BIOTECN

OLO

GIA

BIOTEC

NO

LOG

IA

CONOCIMIENTO CONOCIMIENTO CIENTIFICOCIENTIFICO

Bioquímica

Ingeniería Bioquímica

Microbiología

Biología Molecular

Biología Celular

Computación

Genética

Inmunología

Fisiología

HERRAMIENTAS BIOTECNOLOGICASHERRAMIENTAS BIOTECNOLOGICAS

Biosensores

Antisentido

Bioprocesos

Ingeniería de proteínas

Anticuerpos monoclonales

Cultivo de células y tejidos

Ingeniería genética

MEDICINAMEDICINA

AMBIENTALAMBIENTAL

AGROPECUARIOAGROPECUARIORendimiento de cosechas

Salud animal

Calidad de alimentos

DiagnósticoVacunas

Terapéutica

BiorremediaciónMonitoreo ambientalControl de la

polución

APLICACIONES UTILESAPLICACIONES UTILES

Nos encontramos frente a una nueva “Revolución Industrial” llamada Biotecnología, no basada en hierro y acero sino en microbios que, en manos de científicos, se convierten en minúsculas fábricas para producir fármacos, compuestos químicos industriales, combustibles o alimentos.

El prefijo “BIO” se refiere a bacterias, levaduras y otras células vivas, así como a componentes de estas células.

La “TECNOLOGIA” consiste en relucientes depósitos de acero, llenos de microbios, conectados a sus fuentes de alimentación y oxígeno mediante una intrincada red de válvulas que se cierran y abren según los ritmos que marca una computadora.

DEFINICION

Según la Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos:

Es la aplicación de los principios científicos y de la ingeniería al procesamiento de materiales por agentes biológicos para proveer bienes y servicios.

PRINCIPIOS CIENTIFICOS Y DE LA INGENIERIA:

Conjunto muy amplio de disciplinas que ponen especial énfasis en la Microbiología, Bioquímica, Biología Molecular, Genética, Inmunología e Ingeniería Bioquímica y Química.

MATERIALES:

Incluye a aquellos orgánicos e inorgánicos, en tanto los agentes biológicos son, en general, catalizadores biológicos; en particular, microorganismos, células animales, células vegetales, virus y enzimas.

BIENES:

Todos los productos (alimentos, productos farmacéuticos, recuperación de metales, etc.)

SERVICIOS:

Lo relacionado específicamente con las prestaciones tales como purificación de agua o tratamiento de efluentes y extracción de derrames de petróleo.

AREAS TEMATICAS PRIORITARIAS

SALUD:

Vacunas (desarrollo de vacunas por procedimientos que utilicen ingeniería genética).

Reactivos de diagnóstico: Desarrollo de reactivos por técnicas inmunológicas (enzimo-inmunoensayos o por ingeniería genética).

AREA AGRICOLA:

Diagnóstico de fitopatógenos en plantas de interés económico.

Desarrollo de agentes de control biológico y plantas.

Desarrollo de plantas transgénicas

Métodos de mejoramiento de especies a través de técnicas no convencionales.

Aceleración en la obtención de híbridos.

Utilización de marcadores moleculares.

Identificación y caracterización de genes de interés.

AREA PECUARIA:

SANIDAD ANIMAL:

Desarrollo de métodos para el diagnóstico de enfermedades animales.

Producción de nuevas vacunas virales, bacterianas y parasitarias por técnicas de avanzada.

PRODUCCION ANIMAL:

Manipulación y sexado de embriones.

Hormonas para el mejoramiento de la producción animal.

PRODUCCION DE INSUMOS INDUSTRIALES:

Mejoramiento y control de calidad de las industrias de alimentos, incluyendo derivados lácteos, vinos y cervezas.

Tratamiento biológico de efluentes.

Entrando ya en Entrando ya en tema…tema…

El desarrollo de un proceso de producción a gran escala, en forma exitosa, es el resultado de acelerar e intensificar un concepto original, generalmente un procedimiento de laboratorio o a pequeña escala.

La actividad de desarrollo se concentra en tres áreas principales:

•Desarrollo de los organismos.

•Desarrollo del medio de cultivo.

•Ingeniería de fermentación.

EL FERMENTADOREL FERMENTADOR

DEFINICION OPERATIVA:

•Contenedor en el que se Contenedor en el que se mantiene un medio ambiente mantiene un medio ambiente favorable para la operación de favorable para la operación de un proceso biológico deseado.un proceso biológico deseado.

En cuanto al biorreactor:En cuanto al biorreactor:

Para cada proceso biotecnológico, el sistema de contención más apropiado debe diseñarse para brindar el mejor medio ambiente, optimizado para el crecimiento celular y actividad metabólica.

Equipos accesorios.

•Válvulas de seguridad

•Manómetros

•Válvulas de control

•Tuberías

•Control de temperatura

•Control de pH

•Control de espumas

•Puntos de muestreo

El medio ambiente puede considerarse en tres aspectos:

•BIOLOGICO

•QUIMICO

•FISICO

Fermentación Fermentación

Para el cultivo de Para el cultivo de microorganismos en condiciones microorganismos en condiciones óptimas, así como para la óptimas, así como para la producción por producción por microorganismos de los microorganismos de los metabolitos o las enzimas metabolitos o las enzimas deseados deben ser deseados deben ser desarrollados procedimientos de desarrollados procedimientos de fermentaciónfermentación

Tipos de fermentadoresTipos de fermentadores

Air lift: al medio del cultivo se le inyecta aire para ser agitado, el cual también sirve como fuente de oxigeno para el crecimiento microbiano.

Tanque agitado: el medio de cultivo es movido interior por medios mecánicos.

Columna de aire

La agitación es necesaria para:

1- incrementar la velocidad de transferencia de oxígeno desde las burbujas de aire al medio líquido; los microorganismos no pueden utilizar oxígeno gaseoso, sino solamente el que se encuentra en disolución.

.Sistemas de aireación y agitación

2- aumentar la velocidad de transferencia de oxígeno y nutrientes desde el medio a las células. Debido al movimiento se evita que las células creen áreas estancadas con bajos niveles de oxígeno y nutrientes.

3- impedir la formación de agregados celulares.

4- aumentar la velocidad de transferencia de productos metabólicos de las células al medio.

5- aumentar la tasa o la eficiencia de la transferencia de calor entre el medio y las superficies de refrigeración del fermentador.

Tipos de agitadores.

Tipos de fermentación:

•Crecimiento en suspensión: los organismos están sumergidos y dispersados en el medio nutritivo y su movimiento sigue al medio

•Crecimiento con soporte: los organismos crecen como una mono capa o película sobre una superficie en contacto con un medio nutritivo.

TECNOLOGIA DE TECNOLOGIA DE BIOPROCESOS - BIOPROCESOS - FERMENTACIONFERMENTACION

Las etapas en la manufactura de productos en la tecnología de bioprocesos son, esencialmente, similares independientemente del organismo utilizado, del medio elegido y del producto buscado.

En todos los ejemplos, se cultiva gran número de células en condiciones controladas.

Los organismos deben cultivarse y “motivarse” para formar el producto deseado, mediante un sistema de contención técnica y física (el biorreactor) y un medio correcto en su composición y parámetros reguladores del crecimiento, tales como temperatura y aireación.

PRINCIPIOS DE PRINCIPIOS DE CRECIMIENTO CRECIMIENTO MICROBIANOMICROBIANO

El crecimiento de microorganismos puede verse como el incremento en el material celular, expresado en términos de masa o número de células.

El incremento en biomasa puede determinarse gravimétricamente o numéricamente para sistemas unicelulares.

Tiempo de duplicación:Tiempo de duplicación:

Se refiere al tiempo requerido para duplicar el peso de la biomasa.

Tiempo de generación:Tiempo de generación:

Se refiere al tiempo necesario para duplicar el número de células.

En un proceso biotecnológico, existen tres formas de hacer crecer a los microorganismos en un biorreactor:

-Por lotes o discontinua (batch)

-Semi-continuo (fed-bach)

-Continuo

Modos de operación de los fermentadores:

•Operación por lotes: Operación por lotes: puede puede ser considerada como un ser considerada como un sistema cerrado. A tiempo sistema cerrado. A tiempo cero, la solución esterilizada cero, la solución esterilizada de nutrientes se inocula con de nutrientes se inocula con microorganismos microorganismos y y permite permite que se lleve acabo la que se lleve acabo la incubación en condiciones incubación en condiciones optimas de fermentación.optimas de fermentación.

La composición del medio de cultivo, la concentración de biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente en forma continua como resultado del metabolismo de las células

La naturaleza compleja del crecimiento de microorganismos por lotes, se muestra tal como sigue:

La fase 1 o “lag”, es un tiempo de aparente no crecimiento, pero estudios bioquímicos demuestran actividad metabólica, indicando que las células están en proceso de adaptación a las condiciones ambientales y que un nuevo crecimiento comenzará, eventualmente.

Existe, luego, una fase de aceleración transitoria cuando el inóculo comienza a crecer que es seguida, rápidamente, por una fase de crecimiento exponencial.

En la fase exponencial, el crecimiento microbiano ocurre a la máxima velocidad posible para ese microorganismo, con nutrientes en exceso, parámetros de crecimiento ideales y ausencia de inhibidores.

Sin embargo, en cultivos por lote, el crecimiento exponencial es de duración limitada y, a medida que las condiciones nutricionales cambian, la velocidad de crecimiento disminuye y se entra en la fase de deceleración, seguida de la fase estacionaria, donde el crecimiento global no se obtiene, por falta de nutrientes.

La fase final del ciclo es la fase de muerte, cuando la velocidad de crecimiento ha cesado.

La mayoría de los procesos biotecnológicos por lotes se detiene antes de esta fase, debido a la disminución en el metabolismo y a la lisis celular.

Algunos medios para prolongar la vida de un cultivo por lotes:

-Adición gradual de componentes nutritivos concentrados (carbohidratos), aumentando el volumen del cultivo (utilizado para producción industrial de levadura).

-Adición de medio al cultivo (perfusión) y extracción de un volumen igual de medio usado, libre de células (utilizado para cultivos de células animales).

Ventajas de un Ventajas de un proceso por lotes:proceso por lotes:

Las principales son: menor riesgo de contaminación, flexibilidad operacional cuando los fermentadores se utilizan para distintos productos, un control más cercano de la estabilidad genética del organismo, una mejor coordinación con estadios del proceso entre lotes previos y posteriores.

Desventajas del Desventajas del proceso por lotes:proceso por lotes:

La principal es la alta proporción de tiempo improductivo en la operación del fermentador, dificultad de diseño y la operación de procesos que no están en estado estacionario y la variabilidad entre lotes.

•Los fermentadores deben ser vaciados, limpiados, esterilizados y recargados antes de cada fermentación, operaciones todas esenciales pero no productivas.

•En procesos por lotes, estas operaciones pueden tomar tanto tiempo como la fermentación misma.

•En un proceso continuo, por el contrario, una corrida puede durar semanas o meses, es decir que el tiempo no productivo es, en proporción, pequeño.

•Fermentación alimentada Fermentación alimentada (fed-batch): (fed-batch): en los procesos en los procesos alimentados los sustratos se alimentados los sustratos se añaden escalonadamente a añaden escalonadamente a medida que progresa la medida que progresa la fermentaciónfermentación

• Fermentación continua:Fermentación continua: se establece un sistema abierto. La solución nutritiva se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultáneamente del sistema.

• Biorreactor mezclado Biorreactor mezclado homogéneamente: homogéneamente: Este se Este se utiliza como un quimiostato o utiliza como un quimiostato o como un turbidostato. En el como un turbidostato. En el quimiostato en edo. De quimiostato en edo. De equilibrio, el crecimiento de las equilibrio, el crecimiento de las células se controla ajustando la células se controla ajustando la concentración de un sustrato. concentración de un sustrato. Cualquier sustrato que se Cualquier sustrato que se requiera (CHO, N2, sales, O2) requiera (CHO, N2, sales, O2) puede ser utilizado como puede ser utilizado como sustrato limitante.sustrato limitante.

En el turbidostato el crecimiento En el turbidostato el crecimiento de las células se mantiene de las células se mantiene constante utilizando la turbidez constante utilizando la turbidez para controlar la concentración de para controlar la concentración de biomasa y la velocidad de biomasa y la velocidad de alimentación de la solución de alimentación de la solución de nutrientes se ajusta de forma nutrientes se ajusta de forma apropiada.apropiada.

• Reactor de flujo de tapón: Reactor de flujo de tapón: En este tipo de fermentación En este tipo de fermentación continua la solución de cultivo continua la solución de cultivo fluye a través de un reactor fluye a través de un reactor tubular sin mezclado.tubular sin mezclado.

•Esterilización de fermentadores.

Esterilización:

•En el laboratorio, el método estándar de esterilización es el calor: 120ºC de calor húmedo durante 15 min o 160ºC de calor seco durante, al menos, 1 hora. A escala industrial, el calor seco es prohibitivamente caro, salvo en casos muy especiales y se utiliza, habitualmente, la esterilización por calor húmedo.

Intercambiadores de calor

•Esterilización del fermentador y el medio conjuntamente.

•El calentamiento se consigue mediante:

•Inyección de vapor en el medio, por lo que el medio se prepara ligeramente más concentrado para compensar la dilución por el vapor condensado.

•El medio se calienta por conducción, haciendo pasar vapor por la camisa de termostatización.

•Esterilización por separado del fermentador y el medio.

•Este sistema ofrece ventajas ya que reduce el tiempo en el que el recipiente de fermentación es improductivo: un fermentador vacío se esteriliza con relativa rapidez.

-Cambio de escala

-Diseño de medios para procesos de fermentación

-Fermentación en sustratos sólidos

-Tecnología de cultivos de células de plantas y animales

-Procesamiento posterior de la muestra

Pasos a tener en cuenta:Pasos a tener en cuenta:

Procesamiento posterior de la

muestra.

Purificación.

El diseño y la operación eficiente de los procesos de purificación, son elementos vitales para obtener los productos deseados para uso comercial.

Deberían reflejar la necesidad de no perder más que lo absolutamente necesario del producto final.

Este procesamiento final involucrará, principalmente, la separación inicial de la mezcla de cultivo hacia una fase líquida y una sólida, con la subsecuente concentración y purificación del producto deseado.

El procesamiento involucrará más de una etapa:

-Destilación

-Centrifugación

-Filtración

-Ultrafiltración

-Extracción con solventes

-Adsorción

-Tamices moleculares

-Electroforesis

-Cromatografía de afinidad

-Liofilización

TECNOLOGIA TECNOLOGIA UTILIZANDO UTILIZANDO

ENZIMASENZIMAS

La tecnología de enzimas involucra la producción, aislamiento, purificación, uso en forma soluble y, finalmente, la inmovilización de las enzimas para su utilización en gran variedad de biorreactores.

La utilización de sistemas enzimáticos libres de células, presenta ventajas respecto de los procesos químicos que involucran un número de reacciones secuenciales.

En fermentación, el uso de microorganismos como catalizadores puede presentar las siguientes limitaciones:

1. Una alta proporción del sustrato será utilizada para convertirse en biomasa

2. Pueden ocurrir reacciones secundarias inútiles

3. Las condiciones para el crecimiento de los microorganismos pueden ser diferentes de las requeridas para la formación del producto

4. El aislamiento y purificación del producto deseado, a partir de la mezcla de fermentación, puede ser dificultoso.

INGENIERIA INGENIERIA GENETICA E GENETICA E INGENIERIA INGENIERIA

PROTEICA DE PROTEICA DE ENZIMASENZIMAS

La utilización de estas técnicas ha posibilitado producir enzimas industriales con muy buena calidad y pureza.

Crecimiento de microorganismosCrecimiento de microorganismosconteniendo la enzima de utilidadconteniendo la enzima de utilidad

Purificación dePurificación dela enzimala enzima

Determinación deDeterminación dela secuencia parcialla secuencia parcial

de aminoácidosde aminoácidos

Síntesis de Síntesis de oligonucleótidosoligonucleótidos

Identificación de clonesIdentificación de clones

Transformación de microorganismosTransformación de microorganismos

Producción industrial de enzimaProducción industrial de enzima

mARN mARN ADN ADN

Purificación de mARNPurificación de mARNtotaltotal

Clonación del ADNClonación del ADNen E. colien E. coli

Objetivos en la preparación Objetivos en la preparación de enzimas modificadas:de enzimas modificadas:

1.1. Aumentar la actividad de Aumentar la actividad de las enzimaslas enzimas

2.2. Mejorar la estabilidadMejorar la estabilidad

3.3. Permitir que funcionen en Permitir que funcionen en un ambiente diferenteun ambiente diferente

4.4. Cambiar el pH o Cambiar el pH o temperatura óptimostemperatura óptimos

5.5. Cambiar la especificidad Cambiar la especificidad para que utilice un sustrato para que utilice un sustrato diferentediferente

6.6. Cambiar la reacción Cambiar la reacción catalizadacatalizada

7.7. Aumentar la eficiencia de Aumentar la eficiencia de un procesoun proceso

ENZIMAS ENZIMAS INMOVILIZADASINMOVILIZADAS

El uso de enzimas en forma soluble o libre, debe considerarse como un posible derroche dado que, en general, la enzima no puede recuperarse al final de la reacción.

Una nueva área de tecnología enzimática es la relacionada con la inmovilización de las enzimas en polímeros insolubles, tales como membranas o partículas, actuando como portadores de la actividad enzimática.

Las ventajas de los Las ventajas de los catalizadores inmovilizados:catalizadores inmovilizados:

1.1. Permite el reuso de las enzimasPermite el reuso de las enzimas

2.2. Ideal para operaciones continuasIdeal para operaciones continuas

3.3. Los productos están libres de Los productos están libres de enzimaenzima

4.4. Permite un mejor control de los Permite un mejor control de los procesos catalíticosprocesos catalíticos

5.5. Mejora la estabilidad de las Mejora la estabilidad de las enzimasenzimas

6.6. Permite el desarrollo de Permite el desarrollo de sistemas de reacción sistemas de reacción multienzimáticosmultienzimáticos

7.7. Ofrece un potencial considerable Ofrece un potencial considerable en uso médico e industrialen uso médico e industrial

8.8. Reduce los problemas de Reduce los problemas de tratamiento de efluentestratamiento de efluentes