BiosensorUn biosensor es un dispositivo para la detección de un analito que combina una biológicacomponente con un componente detector fisicoquímica.Se compone de 3 partes:°el elemento sensible biológica (material biológico (por ejemplo, tejido, microorganismos,orgánulos, receptores celulares, enzimas, anticuerpos, etc ácidos nucleicos), un biológicamentematerial derivado o biomimic) Los elementos sensibles pueden ser creados por biológicaingeniería.°el transductor en el medio (asociados ambos componentes)°el elemento detector (trabaja de una manera fisicoquímicos; óptico, piezoeléctricoelectroquímica, termométrico, o magnético.)El ejemplo más común de un biosensor comercial es el biosensor de glucosa en sangre,que utiliza una enzima para romper la glucosa sanguínea. Al hacerlo, se transfiere un electrón aun electrodo y esta se convierte en una medida de la concentración de glucosa en sangre. Laalta demanda del mercado para este tipo de sensores ha impulsado el desarrollo de sensor asociadotecnologías.Recientemente, las matrices de muchas moléculas de detección se han aplicado diferentes en los llamadosdispositivos electrónicos nariz, donde se usa el patrón de respuesta de los detectores ahuella digital de una sustancia.Un canario en una jaula, como el usado por los mineros para advertir de gas podría ser considerado como un biosensor.Muchas de las aplicaciones de biosensores actuales son similares, en que utilizan organismos queresponder a sustancias tóxicas en un nivel mucho más bajo que nosotros para avisarnos de su presencia.Tales dispositivos se pueden utilizar tanto en el control ambiental y en el tratamiento de aguas

instalaciones.Principios de DetecciónBiosensores piezoeléctricos y biosensores ópticos basados en el fenómeno de superficieresonancia de plasmón son ambas técnicas onda evanescente. Esta utiliza una propiedad que se muestrade oro y otros materiales; específicamente que una fina capa de oro en una refracción altoÍndice superficie de cristal puede absorber la luz láser, que produce ondas de electrones (plasmones superficiales)sobre la superficie de oro. Esto se produce sólo en un ángulo específico y longitud de onda de la luz incidentey es altamente dependiente de la superficie del oro, de tal manera que la unión de un analito objetivo aun receptor en la superficie de oro produce una señal medible.Otros biosensores ópticos se basan principalmente en los cambios en la absorbancia o fluorescencia de unacompuesto indicador apropiado.Los sensores piezoeléctricos utilizar cristales que se someten a una transformación de fase cuando unacorriente eléctrica se aplica a ellos. Una corriente alterna (AC) produce una situación

Page 2onda en el cristal a una frecuencia característica. Esta frecuencia es altamente dependientelas propiedades de la superficie del cristal, de tal manera que si un cristal está recubierto con una biológicaelemento de reconocimiento de la unión de un analito diana (grande) a un receptor producirá unacambio en la frecuencia de resonancia, lo que da una señal de unión.Biosensores electroquímicos se basan normalmente en la catálisis enzimática de una reacción queproduce iones. El sustrato sensor contiene tres electrodos, un electrodo de referencia, unelectrodo activo y un electrodo sumidero. Un electrodo contador también puede estar presente como un ionfuente. El analito se ve involucrado en la reacción que tiene lugar en la activasuperficie del electrodo, y los iones producidos crear un potencial que es restada de quedel electrodo de referencia para dar una señal.

Biosensores basados termométricas y magnéticos son raros.AplicacionesHay muchas aplicaciones potenciales de los biosensores de varios tipos. El principalrequisitos para un enfoque biosensor para ser valiosa en términos de investigación yaplicaciones comerciales son la identificación de una molécula diana, la disponibilidad de unelemento de reconocimiento biológico adecuado, y el potencial para desechable portablesistemas de detección que se prefiere sensibles basados en técnicas de laboratorio en algunossituaciones. Algunos ejemplos se dan a continuación:°Monitoreo de glucosa en pacientes con diabetes <- motor del mercado histórico°Otras metas de salud relacionados con la medicina°Aplicaciones medioambientales, por ejemplo, la detección de pesticidas y agua de ríocontaminantes°Teledetección de bacterias en el aire, por ejemplo, en la lucha contra el bioterrorismo actividades°La detección de patógenos°La determinación de niveles de sustancias tóxicas antes y después de biorremediación°Detección y determinación de organophospate¿Cuáles son los biosensores?Un biosensor es un dispositivo analítico que convierte una respuesta biológica en una señal eléctricaseñal (Figura 6.1). "Biosensor" El término se utiliza a menudo para cubrir los dispositivos de sensores utilizados ena fin de determinar la concentración de sustancias y otros parámetros de biológicointerés incluso cuando no utilizan un sistema biológico directamente. Esta muy amplio

definición es utilizada por algunas revistas científicas (por ejemplo, biosensores Elsevier Applied Science)pero no se aplica a la cobertura aquí. El énfasis de este Capítulo se refieraenzimas como el material biológicamente sensible, pero hay que reconocer que otrossistemas biológicos pueden ser utilizados por los biosensores, por ejemplo, el metabolismo celular completo,la unión del ligando y la reacción antígeno-anticuerpo. Los biosensores representan un rápidoampliando el campo, en la actualidad, con una tasa estimada de crecimiento de 60% anual, el mayor

Página 3impulso proveniente de la industria de la salud (por ejemplo, 6% del mundo occidental es diabéticoy se beneficiarían de la disponibilidad de un biosensor rápido, exacto y sencillo paraglucosa), pero con un poco de presión en otras áreas, tales como la evaluación de calidad de los alimentos ymonitoreo ambiental. El mercado mundial analítico estimado es de unos£ 12 mil millones años-1de los cuales el 30% se encuentra en el área de cuidados de la salud. Existe claramente una granla expansión del mercado potencial como menos de 0,1% de este mercado está actualmente utilizando biosensores.La investigación y el desarrollo en este campo es amplia y multidisciplinar, que abarcabioquímica, ciencia biorreactor, química física, electroquímica, electrónica yingeniería de software. La mayor parte de esta corriente potenciométrica esfuerzo y preocupacionesbiosensores amperométricos y tiras colorimétricas enzimáticas de papel. Sin embargo, todos los principalestipos de transductores son susceptibles de ser examinado a fondo, para su uso en biosensores, en los próximospocos años.Un biosensor exitoso debe poseer al menos algunas de las características siguientes beneficios:1. El biocatalizador debe ser muy específico para el propósito de los análisis, ser estables

bajo condiciones normales de almacenamiento y, salvo en el caso de la enzima colorimétricatiras y varillas de inmersión (véase más adelante), muestran una buena estabilidad durante un gran número de ensayos(Es decir, mucho mayor que 100).2. La reacción debe ser tan independiente de parámetros físicos tales como agitación, pHy la temperatura, es manejable. Esto permitiría el análisis de muestras conmínimo pre-tratamiento. Si la reacción involucra cofactores o coenzimas estosdebe, preferiblemente, también será co-inmovilizada con la enzima (véase el capítulo 8).3. La respuesta debe ser exacta, precisa, reproducible y lineal en el útilrango analítico, sin dilución o concentración. También debe estar libre deruido eléctrico.4. Si el biosensor se va a utilizar para la monitorización invasiva en situaciones clínicas, lasonda debe ser pequeña y biocompatible, que no tiene efectos tóxicos o antigénico. Si se tratapara ser utilizado en fermentadores debe ser esterilizable. Esto se realiza preferiblemente portratamiento en autoclave pero sin enzimas biosensor puede soportar actualmente tan drástica en húmedotratamiento térmico. En cualquier caso, el biosensor no deben ser propensos a la suciedad oproteolisis.5. El biosensor completo debe ser barato, pequeño, portátil y capaz de serutilizado por los operadores semicalificados.6. Debe haber un mercado para el biosensor. Hay un propósito claramente pocoel desarrollo de un biosensor si otros factores (por ejemplo, subsidios gubernamentales, la continuaempleo de analistas especializados, o la percepción de los clientes pobres) fomentar el usode los métodos tradicionales y desalentar la descentralización de las pruebas de laboratorio.La respuesta biológica del biosensor está determinada por la membrana biocatalíticaque realiza la conversión de reactante a producto. Enzimas inmovilizadas poseeruna serie de características ventajosas que los hace particularmente aplicable para su uso entales sistemas. Se puede volver a utilizarse, lo que asegura que la actividad catalítica es igual

para presentar una serie de análisis. Este es un factor importante en la obtención reproducibleresultados y evita los problemas asociados con la pipeta réplica de la enzima libre

Page 4de otro modo necesario en protocolos de análisis. Muchas enzimas son intrínsecamente estabilizados porel proceso de inmovilización (ver capítulo 3), sino que incluso esto no ocurra hayaparente estabilización generalmente considerable. Es normal usar un exceso de la enzimadentro del sistema de sensor inmovilizado. Esto da una redundancia catalítica (es decir, h << 1)que es suficiente para garantizar un aumento de la estabilización aparente del inmovilizadoenzima (véase, por ejemplo, las figuras 3,11, 3,19 y 5,8). Aun cuando existe ciertala inactivación de la enzima inmovilizada en un período de tiempo, esta inactivación es generalmenteestable y predecible. Cualquier decaimiento actividad se incorpora fácilmente en una analíticaesquema de interpolación con regularidad las normas entre los análisis de muestras desconocidas.Por estas razones, muchos de estos sistemas de enzimas inmovilizadas son reutilizables hasta 10.000veces durante un período de varios meses. Claramente, esto resulta en un ahorro considerable entérminos de coste relativo de las enzimas en el uso de análisis de enzimas libres solubles.Cuando la reacción, que se producen en la membrana enzima inmovilizada de un biosensor, eslimitado por la velocidad de difusión externa, el proceso de reacción poseerá un número devaliosos activos analíticos. En particular, se obedecen a la relación mostrada en la ecuación3.27. De ello se deduce que el biocatalizador da un cambio proporcional en la velocidad de reacción enrespuesta a la sustancia reaccionante (sustrato) en un rango de concentración lineal sustancial, variosveces la K intrínsecam(Véase la figura 3.12 e línea). Esto es muy útil como analito

concentraciones son con frecuencia aproximadamente igual a la Kms de sus enzimas apropiadasque es aproximadamente 10 veces más concentrada que puede ser determinado normalmente, sindilución, por el uso de la enzima libre en solución. También después de la ecuación 3.27 es laindependencia de la velocidad de reacción con respecto al pH, fuerza iónica, temperatura yinhibidores. Esto simplemente evita los problemas difíciles a menudo se encuentran debido a la variabilidadreales de muestras de análisis (por ejemplo, caldo de fermentación, sangre y orina) y externocondiciones. Control de la respuesta biosensor por la difusión externa del analito puede seralentado por el uso de membranas permeables entre la enzima y el mayorsolución. El espesor de estos se puede variar con efectos asociados en laconstante de proporcionalidad entre la concentración de sustrato y la velocidad de reacción (es deciraumento de grosor de la membrana aumenta la capa no agitada (d) que, a su vez, disminuyela constante de proporcionalidad, kL, En la ecuación 3,27). Incluso si la total dependencia de latasa difusional externa no se alcanza (o alcanzable), cualquier aumento en la dependenciade la velocidad de reacción en la difusión externa o interna causará una reducción en ladependencia del pH, la fuerza iónica, la temperatura y las concentraciones de inhibidor.Figura 6,1. Diagrama esquemático que muestra los componentes principales de un biosensor. Labiocatalizador (a) convierte el sustrato en producto. Esta reacción está determinada por el

Page 5transductor (b) que la convierte en una señal eléctrica. La salida del transductor esamplificada (c), procesada (d) y se muestra (e).La parte clave de un biosensor es el transductor (que se muestra como el 'cuadro negro' en la Figura 6.1)

que hace uso de un cambio físico que acompaña a la reacción. Esto puede ser1. la salida de calor (o absorbido) por la reacción (biosensores calorimétricos),2. cambios en la distribución de cargas que causan un potencial eléctrico al serproducida (biosensores potenciométricos),3. movimiento de los electrones producidos en una reacción redox (biosensores amperométricos),4. salida de luz durante la reacción o una diferencia entre la absorbancia de luzreactivos y productos (biosensores ópticos), o5. los efectos debidos a la masa de los reactantes o productos (piezo-eléctricos biosensores).Hay tres llamadas "generaciones" de los biosensores, los biosensores de primera generación enel producto normal de la reacción se difunde hacia el transductor y hace que la eléctricarespuesta, la segunda generación de biosensores específicos que implican «mediadores» entre lareacción y el transductor con el fin de generar una respuesta mejorada, y la tercera generaciónbiosensores donde la reacción misma provoca la respuesta y ningún producto o mediadordifusión está directamente involucrado.La señal eléctrica desde el transductor a menudo es baja y superpuestas a una relativamentealta y ruidosos (es decir, que contiene un componente de señal de alta frecuencia de una aparentementenaturaleza aleatoria, debido a las interferencias eléctricas o generado dentro de la electrónicacomponentes del transductor) de referencia. El procesamiento de señal normalmente implicarestando una "referencia" de la señal de referencia, derivada de un transductor similar sinbiocatalítica membrana, a partir de la señal de la muestra, la amplificación de la señal de diferencia resultantey electrónicamente filtrado (suavizado), el ruido de la señal no deseada. La relativamentenaturaleza lenta de la respuesta biosensor facilita considerablemente el problema de ruido eléctricofiltración. La señal analógica producida en esta etapa puede ser la salida directa, pero es generalmenteconvertida en una señal digital y se pasa a una etapa microprocesador donde los datos son

procesada, convertida a unidades de concentración y de salida a un dispositivo de visualización o almacén de datos.Biosensores potenciométricos

Página 6Biosensores potenciométricos hacer uso de electrodos selectivos de iones para transducir lareacción biológica en una señal eléctrica. En términos simples esto consiste en unaenzima inmovilizada membrana que rodea la sonda de un pH-metro (Figura 6.3),donde la reacción catalizada genera o absorbe iones de hidrógeno (Tabla 6.2). La reaccióncontiguo a la membrana delgada de vidrio de detección causa un cambio en el pH que puede serleer directamente desde la pantalla del pH-metro de. Típica de la utilización de dichos electrodos es que elpotencial eléctrico se determina en una impedancia muy alta que permite efectivamente ceroel flujo de corriente y sin causar interferencia con la reacción.

Page 7Figura 6.3. Un biosensor potenciométrico simple. Una membrana semi-permeable (a)rodea el biocatalizador (b) atrapado al lado de la membrana de vidrio activo (c) de un pHsonda (d). El potencial eléctrico (E) se genera entre el interior de Ag / AgClelectrodo (f) bañado en HCl diluido (g) y un electrodo de referencia externo (h).Hay tres tipos de electrodos selectivos de iones que son de uso en biosensores:1. Los electrodos de vidrio para cationes (por ejemplo, electrodos de pH normales) en el que la detecciónelemento es una membrana muy fina hidratada cristal que genera una transversalpotencial eléctrico debido a la concentración dependiente de la competencia entre lostudes de sitios de unión específicos. La selectividad de esta membrana se determinapor la composición del vidrio. La sensibilidad a H+es mayor quealcanzable para NH4+,

2. Los electrodos de vidrio de pH recubierto con una membrana permeable a los gases selectivo para CO2,NH3o H2S. La difusión del gas a través de esta membrana produce un cambio enpH de una solución de detección entre la membrana y el electrodo que es luegodeterminado.3. De estado sólido electrodos donde se sustituye la membrana de vidrio por una membrana delgadade un conductor de iones específico a partir de una mezcla de sulfuro de plata y una de platahaluro. El electrodo de yoduro es útil para la determinación de I-en la peroxidasareacción (Tabla 6.2c) y responde también a los iones cianuro.Tabla 6.2. Las reacciones que implican la liberación o absorción de iones que pueden ser utilizados por losbiosensores potenciométricos.(A) H+cación,glucosa oxidasaH2OD-glucosa + O2D-glucono-1 ,5-lactona + H2O2D-gluconato + H+[6,3]penicilinasapenicilinapeniciloico ácido H +

+[6,4]ureasa (pH 6,0)unH2NCONH2+ H2O + 2H+2NH4++ CO2[6,5]ureasa (pH 9,5)bH2NCONH2+ 2H2O2NH3+ HCO3-+ H+[6,6]lipasalípidos neutros + H2Oglicerol + ácidos grasos + H+

[6,7](B) NH4+cación,

Page 8L-amino ácido oxidasaL-aminoácido + O2+ H2Oceto ácido + NH4++ H2O2[6,8]asparaginasa `L-asparagina + H2OL-aspartato + NH4+[6,9]ureasa (pH 7,5)H2NCONH2+ 2H2O + H+2NH4+

+ HCO3-[6.10](C) I-anión,peroxidasaH2O2+ 2H++ 2I-Yo2+ 2H2O [6,11](D) CN-anión,b-glucosidasaamigdalina + 2H2O2glucose + H + benzaldehído++ CN-[6.12]unTambién se puede utilizar en NH4+y CO2(Gas) biosensores potenciométricos.b

También se puede utilizar en un NH3(Gas) biosensor potenciométrico.La respuesta de un electrodo selectivo de iones está dada por(6.5)donde E es el potencial medido (en voltios), E0es una constante característica del ion-selectivo / externo sistema de electrodos, R es la constante de los gases, T es la temperatura absoluta(K), z es la carga iónica firmado, F es el Faraday, y [i] es la concentración de la libreno complejadas especies iónicas (estrictamente, [i] debe ser la actividad del ion pero alLas concentraciones que se encuentran normalmente en biosensores, esto es efectivamente igual a laconcentración). Esto significa, por ejemplo, que hay un aumento en la electricidadpotencial de 59 mV por cada aumento de diez años en la concentración de H+a 25 º C. Ladependencia logarítmica de la potencial de la concentración iónica es responsable tantola amplia gama de análisis y la baja precisión y precisión de estos sensores. Surango normal de detección es 10-4- 10-2M, aunque una minoría son diez veces mássensible. Tiempo de respuesta típico es entre uno y cinco minutos, permitiendo hasta 30analiza cada hora.Los biosensores que implican H+liberación o utilización requieren el uso de muy débilmentesoluciones tamponadas (es decir, <5 mM) si un cambio significativo en el potencial se ha de determinar.La relación entre el cambio de pH y la concentración de sustrato es complejo, incluyendootros tales efectos no lineales como la variación de actividad de pH y tamponamiento proteína. Sin embargo,

condiciones a menudo se pueden encontrar en donde existe una relación lineal entre la aparentecambio en el pH y la concentración de sustrato. Un desarrollo reciente de ion selectivo

Página 9electrodos es la producción de iones selectivos transistores de efecto de campo (ISFET s) y sususo como biosensor ligados a enzimas transistores de efecto de campo (ENFET s, Figura 6.4). EnzimaLas membranas se recubren sobre las puertas selectivos de iones de estos dispositivos electrónicos, el biosensorresponder al cambio de potencial eléctrico a través de la corriente de salida. Por lo tanto, estos sondispositivos potenciométricos aunque producen directamente los cambios en la corriente eléctrica. Laprincipal ventaja de estos dispositivos es su tamaño extremadamente pequeño (0,1 mm <<2) Que permitebarato producido en masa utilizando la tecnología de fabricación de circuitos integrados. Como ejemplo, unaurea sensible al FET (ENFET que contiene ureasa unida con un electrodo de referenciaque contiene glicina unido) se ha demostrado que sólo muestran una variación de 15% en respuesta aurea (0,05 - 10,0 mg ml-1) Durante su tiempo de vida activa de un mes. Varios analitos puede serdeterminado por biosensores miniaturizados que contienen matrices de ISFETs y ENFETs. Lasensibilidad de los FETs, sin embargo, puede ser afectada por la composición, fuerza iónica yconcentraciones de las soluciones analizadas.Figura 6,4. Diagrama esquemático de la sección a lo ancho de una ENFET. La realdimensiones de la zona activa es de aproximadamente 500 mm de largo por 50 mm de ancho por 300 mm de espesor.El cuerpo principal del biosensor es un chip de silicio de tipo p con dos áreas de silicio de tipo n; la

negativo de la fuente y el drenaje positivo. El chip está aislada mediante una capa delgada (0,1 mmde espesor) de sílice (SiO2) Que forma la puerta del FET. Por encima de esta puerta es una delgada igualmentecapa de H+Material sensible (por ejemplo, óxido de tántalo), una membrana selectiva de iones de protección,el biocatalizador y la solución de analito, que está separada de las partes sensibles de laFET por un material inerte de encapsulación de poliimida fotopolímero. Cuando se aplica un potencialentre los electrodos, una corriente fluye a través del FET dependiente en lo positivopotencial detectado en la puerta selectiva de iones y su consecuente atracción de electrones enla capa de agotamiento. Esta corriente (I) se compara con el de una similar, pero noISFET catalítica inmerso en la misma solución. (Tenga en cuenta que la corriente eléctrica es, porconvención, en la dirección opuesta al flujo de electrones)