Prof. Dr. Reinaldo de Armas PhD

BIOTECNOLOGÍA ANIMALLCPA - 405Módulo. 5

Módulo 5. Empleo de las técnicas de Biotecnología en la reproducción:

Programas MOETFecundación in vitro Creación de bancos de germoplasmaAnálisis de sexo y marcadores genéticos. Técnicas de micro manipulación de gametos

y embriones

VIAS POSIBLES DE PRODUCCIÓN DE EMBRIONES

Superovulación. Producción in vitro:a) Post mortem.

b) Hembras ovarectomizadas.

c) Aspiración folicular in vivo.

SUPEROVULACIÓN

FECUNDACIÓN DE LA HEMBRA DONANTE

COLECTA DE EMBRIONES

BUSQUEDA Y SELECCIÓN DE EMBRIONES

TRANSFERENCIA

PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES

a) Post mortem.b) Animales vivos Hembras

MEDIOS EMPLEADOS EN LA FIV

•Medio de maduración (TCM 199 + FSH)

•TALP hepes (medio para procesamiento del semen)

•Medio de fert i l ización (TCM 199 + heparina)

•Medio de desarrol lo (TCM 199 + IGF1 y otros adit ivos o OSF)

COLECTA Y SELECCIÓN DE LOS OVOCITOS

MADURACIÓN IN VITRO

Procesamiento del semen

FERTILIZACIÓN DE LOS

OVOCITOS

CULTIVO DE DESARROLLO

De acuerdo a los problemas planteados, los beneficios son:

•Util ización en los programas de mejora genética a menor costo y/o con resultados más rápidos que los logrados con las metodologías disponibles.

•A través de mell izos, producir 30-40% más de terneros por vaca y una ganancia neta superior al 20% con respecto a un sistema clásico.

•Realizar un máximo aprovechamiento con el menor costo del semen de mayor cal idad y precio.

•Aprovechar vacas de alto valor descartadas de la reproducción que actualmente significan una pérdida permanente de genética.

•Producir crías a partir de hembras gestantes, impúberes o que no responden a la superovulación.

•Realizar cambios de raza, cruzamientos, etc. con bajos costos relativos y en cortos períodos.

* Crear bancos de germoplasma con costos competitivos a nivel internacional.

Congelación de Semen:Diluentes crioprotectores:Citrato yemaGlicerina lecheBiladylTriladylAndromed

Métodos de congelación:ÁmpulasPastillasPajuelas

Congelación de embriones y ovocitos:

En caso de que las receptoras no estén disponibles.Transporte a largas distancias o intercambio

comercial.Preservación de material genético.Fuente de ovocitos para FIV u otras manipulaciónes.

- 7 0C

- 32 0C

- 196 0C

t 0C

min.

3 6

seeding

0. 3 0C / min.

5 min.

Equipo de congelación programable

Equipo de congelación manual

Resultados de la transferencia de embriones congelados en glicerol (3 pases) y en etilenglicol (transferencia directa).

Tratamiento de congelación

Transferencias Preñeces a 60 días# %

Glicerol 68 26 38.2 a

Etilenglicol 135 71 52.6 b

Letras diferentes difieren estadísticamente p >0.05

Sexaje de Espermatozoides Principios importantes de la técnica:

El cromosoma X tiene 3,8% mas ADN (material genético) que el Y. El colorante, H33342, se une al ADN cuantitativamente, lo que es decir,

entre mas ADN, mas cantidad se adhiere. Cuando un has de luz a cierta longitud de onda es proyectada, el

colorante adherido al espermatozoide se hace fluorescente, Así el espermatozoide X produce un 3,8% mas luz azul que el Y . El citómetro de flujo clasificador de espermatozoides tiene los

componentes para llevar a cabo los pasos descritos, incluyendo un laser para proporcionar la luz a la longitud de onda de correcta para excitar el colorante Un detector para medir la cantidad de luz y un computador para analizar la información.

Los espermatozoides son bombeados a través de un delgado tubo que vibra saliendo en pequeñas gotas. Las gotas que contienen espermas X reciben una carga eléctrica + y son desviados a un tubo colector de espermatozoides hembras. Las gotas con espermas Y son cargados - y desviados a un tubo colector de espermatozoides machos.

Los espermatozoides muertos y aquellos que no han podido ser sexados, no son recogidos.

Diagrama del equipo de sexaje de semen

Limitantes de la técnica:Limitantes de la técnica:

•Alto costo del equipamiento y entrenamiento del personal.•El procedimiento no ofrece 100% de separación.•El tiempo que demora en procesarse todo el eyaculado es largo y es por esto que las pajillas producidas son de baja concentración (1 a 3 x 106

esp/ml).•Alto costo de las pajillas.•Resultados de preñez ligeramente más bajos.

Sexado de Sexado de embrionesembriones

Inseminación intracitoplasmáticaInseminación intracitoplasmática

Diferentes métodos de transgénesisDiferentes métodos de transgénesis

Objetivo:Objetivo:

Modificación genética para producir proteínas Modificación genética para producir proteínas de interés (productivo, salud, medicina).de interés (productivo, salud, medicina).

Se logra a través de:Se logra a través de:

Mediado por retrovirusMediado por retrovirusMediado por espermatozoosMediado por espermatozoosQuimerasQuimerasMicroinyección de ADNMicroinyección de ADN

Clonaje de embrionesClonaje de embriones

Clonaje de animales adultos

Células de la Granulosa

Cultivo de Células Primarias aspiradas de folículos >5mm

(células de la granulosa)

Fibroblastos

Adultos o jóvenes

Diferentes líneas celulares

Múltiples pases ( 10 a 11 Pases)

Bisección y selección del

citoplasma receptor * *

Pareo celular

1st and 2nd Fusión

Eliminación del cumulus y zona pelúcida * **

Activación, cultivo y transferencia

Electrofusión