de amor y sin pedir

nunca nada a cambio.



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ELDER MILER REYES AVALOS

AGRADECIMIENTO

Agradecemos a Dios, que nos ha

conservado con vida, salud y ha

puesto en nuestras vidas, personas,

sucesos, pruebas, virtudes e

inteligencia que nos ha llevado

hasta aquí.

A nuestra querida profesora asesora

Mg. Marilú Roxana Soto Vásquez y

co asesor Miguel Muñoz Ríos, por su

inteligencia y conocimientos, a

quienes les debemos que este trabajo

tenga los menores errores posibles.

Gracias por su dedicación.



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JURADO DICTAMINADOR

Dr. Vigo Alcántara Valdemar --------------------- PRESIDENTE

Dr. Ruiz Reyes Segundo Guillermo --------------------- MIEMBRO

Mg Soto Vásquez Marilú Roxana --------------------- MIEMBRO



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PRESENTACIÓN

Señores Miembros del Jurado:

En cumplimiento con las disposiciones vigentes emanadas del reglamento

de Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la

Universidad Nacional de Trujillo, sometemos a vuestra consideración y

elevado criterio, el presente informe de tesis II titulado "Efecto in vitro del

extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L.

“Purum rosa” frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida

albicans”. Esperando que el jurado se sirva a calificar este trabajo según su

criterio establecido, a pesar de la existencia de alguna deficiencia

encontrada durante el desarrollo del presente trabajo de investigación.

Trujillo, Junio 2012

Reyes Avalos, Elder Miler Ruiz Noriega, Lucía del Pilar



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ÍNDICE

DEDICATORIA………………………………………………………………… i

AGRADECIMIENTO………………………………………………………….. ii

JURADO DICTAMINADOR…………………………………………..... iii

PRESENTACIÓN.……………………………..………………………. iv

RESUMEN……………………………………………………………….. vi

ABSTRACT…………………………………………………..………… vii

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………… 1

II. MATERIAL Y MÉTODO……………………………………… 11

III. RESULTADOS…………………………………………………. 22

IV. DISCUSIÓN………………………………………………...….. 25

V. CONCLUSIONES……………………………………………… 31

VI. RECOMENDACIONES………………………………………….. 32

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………. 33

VIII. ANEXOS…………………………………………………...… 40



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RESUMEN

Gran parte de la terapéutica actual se basa en productos obtenidos a partir

de fuentes naturales, y en especial la fuente vegetal. Dentro de ella encontramos

una amplísima variedad de plantas, sobre todo en Perú, con metabolitos

secundarios importantes para la farmacología, que son utilizadas por gran parte de

la población de países en desarrollo, se calcula que es un 80% de esta población.

En Perú, Bejaria aestuans L. crece en la sierra del departamento de La Libertad y

es usada tradicionalmente en el tratamiento de algunos tipos de infecciones, como

las infecciones de tracto urinario e infecciones micóticas.

En este trabajo se plantea el siguiente problema: ¿Cuál es el efecto in vitro

del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. “Purum

rosa” frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida

albicans?

Como resultados, se identificaron los siguientes metabolitos secundarios

en el extracto hidroalcohólico de Bejaria aestuans L., obtenido por extracción

continua soxhlet: catequinas, cumarinas, polifenoles, flavonoides, saponinas,

antocianinas, triterpenos, esteroides, taninos y alcaloides; algunos de los cuales se

presume posee actividad antibacteriana y/o antimicótica, y se comprobó, mediante

el método de difusión en agar de Kirby Bauer, que el extracto hidroalcohólico de

Bejaria aestuans L., a concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL y

200 mg/mL, posee actividad antibacteriana in vitro frente a Staphylococcus

aureus pero no muestra actividad frente a Escherichia coli y Candida albicans.

Palabras Claves: Bejaria aestuans L., efecto in vitro, extracto

hidroalcohólico, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans.



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ABSTRACT

Much of the current therapy is based on products obtained from natural sources,

particularly the plant source. Within it we find a wide variety of plants, especially

in Peru, with important secondary metabolites for pharmaceuticals, which are

used by much of the population of developing countries, is estimated to be 80% of

this population. In Peru, Bejaria aestuans L. grows in the highlands of the

department of La Libertad and is traditionally used to treat some types of

infections such as urinary tract infections and fungal infections.

This paper poses the following problem: What is the in vitro effect of

hydroalcoholic extract of the inflorescences of Bejaria aestuans L. "Purum rosa"

against strains of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans?

As a result, we identified the following secondary metabolites in the

hydroalcoholic extract of Bejaria aestuans L. obtained by Soxhlet continuous

extraction: catechins, coumarins, polyphenols, flavonoids, saponins, anthocyanins,

triterpenes, steroids, tannins and alkaloids, some of which are presumed to possess

antibacterial activity and / or antifungal, and found by the agar diffusion method

of Kirby Bauer, the hydroalcoholic extract of Bejaria aestuans L. at

concentrations of 25 mg / mL, 50 mg / mL, 100 mg / mL and 200 mg / mL, have

in vitro antibacterial activity against Staphylococcus aureus but shows no activity

against Escherichia coli and Candida albicans.

Keywords: Bejaria aestuans L., in vitro effects, hydroalcoholic extract,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans.



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I. INTRODUCCIÓN

En épocas en que el hombre sólo tenía a su disposición los recursos que

el planeta le otorgaba, buscó en éstos las herramientas para disminuir el dolor

físico y evitar la muerte. Entre los recursos más aprovechados por distintas

culturas a través de la historia, se encuentran los recursos minerales, animales y

vegetales. Éstos constituyeron hasta mediados del siglo XX los recursos

terapéuticos por excelencia 1.

Dentro de los reinos de la naturaleza que contribuyen hasta hoy en

disminuir síntomas y prevenir enfermedades, destaca el reino vegetal. Las

plantas, gracias a su maravilloso y complejo metabolismo, constituyen un

verdadero arsenal químico, del cual sólo se conoce con éxito un tercio,

considerando la variedad de especies existentes a nivel mundial y aquellas

inexploradas hasta hoy, sin considerar aquellas especies ya extintas 1,2.

Fue así como cada región del mundo desarrolló su forma de curar a

partir de plantas medicinales, que es única y característica, puesto que se

utilizaban especies endémicas de las regiones en cuestión. Con el tiempo estas

terapias características locales pasaron a conformar la llamada medicina

tradicional y al ser preservada por los pueblos originarios fue llamada medicina

aborigen o autóctona, existiendo estos términos hasta nuestros días, al igual que

las recetas tradicionales o autóctonas que agrupan tanto usos, formas de

preparación, administración, dosis, entre otros parámetros farmacológicos

modernos 1.



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Paracelso, el padre de la Farmacología Química, médico y químico suizo

en pleno Renacimiento, fue el primero en señalar que las propiedades medicinales

de las plantas radican en sus principios activos aislables por técnicas alquímicas.

Esta observación constituye la base de la Farmacología Moderna. Luego y gracias

al desarrollo de la síntesis química, hombres de ciencia lograron copiar núcleos

básicos de moléculas exitosas de la naturaleza para mejorarlas haciéndolas más

selectivas y seguras 2,3.

Es así como nuestra realidad terapéutica hoy en día, está regida por la

química sintética, pero lo que pocos saben es que estas exitosas moléculas que

curan no son sino copias mejoradas de sustancias químicas que la naturaleza en

forma espontánea creó, llamadas metabolitos secundarios 2.

Las plantas, organismos autótrofos, además del metabolismo primario

presente en todos los seres vivos, poseen un metabolismo secundario que les

permite producir y acumular compuestos de naturaleza química diversa. Estos

compuestos derivados del metabolismo primario se denominan metabolitos

secundarios, se distribuyen diferencialmente entre grupos taxonómicos, presentan

propiedades biológicas, muchos desempeñan funciones ecológicas y se

caracterizan por sus diferentes usos y aplicaciones como medicamentos,

insecticidas, herbicidas, perfumes o colorantes, entre otros 4.

Es importante destacar que los metabolitos secundarios también reciben

la denominación de productos naturales y tienen un importante y significativo

valor medicinal y económico, derivado éste último de su uso en la industria

cosmética, alimentaria y claro en la farmacéutica. Un gran número de estos

productos naturales, que ya se usaban en la medicina antigua como remedios para



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combatir enfermedades, se utilizan en la actualidad como medicamentos, resinas,

gomas, potenciadores de sabor, aromas, colorantes, etc. 4.

La fitoterapia, entonces, es un pilar para la farmacoterapia, es una

ciencia que estudia la utilización de productos de origen vegetal con finalidad

terapéutica, ya sea para prevenir, para atenuar o para curar un estado patológico.

La fitoterapia es la técnica médica que se sirve de las plantas para combatir las

enfermedades y restablecer los equilibrios de la salud. En otros países a esta

técnica se la denomina herbalismo 5.

Aproximadamente, el 60% de la población mundial utiliza plantas y

productos derivados de ellas en su medicación. Estos productos naturales hoy en

día son considerados como una de las “medicinas” de gran importancia por su

efectividad terapéutica. De las 520 nuevas drogas aprobadas entre 1983 y 1984, el

39% fueron productos naturales o derivados de productos naturales, y el 60 a

80% de drogas antibacterianas y de anticancerígenos son derivados de productos

naturales. Por ejemplo, del desarrollo de drogas no proteicas se han obtenido

derivados generados de productos naturales como la sinvastatina, lovastatina,

enalapril, ciprofloxacina y ciclosporina, entre otros, y agentes anticancerígenos

como el taxol y docetaxol (Harvey, 2000). Sin embargo, la actividad terapéutica

no sólo se puede conseguir luego de procesos de extracción y purificación de

principios activos, sino directamente de la planta misma o de algunos extractos

relativamente simples de obtener 6.



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Aproximadamente el 80 % de la población de la mayor parte de los

países en desarrollo todavía usan la medicina tradicional derivada de plantas para

tratar enfermedades en humanos. Países como China, Cuba, Sri-Lanka, Tailandia

y otros han inscrito oficialmente en sus programas de salud el uso de la medicina

tradicional, por ejemplo, la homeopatía que depende de material vegetal o sus

derivados para tratar dolencias en humanos 7.

La fitoterapia ha resultado ser más útil que la medicina moderna para el

tratamiento de ciertas enfermedades crónicas, con menos efecto secundario y más

económica 7.

Las plantas aromáticas y medicinales son fuente exclusiva de algunas

drogas que se emplean en tratamientos médicos nuevos, puede decirse que

alrededor del 25 % de las drogas en la farmacopea moderna son derivadas de

plantas y muchas otras son sintéticos análogos construidos de componentes

prototipos aislados de plantas; se emplean, además, como suplementos

nutricionales y en la industria de cosméticos y perfumes, lo que ha aumentado su

valor en años recientes 7.

En muchas ocasiones para curar determinadas patologías que afectan la

salud se ha tenido que recurrir a ciertos procedimientos terapéuticos que se

apartan de la medicina convencional. En la actualidad, esta alternativa médica

experimenta un auge. Muchos países se han involucrado en la obtención de

medicamentos a partir de plantas, esto se debe a una serie de factores, entre los

cuales debemos destacar en muchos casos el conocimiento preciso de su

composición química, y el hecho de que en la actualidad la utilización de estas



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plantas se fundamenta en numerosos ensayos farmacológicos in vivo e in vitro.

De esta forma, el uso de las especies vegetales medicinales que se ha venido

haciendo en forma empírica y basada en la tradición busca tener hoy una base

científica 6.8.

El Perú, considerado el tercer país más mega diverso del planeta, ha

efectuado importantes aportes de especies y variedades para el mundo gracias a

los diversos pisos ecológicos y microclimas que presenta, contando con 84 zonas

de vida de las 103 conocidas donde habría 50 mil especies vegetales (20% de las

existentes en la Tierra) de las que 2,000 han sido utilizadas con fines curativos.

Es así como el uso de las plantas con fines terapéuticos es de gran utilidad, ya que

de ellas son obtenidas innumerables sustancias químicas. La investigación, brinda

la oportunidad de encontrar nuevos principios activos a partir de una materia

prima más económica y natural 9.

Dentro de las plantas medicinales, que forman parte de esa gran

megadiversidad nuestra, se encuentra una especie conocida comúnmente como

“Purum rosa”, cuyo nombre es Bejaria aestuans L.; esta especie pertenece a la

familia Ericaceae, dicha familia presenta una amplia distribución geográfica;

está presente en todos los continentes desde las zonas templadas y frías (excepto

en la Antártica) hasta las regiones montañosas neotropicales, donde alcanzan su

mayor diversidad. Las ericáceas constituyen una familia diversa, con 110 géneros

y aproximadamente 4000 especies 10.

Para el Perú, habían sido reportadas 135 especies, a las que Ulloa et al.

(2004) añadieron dos, con lo cual actualmente se consideran que crecen en la



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flora peruana 137 especies de Ericaceae en 22 géneros. De estas, Bejaria

aestuans L., es una de las especies de las que se tiene referencia de su crecimiento

en la sierra del departamento de La Libertad y es usada popularmente en el

tratamiento de algunos tipos de infecciones 11.

Bejaria aestuans L. es un arbusto o árbol de 1-1.5 m de altura, de corteza

lisa o con fisuras, glabras, tomentoso, híspido, de color gris o marrón oscuro

Hojas coriáceas, planas, rara vez de revolución o longitudinal encorvada, elíptica

(estrechamente ovadas u ovales), base cuneada (obtuso), ápice obtuso o agudo, a

menudo mucronado, margen entero, ciliado, o glandular-ciliado, ambas

superficies glabras, híspido, o glandular híspida; peciolo ligeramente achatado en

la sección transversal, Inflorescencia terminal, axilar, racemosa, de color rosa a

blanco, a veces rojas, pétalos obovados estrecho (elíptica), estambres incluidos o

ligeramente exentos 11.

Bejaria aestuans L. es una especie arbustiva que frecuentan en

quebradas boscosas, terrenos pedregosos; laderas abiertas, pedregosas y

boscosas ubicadas entre los 2050 – 3400 m.s.n.m. en los departamentos de la

mayor parte del Perú 12.

En cuanto a trabajos de investigación del género y la especie

encontramos que Yon (1977) manifestó que las hojas e inflorescencias de

Bejaria glauca presentan glicósidos saponínicos del tipo saponinas triterpénicas,

encontrándose éstas, en mayor proporción en las hojas. Cabe decir que este

tipo de saponinas se le atribuyen posibles propiedades expectorantes 13.



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Sabemos del uso local de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. en

casos de infecciones del tracto urinario e infecciones micóticas vaginales. En más

del 95% de los casos, un único microorganismo es el responsable de la ITU. El

agente etiológico más frecuente de ITU en ambos sexos es la Escherichia coli,

responsable del 75% a 80% de casos; de allí que eligiéramos esta cepa en el

estudio 14.

Staphylococcus aureus fue elegida por ser agente etiológico de diversas

patologías, incluyendo infecciones de piel y tejidos blandos, bacteremia,

endocarditis, infección del SNC y del tracto genitourinario. Por su ubicuidad y en

función de los procedimientos médicos y uso de antimicrobianos, se confiere

especial énfasis al aislamiento y estudio epidemiológico de S. aureus,

considerando su rol primordial en las infecciones nosocomiales 15.

En el caso Las infecciones vaginales, la candidiasis suele encontrarse

disputando el primer o segundo lugar en el diagnóstico diferencial de las

diferentes causas de molestias vulvo vaginales y flujo. Las especies comúnmente

asociadas a la infección vaginal por cándida son Candida albicans, Candida

glabrata, Candida tropicalis, Candida krusei y Candida guillermond. Pero

aproximadamente, 85% a 90% de las Candidiasis vulvo vaginales son debidas a

Candida albicans 16.

La actividad antimicrobiana y antifúngica de extractos de plantas usadas

en medicina popular contra diversas bacterias y hongos, los cuales causan

infecciones frecuentes en humanos, ha sido ampliamente estudiada (Quiroga et

al., 2001; Navarro García et al., 2003; Carpinella et al., 1999; Zhu et al., 2005;



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Somchit et al., 2003; Dabur et al., 2004). Debido a los efectos adversos de

algunas de las drogas antibacterianas y antifúngicas utilizadas actualmente

(Girois et al., 2005; Song and Deresinski, 2005; The Merck Manual of Medical

Information, 2003), a que son poco efectivas e inducen frecuentemente

resistencia (Escalante et al.,2002; Zhang et al., 2005), numerosos investigadores

han encaminado sus trabajos hacia la búsqueda y aplicación de nuevos

compuestos biológicamente activos que exhiban efectos secundarios mínimos

(Fenner et al.; 2005; Bisignano et al., 2000; Jones et al.,2000; Ali-Shtayehant Abu

Ghdeib, 1999; Kandil et al., 1994) 17.

Los metabolitos secundarios responsables de las posibles actividades

antibacterianas y antifúngicas de algunas plantas podrían ser flavonoides, fenoles,

glicósidos de fenoles, saponinas, según manifiesta Grayer y Harborne, 1994;

Osbourn, 1996 17.

Referente a su posible efecto antibacteriano y antifúngico encontramos

algunos trabajos de investigación como el de Bussmann R, Glenn A. & Sharon D.

(2010) que refiere que las flores y hojas de Bejaria aestuans L. presentan

actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus 18.

Núñez (1989) que menciona que la especie Bejaria glauca presenta un

tallo con cutícula y colénquima laminar; mientras que las hojas presentan

parénquima lagunoso, células claviformes típicas y cutícula muy desarrollada.

Asimismo expresa que esta especie es usada tradicionalmente para el tratamiento

de descensos vaginales por la presencia de mucílagos 19.



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Bussmann R. and Sharon D. (2006) manifiestan que las hojas e

inflorescencias de Bejaria aestuans L., se usan en medicina tradicional, en forma

de decocto (1.5 g/1Litro de agua), mezclándola con otras plantas, tomándose 3

veces al día para la diabetes, próstata, regulación menstrual, inflamaciones del

útero, riñones, hígado, vejiga, ovarios, dolores menstruales y quistes 20.

En el Perú, la medicina tradicional es un pilar fundamental en materia de

salud, tanto por lo económico como por las tradiciones de cada comunidad en

cuanto a “remedios caseros”. Sin embargo, es importante que se realicen estudios

científicos que respalden la eficacia de dichos productos para otorgarles mayor

seguridad y eficacia a la presumible actividad terapéutica de las plantas.

Dadas las luces y evidencia sobre el posible efecto positivo

antibacteriano y antimicótico y considerando lo anteriormente expuesto sobre el

auge de la medicina en base a plantas medicinales y la gran dependencia de

nuestra comunidad al uso tradicional de las mismas por ser una alternativa

económica y por muchos percibida como segura, consideramos más que necesaria

la realización de este trabajo de investigación que busca demostrar el efecto in

vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L.

“Purum rosa” frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y

Candida albicans.

Frente a lo expuesto nos planteamos la siguiente interrogante, ¿Cuál es

el efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria

aestuans L. “Purum rosa” frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia

coli y Candida albicans?



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Ante esta pregunta nos planteamos la siguiente hipótesis, El extracto

hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. “Purum rosa”

presenta efecto antibacteriano y antimicótico in vitro frente a cepas de

Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans.

Durante la realización de este trabajo pretendemos cumplir el siguiente

objetivo:

- Evaluar el efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las

inflorescencias de Bejaria aestuans L. “Purum rosa” frente a cepas de

Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans.



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II. MATERIAL Y MÉTODO

2.1. MATERIALES

a) Material biológico

Material vegetal: 500 g de inflorescencias de Bejaria

aestuans L. “Purum rosa” que se recolectaron del caserío de

Capachique, distrito de Usquil, provincia de Otuzco,

departamento La Libertad en el mes de Marzo del año 2012.

Material microbiológico: cepas clínicas de Staphylococcus

aureus, Escherichia coli y Candida albicans proporcionados

por los Laboratorios de Bacteriología y Micología del

Departamento Académico de Microbiología y Parasitología

de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad

Nacional de Trujillo.

b) Material de laboratorio

Material de vidrio

Pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL

Vasos de precipitación de 100 y 250 mL.

Probetas de 100mL.

Tubos de ensayos

Matraces de 500 y 1000 mL.

Fiolas de 10, 25, 50 y 100 mL.

Frasco de vidrio de color ámbar de boca ancha



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Mortero

Viales

Equipos

Balanza analítica OHAUS GA 200

Balanza de triple brazo OHAUS 700/800 series

Tamices

Alcoholímetro

Cocina eléctrica Finely

Equipo de Soxhlet

Estufa Memmert

Autoclave Airshoft

Baño María Memert

Reactivos y Solventes

Agua destilada

Solución salina fisiológica

Etanol 30° G.L.

Etanol 95 ° G.L.

Metanol

Carbonato de sodio

Acido pícrico

Cloroformo

Anhídrido acético

Ácido sulfúrico concentrado

Tricloruro férrico al 5%



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Hidróxido de sodio

Hidróxido de potasio

Magnesio metálico

Alcohol amílico

Acido 3,5-dinitrobenzoico

Ácido clorhídrico concentrado

Subnitrato de bismuto

Yoduro de potasio

Cloruro de sodio en polvo

Bicloruro de mercurio

Yodo resublimado

Reactivo de Wagner

Reactivo de Hager

Medicamentos

Discos de Amikacina

Discos de Fluconazol

Medios de cultivo

Agar Mueller Hinton

Agar nutritivo

Agar Sabouraud

Otros

Caja de guantes estériles

Gradilla.

Mechero



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Papel filtro

Puntas estériles

Papel kraft

Asa de bacteriológica

Pinzas punta roma

Placas de petri descartables

Sacabocados

Calibrador de Vernier

2.2. MÉTODOS

2.2.1. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA21,22.

Se recolectaron 500g de inflorescencias de Bejaria aestuans L. del caserío

de Capachique, distrito de Usquil, provincia de Otuzco, departamento La

Libertad en el mes de Marzo del año 2012.

La recolección de la especie se realizó por el método convencional o clásico

de herborización, seleccionando el material en el campo y verificando que

esté en buenas condiciones, de preferencia por la mañana.

2.2.2. IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN TAXONÓMICA DE

LA ESPECIE21,22.

Se llevó un ejemplar completo de la planta al Herbarium Truxillensis de la

Universidad Nacional de Trujillo para su identificación y posterior

verificación taxonómica según el sistema filogenético de la especie.



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2.2.3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA21,22.

Selección de la muestra: El material recolectado se trasportó al laboratorio

de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la

Universidad Nacional de Trujillo, donde se eliminaron las sustancias

extrañas del material vegetal.

Lavado de la droga: Luego de la separación de las sustancias extrañas, se

procedió a lavar el material vegetal con agua destilada.

Secado: Una vez lavado, se procedió a adecuar la droga en bolsas de papel

Kraft con orificios, las que se colocaron en estufa a una temperatura de

40°C, realizando la posterior determinación de peso cada 24 horas hasta

valores constantes.

Pulverización: Una vez seco se pulverizó en mortero.

Tamizaje: Se hizo pasar el material obtenido de la pulverización, a través

de los tamices Nº 2, 1.2, 0.7, la muestra de trabajo correspondió al tamiz 0.7

Almacenamiento: El polvo obtenido, se guardó en frascos de vidrio de

color ámbar de boca ancha a una temperatura de 40°C.

2.2.4. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO22.

- Se pesaron dos muestras de 10g de droga pulverizada cada una, se

colocaron en cápsulas de porcelana para ser humectadas con etanol de 30°

G.L. por 24 horas, luego se mezcló con c. s. de arena lavada.

- Para la extracción se preparó un cartucho de papel de filtro que se colocó

en la cámara soxhlet, y se extrajo con 150 mL de etanol de 30° G.L. hasta

agotamiento.

- El producto se filtró con papel filtro Whatman N° 4.



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- La solución resultante se llevó a concentrar en rotavapor a una presión

reducida y a una temperatura de 50 °C; luego se pesó el residuo seco y se

guardó en refrigeración entre 2 y 8°C en frasco de vidrio de color ámbar

estéril, hasta su dilución con etanol de 30° G.L. para su posterior uso en los

ensayos microbiológicos.

2.2.5. ANÁLISIS FITOQUÍMICO PRELIMINAR DEL EXTRACTO

HIDROETANÓLICO21

Ensayo de Catequinas: Se tomó I gota de la solución alcohólica, con la

ayuda de un capilar y se aplicó sobre papel filtro. Sobre la mancha se aplicó

una solución de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde

carmelita a luz UV indica un ensayo positivo.

Ensayo de Resinas: se añadió a 2mL de la solución alcohólica y 10mL de

agua destilada. La aparición de un precipitado indica un ensayo positivo.

Ensayo de Baljet: Permitió reconocer la presencia de compuestos con

grupo lactónico, en particular Cumarinas, aunque otros compuestos

lactónicos pueden dar positivo al ensayo.

Para ello se tomó una alícuota del extracto etanólico y se adicionó 1mL del

reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o

precipitado rojo.

Ensayo de Liebermann-Burchard: Permitió reconocer la presencia de

triterpenos y/o esteroides, por poseer un núcleo del androstano,

generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6.

Para ello, se tomó una alícuota del extracto etanólico y se llevó a evaporar

en baño maría, el residuo se redisolvió en 1mL de cloroformo, se adicionó



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1mL de anhídrido acético y se mezcló bien; por la pared del tubo de ensayo

se dejó caer de II a III gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un

ensayo positivo se reconoce por un cambio rápido de coloración:

1. Rosado-azul muy rápido.

2. Verde intenso visible aunque rápido.

3. Verde oscuro-negro, final de la reacción.

Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio

generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades

importantes de estos compuestos. Para realizar este ensayo no debe existir

agua en el medio de reacción, pues ésta con el ácido sulfúrico reacciona de

forma violenta.

Ensayo de la Espuma: Permitió reconocer la presencia de saponinas, tanto

del tipo esteroidal como triterpénica. Se tomó una alícuota y se diluyó con

cinco veces su volumen en agua, se agitó fuertemente durante 5 a 10 min.

El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del

líquido de más de 2 mm de altura y persiste por más de 2 min.

Ensayo de Cloruro Férrico: Permitió reconocer la presencia de

compuestos fenólicos. A una alícuota del extracto etanólico se añadió III

gotas de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica, un ensayo

positivo da la siguiente información general:

-Desarrollo de una coloración rojo-vino: compuestos fenólicos en general.

-Desarrollo de una coloración verde intensa: taninos del tipo pirocatecólicos.

-Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos.

Ensayo de Bornträger: Permitió reconocer la presencia de quinonas. Se

agregó 1mL de hidróxido de sodio, se agitó mezclando las fases y se dejó



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reposar hasta su separación. El ensayo se consideró positivo cuando la fase

acuosa alcalina (superior) se coloreó de rosado o rojo.

Ensayo de Shinoda: Permitió reconocer la presencia de flavonoides. Se

diluyó con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de

magnesio metálico. Después de la reacción se esperó 5 min, se añadió 1mL

de alcohol amílico, se mezclaron las fases y se dejó reposar hasta que se

separaron.

El ensayo se considera positivo cuando el alcohol amílico se colorea de

amarillo, naranja, carmelita o rojo; intenso en todos los casos.

Ensayo de Kedde: Permitió reconocer la presencia de glucósidos

cardiotónicos. Una alícuota del extracto en etanol se mezcló con 1mL del

reactivo y se dejó reposar durante 5 a 10 min. En un ensayo positivo se

desarrolla una coloración violácea, persistente durante 1 a 2 h.

Ensayo de Antocianidinas: Permitió reconocer la presencia de estructuras

de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. Se calentó 2 mL del

extracto etanólico por 10 min. con 1 mL de HCl concentrado, se dejó enfriar

y se añadió 1 mL de agua y 2 mL de alcohol amílico, se agitó y se dejó

separar las fases. La aparición de color rojo a marrón en la fase amílica

indica un ensayo positivo.

Ensayo de Dragendorff: Permitió reconocer la presencia de alcaloides;

para ello, se tomó una alícuota y se añadió I gota de ácido clorhídrico

concentrado, (calentamos suavemente y dejamos enfriar). Con la solución

ácida se realizó el ensayo, se añadió III gotas del reactivo de Dragendorff,

Se considera (+) cuando presenta opalescencia, (++) cuando presenta

turbidez definida, y (+++) cuando presenta precipitado.



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Ensayo de Mayer: Se realizó según la forma descrita anteriormente, hasta

obtener una solución ácida, luego se añadió una pizca de cloruro de sodio en

polvo, se agitó y filtró, se añadió III gotas de la solución reactiva de Mayer

y se observó. Se considera (+) opalescencia, (++) turbidez definida, (+++)

precipitado coposo.

Ensayo de Wagner: Se realizó según la forma descrita anteriormente, hasta

obtener una solución ácida, luego se añadió III gotas del reactivo de Wagner

y los resultados se clasificaron de la misma forma.

Ensayo de Hager: Se realizó según la forma descrita anteriormente, hasta

obtener una solución ácida, luego se añadieron III gotas del reactivo de

Hager y los resultados se clasificaron de la misma forma.

2.2.6. ENSAYO MICROBIOLOGICO23,24,25,26.

PREPARACIÓN DE LAS CEPAS BACTERIANAS

Las cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans

fueron proporcionadas por los Laboratorios de Bacteriología y Micología

del Departamento Académico de Microbiología y Parasitología de la

Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.

Reactivación de los cultivos de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y

Candida albicans

A partir de los cultivos puros de S. aureus, E. coli se hicieron los sembrados

en tubos de ensayo conteniendo Agar Nutritivo y se incubaron a 37º C por 24

horas, para C. albicans se sembró en tubos de ensayo conteniendo Agar



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Sabouraud y se incubó a 37º C por 48 horas. Luego se evaluó la pureza de los

cultivos mediante coloración Gram para S. aureus, E. coli.

Preparación y estandarización de los inóculos de Staphylococcus aureus,

Escherichia coli y Candida albicans

A partir de los cultivos reactivados de cada bacteria y hongo se realizaron

suspensiones en solución salina fisiológica estéril hasta alcanzar la densidad

microbiana similar a la turbidez del tubo Nº 0,5 del Nefelómetro de Mc

Farland (1,5x108 cél/mL).

PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD

ANTIBACTERIANA POR EL METODO DE DIFUSION EN AGAR –

METODO DE KIRBY BAUER

Se llevó a cabo mediante el método de Kirby Bauer modificado, para lo cual a

partir de la suspensión de S. aureus, se sembró por superficie en placas con Agar

Mueller Hinton, luego se secó a temperatura ambiente por 15 minutos

aproximadamente. Posteriormente se realizaron 4 pozos de 6mm de diámetro

en la superficie del Agar Mueller Hinton, a una distancia no menor de 15 mm

entre ellos y a 1.5 cm del borde de la placa, se añadió en ellos 80 uL de cada

concentración del extracto hidroalcoholico previamente preparado (25 mg/mL,

50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL) y se dejó reposar por 30 minutos y

luego se incubaron a 37º C por 24 horas. Para E. coli se procedió de la misma

manera que para S. aureus y en el caso de C. albicans se incubó por 48 horas.

Se realizaron cuatro ensayos por cada bacteria y hongo.

Finalmente se midió el halo de inhibición de crecimiento de S. aureus, E. coli



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y C. albicans y los resultados fueron expresados como diámetro (mm) de

halo de inhibición.

Evaluación del efecto del etanol (solvente)

Para evaluar el efecto del etanol de 30° G.L. sobre el crecimiento de S. aureus

E. coli y C. albicans, se procedió de manera similar que en el caso de la

evaluación del efecto del extracto, a diferencia de que en los pozos se añadió

80 uL de etanol de 30° G.L.

Prueba de sensibilidad a antibióticos patrón

Se realizó mediante el método de Kirby Bauer, para lo cual se utilizó discos de

amikacina para S. aureus, y E. coli y fluconazol para C. albicans.

2.3. ANALISIS ESTADÍSTICO

Los resultados obtenidos se analizaron mediante las siguientes pruebas:

media aritmética, desviación estándar y coeficiente de variación.



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III. RESULTADOS

Tabla 1

Metabolitos secundarios en el extracto hidroalcohólico de las

inflorescencias de Bejaria aestuans “Purum rosa”.

Metabolito secundario Ensayos Identificación

Catequinas Catequinas +

Resinas Resinas -

Cumarinas Baljet +++

Fenoles Cloruro férrico ++

flavonoides shinoda +

Saponinas Espuma +

Cardenolidos Kedde -

Antocianidinas Antocianidinas +

Triterpenos y

Esteroides Lieberman-burchard +

Quinonas Borntrager -

Taninos Gelatina +

Alcaloides

Dragendorff ++

Mayer +

Wagner ++

Hager +

Leyenda:

IDENTIFICACION: - Negativo

+ Baja

++ Moderada

+++ Alta



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Tabla 2

Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. “Purum rosa” frente a Staphylococcus

aureus, Escherichia coli y Candida albicans

Leyenda:

*: Promedio del

diámetro de Inhibición

expresado en mm

N: Negativo

Microorganismo

Concentraciones del Extracto

hidroalcohólico (mg/mL)

Solvente

(control

negativo)

antimicrobiano

(Control positivo)

25 50 100 200 Etanol

30°G.L.

Amikacina

(10 µg)

Fluconazol (25

µg)

S. aureus 14.3* 14.5* 15.5* 18* N 30* ---

E. coli N N N N N 30* ---

C. albicans N N N N N --- 29*



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Tabla 3

Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de

Bejaria aestuans L. “Purum rosa” frente a Staphylococcus aureus

Concentraciones

(mg/mL)

PROMEDIO D.E. C.V.

25 14.25 0.9574 6.7188

50 14.5 0.5774 3.9817

100 15.5 1.0000 6.4516

200 18 1.1547 6.4150



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IV. DISCUSIÓN

Los metabolitos secundarios, a menudo, desempeñan un papel importante en

la planta, tales como defensa contra predadores, microorganismos, estrés, etc.;

estos componentes han sido utilizados como drogas durante milenios. Por lo tanto,

la detección de fitoquímicos sirve como primer paso en la predicción de tipos de

potenciales compuestos activos de plantas 36.

La tabla 1 muestra las pruebas fitoquímicas de identificación de metabolitos

secundarios del extracto hidroetanólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans

L., con lo que identificamos, cualitativamente, la presencia de catequinas,

cumarinas, flavonoides, polifenoles, antocianidinas, triterpenos, esteroides,

saponinas, taninos y alcaloides.

En el tamizaje fitoquímico que reportó el trabajo “Antibacterial activity of

Tabernaemontana stapfiana britten (Apocynaceae) extracts” evidenció la

presencia de alcaloides, flavonoides, cumarinas, taninos y saponinas, como

nuestro extracto, y los asoció con la actividad antimicrobiana que presentaron sus

extractos metanólicos. Estos mostraron una buena actividad contra las cepas

bacterianas utilizadas, incluyendo cepas de Staphylococcus aureus resistentes33.

Muchos de los metabolitos secundarios identificados tienen efecto

antibiótico comprobado, en el caso de la acción de los fenoles y polifenoles, se

debe, presumiblemente, a la inhibición enzimática por acción sobre los grupos

sulfihidrilos de los aminoácidos de cisteína, o por medio de reacciones más

inespecíficas con proteínas bacterianas 28.



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Los flavonoides, estas estructuras fenólicas que contienen un solo grupo

carbonilo, son sintetizados por las plantas en respuesta a la infección

antimicrobiana, y su actividad sobre las bacterias probablemente se deba a su

capacidad de generar complejos con proteínas extracelulares y proteínas solubles,

así como una actividad sobre la pared celular muy similar a la de las quinonas.

Los flavonoides lipofílicos pueden perturbar la integridad estructural de la

membrana celular 28.

Gran numero de flavononoides naturales como quercetina, kaempferol,

naringenina, rutina y glicosido de naringenina son reportados por Rochchin et al.;

(1973) como inhibidores de infecciones y antiinflamatorios 30.

Otro mecanismo propuesto por el que los flavonoides muestran actividad

antibacteriana, es que provocan la muerte bacteriana al inhibir la síntesis de ADN

o ARN debido a que tienen una estructura plana similar a la de las bases púricas y

pirimídicas, por lo tanto se pueden intercalar formando puentes de hidrógeno con

las bases de la doble hélice y de esta forma las flavonas alteran la estructura

tridimensional de los ácidos nucleícos, impidiendo su adecuada síntesis de novo,

además de provocar errores de lectura durante la transcripción 31.

Los taninos, son otro grupo de metabolitos secundarios importante. Estos

conforman un grupo de sustancias fenólicas poliméricas capaces de precipitar

gelatina en solución, una propiedad conocida como astringente. Están divididas en

dos grupos: hidrolizables y condensados. Los taninos hidrolizables están basados

en el ácido gálico, usualmente como ésteres múltiples con la D-glucosa, mientras

que los taninos condensados más importantes (a veces llamadas

proantocianidinas) son derivados de monómeros flavonoides. Se cree que la



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actividad antimicrobiana de estos compuestos se debe a su interacción sobre las

adhesinas, proteínas de la pared celular, y a su capacidad de unirse a

polisacáridos. Los taninos condensados llamados proantocianidinas son

compuestos fenólicos estables que pueden prevenir la expresión de las fimbrias P

de E. coli como parte de su actividad antibacteriana, y además tienen actividades

antioxidantes 28.

En el trabajo “Antimicrobial properties of tannins” se menciona que los

diferentes mecanismos propuestos hasta ahora para explicar la actividad

antimicrobiana de los taninos incluyen la inhibición de las enzimas microbianas

extracelulares, la privación de los sustratos necesarios para el crecimiento

microbiano o la acción directa sobre el metabolismo microbiano mediante la

inhibición de la fosforilación oxidativa, y por último se sabe de un mecanismo de

privación de hierro; pero muchos microorganismos pueden superar las defensas de

las plantas sobre la base de taninos ya a través de la síntesis de complejos tanino-

polímeros, oxidación, biodegradación de taninos o de síntesis de sideróforos 37.

Por otro lado se ha demostrado que las lactonas, cumarinas por ejemplo,

inhiben enzimas bacterianas como la DNA polimerasa y la timidilato sintetasa 31.

Los terpenos o terpenoides son activos contra bacterias, virus, hongos y

protozoarios. Se cree que esta actividad antimicrobiana se debe a una perturbación

de la estructura de la membrana celular por su naturaleza lipofílica, dejando a

merced de un choque osmótico 27.

Uno de los principales mecanismos de acción como antibiótico propuestos

para los terpenoides, consiste en la disrupción de la membrana celular bacteriana

mediante tres posibles vías: aumentando la permeabilidad de la membrana a iones



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pequeños, afectando la estabilidad estructural de la membrana y desestabilizando

el empaquetamiento de la bicapa lipídica, cualquiera de estos tres efectos produce

la muerte en la célula bacteriana 32.

En el trabajo titulado “Assessment of the medicinal potentials of the

methanol extracts of the leaves and stems of Buddleja saligna” se demostró que

los extractos de plantas eran activas contra las bacterias Gram-positivas y algunas

cepas de bacterias Gram-negativas. Esta observación apoya por tanto el hecho de

que, en general, las bacterias Gram-negativas son más resistentes que las bacterias

Gram-positivas 34.

Podríamos considerar el hecho de que las bacterias gram-negativas

presentan mayor sensibilidad, puesto que su pared celular es menos compleja por

tener una capa simple (red de mureína delgada), mientras que en las bacterias

gram-positivas, poseen una estructura de multicapa (red de mureína muy

desarrollada y llega a tener hasta 40 capas). Un ejemplo lo presenta el aceite

esencial de Melaleuca alternifolia (Tea tree) que se ha encontrado causa la

filtración de iones K+ en la membrana de la Escherichia coli con lo cual estimula

su autolisis 32.

En el trabajo “Assessment of phytochemical content, polyphenolic

composition, antioxidant and antibacterial activities of Leguminosae medicinal

plants in Peninsular Malaysia”, se evidenció que todos los extractos probados, no

eran activos contra bacterias Gram-negativas. Explica que esto podría ser debido a

la presencia de la membrana externa que poseen y que actúa como una barrera de

permeabilidad. La presencia de canales porina en la membrana externa de

bacterias Gram-negativas también restringiría la difusión de muchos antibióticos y



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las bombas de eflujo en la transmembrana bombean los agentes antibacterianos a

través de los procesos de eflujo activos y por lo tanto, daría lugar a una mayor

resistencia intrínseca en caso de bacterias gram-negativas 36.

Demostró además que los agentes antibacterianos son principalmente de

naturaleza hidrófila. Además de constatar que la fracción de alcaloides exhiben

actividad antibacteriana bastante fuerte 36.

Asimismo existen otros factores que influyen sobre los resultados, tales

como: el volumen y tipo de medio de cultivo, la concentración y edad del inóculo,

las condiciones de incubación, etc. 32.

La tabla 2 muestra el efecto antibiótico in vitro del extracto hidroetanólico

de las inflorescencias de Bejaria aestuans L., en el que se comprueba el efecto

antibacteriano en cepas de Staphylococcus aureus, posiblemente por alguno de los

mecanismos antes mencionados de alguno o varios metabolitos secundarios que

posee el extracto hidroetanólico de Bejaria aestuans L.

Según el trabajo titulado “Antibacterial and phytochemical screening of

Anethum graveolens, Foeniculum vulgare and Trachyspermum ammi” las

bacterias con una zona clara de inhibición de más de 12 mm se consideran

sensibles 35. Nuestro extracto, mostró un diámetro de halo de inhibición, en

promedio, que fue desde 14.3 mm, en su concentración más baja de 25 mg/mL,

hasta 18 mm, en su concentración más alta de 200 mg/mL, frente a S. aureus, lo

que la hace considerarse sensible.



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Se encontró que el extracto hidroetanolico no posee efecto antibacteriano

frente a Escherichia coli, pudiendo ser por poseer una membrana más compleja, lo

que le confiere mayor grado de resistencia a los agentes antimicrobianos 31, y/o

por la razones mencionadas anteriormente. Para Candida albicans tampoco se

observó efecto antimicótico del extracto.

El uso tradicional que se le da a esta especie, es como tratamiento de

infecciones urinarias, y es sabido que las infecciones urinarias generalmente son

causadas por bacterias gram-negativas, como Escherichia coli. Puede que el

efecto antibacteriano in vivo se dé, ya que como se mostró, el extracto de Bejaria

aestuans L. posee fitoconstituyentes como taninos, los que previenen la expresión

de las fimbrias P de E. coli, lo que puede hacer que mejore el cuadro de infección,

así como otros metabolitos, como flavonoides, saponinas, alcaloides, terpenoides

y polifenoles en general, que a mayores concentraciones, por los mecanismos

mencionados, posiblemente, manifieste actividad antibacteriana.



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V. CONCLUSIONES

1. El extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L.

“Purum rosa”, presenta los siguientes metabolitos secundarios, catequinas,

cumarinas, polifenoles, flavonoides, saponinas, antocianinas, triterpenos,

esteroides, taninos y alcaloides.


“Purum rosa”, a concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL y 200

mg/mL, posee efecto antibacteriano in vitro frente a Staphylococcus aureus.


“Purum rosa” a concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL y 200

mg/mL, no posee efecto antibacteriano in vitro frente a Escherichia coli.


“Purum rosa” a concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL y 200

mg/mL, no posee efecto antimicótico in vitro frente a Candida albicans.



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VI. RECOMENDACIONES

1. Se recomienda aislar los diferentes metabolitos secundarios encontrados y

comprobar cuál es el metabolito responsable de la acción antibacteriana

que se ha podido comprobar.

2. Se recomienda cuantificar los metabolitos secundarios identificados para

tener un adecuado estudio de la especie.



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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

ANEXO 1

EJEMPLAR DE LA ESPECIE Bejaria aestuans L. “purum rosa”

IDENTIFICADA EN EL HERBARIUM TRUXILLENSIS DE LA UNT



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ANEXO 2

Identificación taxonómica de Bejaria aestuans L. “purum rosa”

CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA

(HUT – Nº 52835)

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Ericales

Familia Ericaceae

Género Bejaria

Especie Bejaria aestuans L.



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ANEXO 3

Medidas de los diámetros de los halos de inhibicion del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria aestuans L. frente

a Staphylococcus aureus

Concentraciones

(mg/mL)

Diámetro del halo de inhibición (mm) PROMEDIO D.E. C.V.

I II III IV

25 14 13 15 15 14.25 0.9574 6.7188

50 14 14 15 15 14.5 0.5774 3.9817

100 15 15 17 15 15.5 1.0000 6.4516

200 17 17 19 19 18 1.1547 6.4150



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li

ANEXO 4

Gráfico 1

Efecto in vitro del extracto hidroalcohólico de las inflorescencias de Bejaria

aestuans L. “Purum rosa” frente a Staphylococcus aureus



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ANEXO 5

ENSAYO MICROBIOLOGICO in vitro

Escherichia coli (efecto antibacteriano in vitro negativo)



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liii

Staphylococcus aureus (efecto antibacteriano in vitro positivo)



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liv

Candida albicans (efecto antibacteriano in vitro negativo)



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