Biotecnologia Vegetal

Biotecnología Vegetal

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5to Coloquio Internacional

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BIOTECNOLOGÍAVEGETAL

LIBRO DE REPORTES CORTOS

Junio 16- 19, 1999

INSTITUTO DEBIOTECNOLOGÍADE LAS PLANTAS

COLOQU5


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Diseño: D.I. Omar Rojas Martínez COPEXTEL S.A. Villa Clara

Edición: Yelenys Alvarado Capó Orlando Gregorio Chaviano

Fotomecánica e impresión: Ediciones GEO.

Instituto de Biotecnología de las Plantas,1999Sobre la presente edición: Instituto de Biotecnología de las Plantas,1999

Reservados todos los derechos. Ninguna partede este libro puede ser reproducida en formaalguna por cualquier sistema electrónico, me-cánico, por fotocopia o cualquier otro, sin per-miso por escrito de los titulares del copyright.

El contenido de los trabajos que aparecen eneste libro es responsabilidad de sus autores.

Instituto de BIotecnología de las Plantas:Biotecnología Vegetal: Libro de reportescortos, Quinto Coloquio Internacional deBiotecnología Vegetal, 16-19 de Junio,1999/ Instituto de Biotecnología de lasPlantas; Santa Clara, IBP, 1999.

270p., 16x24cm

1-Biotecnología VegetalI-Coloquio Internacional de Biotecnología Ve-getal, Quinto, Santa Clara, 1999

Instituto de Biotecnología de las PlantasCarretera a Camajuaní, Km. 5 ½. Santa Clara.Villa Clara. Cuba.Fax: 53(422) 81329e-mail: [email protected]

ISBN 959-7122-03-0

Impreso en Cuba / Printed in Cuba200 ejemplares.

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COMITÉ ORGANIZADOR

Presidente:Dr. Andrés Olivera Ranero.RectorUniversidad Central “Marta Abreu”de Las Villas.

Vicepresidente:Dr. Sc. Juan N. Pérez Ponce.DirectorInstituto de Biotecnología de lasPlantas.

Secretario Ejecutivo:Dr. Rafael Gómez KoskyVicedirector científicoInstituto de Biotecnología de lasPlantas.

Miembros:Yelenys Alvarado CapóElio Jiménez GonzálezDaniel Agramonte PeñalverRolando Manso MuroOrlando Gregorio ChavianoMiguel Suárez CastelláJorge Luis Proenza

TEMÁTICAS1. Saneamiento y diagnóstico de

microorganismos patógenos.2. Mejora por variación

somaclonal, mutagénesis yselección in vitro.

3. Cultivo de tejidos y células.4. Embriogénesis somática y

semilla artificial.5. Propagación masiva de plantas.6. Transformación genética y

biología molecular.7. Contaminación microbiana en

el cultivo in vitro.8. Metabolitos secundarios

BIOTECNOLOGÍAVEGETAL

5to COLOQUIOINTERNACIONAL


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TABLA DE CONTENI-DO

Conferencias

Reportes cortos

Saneamiento y diagnóstico demicroorganismos patógenos.

Mejora por variaciónsomaclonal, mutagénesis yselección in vitro.

Cultivo de tejidos y células.

Embriogénesis somática ysemilla artificial.

Propagación masiva deplantas.

Transformación genética ybiología molecular.

Contaminación microbiana enel cultivo in vitro.

Metabolitos secundarios

Resúmenes

Indice de materia

Indice de autores

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C-1 Aplicaciones de la biotecnología vegetal en frutos tropicales:manejo postcosecha y usos como vehículos de inmunización enseres humanos.

Miguel A. Gómez Lim

Departamento de Ingeniería Genética, CINVESTAV, Irapuato, Apartado Postal 629.Irapuato, GTO. México, E-mail: [email protected]

La maduración de frutos es un complejo proceso de desarrollo, esencial en el ciclo devida de las plantas. Normalmente hay un incremento dramático en la biosíntesis deetileno, el principal acelerador de la maduración, y en la tasa respiratoria. Estos eventosson solo dos manifestaciones externas de una serie de reacciones internas que reflejanuna marcada actividad metabólica. Este proceso se ha estudiado fundamentalmentedesde un punto de vista descriptivo y bioquímico. Su importancia radica en el hecho deque la sobremaduración (ablandamiento acelerado) de frutas y hortalizas constituyeuna de las principales causas de pérdidas económicas en la actualidad en el mundoentero.

Gracias a los estudios efectuados en los últimos años en esta área, se han logrado dise-ñar estrategias para controlar la sobremaduración, por ejemplo con el uso de cámarascon atmósferas controladas. Sin embargo, en la actualidad el uso de la biología molecularen el área de la fisiología postcosecha ha contribuido al control de este fenómeno deuna manera sin precedentes.

Las estrategias basadas en el uso de la biotecnología, emplean la información genéticade las enzimas que producen etileno, el agente responsable de la sobremaduración. Pormedio de la transformación genética se producen plantas con frutos que no producenetileno o producen muy poco. La aplicación de etileno exígeno restaura el patrón nor-mal de maduración. Esta estrategia es aplicable en potencia a cualquier fruto. Actual-mente en el CINVESTAV-Irapuato llevamos a cabo un programa encaminado a reducirlas pérdidas postcosecha de mango, plátano y papaya por medio de la manipulacióngenética de la producción de etileno. Los frutos resultantes presentaran maduracióncontrolada.

Por otra parte, muchos grupos de investigación han estado experimentado con plantastransformadas para usarlas como “biorreactores”. Se ha demostrado que las plantaspueden utilizarse para producir proteínas de alto valor tales como peptidos para usoterapéutico, anticuerpos, seroalbúmina humana o vacunas orales. Los datos obtenidosindican que el consumo por vía oral de material transgénico conteniendo antígenosinduce una respuesta inmune. ¿Qué ventajas tendría el utilizar a frutos como vehículospara aplicar vacunas humanas? La principal ventaja es de tipo económico. Se estimaque el costo de producción de vacunas de este tipo sería extremadamente bajo, sobretodo en comparación con los costos actuales. Otra ventaja sería una distribución mu-cho mas fácil y amplia, al no requerir refrigeración. Esto redundaría en menos inactivaciónde las vacunas. Para este proyecto se escogió al plátano porque es el fruto tropical máspopular del mundo y en muchos países es un alimento básico. Por ello no sería difícillograr su aceptación. Por otra parte el plátano es un cultivo que puede transformarse yregenerarse. En la ponencia se discutirán los últimos resultados y las perspectivas y elpotencial de estas líneas de investigación.


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C-02 Recent Progress in Banana Biotechnology Research

L. Sági

Laboratory of Tropical Crop Improvement. Catholic University of Leuven, Belgium. Kar-dinaal Mercierlaan 92B-3001 Heverlee, Belgium.Email: [email protected] http:// www.agr.kuleuven.ac.be/dtp/tro/home.htm

Conventional breeding of banana is hampered by relatively long generation times, sterilityand triploidy of most cultivated varieties, which impede successful breeding for resistanceagainst the major diseases and pests caused by fungi (Mycosphaerella spp., Fusariumoxysporum f.sp. cubense), viruses (bunchy top, bract mosaic and streak viruses) andnematodes (Radopholus similis, Pratylenchus spp., etc.).

Recent developments in biotechnology offer new opportunities in controlling diseasesand pests in banana. Regenerable embryogenic cell suspensions have been establishedfrom various somatic tissues. Protoplasts have been isolated from cell suspensions andplants have been regenerated at a high frequency. Cryopreservation techniques havebeen elaborated for long-term storage of cell suspensions and in vitro meristems. Gene-tic transformation of embryogenic cell suspensions and meristematic tissues has lead tothe production of the first transgenic banana plants.

At present, three systems appear to be feasible for the production of transgenic bananaplants: (i) introduction of DNA into regenerable, cell suspension-derived protoplasts byelectroporation, (ii) particle bombardment transformation of embryogenic cell suspensioncultures, and (iii) Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic cells. Usingthese technologies, more than 1,000 independent transgenic lines have been recentlyproduced from plantain and Cavendish dessert banana cultivars. Large-scale molecularand biochemical characterization confirmed that a vast majority of them contained andexpressed the foreign genes. For instance, PCR-screening of in total more than 800putative transgenic plants revealed that more than 90% of them contained the selectablemarker gene. No significant differences were found in this respect between the twocultivars and the different genes used as a selectable marker. Similar results were obtainedby Southern blot hybridization which confirmed that the majority of the plants analysedhad the selectable marker gene incorporated in their genome. Several hundreds oftransgenic lines have been micropropagated for testing the stability and effect of thetransgenes in different field environments.

Furthermore, a new group of broad-spectrum antifungal proteins has been found tocontrol pathogenic fungi of banana in vitro. Close to 200 individual transgenic plantstransformed with gene combinations encoding different antifungal protein genes havebeen grown in the greenhouse. A simple and reproducible leaf disc bioassay has beendeveloped for the evaluation of resistance to fungal pathogens. A differential diseaseresponse has been observed among transgenic plants, which ranges from susceptibilityto a high degree of resistance compared to control plants. Computer image capturingand software based area calculation allowed for the precise measurement of the infectedleaf area and for the classification of the level of resistance of each transformant.

In view of the progress mentioned above, it can be expected that genetic improvementby transformation will, in the near future, contribute to the production of disease and/orpest resistant bananas with improved quality both for local consumption and commercialproduction.


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C-03 Bases fisiológicas del envejecimiento y revigorización vegetal.

R. Rodríguez; M.I Centeno; M.J.Cañal; B. Fernández y M F Fraga.

Instituto de Biotecnología de Asturias (Asociado al CSIC), E-33071 Oviedo, España. FaxNº 34-7-5104867, E-mail: [email protected]. Fisiología Vegetal, Dpto. B.O.S., Facultad de Biología Universidad de Oviedo, Es-paña.

Cambio de fase (Brink, 1962), envejecimiento ontogénico (Fortanier y Jonkers, 1976),envejecimiento de meristemos (Olesen, 1978) y maduración (Pierik, 1990) son térmi-nos que se refieren a la transición fase juvenil-fase adulta. Leopold (1975) utilizó eltérmino maduración para referirse a la transición a fase madura, y envejecimiento paraindicar el conjunto de procesos degenerativos controlados, al menos en parte, por fac-tores exógenos. Asociados a la maduración existen cambios en las característicasmorfológicas y de desarrollo, estos cambios son graduales y se presentan de forma varia-ble según las especies; de tal forma que los materiales adultos sufren alteraciones edad-dependientes que conllevan una pérdida generalizada de vigor y descenso de sus posi-bilidades de manipulación. El conjunto de estos procesos que dificultan la manipula-ción de material adulto se denomina envejecimiento fisiológico (Franclet et al., 1987).

El conocimiento de las bases moleculares del cambio de fase y maduración de las plan-tas tiene gran interés académico pero además, constituye un campo de investigación ydesarrollo importante desde la perspectiva aplicada; .ya que, aunque la etapa de madu-ración-envejecimiento puede ser adecuada para la selección, minimiza las posibilida-des de manipulación de especies elite que hayan expresado sus características genéticasaditivas y no aditivas.

El rejuvenecimiento total implica la reversión completa del proceso de maduración,como resultado de la reproducción sexual o de la propagación vegetativa a través deformación de yemas adventicias y embriones somáticos.La reproducción sexual o apomíctica media, de forma natural procesos de rejuveneci-miento-revigorización que facilitarían la propagación de especies adultas. Estos proce-sos de revigorización también puede ser inducido mediante aplicaciones de giberelinas,temperaturas altas, iluminación baja, cultivo in vitro seriado, microinjerto en cascada,entre otros tratamientos Desafortunadamente, no se conocen en profundidad los me-canismos de control de estos procesos, y por tanto, su manipulación con fines prácticosde clonación es aún muy limitada. Además, ni la maduración ni el rejuvenecimiento sehan podido caracterizar bioquímicamente y el conocimiento sobre las bases molecularesde estos procesos es escasa.

Desde 1989, con la organización del Instituto de Estudios Avanzados sobre las basesmoleculares del envejecimiento en plantas, (Rodríguez, Sánchez Tamés y Durzan , Eds,1990); nuestro grupo trata de realizar aportaciones sobre las bases moleculares de esteproceso en especies leñosas (Rodríguez, 1993). Hasta la fecha, hemos realizado nues-tros estudios con la angiosperma Corylus avellana y con las Gimnospermas Pinus nigray Pinus radiata..


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Los resultados obtenidos en Corylus avellana ( Berros et al, 1996, 1997; Centeno et al.,1998ª ; Diaz-Sala et al. 1990, 1994, 1995; Rey et al.,1993; 1994, 1998; Rodríguezet al., 1988) pueden resumirse (Tabla 1) en los siguientes puntos:

1. Relación directa entre tejidos competentes y mayores actividades respiratorias yperoxidásicas. También mayor contenido azúcares, RNA y proteínas.

2. Expresión proteica específica en función del grado de desarrollo del material obje-to de estudio; más complejos en materiales adultos.

3. Diferente nivel expresión de la subunidad 55 kD de rubisco, inferior en materialesadultos y superior en juveniles e intermedia en tejidos revigorizados.

4. Determinación de rangos de PM específicos:14.2-20.1 Kda determinantes de teji-dos maduros, 40-60 Kda específicos de tejidos revigorizados, juveniles yembriogénicos.

5. Patrones de metilación sitio específica del gDNA dependientes de fase de desarro-llo, siendo menos complejos en materiales juveniles..

6. Presencia de mayores niveles de citoquininas en materiales adultos, principalmen-te debido a la contribución de Z y DHZ.

7. Contenidos superiores de Put. libre en tejidos juveniles. Posibilidad de utilizar larelación Put /Spd + Spm como indicadora de envejecimiento - rejuvenecimiento.

Tabla 1. Características diferenciales asociadas con la edad en avellano.

CARACTERÍSTICA MATERIAL ADULTO MATERIAL IN VITROMATERIAL JUVENIL

Floración Presente AusenteAusente

Enraizamiento Bajo AltoAlto

Patrón polipeptídico Complejo SencilloIntermedio

Polipéptidos específicos Presentes AusentesAusentes

Actividad Rubisco Baja BajaElevada

Frecuencia metilación DNA Mayor IntermediaMenor

PAs mayoritarias Spm, Spd PutPut

Put/Spd+Spm Baja IntermediaAlta

Citoquininas Superior -Inferior

Z, DHZ Superior -Inferior

Dentro del proyecto europeo (Fair3 CT96-1445), nuestro grupo de investigación ha


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puesto de manifiesto ( Centeno et al., 1998b; Centeno et al., 1998c; Fraga etal.,1997a, 1997b; Lopez et al.,1993ª, 1993b, 1996; Pacheco et al., 1993) los si-guientes datos acerca de Pinus radiata.

8. Se han conseguido establecer in vitro tanto tejidos juveniles como tejidos adultosde Pinus radiata. Mientras que los tejidos juveniles han podido ser establecidos di-rectamente, para introducir tejidos adultos ha sido necesario recurrir a la técnica delmicroinjerto

9. Se han observado respuestas de organogénesis directa y organogénesis adventiciaindirecta con tejidos juveniles de un año, mientras que con tejidos juveniles decuatro años solo se han observado respuestas de organogénesis directa.

10. La época de recogida de las púas, estado fisiológico, localización en el árbol, eltratamiento al que son sometidas y la naturaleza del porta son factores decisivos enel éxito de la revigorización de tejidos adultos mediante la técnica del microinjerto.

11. Tratamientos de revigorización ex vitro (como injertos en cascada) facilitan larevigorización in vitro.

12. En Pinus radiata existe mayor número de metil-citosinas en secuencias CCA/AGGque en secuencias CCGG.

13. El grado de metilación «sitio-específica» del DNA genómico de individuos juveni-les es inferior al de individuos adultos y cultivados in vitro.

14. Los individuos cultivados in vitro presentan un grado de metilación diferente al deindividuos juveniles, debido, posiblemente, a las peculiares condiciones de creci-miento en las que se encuentran.

15. Los braquiblastos en desarrollo del árbol correspondiente al tercer injerto seriadomostraron los mayores contenidos en citoquininas por gramo de peso seco, en rela-ción a los encontrados en braquiblastos sin crecimiento y en braquiblastos de losdos tipos procedentes del primer injerto. Esto fue debido principalmente a una acu-mulación de isopenteniladenina e isopenteniladenosina en la porción basal de losmismos, aquella que contiene el meristemo.

16. Los niveles de citoquininas (iP e iPA) presentan niveles 8 veces superiores en losbraquiblastos en desarrollo árboles correspondientes al tercer injerto seriado res-pecto a los del primer injerto, concentrándose las citoquininas en la porción basalde los mismos.

17 Los braquiblastos en desarrollo del árbol procedente del primer injerto, presentandoble contenido de AIA que aquellos procedentes del tercer injerto. Esta auxinase distribuye de forma homogénea en las porciones apical y basal.

17. Los niveles de PAs totales disminuyen durante la maduración-envejecimiento deórganos tanto en individuos juveniles como adultos.

18. En individuos juveniles la contribución mayoritaria de PAs corresponde a la frac-ción libre, mientras que en individuos adultos la mayor parte del contenido de PAscorresponde a la fracción ligada a compuestos de bajo peso molecular solubles enácido perclórico.

19.- La relación PAs libres/ PAs conjugadas es próxima a uno en individuos en los queel cambio de fase es inminente.

En el transcurso de la ponencia se hará referencia a algunos de los resultados citados,prestando especial atención a las técnicas de revigorización y alternativas para superarla baja competencia morfogénica dependiente del envejecimiento ontogénico y fisio-lógico.


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C-04 Fisiología del cultivo in vitro.

Maria Jesús Cañal, Roberto Rodríguez, Belén Fernández, Ricardo Sánchez-Tames Y Juan Pedro Majada

Lab. Fisiología Vegetal, Dpto B.O.S., C/ Catedrático Rodrígo Uría s/n 33071, Universi-dad de Oviedo, España.

INTRODUCCIÓN

La micropropagación es una técnica, desarrollada para la producción en masa de plan-tas, que ha sido utilizada con éxito desde los años 60. La principal ventaja de estatécnica estriba en la multiplicación rápida de material clonal libre de enfermedades.Esta característica ha servido para introducir rápidamente en el mercado nuevas varie-dades de plantas obtenidas mediante selección, mutación, programas de mejora o ma-nipulación genética. Sin embargo, la industria de la micropropagación presenta seriaslimitaciones debido a los elevados costes de producción, reduciéndose la mayor partede su actividad al sector de plantas ornamentales (Holdgate y Zandvoort, 1992).

En la mayor parte de los procedimientos empleados actualmente no se hace referenciaal control efectivo del desarrollo de las plantas in vitro. Sin embargo, las tasas de creci-miento, desarrollo y muchas de las características fisiológicas y morfológicas de las plan-tas formadas in vitro están influenciadas por el ambiente físico, químico y gaseoso de losrecipientes (Kozai et al., 1992a; Buddenford-Joosten y Woltering, 1994). Por tanto elestudio y control del ambiente de los cultivos también incidirá positivamamente en laoptimización de los procedimientos de micropropagación.

CARACTERÍSTICAS DEL AMBIENTE IN VITRO EN LA MICROPROPAGACIÓN CON-VENCIONAL

Tradicionalmente los protocolos de propagación han ignorado los factores ambientalesdel cultivo, centrándose en experimentos factoriales de aplicación exógena de nutrientesy reguladores del crecimiento. En estas condiciones las plantas se desarrollan en condi-ciones asépticas dentro de un recipiente hermético, expuestas a bajos niveles de luz,sobre un medio gelificado que contiene nutrientes para mantener un crecimientoheterótrofo, y todo ello bajo unas condiciones de elevada humedad relativa.

Los factores que pueden afectar al crecimiento y morfogénesis de las plantas in vitro sepueden clasificar como se indica en la Fig. 1. Los fenómenos que controlan los cambiosambientales en el interior de un recipiente de cultivo son similares a los que ocurren enel interior de un invernadero, ya que de hecho un recipiente de cultivo es, hasta ciertopunto, un invernadero en miniatura mantenido en condiciones asépticas. Bajo estepunto de vista, Kozai et al., (1992a) mantienen que es interesante realizar estudiosecológicos, ecofisiológicos, y de fisiología e ingeniería ambiental en el proceso demicropropagación. Aunque el valor que presenta cada uno de los parámetros descritosen la Fig. 1, va a depender de las condiciones de la cámara de crecimiento, del recipien-te, de las condiciones de cultivo y de los propios explantos, el ambiente in vitro presen-ta unas características generales que se resumen en la Tabla 1. Como se puede observar,el ambiente in vitro presenta unas tasas bajas de flujo y energía, debido a la existenciade un sistema semicerrado, con mínimas variaciones de temperatura, elevada humedadrelativa y grandes cambios diarios de la concentración de CO2 en el interior de losrecipientes.


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CARACTERÍSTICAS DE AMBIENTE AÉREO EN EL INTERIOR DE LOS RECIPIENTES

El tipo de recipiente de cultivo (tamaño, forma, material y sistema de cierre) puedecondicionar la evolución de la composición gaseosa en su interior durante el cultivo. Enrecipientes de cultivo cerrados herméticamente se ha detectado una acumulación degases (dióxido de carbono -CO2-, etileno -C2H4-, etano, etanol y acetaldehído) que,además de influir o controlar el crecimiento, también pueden afectar a procesos dediferenciación y morfogénesis (Thomas y Murashige, 1979; Righetti et al., 1990).

Fig. 1.- Factores que pueden influir en el crecimiento y morfogénesis de las plantas invitro. (Basado en el modelo propuesto por Kozai et al. (1992).

Para mantener un crecimiento heterótrofo en estos recipientes, es necesaria una fuenteexógena de hidratos de carbono, ya que la concentración de CO2 durante el períodoluminoso está por debajo del punto de compensación (50-100 μmol mol-1) (Ando,1978; Fujiwara et al., 1987; Pospisilova et al., 1988; Desjardins et al., 1988; Infante etal., 1989; Kozai y Sekimoto, 1988). La concentración de CO2 aumenta de forma cons-tante durante el período oscuro, aunque una vez reiniciado el período luminoso, elnivel de CO2 desciende rápidamente (Fujiwara et al., 1987; Fujiwara y Kozai, 1995). Enestas condiciones, la falta de CO2 disminuye los requerimientos lumínicos de los culti-vos, siendo más importante su papel en fotomorfogénesis que en fotosíntesis. Además,generalmente los gradientes de potencial hídrico y los coeficientes de difusión del aire ydel medio en el recipiente son más pequeños que los existentes en el exterior, lo quegenera bajas tasas de flujo de agua en el recipiente (Sallanon y Coudret, 1990). Laintroducción de filtros bacteriológicos en los recipientes de cultivo permite aumentar latasa de intercambio gaseoso y mantener gradientes de humedad que han introducidonuevos parámetros a considerar en los procesos morfogénicos (Majada et al., 1997).


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Variables de estado Variables de flujo

Ambiente aéreo1. Elevada humedad relativa2. Temperatura del aire3. Concentración elevada de CO2 durante el período

oscuro y baja durante el período luminoso4. Elevada concentración de etileno

Ambiente en el sustrato5. Elevada concentración de azúcar6. Elevada concentración de sales7. Baja concentración de oxígeno, y liberación de

exudados tóxicos8. Elevada concentración de reguladores

Flujo de materia y energía1. Tasa de transpiración baja2. Tasa fotosintética baja3. Elevada respiración en oscuridad4. Flujo de radiación térmica y de fotones bajo5. Balance negativo de CO26. Tasa baja de absorción de agua7. Tasa baja de absorción de azúcares8. Tasa baja de absorción de iones9. Tasa baja de absorción de componentes del medio.

Tabla 1. Características generales del ambiente in vitro en la micropropagación conven-cional con respecto a las variables de estado y de flujo

CARACTERÍSTICAS DEL AMBIENTE EN LOS SUSTRATOS

Para estudiar la disponibilidad de agua, nutrientes y reguladores de desarrollo en losdistintos sustratos empleados en cultivo de tejidos, debemos de tener en cuenta losdiferentes componentes del potencial hídrico (Debergh et al., 1981, Debergh, 1983), yotros tres factores de especial relevancia en sustratos gelificados: la dinánica de flujo, lavelocidad de difusión de solutos y la influencia de la temperatura (Campbell y Cheftel,1985).

A. Agar.Distintos autores han estudiado el efecto de la concentración y marca comercial deagar, así como el comportamiento de las distintas especies ante el tipo de agar y suconcentración (Debergh, 1983, Bornman y Vogelmann 1984, Kordan 1988, Leshem,1983 y Scherer 1988), pero no se encontró una correlación entre las características y elcrecimiento de las plantas.

B. Nutrientes y reguladores.

La definición de protocolos para la micropropagación heterótrofa de plantas, se ha ba-sado en experimentos factoriales de aplicación exógena de nutrientes y reguladores delcrecimiento (Williams, 1992; Williams y Taji, 1991). Este hecho explica la gran cantidadde medios existentes, definidos específicamente para cada especie y tipo de explantoempleado. Estos factores, junto al empleo de sustratos gelificados, han influido negati-vamente en la realización de trabajos que analicen el efecto del balance iónico y de laconcentración total de iones y reguladores en la absorción y asimilación de nutrientes(George y Sherrington, 1984).

Aunque los medios nutritivos empleados en la micropropagación convencional hansido optimizados para cultivos heterótrofos, en la actualidad se trabaja para definir nue-vas formulaciones adaptadas a las posibilidades de control ambiental existentes en laactualidad, investigando previamente el control y la eficiencia de la absorción denutrientes bajo distintas condiciones ambientales (Kozai et al., 1992a). Resultados ob-


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tenidos en nuestro laboratorio ponen de manifiesto que el consumo de nutrientes esmuy inferior al esperado, siendo únicamente significativo en el caso del fosfato, quepuede llegar a ser limitante en algunos cultivos (Dantas et al., 1999; Moncaleán et al.,1999). A partir del análisis de nuestros resultados y de los obtenidos por otros autores(Williams, 1992 y Leifert et al., 1995) parece claro que la composición y la concentra-ción mineral de los medios de cultivo, así como el ambiente del cultivo condicionatotalmente la respuesta de los cultivos en cuanto a crecimiento y características fisioló-gicas de las plantas obtenidas; lo cual está condicionando la definición de nuevos me-dios de cultivo aplicados de forma estática o de forma dinámica durante el transcuro decada período de cultivo.

Al igual que en el medio mineral, de forma general los protocolos de aplicación dereguladores del crecimiento se establecen mediante ensayos factoriales, manteniendolos cultivos en contacto con la hormona durante todo el subcultivo. Sin embargo, resul-tados obtenidos en nuestro laboratorio ponen de manifiesto que la absorción de hor-monas en la fase de proliferación se produce mayoritariamente en las primeras horas decultivo (Feito et al., 1994; Feito et al., 1995; Moncaleán et al., 1999), absorción quecondiciona totalmente la respuesta morfogénica de los cultivos mediante la alteracióndel balance endógeno de reguladores del crecimiento (Dantas et al., 1997). En estesentido ensayos realizados en nuestro laboratorio, ponen de manifiesto que la adminis-tración de pulsos hormonales durante períodos cortos es más efectiva en la prolifera-ción de yemas axilares y lo que resulta más interesante favorece el posterior enraizamientode los tallos obtenidos.

RESPUESTAS DE TALLOS/PLÁNTULAS AL AMBIENTE IN VITRO

En la Tabla 2 se resumen algunas de las respuestas más habituales de los explantosintroducidos en cultivo, como resultado de la interacción que se produce entre losexplantos y las características ambientales descritas (Tabla 2). Resultados obtenidos ennuestro laboratorio han demostrado que la manipulación del ambiente en los recipientesde cultivo, modula las características morfo-anatómicas y fisiológicas de las plantasobtenidas a través de cultivo de tejidos (Majada et al., 1998, Majada et al., 1999). Deforma general podríamos decir que el fenotipo inducido por las condiciones de cultivoes intermedio entre plantas crecidas en ambientes herméticos no controlados y plantasaclimatadas

Tabla 2. Respuestas al ambiente en la micropropagación convencional

Tejidos Planta

1. Disminución o alteración del contenido de cerasepicuticulares2. Funcionamiento estomático anormal3. Disminución del contenido en clorofila4. Menor peso seco final5. Disminución del área foliar6. Disminución del número estomático7. Menor desarrollo anatómico

1. Menor tasa de crecimiento2. Crecimiento suculento3. Desórdenes fisiológicos y morfológicos4. Formación de pocas raíces secundarias5. Elevada variablidad en tamaño, forma y estado de

6. Mayor frecuencia de mutaciones.7. Presencia de contaminaciones


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ESTRATEGIAS EN EL CONTROL AMBIENTAL DE LOS RECIPIENTES

Como consecuencia del ambiente in vitro, todos los factores descritos en la Tabla 2,contribuyen al desarrollo de plantas con un fenotipo incapaz de sobrevivir al transplantea invernadero o campo (Preece y Sutter, 1991), debido al stress hídrico provocado porla ausencia de regulación estomática (Brainerd y Fuchigami, 1982; Conner y Conner,1984; Ziv et al., 1987; Pospisilova et al., 1988) y menor cantidad de ceras epicuticulares(Sutter y Langhams, 1979, 1982; Sutter, 1988; Conner y Conner, 1984).

Actualmente disponemos de distintas estrategias para controlar el ambiente en los siste-mas de micropropagación: control en cultivos heterótrofos (a), en cultivos mixótrofos(b) y en cultivos autótrofos (c).

a. El control del ambiente en cultivos heterótrofos (recipientes sin ventilación) se centraen las fases de enraizamiento y aclimatación. El ambiente puede ser modificadogradualmente en estas etapas para favorecer posteriormente el crecimiento y desa-rrollo de tallos y plantas en invernadero. Aunque ampliamente utilizada por losmicropropagadores convencionales, las posibilidades de control son mínimas y selimita generalmente a una disminución de la humedad relativa.

b. Establecimiento de cadenas cicloclonales de micropropagación mixótrofa, las cualesse sustentan en una mezcla de nutrición heterótrofa y autótrofa (recipientes conventilación), y que va a depender de la disponibilidad de CO2 y azúcares por losexplantos en el recipiente de cultivo.

c. La tercera estrategia alternativa la constituye el control del ambiente para mantenerun crecimiento autótrofo (recipientes con vemtilación y control de dióxido de car-bono) aséptico en las fases de multiplicación y enraizamiento.

La elección de la mejor estrategia va a depender de los objetivos específicos deproducción, así como de los requerimientos culturales de cada especie, número detransplantes requerido, valor añadido del producto, relación calidad precio, etc.

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SANEAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DE MICROORGANISMOSPATÓGENOS.

1-01 Evaluación del saneamiento al Raquitismo de los retoños portratamiento térmico a propágulos de caña de azúcar.

J.R. Pérez Milián, Yamilé Figueredo y Madyu Matos.

Estación de Investigación de la Caña de azúcar. Jovellanos 42600, Matanzas, Cuba. E-mail: [email protected]

Palabras claves: raquitismo de los retoños, hidrotermoterapia, caña de azúcar, con-trol.

INTRODUCCIÓN

La hidrotermoterapia, por su alta efec-tividad, es el método de control másusado en el mundo contra varias enfer-medades de la caña de azúcar. En Cubase utiliza en la obtención de semillacategorizada para garantizar que el ma-terial de propagación llegue a los cam-pos comerciales con un estadofitosanitario capaz de competir contralas adversidades del medio, entre lasque se incluye la posibilidad real delataque de plagas y enfermedades. Lasinvestigaciones desarrolladas en estesentido reflejan las posibilidades decontrarrestar el raquitismo de los reto-ños (RSD) mediante un manejo adecua-do del tratamiento.

MATERIALES Y MÉTODOS

En el presente trabajo se evaluaron dife-rentes combinaciones de tiempo y tem-peratura: 53ºC/20min., 50.5ºC/2h y re-mojado + 50ºC/3h para estudiar el sa-neamiento en la variedad CP31-294muy enferma de RSD (comprobado porcontraste de fase) empleando tamañosdel propágulo de 1, 2 y 3 yemas. Seplantó en el campo un bloque al azar

con 3 repeticiones. A los 10 meses seevaluó el saneamiento por el métodode tinción por transpiración (STM), to-mando 5 tallos por réplica (15 por tra-tamiento) . Por otra parte se estudióla efectividad de tratamientos sucesi-vos (3 durante 20 meses) en la mismavariedad, empleando tratamientohidrotérmico de 50.5ºC/2h y aplican-do el STM para su evaluación final.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados mostraron que con nin-guno de los tratamientos empleados selogró un control absoluto del RSD, quelos tratamientos más largos son másefect ivos y que el tamaño delpropágulo no tiene influencia sobre elcontrol. Se obtuvo además, que unprimer tratamiento sobre material en-fermo es eficaz, sin que se observengrandes diferencias respecto al segun-do y tercer tratamiento, lográndosedespués del primer tratamiento un au-mento del porcentaje de vasos funcio-nales desde el 40% del material origi-nal hasta por encima del 85%.


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1-02 Empleo del método de tinción por transpiración de losvasos del xilema (STM) para la evaluación del saneamiento alRSD.

Yamilé Figueredo, J. R. Pérez Milián y Madyu Matos.

Estación de Investigación de la caña de Azúcar. Jovellanos 42600, Matanzas, Cuba.E-mail: [email protected]

Palabras claves: raquitismo de los retoños, tinción, xilema, saneamiento, caña deazúcar.

INTRODUCCIÓN

El raquit ismo de los retoños esprobablemente la enfermedad másimportante de la caña de azúcar,afectando un gran número devariedades de la producción. El agentecausal es la bacteria Clavibacter xylisubsp. xyli, la cual se aloja en los vasosdel xilema. El tratamiento hidrotérmicoa la semilla es el método más usadopara su control, pero no logra una to-tal erradicación del patógeno. Sin em-bargo, después del tratamiento térmicose observa un incremento en elrendimiento, siendo este el criterioempleado para medir la efectividad delsaneamiento.

Por otra parte, el diagnóstico visual dela enfermedad se dificulta ya que lossíntomas externos pueden confundirsecon otras patologías. Sobre la base deesta dificultad, se han desarrolladootras técnicas de diagnóstico queresistencia al RSD de 5 variedades decaña de azúcar (C111-79, C323-68,C120-78, CP 31-294 y My5514)tratadas a 50ºC durante 2 horas einoculadas con jugo de plantasenfermas. Los tallos se introdujeron enuna solución de Safranina Omanteniendo las hojas fisiológicamenteactivas.


La solución es absorbida por la plantay los vasos funcionales (VF) se tiñencon el colorante. Al realizar un análisisde los resultados se evidenció quemediante esta técnica se pudodemostrar un comportamientodiferenciado de las variedades ante elRSD, que va desde muy pocadiferencia entre las plantes tratadas einoculadas en My5514 hasta unadiferencia muy acentuada en C120-78.El comportamiento del porcentaje devasos funcionales corroboró losresultados alcanzados en otrasinvest igaciones con My5514(resistente) y CP31-294 (susceptible).Se analizó el saneamiento de lasvariedades Ja60-5, C1051-73 y CP52-43 mediante el contraste de fases (CF)y el STM cuando los tallos enfermosse trataron térmicamente condiferentes combinaciones de tiempo ytemperaturas (50.5ºC/2h, 53ºC/20min. y un testigo sin tratar). Seencontró la presencia de la bacteriautilizando el CF, sin embargo al analizarel porcentaje VF en todos los casos fuesuperior al 85% después de untratamiento de 50.5ºC/2h, lo cualconfirma la utilidad de este métodopara la evaluación del saneamiento alRSD, criterio que puede utilizarse parala calificación de los bancos de semilla.


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1-03 Marchitez de vitroplantas de bananos (FHIA-18, Gran enano yGross Michel) causadas por Pythium debaryanum Hesse en fase deaclimatización.

Michel Leiva Mora y Miguel Angel Dita Rodríguez.

Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central ”Marta Abreu” de LasVillas, Carretera a Camajuaní km. 5.5, Santa Clara, Villa Clara. Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras claves: banano, aclimatización, Phytium debaryanum, marchitez.

INTRODUCCIÓN

Como consecuencia de los cambiosprovocados por el cultivo in vitro en lasplantas micropropagadas ha sido necesariodesarrollar técnicas especiales deaclimatización en condiciones ex vitro e invitro que aseguren un acercamientogradual y progresivo a sus caracteresnormales.

La fase de aclimatización es de vitalimportancia para lograr plantas sanas yvigorosas aunque en muchos casos esteimportante requisito se ve obstaculizadopor la incidencia de plagas yenfermedades. La alta humedad relativaque se requiere, sobre todo en losprimeros momentos después deltransplante para evitar transpiracionesexcesivas y con ello lograr un desarrolloadecuado de los estomas y la cutículafavorece la aparición de numerososorganismos entre los que predominan: al-gas, hongos fitopatógenos aéreos y delsuelo, moluscos y enfermedadesbacterianas.

Dentro de las enfermedades observadasen nuestras condiciones, inciden conmayor frecuencia las causadas por hongosfitopatógenos. Dentro de los principalesgéneros encontrados se destacan: Pythium,Phytophthora, Fusarium, Cercospora, etc.

El género Pythium comprende variasespecies fitopatógenas productoras deDamping-off, marchitez, pudriciones defrutos, entre otros. Estos representantes son

habitantes del suelo, consideradoscomúnmente como patógenos débiles queatacan a las plantas en los primeros estadiosde su crecimiento y desarrollo, así comoen condiciones de elevadohumedecimiento del suelo.

El presente trabajo tuvo como objetivoprincipal la determinación del agentecausal de la marchitez de vitroplantas debananos en fase la fase de aclimatización.


Se tomaron vitroplantas de bananos en lafase de aclimatización (fase IV) de : FHIA-18 ( AAAA), ( AAA), ( AAA), Gross Michel yGran enano; los cuales evidenciaban unmarchitamiento pronunciado en todo elfollaje, además presentaban dañosnecróticos en la base del pseudotallo.Además, los daños en el sistema radicaleran apreciables.

De cada planta se extrajo el sistema radi-cal y se lavó por separado con aguacorriente durante un período de 15 min,posteriormente se desinfectó en unasolución de hipoclorito de sodio al 3% porun tiempo de 1 min y se lavó en unerlenmeyer que contenía 50 ml de aguadesionizada estéril. Las raíces fueroncolocadas en placas de Petri esterilizadasy con la ayuda de un bisturí estéril secortaron segmentos de 1cm de longitud yposteriormente se secaron en un papel defiltro previamente esterilizado, en la cabinade flujo laminar. Se tomaron placas dePetri de 7 cm de diámetro que contenían


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10 ml del medio PDA y en cada placa secolocaron 5 segmentos de raíces,seguidamente se incubaron a 28ºC y apartir de las 24 horas se procedió aobservar con la ayuda de un microscopioestereoscópico la aparición delcrecimiento micelial; una vez confirmadoel mismo se transfirió a placas de Petri de7 cm de diámetro conteniendo 10 ml delmedio PDA e incubadas a 28ºC durante48 horas. A los aislados obtenidos serealizaron preparaciones en portaobjetoscon lactofenol azul y se procedió adescribir sus características e identificar elgénero y especie.

Dentro de los principales caracteresculturales evaluados se destacaron: laforma de las colonias, color del céspedmicelial y del reverso de las colonias asícomo la textura.

Por último se realizó la prueba depatogenicidad, cumpliendo con el últimopostulado de Koch, sobre vitroplantasrecién adaptadas de Gran Enano encondiciones de sustrato previamenteesterilizado, con el régimen de humedadestablecido en la fase IV para simular lascondiciones a que son sometidas lasvitroplantas de bananos. Se utilizaroncuatro aislados y se inocularon a razón de105 ufc/ml y se emplearon por planta 20ml de la suspensión por planta e inocularon10 plantas por aislados.


Se determinó que el agente causal de lamarchitez de las posturas de bananos fuePythium derbayanum Heese, un patógenoimportante del suelo que se ve favorecidopor condiciones de alta humedad.

Se obtuvieron un total de 4 aislados delagente causal de la marchitez envitroplantas de bananos, que resultaron serpatogénicos, además se describieronalgunas características entre las que sedestacaron: hifas engrosadas, hialinas,ramificadas, sin septos, esporangiosdentados y alargados, zoosporangiosredondeados con zoosporas envueltas en

una matriz gelatinosa. Las coloniasobtenidas fueron de crecimientouniforme, el césped miceliar de colorblanco, con reverso blanco-amarillentoy de textura algodonosa. En losaislamientos realizados aparecieron otroshongos que demostraron tener actividadsaprofítica en el suelo, de ellos seidentificaron los siguientes géneros: As-pergillus, Rhizoctonia y Fusarium. Lascaracterísticas anteriormente descritascoinciden con las reportadas por autorescomo Walker (1965), Herrera (1989,1996).

Los primeros síntomas aparecieronaproximadamente a los 35 días despuésde inoculadas las plantas y se lograronreproducir con exactitud los síntomasobservados con anterioridad; el testigo sininocular no mostró ningún síntoma de laenfermedad. Con esto se confirmó quePhytium Debaryanum era el agente causalde la marchitez de las vitroplantas debanano en la fase de aclimatización.

Las condiciones de elevada humedadfavorecen la aparición de esta importanteenfermedad por lo que el uso de unsustrato con buenas propiedades físicasasí como mantener un régimen de riegoadecuado son elementos importantespara evitar la aparición de este patógeno.Recomendamos tener especial cuidadoen la elaboración del sustrato a utilizar,de modo que no permita unsobrehumedecimiento al establecerse lascondiciones de humedad requerida enesta fase. Además orientamos en loposible realizar una desinfección delsustrato y del material vegetal antes deser plantado.

BIBLIOGRAFÍA

Herrera, Y. L., 1996. La marchitez de lasvitroplantas de banano en la fase deadaptación causada por Pythiumderbayanum, Heese. Centro Agrícola3: 93-96.

Walker, J. C., 1965. Patología Vegetal. 2da

Edición. La Habana, Instituto cubanodel Libro, 818 p.


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1-04 Alternativa para el saneamiento al virus DMV en malanga(Xanthosoma sagittifolium Schott), Clon México 8, medianteelectroterapia.

Janet Igarza Castro1, Ricardo Hernández Pérez2, Beatriz Cruz Castellanos1.

1Laboratorio Provincial de Biotecnología Vegetal, Holguín, Cuba. E-mail:[email protected] Nacional de ViandasTropicales (INIVIT), Santo Domingo,Villa Clara. E-mail: [email protected]

Palabras claves: Xanthosoma sagittifolium, saneamiento, virus del mosaico de la malanga,electroterapia.

INTRODUCCIÓN

Los métodos tradicionales de saneamien-to a enfermedades han sido aplicados, porlo general teniendo en cuenta el patóge-no y su traslocación en el tejido de la plan-ta. Comúnmente se utilizan para atenuaro eliminar los virus en vegetales(Quar,1977; Lozoya y Dawson, 1982;Griffith et al., 1990; El Amin et al 1994;Hernández et al,1995). Numerosas inves-tigaciones al aplicar estas técnicas han lle-gado a obtener hasta un 100% de sanea-miento, sin embargo no se pueden pro-poner como tecnologías estandarizadasporque no cumplen con los requisitos fun-damentales como son la eficiencia paraentrar en un proceso productivo y presen-tan desventajas por el gran numero dematerial inicial destruido, largos periodosde tiempo para obtener material vegetalpara el diagnostico y la baja producciónde material saneado ( Hernández et al.,1997).

Hernández et al, (1997) construyeron unequipo con aditamentos para procesar ungran número de muestras para el progra-ma Nacional de Saneamiento del Comple-jo Viral del Ajo (Patente AO 1C/ 08 No22496) extendido después como métodoal Programa Nacional de Producción demicropropagación de líneas sanas de cañade azúcar desde 1995-1997, como alter-nativa para el control de bacterias y virus (Hernández et al, 1997) y posteriormenteen papa para el control del Virus delEnrollamiento de la Hoja de la papa(Bernal y Hernández 1997), reportadopara otros virus como el PVX y PVY (Lozoya, 1996).

Según se informa la enfermedad más di-fundida en Xanthosoma, Colocasia y deforma general en las Aráceas, es el virusdel mosaico de la malanga (DasheenMosaic Virus, DMV) (Zettler et al, 1978);encontrándose su incidencia en Cuba enel 95% de las plantaciones de malanga(Quintero, 1987). Teniendo en cuenta laslimitaciones que tienen el cultivo demeristemos y las pérdidas que se produ-cen cuando se usa la hidrotermoterapia(MINAGRI, 1990), es que consideramosimportante estudiar como alternativa de sa-neamiento el uso de la corriente eléctricapara la eliminación del virus mosaico de lamalanga (DMV).

Se seleccionaron los cormos debidamen-te diagnosticados con presencia de la en-fermedad viral DMV. A las yemas se le apli-có electroterapia como método de sanea-miento y los ápices meristemáticos (0.1-0.5 mm) fueron sembrados en medios decultivo lquido según tecnología demicropropagación en el cultivo de malangadel INIVIT (García et al, 1998). Se realiza-ron dos subcultivos para el diagnósticomediante UM-ELISA, obteniéndose comoresultado de los diferentes tratamientoseléctricos empleados un 100 % de plan-tas regeneradas, mayor que el testigo sintratar (70-75 %). Una X de crecimientode casi el doble del tamaño de lasvitroplantas (6,1cm). Con un saneamien-to al virus entre 70-100%. Los resultadosde la investigación al aplicar laElectroterapia, permiten llegar a definir unprocedimiento para la obtención de plan-tas libres al DMV lo cual fue comproba-do en el clon Mex-8 del géneroXanthosoma.


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1-05 Selección de plantas libre de virus en el campo para lamicropropagación de Xanthosoma sagittifolium L.

Malachy Dottin1, Juan N. Pérez Ponce1, D. Agramonte1, R. Hernández2, TatianaPichardo1 y Felipe Jiménez1.

1Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central “ Marta Abreu” de lasVillas. Carretera a Camajuaní km. 5.5, Santa Clara, Villa Clara. Cuba. E-mail:[email protected] de Viandas Tropicales, Apartado 6, Santo Domingo, Villa Clara. E-mail:[email protected]

Palabras claves: micropropagación, Xanthosoma sagittifolium, malanga, diagnóstico, vi-rus del mosaico de la malanga.

INTRODUCCIÓN

La selección de planta donadores demalanga se debe realizar en el banco degermoplasma de alta calidad genética yfitosanitaria o en plantaciones destinadasa semillas, con adecuada agrotécnia ysistemas fitosanitarios preventivosestablecidos, esto es lo ideal. Resultaríaademás de gran factibilidad realizar laselección en plantación de vitroplantas,donde la utilización de semilla sanadisminuye los niveles de infección de loscampos. Cualquier intento pordesarrollar un programa de reproducciónde semilla básicas en este cultivo en lasbiofábricas del país, llevaría implícito lautilización de una gran cantidad recursosy equipamientos indispensable paraobtener las plantas sanas de DMV Portanto, Los objetivos de este trabajofueron los de conocer las posibilidadesde detectar el Mosaico de la Malanga através de un kit comercial, enfretándoloal aislado presente en Villa Clara,mediante la aplicación de la técnica deUM-ELISA en plantas micropropagadasy procedentes de campo.


Las técnicas util izadas para elprocesamiento de las muestras siguieronel procedimiento descrito por Bernal(1997). Se evaluaron 90 plantas de untotal de 5557 de 1.2 hectáreas en elcampo. El carácter sintomático yasintomático de sendos grupos fueconfirmado mediante el diagnóstico por

Utramicro-ELISA de doble anticuerpo enel Laboratorio de Virología del IBP. Lainterpretación de los resultados se realizóconsiderándose positivas todas aquellasmuestras cuyo valor fue superior al límitede corte (cut off) obtenido por el duplode la medida de los controles negativos.Las placas fueron repetidas cuando noreunían los parámetros de calidadprevistos para los análisisinmunoenzimáticos (Peralta y Frías,1987).


La tabla 1 muestra la comprobación en-tre los valores de fluorescencia, obteni-dos en muestras con síntomas del Mo-saico, semejantes a los producidos porel DMV en campo y los valores de plan-tas asintomáticas. Se analizaron 45 plan-tas con síntomas, sólo el 32.4% de plan-tas con síntomas del mosaico en camporesultó positivo y el 67% negativo.

A manera de conclusión se observa queel porcentaje de plantas negativas alDMV en campo fue de 44.0-55.5%, laselección en base a los síntomas decampo no fue eficiente para obtenerplantas negativas al DMV y las plantaspositivas y negativas se comportaron consimilares coeficientes de multiplicaciónin vitro (Tabla 2). Estos resultadosobtenidos permiten postular que con uneficiente sistema de diagnóstico sepueden seleccionar plantas libres del vi-rus en el campo.


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Tabla 2: Resumen de la presencia de DMV en campo, in vitroy en fase de adaptación.

Plantas en campo

Consíntomas

Sinsíntomas

Vitroplantasin vitro

Vitroplantasen fase deadaptación

% Positivas 26.6 b 40.0 b 46.4 a 56.4 a

% Negativas 55.5 a 44.0 ab 53.6 a 39.8 b

% Dudosas 17.7 c 52.0 a 0 b 3.8 c

Tabla 1: Valores de fluorescencia de muestras y controles consíntomas y asintomáticos procedentes de campo.

Plantas con síntomas Plantas asintomáticasNo.

MuestrasVal. Fluoresc No.Muestras Val. Fluoresc

Positivos 12 14.99 1 13.29Negativos 25 6.59 11 5.22Dudosos 8 11.20 13 11.33

Total 45 - 25 -

BIBLIOGRAFÍADottin , M., 1997. Tecnologías para

la micropropagación in vitro declones de Xanthosoma sagittifolium(L).Tesis de Maestría. UniversidadCentral de las villas. Santa ClaraCuba.

Bernal, F. J., 1997.Técnicas desaneamiento para la obtención dePapa.(Solanum tuberosum.L.) librede virus. Tesis de Maestría.Universidad Central de las Villas.Santa Clara Cuba.


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1-06 Caracterización del organismo causal de la Escaldadura foliaren caña de azúcar.

Madyu Matos, Yamilé Figueredo, J. R. Pérez Milián, Antonio Chinea y Fran-cisco Jerez.

Estación de Investigación de la Caña de Azúcar. Jovellanos 42600, Matanzas, Cuba. E-mail: [email protected]

Palabras claves: caña de azúcar, escaldadura foliar, Xanthosonas albilineans, bacteria,identificación.

INTRODUCCIÓN

La escaldadura foliar de la caña de azúcar,producida por la bacteria Xanthomonasalbilineans (Ashby) Dowson, es una de lasenfermedades vasculares más importantesa nivel mundial y está representada en 59regiones geográficas. La sintomatología deesta enfermedad se distingue por presen-tar tres fases diferentes: crónica, aguda yuna fase de latencia, que puede durar des-de algunas semanas o meses, durante loscuales los tallos o raíces infectadas no ma-nifiestan ningún síntoma. En Cuba per-maneció en latencia durante muchos años,sin embargo recientemente se observó unamanifestación de la sintomatología queafectó a un gran número de variedades.La célula bacteriana, presenta forma alar-gada con dimensiones de 0.25-0.30mmpor 0.6-1.0mm, puede aparecer solitariao en cadenas y presenta un flagelo polar.Las colonias que forma son de color ama-rillo pálido, viscosas pero no mucosas. Sehan encontrado 3 serovares distribuidos endiferentes zonas geográficas del mundo. Elestudio de la resistencia varietal y la carac-terización morfológica, serológica ybioquímica del organismo causal es de vi-tal importancia para la obtención de va-riedades resistentes a esta enfermedad ygarantizar un sistema de semilla con la ca-lidad fitosanitaria que exigen los progra-mas nacionales, ya sea por víabiotecnológica o por el sistema tradicio-nal.El objetivo de este trabajo fue caracterizarlos aislamientos de la bacteria obtenidossobre medio de cultivo Wilbrink, a partirde variedades con síntomas de la enfer-medad.


Se estudiaron 6 aislamientos procedentes delas variedades L55-5, C120-78, C86-503,C85-214, My55-14 y CS93-4392 de las pro-vincias de Matanzas, Villa Clara y La Habana.Para la evaluación morfológica se tuvo encuenta la dinámica de crecimiento a 28ºC ylas características culturales de las colonias.La evaluación bioquímica incluyó la tinciónde Gram, el comportamiento de la bacteriafrente a la catalasa, el almidón, así como sucrecimiento en agar nutriente y medioWilbrink sin peptona. El estudio serológicose realizó mediante la técnica de Aglutina-ción en portaobjetos y la InmunodifusiónDoble (IDD), utilizando antisueros de pro-ducción nacional.


Como resultado de la evaluación morfológicase apreciaron colonias aisladas de 1mm dediámetro con bordes enteros, lisas, de colormiel al principio, brillantes y después se tor-naron amarillas, las cuales comenzaron a cre-cer a partir del 5to y 6to día de sembradas,coincidiendo con lo descrito por otros auto-res. Al realizar los ensayos bioquímicos elcomportamiento fue el esperado, en todoslos casos respondieron al género y especieestudiados. La evaluación serológica corro-boró la presencia de X. albilineans, ya que laaglutinación en portaobjetos fue positiva contodos los aislamientos y la IDD reveló identi-dad serológica entre las cepas y el antisueroutilizado. Podemos concluir que las cepasanalizadas responden a la presencia deXanthomonas albilineans (Ashby) Dowson yestas pueden ser utilizadas para lasinoculaciones en los experimentos de resis-tencia de las variedades de caña de azú-car ante la escaldadura foliar.


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1-07 Diagnóstico del virus del estriado del banano (BSV) en cultivareshíbridos de la FHIA y otros de interés comercial en Cuba.

Tatiana Pichardo Moya 1, Elio Jiménez 1, Caridad Font 2, Elena Medina 3,Rafael Prado3.

1Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central «Marta Abreu» de LasVillas. Cuba, Carretera a Camajuaní km. 5.5 Santa Clara, Villa Clara, Cuba. E-mail:[email protected] Nacional de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Ministerio de la Agricultura,Cuba.3Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal de Villa Clara. Ministerio de la Agricultura,Cuba

Palabras claves: banano, virus del estriado del banano, diagnóstico.

INTRODUCCIÓN

El virus del estriado del banano (BSV)se ha convertido en los últimos añosen una fuerte preocupación para losproductores de bananos y plátanos anivel mundial. Aún cuando existenmuy pocas evidencias acerca del im-pacto agronómico y económico de laenfermedad y la interacción entre lasrazas del virus y los distintos cultivares,sí se han reportado pérdidas importan-tes en algunos genotipos.

Este virus fue descrito por primera vezen Costa de Marfil (Lassoudiere, 1974)y fue aislado por Lockhart en 1986.El mismo ha estado ampliamente dis-tribuido en distintas áreas geográficas,sin embargo el incremento reciente ensu incidencia parece estar ligado, aun-que no siempre, al uso de híbridostetraploides (INIBAP, 1998).

En Cuba fueron introducidos a iniciosde la década del 90 un grupo dehíbridos tetraploides de la FederaciónHondureña de Investigaciones Agrarias(FHIA) y varios de ellos han sido pro-

pagados aceleradamente mediante cul-tivo in vitro e introducidos ampliamen-te a escala comercial. El objetivo delpresente trabajo fue realizar un diag-nóstico de BSV y determinar su posi-ble distribución entre los principalescultivares híbridos de FHIA introduci-dos al país así como otros cultivares deinterés comercial.


Se colectaron en campo muestras de11 cultivares tetraploides así como delos cultivares triploides Gran Enano yGross Michel (AAA) procedentes de laEstación Experimental del IBP en Re-medios y de la Empresa de CultivosVarios La Cuba en la provincia de Cie-go de Avila.La detección del BSV se realizó utili-zando la técnica de DAS-ELISA con unkit comercial de la firma AGDIA, si-guiendo el protocolo recomendado porel fabricante. La lectura de las placasse realizó en un equipo SUMA 121.


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En los dos muestreos realizados, de untotal de 650 plantas testadas 26 resul-taron positivas para un 4% de infec-ción. La presencia del virus fue detec-tada en 8 de los cultivares híbridos deFHIA (FHIA 01-V1, 02, 04, 18, 19, 21,22 y 23), con rangos que oscilaronentre un 2 y un 30 % de infección,mientras que en los cultivares FHIA 01,05 y 20 no se detectó ninguna plantapositiva. En los dos cultivares triploidesincluidos en estos ensayos (Gran Ena-no y Gross Michel) no se detectaronplantas con infección por BSV. Estos re-sultados coinciden con la hipótesis deque la incidencia de este badnaviruses mayor en cult ivares híbridostetraploides, tal vez debido a la activa-ción de secuencias virales integradasque ocurre durante el propio procesode hibridación (INIBAP, 1998). Otrosfactores como stress ambiental y lamultiplicación in vitro han sido identi-ficados como causas también del au-mento de la incidencia del BSV. Ladetección de este virus es muy proble-mática debido a la heterogeneidadgenómica y serológica de los distintosaislados, es por esta razón que se pre-cisa del desarrollo de métodos de diag-nóstico que permitan la detección másprecisa del virus tanto en su formaepisomal como integrada.

Los resultados de este trabajo consti-tuyen la base para posteriores estudiossobre la incidencia y distribución deesta enfermedad en cultivares de Musasp. en Cuba.

BIBLIOGRAFÍA

INIBAP, 1998.Banana streak virus: aunique virus-Musa interaction?Proceedings of a workshop of thePROMUSA Virology working groupheld in Montpellier, Frnace. 19-21January.67 pp.

Lassoudiere, A., 1974. La mosaique ditea tirets du bananier Poyo en Côted´Ivoire. Fruits 29:349-357.

Lockhart B. E.L. 1986. Purification andserology of a bacilliform virusassociated with banana streak virusdisease. Phytopathology 76 (10):995-999.


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MEJORA POR VARIACIÓN SOMACLONAL, MUTAGÉNESIS YSELECCIÓN IN VITRO.

2-01 Obtención, evaluación y extensión de somaclones de cañade azúcar (Saccharum spp. Híbrido).

Juan Pérez Ponce, Pedro Orellana Pérez, Elio Jiménez González, Rafael GómezKosky, Víctor Gil Díaz, Lourdes García Rodríguez, Ignacio García Moya, BlancaPérez Mederos, Idalia Herrera O´Farrill, María de los Ángeles Águila, Elio AlfonsoCastro, Juan Vidal Herrada1, Ignacio Santana2, Omelio Carvajal2,

Instituto de Biotecnología de Las Plantas, Universidad Central “Marta Abreu” de LasVillas. Carretera a Camajuaní, km. 5,5 Santa Clara, Villa Clara. Cuba. E-mail:[email protected] de Montaña del Escambray ( FAME), Universidad Central “Marta Abreu” deLas Villas, Cuba.2Estación Experimental de la Caña de Azúcar, EPICA, Jovellanos, Matanzas.

Palabras claves: caña de azúcar, mejoramiento genético, mutagénesis, somaclones IBP.

INTRODUCCIÓN

La alta ploidía de las especies implicadasen el mejoramiento genético, lainestabilidad de los cromosomas debidoa las aneuplodías (Price, 1962) y almosaico cromosómico que se presentaen este cultivo, hacen muy difícil losestudios genéticos, así como los trabajosde mejoramiento clásico por hibridación.Por ello se trabaja con grandes poblacionessegregantes, de modo que la eficienciade muchos programas de cruzamientoes baja, ya que requieren de 10 a 15años de trabajo en los esquemas deselección a partir de cruzamientos, y parala obtención de una nueva variedad comomedia mundial se requieren 500 000posturas.

Con el surgimiento de las técnicasbiotecnológicas que permiten manejar invitro órganos, tejidos y células, surgeuna amplia perspectiva para el empleode estas técnicas tanto para lapropagación masiva como para elmejoramiento genético

La posibilidad de tener un método sencilloy eficiente para poder mejorar caracteresespecíficos a buenos genotipos, comoresistencia a enfermedades o a condiciones

ambientales adversas como sequía osalinidad u otros defectos de las plantasha sido siempre una hipótesis de lagenética mutacional, sin embargo, no sehan obtenido los resultados que seesperaban. Con el empleo del cultivo invitro para la mutagénesis inducida se abrenmuchas perspectivas para la genéticamutacional, lo que puede considerarse lanueva era de las mismas


Para la aplicación de técnicasbiotecnológicas en la mejora genéticade la caña de azúcar se realizaroninvestigaciones básicas para evaluar laregeneración de plantas con alta eficiencia,la magnitud de la variación somaclonal, elempleo de mutagénicos físicos y químicosin vitro, así como los métodos yprocedimientos para la selección depoblaciones obtenidas in vitro. Para laejecución del trabajo se confeccionó unesquema de selección (Pérez Ponce et al.,1998) donde se obtuvieron de 5000 - 22928 individuos por variedad de interés parala producción, los que fueronseleccionados sobre la base de los objetivosespecíficos de la mejora. En el caso de lavariedad B43-62 también se trabajó contratamientos mutagénicos químicos en las


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yemas. Los mutagénicos empleados fueronradiaciones de Co60 a dosis de 10 - 20 -30 - 40 y 50 Gy y NaN3 a 0.01, 0.001 %.Se determinaron las técnicas yprocedimientos in vitro incluyendo lostratamientos mutagénicos. Losexperimentos de campo fueron evaluadosen base a las características morfológicassegún metodología de Dillewjin (1952) ypara los caracteres agroazucareros por lametodología del INICA, (Anónimo, 1985)


Con los resultados metodológicos sedefinió un esquema de selección, tambiénse verificó que sólo después de tresmultiplicaciones vegetativas, se puederealizar una selección de verdaderosmutantes.

Se obtuvieron 16 somaclones. Lossomaclones obtenidos fueron evaluadoscon respecto a la resistencia aenfermedades en las pruebas estatalesestablecidas para este objetivo. Elcomportamiento agroazucarero se

determinó en experimentos de campodesarrollados en estaciones experimentalesde la Universidad Central, del INICA y enbloques experimentales de complejosazucareros. Para la extensión se obtuvieronde 200000 a 400000 vitroplantas de cadasomaclón seleccionado en dependenciade las solicitudes de la producción. De los16 somaclones evaluados 5 se aprobaronpara la extensión e introducción en laproducción, estos son: de la CP52-43 elsomaclón IBP83-27, de C87 51 el IBP 87-100 de POJ28-78 los somaclones IBP 89-112, IBP 89-361 e IBP 89-355.En la tabla1 se exponen los resultados integrales delprograma, apreciándose que para laobtención de una nueva variedad serequirieron 11 432 individuos y losesquemas de selección duraron de 5 a 7años demostrándose la eficiencia de lamejora mutacional in vitro en comparacióncon la mejora convencional para caracteresespecíficos, lo cual ha sido planteado porvarios investigadores, pero no conresultados concretos (Larkin y Scowcroft,1981 y Micke y Donini, 1994 ).

Tabla 1. Resultados del programa de mejora por Biotecnología.

Carácter a mejorar.y Genotipo

Tratamiento mutagénico NoPlantas

Selección x TratamientoTotal No. % Total

Variedadesobtenidas

Contenido de azúcar POJ28-78

10 - 20Gy callos 8 230 4 10 Gy-220 Gy-2

0.04 2-10 Gy1-30Gy

3

Reducción de la floraciónC52-43

0 - 10 - 30 - 50Gycallos

5 000 8 0-2, 10Gy-2,3-1, 50Gy-3

0.16 1-10Gy 1

Resistencia a roya B43-62 NaN3 0.01 callo 22 928 3 2-40Gy1 NaN3

0.02

Resistencia a la sequíaC87-51

10 y 20Gy callo 6 000 1 1 - 10Gy 0.01 1-10Gy 1

Resistencia a carbónJa60-5 y My54-50

0 - 10 - 30Gy callo 15 500

TOTAL 57 158 16 --------- ------4-10Gy1-30Gy

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BIBLIOGRAFÍA

Dillewijn, C. Van., 1952. Botánica de lacaña de azúcar. Ed. Revolucionaria,Instituto del Libro. Habana 480 p.

Larkin, P., J., Y W., R., Scowcroft, 1981.Eyespot disease of sugarcane. PlantPhysiol. 67; 408-414.

Micke, A., y B., Donin, 1994. InducedMutation. En: M. D. Haywood, N. O,Chapman y J. Hall (Eds) Plant Breed-ing; Principles and Prospectcs p 52-62.

Anónimo, 1985 Normas técnicas para elcultivo de la caña de azúcar y lasevaluaciones de campo. INICA.

Pérez Ponce, J.N., 1998. Mutagénesis invitro. En: J. N. Pérez Ponce (Ed)Propagación y mejora genética deplantas por biotecnología. Instituto deBiotecnología de las Plantas p 297-324.


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2-02 Mejoramiento del híbrido de plátano FHIA - 21 (AAAB) con eluso de la mutagénesis in vitro.

Idalmis Bermúdez, P. Orellana, J. Pérez Ponce, J. Clavero, N. Veitía, C. Romero,L. García R, R. Mujica y L. García.

Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP). Universidad Central “Marta Abreu” deLas Villas. Carretera a Camajuaní Km. 5.5 Santa Clara, Villa Clara, Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras claves: FHIA-21, mutagénesis, mejoramiento genético, Sigatoka negra,radiaciones Gamma.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad más destructiva debananos, plátanos y bananos de cocciónen el mundo es la Sigatoka negra(Mycosphaerella fijiensis Morelet). Desdesu aparición en Cuba en noviembre de1990, la Sigatoka se ha convertido en laenfermedad fungosa más importante queafecta las plantaciones de plátanos ybananos en el país.

La solución más adecuada para reducirlos daños de esta devastadoraenfermedad, es el desarrollo devariedades resistentes. Desde 1984 laFHIA (Federación Hondureña deInvestigación Agrícola) ha venidodesarrollando un amplio programa parala búsqueda de híbridos resistentes a laSigatoka, entre ellos el plátano FHIA-21(AAAB), tipo French (hembra), de altorendimiento, buena calidad y tamaño delos frutos, resistente a Fusariumoxysporun, pero presenta problemasdebido a su porte demasiado alto y supobre ahijamiento.

El empleo de agentes mutagénicosconjugados con las técnicas de labiotecnología ofrece una oportunidad deintensificar la variabilidad genética paramejorar características agronómicas (Hoet al, 1993, 1994). Adicionalmente, ladisponibilidad de las técnicas de cultivode tejidos también facilita la inducción,la selección y propagación de losmutantes.

En vistas del estado actual de las técnicasde mejoramiento con el uso de la

Biotecnología se desarrolló este trabajocon el objetivo de seleccionarsomaclones con porte bajo enpoblaciones irradiadas del cultivar FHIA21 y estudiar su comportamiento frentea la Sigatoka negra.


La primera parte del trabajo consistió enel establecimiento en el laboratorio delmaterial vegetal, para luego multiplicar-lo in vitro siguiendo el procedimientoque describen Orellana et al,. (1991).Luego fueron irradiadas con dosis de 25Gy de radiaciones Gamma, fuente C60,para inducir variabilidad en el materialvegetal (multiyemas). Posteriormente semultiplicaron durante 5 subcultivos y seregeneraron hasta obtener 10 000vitroplantas enraizadas, las que se sem-braron en invernadero durante 45 díasy finalmente fueron transplantadas alcampo, en la Estación Experimental deRemedios (IBP). Durante el desarrollo dela plantación, no se realizaron aplicacio-nes de fungicidas y se realizó una laborcultural mínima para observar la respues-ta natural de las plantas.

Las evaluaciones realizadas consistieronen la selección de plantas con caracte-res positivos en el campo, a la vez quese estudió la variabilidad de la población.Se evaluó la altura de la planta (estable-ciéndose tres rangos ), diámetro delpseudotallo, número de hojas totales ynúmero de hojas manchadas porSigatoka negra en la emisión y cosechadel racimo, número de manos y dedosdel racimo (en tres rangos). Las líneas con


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características positivas se sembraron enla misma Estación Experimental, en for-ma de estudio clonal a 5 plantas por lí-nea en comparación con el FHIA 21 ori-ginal. Las líneas más promisorias fueronimplantadas in vitro para incrementar lapoblación de cada una de ellas y estu-diarlas en otros ambientes.


Las evaluaciones mostraron una alta va-riabilidad en el material vegetal en cuan-to a la altura de la planta, diámetro delpseudotallo, número total de hojas, in-cidencia de Sigatoka negra así comocambios en el racimo, lo cual indica laeficiencia de la combinación delmutágeno físico y el cultivo de tejidos.Resultados semejantes obtuvieronNovak et al., (1990) en un programa demejoramiento por mutaciones en losclones de este género.

Una alta tasa de variación entre las plan-tas fue observada fundamentalmente enla altura de estas como se puede apre-ciar en la tabla 1.

En el material irradiado seleccionado seobtuvieron 41 plantas(38,3%) con altu-ra inferior a 250 cm y 61 (57,0 %), quevarió entre 251 y 300 cm, sólo 5 plantasseleccionadas, sobrepasaron los 300 cm. En la población irradiada no seleccio-nada el 35.76 % de las plantas alcanza-ron una altura no superior a 250 cm y el58.68 % no sobrepasó los 300 cm. Loanterior evidencia que existió una mar-cada influencia ambiental en ambas po-blaciones, pues la altura normal de estecultivar para el primer ciclo oscila entre250 y 300 cm, sin embargo, se encon-tró dentro de las plantas de porte másbajo, en el material irradiado, varias concambios favorables en cuanto al tama-ño del dedo, forma del racimo y estruc-tura foliar, muy diferentes a las del origi-nal. Los objetivos de la investigación noestaban encaminados sólo a la búsque-da de plantas de porte bajo, pues comoindican los valores porcentuales, estosse mantienen muy similares, sino tenien-do en cuenta el conjunto de otros ca-racteres positivos. Es importante seña-lar que muchos cultivares de plátanos ybananos, en el primer ciclo, no desarro-

llan la altura que alcanzan en los siguien-tes.

Se observaron también grandesvariaciones en el número de dedos delracimo en la población total,obteniéndose una mayor cantidad deplantas con racimos de más de 60 dedos.La frecuencia de variantes fenotípicas enlas primeras 1024 plantas evaluadas fuede 4.00 %, obteniendo 4 somaclonescon posible cambio a Horn, aunque dosde ellos han presentado afectaciones porSigatoka negra (Tabla 2).

Cuando se comparó la población dematerial irradiado seleccionada y no se-leccionada en cuanto a su promedio ya la desviación típica de las poblaciones,se pudo determinar que el material irra-diado no seleccionado presentó una al-tura media de 270.71 cm superior a ladel material seleccionado que fue de250.44 cm. En el caso del número demanos por racimo la media estuvo en-tre seis y siete manos en ambos casos.Al analizar los promedios del número dededos por racimo se encontró que lasplantas lograron en la mayoría de los ca-sos más de 60, mostrando una correla-ción positiva entre la altura de la plantay el número de dedos totales por raci-mo.

Entre las selecciones se destacan cincoplantas que presentaron el mejor com-portamiento integral en varios caracte-res, encontrándose diferencias entre ellasen cuanto a su reacción a la Sigatokanegra.

Las líneas seleccionadas se hanestablecidas nuevamente in vitro con elfin de producir suficiente cantidad deplantas para las comparacionesposteriores en ensayos replicados con elcultivar original FHIA-21, una vez setengan los resultados del estudio clonal.Es importante señalar que existió una altaafectación por Sigatoka negra en el clonFHIA-21 de forma general, no llegandoa llenar completamente los dedos del ra-cimo, siendo esto contradictorio con re-portes que plantean la alta resistencia deeste híbrido (Cote et al. , 1994).


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Tabla 1, Comportamiento de la variabilidad en la altura de las plantasdurante el primer ciclo.

Rangos de altura (cm) No. de plantasseleccionadas

Frecuencia decambios (%)

MATERIAL IRRADIADO SELECCIONADO100-250 41 38.30251-300 61 57.00> 300 5 4.70TOTAL 107 100.00

MATERIAL IRRADIADO SIN SELECCIONAR100-250 103 35.76251-300 169 58.68> 300 16 5.55TOTAL 288 100.00

Tabla 2. Variaciones fenotípicas observadas en plantas seleccionadasdurante el primer ciclo, con relación al cultivar original.

No.plantasevaluadas

Porte bajo(posibleHorn)

Dedosmás

largos.

Dedoscortos yfinos.

Dedospequeñosy rectos.

AltaresistenciaSigatokanegra.

FrecuenciaTotal(%)

1024 4 10 20 12 3 4.00

BIBLIOGRAFÍA

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Orellana, P. P., Pérez, J., Agramonte, D.,Gómez, R., Jiménez, E., Martínez, S.,Almaguer, E y Gómez, R. 1991. Lamicropropagación del plátano a es-cala comercial en Cuba. ACEVIC.Boletín Científico. Vol. 3 (3) : 29-38.


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2-03 Inducción de mutaciones por radiaciones Gamma en el cultivoin vitro de brotes de banano cv. Gran Enano (AAA).

Lourdes García Rodríguez, Idalmis Bermúdez Caraballoso, Pedro Orellana Pérez,Novisel Veitía Rodríguez, Leonardo García Rodríguez, Justo Clavero García yCarlos Romero Quintana.

Instituto de Biotecnología de Las Plantas, Universidad Central “Marta Abreu” de LasVillas, Carretera a Camajuaní Km 5.5 Santa Clara, Villa Clara, Cuba, [email protected]

Palabras Claves: banano, mutagénesis, radiaciones Gamma, variación fenotípica,mejoramiento genético

INTRODUCCIÓN

Los plátanos y bananos constituyenunos de los principales cultivos en lospaíses tropicales y subtropicales, sien-do el cuarto después del arroz, el tri-go y el maíz en importancia para la ali-mentación. Sin embargo la producciónde Musa está seriamente afectada porla incidencia de plagas y enfermeda-des causadas por hongos, bacterias,virus y nemátodos. Debido a que lamayoría de los clones de plátano y ba-nano son propagados vegetativamente,generalmente son triploides , estérilesy con frutos partenocárpicos, el mejo-ramiento a través de cruzamientos esextremadamente dificultoso, por loque la utilización del mejoramiento pormutaciones cobra un rol importante eneste cultivo.

Las técnicas convencionales de muta-ción han sido frecuentemente utiliza-das para mejorar los rendimientos, ca-lidad, enfermedades y plagas en loscultivos. Ya que se pueden cambiar unao pocas características de un cultivarsin alterar completamente al genotipo.Más de 1700 variedades mutantes de-sarrolladas de 154 especies de plan-tas han sido oficialmente liberadas(Maluszynski et al., 1995). El uso delcultivo in vitro puede sobreponer al-gunas de las limitaciones en la aplica-

ción de esta técnica y en combina-ción pueden acelerar los programas demejoramiento desde la generación dela variabilidad hasta la selección y lamultiplicación de los genotipos desea-dos. Las ventajas que como modelotiene el cultivo in vitro, para la aplica-ción de la mutagénesis están claras pordos razones biológicas que son: la ca-pacidad de regenerar plantas a partirde una o poca células y la otra, la ca-pacidad de la descomposición de lasquimeras manejando el cultivo (Pérez,1998).

Con el objetivo de estudiar diferentesdosis de radiaciones Gamma en bro-tes del clon Gran Enano para selec-cionar el rango óptimo y cuantificarlas alteraciones fenotípicas encontra-das en la población es que se decidela realización de este trabajo.


Ápices de banano cv. Gran Enano(AAA) fueron aislados de cormos pro-venientes de la Estación experimentalde Remedios ( IBP) para su estableci-miento en el laboratorio según el pro-cedimiento descrito por Orellana et al.(1991). Los brotes obtenidos se colo-caron en un medio para la inducciónde yemas adventicias compuesto porlas sales MS suplementadas con 6Bencil aminopurina (6BAP) 20 mgh/l,


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ácido indolacético (AIA) 0.65 mg/l ysacarosa 30 g/l. El pH del medio seajustó a 5.8. Los explantes fueron tra-tados con 8 dosis desde 5 hasta 40Gy de radiaciones gamma empleandouna fuente Co60. Inmediatamentedespués del tratamiento fueron colo-cados en frascos de cultivo de tejidosque contenían 30ml del medio de cre-cimiento Se utilizaron 100 explantespor tratamiento. La misma cantidadfue evaluada como testigo sin la apli-cación del tratamiento mutagénico. Laradiosensibilidad y la recuperaciónposterior fueron medidas evaluando:. Peso fresco a los 14, 30 y 45 días

después de aplicado el tratamien-to mutagénico. Porcentaje de mortalidad de losbrotes a los 45 días.

Con la dosis seleccionada se proce-dió a un tratamiento masivo deexplantes con el objetivo de evaluar encondiciones de campo las alteracionesfenotípicas de las plantas. Se sembra-ron 6000 vitroplantas en el área de laEstación Experimental antes menciona-da, evaluándose los cambios encontra-dos.


Los explantes mostraron diferentesrespuestas en dependencia de las do-sis de radiaciones aplicadas y los utili-zados como testigo tuvieron un incre-mento del peso fresco de 8.21 gr.,mientras que los tratamientos mostra-ron una disminución gradual del incre-mento del peso a medida que las dosisde radiaciones se hacían mayores, lle-gando solo a 2.2 gr. con la dosis de 40Gy. Cuando se analizó el porcentaje demortalidad encontramos que aumen-tó considerablemente a medida que seincrementaron las dosis de radiacionesencontrándose los valores de la LD50entre 20-25 Gy.

Roux, (1997) realizando un estudio deradiosensibilidad en varios cultivares

de Musa encontró que existían diferen-tes respuestas en dependencia del ni-vel de ploidía y la constitución genéticade los clones proponiendo diferentesdosis de radiaciones gamma para cadauno: 10-20 Gy para los diploidesCalcutta 4 (AA) y Tani (BB), 30-40 Gypara los triploides Gran Enano (AAA)y Williams (AAA) y 40-50 Gy para eltriploide Cachacco (ABB).

En nuestro trabajo con dosis de 40 Gyencontramos un porcentaje de morta-lidad muy alto (85%), por lo que po-demos considerar esta dosis como le-tal, seleccionándose 25 Gy como ladosis óptima que permite un creci-miento aceptable de los explantes enel medio de cultivo.

Una considerable variación fenotípicafue observada en las plantas regenera-das desde los brotes después del trata-miento mutagénico. En los primerosestados de desarrollo de las plantas lairradiación afectó la emergencia y laexpansión de las hojas jóvenes. Las al-teraciones fenotípicas encontradas seaprecian en la tabla 1. Aberracionesmorfológicas fueron observadas prin-cipalmente en algunas hojas jóvenes,lo cual indica un daño en el meristemoapical. Las variantes comprendieroncambios fenotípicos en la estatura dela planta, en la morfología y pigmenta-ción de las hojas y el pseudotallo, asícomo en el hábito de crecimiento dela planta y el florecimiento precoz (al-rededor de los 9 meses). Novak,(1990) obtuvo un 7.4% de alteracio-nes fenotípicas cuando trató brotes deGran Enano con 30 Gy, en nuestro tra-bajo obtuvimos un 20.28% de cambiosfenotípicos, donde el mayor porcen-taje de variación se encontró n los cam-bios de coloración del margen delpeciolo (39.6%) del total de variacióny en el cambio de coloración de lashojas (18.39%).


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Tabla1. Alteraciones fenotípicas observadas en las plantas de banano cv. GranEnano ( AAA) después de ser tratados los brotes con las radiaciones Gamma, dosisde 25 Gy.

Tipo de variación fenotípica No. plantas %

Enanismo: Plantas por debajo de los 1.10 m de

altura

50 5.4

Coloración violácea de las hojas, nerviaciones y

pseudotallo

93 10.12

Forma irregular de las hojas, textura coriácea 25 2.72

Cambio en la coloración de las hojas

• Aumento de la pigmentación por antocianina

(Hojas verde amarillentas y variegadas)

• Tonalidad verde oscuro

• Incremento de manchas violáceas

137

14

18

14.9

1.52

1.96

Cambio de coloración del margen del peciolo

• Verde

• Pardo oscuro

• Franja ancha violácea

108

71

185

11.75

7.72

20.13

Rayado blanquecino de las hojas y el pseudotallo 6 0.65

Cambio en el hábito de crecimiento de la planta

1. Hojas erectas

2. Roseta

3. Abanico

93

21

8

10.12

2.28

0.87

Pseudotallos finos 26 2.83

Florecimiento precoz (9 meses) 14 1.52

Unión de dos o más cambios 50 5.44

BIBLIOGRAFÍA

Maluszynski, M.; Ahloowalia, B.S.;Sigurbjörnsson, B., 1995. Aplicationof in vivo and in vitro mutationtechniques for crop improvement.Euphytica 85: 303-315.

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Orellana , P.; Pérez, J.N.; Agramonte, D.;Gómez, R.; Jiménez, E., 1991. La

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Roux, N., 1997. Improved methods toincrease diversity in Musa usingmutation and tissue culture

techniques. Report of the Second ResearchCo-ordination Meeting of FAO/IAEA/BADC.


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2-04 Estudio en condiciones de campo de seis líneas seleccionadasin vitro frente al cultivo filtrado de Alternaria solani (Sorauer) enpapa S. tuberosum L. var Desirée.

Novisel Veitía Rodríguez, Miguel A. Dita, Lourdes García, Idalmis Bermúdez,Justo Clavero, Carlos Romero, Mayra Acosta y Leonardo García.

Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de LasVillas. Carretera a Camajuaní, km. 5.5 Santa Clara, Villa Clara, Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras claves: Tizón temprano, papa, cultivo filtrado, mutagénesis, mejoramientogenético.

INTRODUCCIÓN

El tizón temprano enfermedad causadapor el hongo Alternaria solani Sorauer yAlternaria alternata (Fr.) Keissler, segúnArzuaga e Izquierdo (1983) constituyeeconómicamente la enfermedad másimportante que ataca las plantaciones depapa en Cuba. El principal método decontrol empleado ha sido el químicopero se buscan variedades resistentescomo solución a largo plazo (Caligary yNachmias 1988).

La variación somaclonal aparece comouna fuente útil y accesible debido a lavariabilidad expresada en la regeneraciónde plantas a partir de callos, protoplastos,embriones en cultivo y cultivo demeristemos; esta puede ser aumentadacon el empleo de la mutagénesis in vitro.Las plantas regeneradas presentan dife-rencias en cuanto a característicasmorfológicas, madurez y respuesta anteel ataque de patógenos; si además secuenta con métodos efectivos de selec-ción utilizando toxinas, medios selectivosy selección ante los patógenos, seincrementa significativamente la frecuen-cia de obtención de plantas tolerantes oresistentes.

La variación somaclonal como variabili-dad en sí, es inferior desde el punto devista del mejoramiento a la que se puedeproducir por medios físicos y químicosya que las frecuencias de mutacionesgénicas y puntuales pueden ser aumen-

tadas manejando los tipos y dosis de ra-diaciones fundamentalmente(Pérez,1992).

El empleo de toxinas de carácter hospe-dero-específico en la búsqueda de plan-tas resistentes a enfermedades brinda laposibilidad de su uso en programas demejoramiento como agente selectivo, in-corporado a los medios de crecimientoen callos para la realización debioensayos, así como estudios relacio-nados con la interacción huésped-pató-geno (Lorenzo et al., 1992).

Tomando en consideración las afectacio-nes de este patógeno en nuestras condi-ciones y la susceptibilidad que en mayoro menor escala muestran las variedadesque se cultivan actualmente en nuestropaís nos propusimos en este trabajo eva-luar en condiciones de campo la respues-ta al ataque del tizón temprano en seislíneas seleccionadas in vitro frente al cul-tivo filtrado de Alternaria solani.


Las líneas seleccionadas se obtuvieron apartir de callos irradiados de la variedadDesirée (susceptible); estas fueron some-tidas a la acción del cultivo filtrado deA. solani en condiciones in vitro según lametodología desarrollada por Veitía y Dita(1995). Posteriormente se multiplicaron,adaptaron y se sembraron un total de 1000 vitroplantas por línea en condicio-nes de campo en la Estación Experimen-


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tal de Remedios (IBP).Las evaluacionesrespecto a la enfermedad se realizaronde acuerdo a la escala aprobada por elcomité de expertos de Sanidad Vegetalampliada a la categoría de afectación parala evaluación del tizón temprano en papa.Como testigo resistente se empleó la es-pecie Solanum chacoense.

Los parámetros evaluados fueron los si-guientes: brotación, altura de las plantas,número de tallos, incidencia de la enfer-medad, número de tubérculos por plan-ta y peso total de los tubérculos por plan-ta.


Al analizar la respuesta de las líneas fren-te a la enfermedad se observó que exis-tió un grupo de estas que tuvieron unmejor comportamiento durante el trans-curso de las evaluaciones, no difiriendosignificativamente del testigo resistente.Se destacó la línea L-27 que alcanzó gra-dos de afectación similares a la especieSolanum chacoense empleada como tes-tigo resistente; le siguieron con menorgrado de afectación las líneas L-30 y L-101. Las restantes líneas (L-107, L-38 yL-93) alcanzaron grados de afectación si-milares al testigo Desirée (susceptible).Estos resultados permitieron afirmar quetres de las seis líneas estudiadas, selec-cionadas in vitro con el cultivo filtrado deAlternaria solani, han presentado en cam-po resistencia o tolerancia a la enferme-dad lo cual corroboró los resultados ob-tenidos por Martínez y Mantell, (1994)quienes lograron trabajando conAlternaria solani en Solanum phujeraJuz,et Buk correspondencia entre las plan-tas seleccionadas in vitro y las seleccio-nadas en condiciones de campo.

El comportamiento agronómico de las lí-neas que mostraron resistencia o toleran-cia a la enfermedad fue superior (L-27 yL-30) o similar (L-107) a la variedad origi-nal.

Como resultado de las evaluaciones rea-lizadas en condiciones de campo las lí-neas L-38 y L-93 presentaron los por-centajes de supervivencias más bajos res-pecto a las demás líneas y el testigo, deigual forma se comportaron en cuanto a

la altura y al número de tallos por planta.

En relación con los resultados referidosal peso total de los tubérculos por plantase obtuvo que las líneas L-27 y L-30 pre-sentaron valores superiores en compara-ción con el testigo Desirée, la L- 107alcanzó valores similares y por el contra-rio las líneas L-38, L-93 y L-101 mostra-ron pesos muy inferiores con respecto altestigo y las demás líneas evaluadas. Encuanto al número de tubérculos por plan-ta se obtuvo que la L-107 produjo elmayor número, los resultados de las res-tantes líneas fueron similares al testigoDesirée que produjo 6.77 tubérculos porplanta. Las líneas L-38 y L-93 tuvieron losvalores más bajos, produciendo 4.58 y4.87 tubérculos por planta, respectiva-mente.

BIBLIOGRAFÍA

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Caligary, P D.S. y Nachmias, A.1988.Screening for fiel resistance to earlyblight (Alternaria solani) in potatoes.Potatoes Res. 31:451-460.

Lorenzo, P.; Ramos, M: y Hernández, M.M. 1992. Extracción de la toxina pro-ducida por el hongo Alternariaalternata Cultivos Tropicales 13 (1):67-69.

Martínez, P. y Mantell, S.,1994. Selecciónin vitro de resistencia al tizón tempra-no (Alternaria solani Sorauer) en lapapa criolla (Solanum phureja Juz.etBuk).

Pérez, P.J., 1992. Mejoramiento conven-cional vs Cultivo in vitro. Primer cur-so FAO-Francia-Cuba sobre técnicasmodernas de mejoramiento y multi-plicación de especies agámicas.

Veitía, N; Dita, M. A., 1995. Estudio delos metabolitos producidos porAlternaria alternata (Fr.) Keissler sobrevitroplantas y callos de papa (Solanumtuberosum L.). Trabajo de DiplomaIBP, UCLV. Cuba.


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2-05 Algunos parámetros bioquímicos de la interacción piña-Phytophthora para el mejoramiento genético.

Ramón Santos, Raúl Tapia, Yudelsy Tandrón, Yania Rodríguez, MarthaHernández, Janet Quiñones, Yarianne Lezcano, Yoany González, AlfredoGonzález.

Centro de Bioplantas. UNICA. Carretera a Morón km. 9. CP 69450. E-mail:[email protected]

Palabras claves: mejoramiento genético, piña, interacción piña-Phytophthora, pudricióndel corazón de la piña, Phytophthora.

INTRODUCCIÓN

La pudrición del corazón de la piña, cau-sada por Phytophthora spp., constituye laprincipal enfermedad fungosa en Cuba,responsable de pérdidas alrededor del 20% de las plantaciones. En la actualidad nose encuentran disponibles fuentes comer-ciales resistentes, lo que imposibilita desa-rrollar programas tradicionales de cruza-mientos. Una alternativa para esta proble-mática se basa en el uso de la biotecnologíay la transformación genética de plantas(Hein, 1998).

Diversos estudios acerca de lasinteracciones planta-hongo, especialmenteen interacciones incompatibles, eviden-cian la inducción de varios tipos deisoenzimas que no están normalmentepresentes en plantas sanas, lo cual ha mos-trado ser el resultado de la síntesis neta deproteínas (Lucas, 1998). El hecho sugiereque la interacción causa activación degenes que codifican estas proteínas y lasreacciones de defensa parecen ser evoca-das a partir de esta expresión de genes.Como concepto general, la expresión deestos genes debe ser suficiente para sopor-tar las reacciones de defensa que debeprevenir la infección por el organismo in-vasor. El objetivo de la investigación estu-vo encaminado a la caracterizaciónbioquímica de expresión en la principalsenda metabólica conducente al poolfenilpropanoides, con vistas a establecerla hipótesis para el estudio de pasos clavesen la regulación de la respuesta defensivade la planta.


Microorganismo y material vegetal

Phytophthora nicotianae var. parasítica seaisló de plantas enfermas y se mantuvodurante siete días en jugo V-8 a 26° C yoscuridad. Vitroplantas de piña cv. Cayenalisa y el genotipo silvestre Bromelia pinguinse usaron como las variantes susceptible(S) y resistente (R), respectivamente. Luegode tres meses de adaptación se inocularoncausando una herida en la base de las hojasy la inmersión en una suspensión deesporas (106 esp/ml). Las plantas controles,descritas como sanas, fueron sumergidasen agua estéril.

Evaluación diferencial de proteínas

Se empleó un procedimiento previamentedescrito por Bauw y Montagu (1997), conligeras modificaciones. La electroforesis enSDS-PAGE se realizó en geles depoliacrilamida al 12%.

Análisis de fenoles

Se empleó una modificación delprocedimiento desarrollado por Hoagland(1990), previamente descrito (Santos etal.,1996). La determinación en HPLC sedesarrolló según el procedimiento deCarpita (1986).

RESULTADOSEl reconocimiento específico del patógenoes gobernado genéticamente por


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interacciones entre los productos de losgenes de resistencia (R) en el hospedero ymoléculas codificadas en un aislado depatógeno dado nombrados genes deavirulencia ‘avr’. (Dang y Holub, 1997).

En la evaluación realizada a las 12 horas,se expresaron al menos tres proteínas enlos tejidos del cultivar R inoculado,ausentes en los tejidos intactos, mientrasque para el cultivar S cuatro de las proteínasinicialmente expresadas en tejidos intactosno se detectaron en tejidos sometidos a lainoculación. A las 24 horas se detectó unabanda de proteínas en el genotipo R,ausente en los tejidos sometidos a lainoculación. No obstante, en estos últimosse apreció un reforzamiento en una de lasbandas, mientras que a las 36 horas, unade las bandas apreciada en la evaluaciónde los tejidos R intactos no fue detectadapara los mismos tejidos sometidos a lainoculación, al tiempo que fueronexpresadas otras proteínas de elevada masamolar y se apreció un reforzamiento en labanda de aproximadamente 43 kDa.Luego de 48 horas del momento de lainoculación, una de las bandas de elevadamasa molar no se detectó en los tejidosdañados para el genotipo R, mientras quese apreciaron cambios significativos en lospatrones de síntesis de estas biomoléculas.En los tejidos S se apreció la síntesis “DeNovo” de al menos dos proteínas.

Transcurridas 60 horas de la inoculación,dos bandas detectadas en los tejidos Rintactos no se apreciaron en los sometidosa la inoculación. La evaluación de lostejidos S infestados evidenció la ausenciade al menos dos proteínas expresadas enlos tejidos intactos y en su lugar la presenciade otras dos bandas. A las 72 horas de lainoculación con el patógeno el 100 % delas plantas S mostraron los síntomas visiblesde la infección. Los tejidos resistentessometidos a la inoculación se mantuvieronrespondiendo al ataque delmicroorganismo.

El análisis cuantitativo relacionado con laexpresión del “pool” de fenoles en lasvitroplantas mostró una gran variabilidaden la síntesis y acumulación de los mismosen tejidos de hojas con relación a larespuesta al ataque del patógeno. Al

comparar los patones del cultivar S sininocular respecto al efecto de lainoculación se observó una drásticareducción en los tenores de estoscompuestos a partir de las 12 horas conmarcada diferencia en la evaluación de las36 horas, mientras que el cultivar R mostróen este momento específico nivelessuperiores en respuesta a la inoculacióncon el patógeno con diferencias másmarcadas respecto al control sin inocularen cuanto al contenido de fenoles totales.

Justo a las 36 horas se detectó la mayorvariedad de fenoles en los tejidosinoculados y a partir de este momentoapareció una mayor cantidad decompuestos desconocidos en los tejidosresistentes sometidos a la inoculación conel patógeno. En evaluaciones realizadas alas 72 horas para el cultivar R se aprecióuna degradación (o conversión) de estasmoléculas, mientras que existió una mayoracumulación de las mismas en los tejidosS. La acumulación de fitoalexinas ocompuestos antibióticos es unacaracterística de los tejidos necrosados,aunque no se conoce claramente si elloconstituye una causa o un efecto. Lo quesi está claro que estas moléculas puedenacumularse en niveles autotóxicos para lostejidos vegetales, si no existe alguna señalque indique a la planta su degradación oconversión a moléculas inertes.

BIBLIOGRAFÍA

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2-06 Selección in vitro en condiciones salinas de líneas de arrozobtenidas a través del uso combinado de técnicas biotecnológicas ynucleares.

Miriam Labrada Pons 1 y María C. González Cepero 2.

1Instituto de Investigaciones Jorge Dimitrov, Bayamo, Granma. E-mail:[email protected] Nacional de Ciencias Agrícolas, Carretera a Tapaste, San José de Las Lajas, LaHabana. E-mail: [email protected]

Palabras claves: arroz, selección in vitro, salinidad, mejoramiento genético, radiacionesGamma.

INTRODUCCIÓN

La utilización de variedades tolerantesrepresenta una de las principales vías paracontrarrestar las pérdidas económicas porsalinidad y sodicidad. En el presente tra-bajo se realizaron varios experimentoscon el objetivo de determinar las concen-traciones salinas e indicadores a emplearpara la selección in vivo e in vitro degenotipos de arroz tolerantes a lasalinidad, así como establecer laradiosensibidad de callos y semillas de lavariedad de arroz Perla de Cuba para elempleo de las dosis adecuadas en los pro-gramas de mejoramiento genético don-de se combinen técnicas biotecnológicasy nucleares.


El primer experimento estuvo dirigido adeterminar el efecto de diferentes con-centraciones de NaCl y Na2CO3 sobre lagerminación y las etapas iniciales del cre-cimiento de las plántulas. Se utilizaron se-millas de las variedades Perla ( suscepti-ble a la salinidad) y Pokkali ( tolerante).Las mismas se colocaron en placas dePetri con papel de filtro humedecido con10 ml de las soluciones de NaCl ( 50, 100,150 mM) y soluciones de Na2CO3 ( 10,20, 30, 40, 50, 100 y 150 mM). A los 7días se evaluó el porcentaje degerminación y a los 15 días se determinola altura de las plántulas (mm), longitud

de la raíz (mm), masa fresca y masa secaen gramos. Por otra parte se evalúo elcomportamiento in vitro de las varieda-des estudiadas ante diferentes concentra-ciones salinas. Se emplearon comoexplantes iniciales semillas de las varie-dades antes mencionadas. Se utilizaron9 tratamientos, los que se conformaroncon el medio de formación de callos,adicionándosele las concentraciones deNaCl ( 20, 40 y 60 mM) y Na2CO3 (10,20, 30, 40 y 50 mM) establecidas a partirdel experimento anterior, incluyendo,además un control con sal. Los callos setransfirieron al medio de regeneracióncon las mismas concentraciones salinasy se colocaron en condiciones de ilumi-nación con un fotoperíodo de 16 horas.A las 3 semanas se evaluó el porcentajede callos con brotes y el número de bro-tes por callo, determinándose el porcen-taje de regeneración por tratamiento.

También se establecieron las dosis de ra-diaciones Gamma de Co 60 útiles, conel propósito de incrementar la variabili-dad genética de la variedad Perla. Semi-llas de la variedad perla fueron irradiadascon dosis entre 0-1000 Gy, a intervalosde 100 y sembradas en condiciones delaboratorio por el método de Sandwichmodificado (Labrada et al, 1983), distri-buidas en tres réplicas con 300 semillaspor tratamiento, incluyendo el testigo sinirradiar. Al cabo de los 7 días se evalúoel porcentaje de germinación y a los 15días de la siembra se midió la altura de


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las plántulas ( AP) en cm, desde el cuellode la raíz hasta el ápice de la hoja máslarga y la longitud de la raíz ( LR); a los 30días se evaluó el porcentaje de supervi-vencia. Estos indicadores fueron utiliza-dos como criterio de radiosensibilidad. Seestudió además el efecto de las radiacio-nes sobre la callogénesis y la regenera-ción de plantas. Para ello se emplearondos tipos de explantes. Semillas: Se irra-diaron con las dosis determinadas en elexperimento anterior ( 0-500 Gy), a in-tervalos de 100. Se sembraron en el me-dio para la formación de callos formados,la masa fresca de los mismos y se calcu-laron los porcentajes de formación decallos. Posteriormente se transfirieron almedio de regeneración de plantas. A los21 días se determinaron los porcentajesde regeneración por dosis y se evaluó elnumero de brotes por callo y por dosis.Callos: Se irradiaron callos de 21 días deincubación con dosis de 0 a 100 Gy, aintervalos de 10, utilizando 30 callos porcada tratamiento. Se evaluó en el núme-ro de callos con brotes, determinándoselos porcentajes de regeneración en cadacaso.

Teniendo en cuenta los resultados de losexperimentos anteriores, se estudió elefecto de las radiaciones y las concentra-ciones salinas sobre la callogénesis y laregeneración de plantas en la variedadPerla. Se irradiaron semillas con dosis de100 y 174 Gy. Posteriormente se coloca-ron en un medio de formación de calloscon la concentraciones ( 0, 20, 40 mM)de las sales estudiadas. Los callos obteni-dos fueron transferidos a un medio deregeneración con las mismas concentra-ciones salinas. A las 3 semanas s evaluóel porcentaje de callos regenerados y elnúmero de brotes por callo. También seirradiaron callos con la dosis establecidaspreviamente ( 5 y 20 Gy), conformándo-se 12 tratamientos con las concentracio-nes ( 0, 20 mM de NaCl y 0, 10 mM deNa2CO3) en el medio de regeneración, alos 21 días se evaluó el porcentaje de for-mación de brotes y el número e brotespor callo.

Se observó el comportamiento de losregenerantes en condicionessemicontroladas. Las plántulas obtenidasa partir del experimento anterior fueronsembradas en macetas plásticas y colo-cadas en una cámara de crecimiento conuna temperatura de 25±2 grados y unfotoperíodo de 16 horas-luz. Al momen-to de la cosecha, en todas las variantesse seleccionaron al azar 5 panículas, a lascuales se les evaluaron los siguientes ca-racteres: Longitud de la a en cm ( LP),numero de granos llenos por panícula (Grll/P), numero de granos vanos ( GrV/P), peso de 1000 gramos ( PMG) y totalde granos ( TG).


Con los resultados obtenidos se com-probó que el Na2CO3 ocasiona mayoresdaños a las plantas que el NaCl. Los índi-ces: altura de las plantas, longitud de laraíz y masa seca pueden ser utilizadoscomo indicadores de tolerancia a lasalinidad, en los primeros estadios delcrecimiento de las plántulas. En cuanto ala respuesta in vivo de la variedad Perla alas dosis de irradiación, se encontró quela altura y la longitud de la raíz fueron losindicadores mas radiosensibles y se ob-servo que las dosis con valores por enci-ma de 500 Gy, provocan drásticas dismi-nuciones en la supervivencia de las plan-tas.

En el comportamiento in vitro se eviden-ció, que la regeneración resultó más afec-tada que la formación de callos, por elefecto de las dosis de irradiación y que laselección de las mismas depende delmaterial a irradiar. Al evaluar la respuestain vitro de la variedad Perla al efecto delas radiaciones y las concentraciones sa-linas se encontraron diferencias significa-tivas en dependencia del aumento de lasdosis y de las concentraciones salinas, asícomo el tipo de sal empleada. Losregenerantes obtenidos a partir de lasdosis de 100 Gy y 20Gy en medio sali-no, mostraron los mayores valores en loscomponentes del rendimiento.


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2-07 Isolation and partial purification of metabolites produced byPhytophthora nicotianae var. parasitica

Raúl Tapia1; Yania Rodríguez1; Janet Quiñones1; Marais Mosqueda1, Carol Car-vajal1; Luis M. Peña Rodríguez2; Ramón Santos.1

1Centro de Bioplantas. Carretera a Morón km. 9 Ciego de Avila, Cuba. Email:[email protected] de Investigaciones Científicas de Yucatán (CICY) Mérida, Yucatán, México

Palabras claves: Phytophthora nicotianae var parasitica, cultivo filtrado, piña.

INTRODUCTION

The rot heart of the pineapple, causedby Phytophthora nicotianae var. para-sitic constitutes the fungous diseasemore important for this cultivation inour country, provoking considerablelost in the crops of the fruit.. Coppensand Matos reported this disease for thefirst time in Hawaii, in 1994. An im-portant factor in the development ofthe disease is the toxins production,(Gaumann, 1954) these are freed whenthe fungi grows in an appropriate liq-uid medium. On the other hand, it hasbeen proven the production of crudefiltered culture with phytotoxic activ-ity as of Phytophthora cactorum, some-thing which has permitted to select re-sistant plants to the disease (Rosati,1990 and Mezzetti, 1994).

The objective of this work is to obtaina phytotoxic filtered, as well as its sepa-ration partially with conferences to de-velop a selection system of crop resis-tant to the rot heart of the pineapple,caused by Phytophthora nicotianae var.parasitic.

MATERIALS AND METHODS

Microorganism

Phytophthora nicotianae var. parasiticcausative agent of the production ofthe heart of the pineapple was isolated

as of plants you sicken, the shelteredwas maintained during 7 days in themiddle of juice cultivation at tempera-ture of 26° C under darkness condi-tions. Disks of 1 cm of diameter wereinoculated in erlenmeyer of 250 mL.Culture medium containing: D - glu-cose (30 g/L); L-aspargine (2g/L); FeSO4· 7 H2O (1 mg/L); CaCl2 · 2 H2O (10mg/L); MgSO4 · 7 H2O (0.1 mg/L);KH2PO4 (0.47 g/L); K2HPO2 (0.26 g/L),tiamine (1 mg/L); ZnSO4 · 7 H2O (4.4mg/L); MnCl2 · 4 H2O (0.072 mg/L);CuSO4 · 5 H2O (0.079 mg/L); Na2MoO4· 2 H2O (0.054 mg/L). The pH was ad-justed to 5.4 and was put on agitationto the darkness during 24 days. To in-terval of four days was evaluated theproduction of pathogen metabolite inthe liquid medium, based on spectro-scopic analysis.

Electrophoresis SDS-PAGE

Was performed as described byLaemmli method (1970). Two-dimen-sional gel electrophoresis was per-formed in a BioRad electrophoresiscell, according to O’Farrell (1975).

Bioassays

Fragments of leaves (4 cm of length) ofthe base were submerged in recipientscontaining 3mL of the filtered crudeconcentrated to the 80 % (v/v). The re-cipients were put on wet chambers andsimilar conditions to the needed by the


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fungi to produce the disease (necrosisin the form of mean ellipse).

Partial separation of the Metabolite

The filtered crude of cultivation, con-centrated to the 80% (v/v) was submit-ted to a partition process with organicsolvents of different polarities. Theobtained fract ions werechromatographied in sylicagel plates

RESULTS

The f igures 1 shows ul travioletspectrums of inoculated and controlmedium. In the inoculated mediumwas observed two maxims around 210-275 nm region. This indicates thepresence of unsaturated metaboliteswith high conjugation in its chemicalstructure.

The crude culture filtrate was parti-tioned with different organic solvents(Ethyl Acetate and n-buthanol) and ap-proximately 100 % of phytotoxic ac-tivity were recovered in the ethyl ac-etate phase.

To be analyzed the proteins present inthe aqueous phase by SDS-PAGE wasappreciated three well defined spot(67-45 kDa). When the proteinaceousfraction was resolved by two-dimen-sional gel electrophoresis was found aspot around 45 kDa with acid proper-ties (IP» 5.2).

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 (nm)

Abs

orba

nce

Control20 days

Figure 1. Ultraviolet spectrum of crude filtrate.

BIBLIOGRAPHICCoppens. G., A. P. Matos, 1994. Pine-

apple Compending of Tropical FruitDiseases. (Eds) Ploetz, R.C,Zwtmyer, W.T., Nishijime., K.GRohanbach and H.D. Ohr. Pp. 45-55.

Gaumann, E., 1954. Toxins and Plantdiseases. Endeavour 13 198-204.

Laemmli, U.K, 1970. Cleavage of struc-tural proteins during the assemblyof the head of bacteriophage T4.Nature 227: 680 - 685.

Mezzetti, B. , R. Capasso., A. Evidente.,F. A. Hammerschlag., R.H.Zimmerman., G.Cristinzio. and P.Rosati., 1994 Interaction of PartiallyPuri f ied Phytotoxins fromPhytophthora cactorum on AppleCell Plasma Membrane. J. Phytopa-thology 142: 219-226.

O’Farrell, P. H.,1975 High resolutiontwo-dimetional electrophoretisis ofproteins. The Journal of BiologicallChemistry, 250(10): 4007- 4021.

Rosat i , P., B. Mezzett i . , M.Ancherani.,S. Foscolo., S. Predieri.and F. Fasolo, 1990. In vitro Selec-t ion of Appel Rootstocksomaclones with Phytophthoracactorum culture filtrate. ActaHorticulturae 280: 409 - 416.


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2-08 Mutagénesis in vitro en Musa spp.

José de la C. Ventura, Jorge López, Sergio Rodríguez, Magaly García, VíctorMedero, José A. Pino, Ayme Rayas, Lianet Gonzalez, Teresa Ramírez, JulianGonzález, Juan R. Galvez, Damisela Reinaldo y Nery Montano.

Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT), Apdo. 6, Santo Domingo,CP 53 000, Villa Clara, Cuba.Teléf: 4-2103 y 4-2344 Fax: 4-2201, Email:[email protected].

Palabras claves: mutagénesis, Musa, variación somaclonal, radiaciones, Sigatoka negra,mejoramiento genético.

INTRODUCCIÓN

En áreas tropicales y subtropicales de altapresión demográfica, el banano y el plá-tano, se han convertido en una valiosafuente de carbohidratos y vitaminas, perono están libres de limitantes productivascomo las enfermedades, problemasvirales como el CMV, BSV y BBTV; losnemátodos y el picudo negro y factoresadversos para la obtención de altos ren-dimientos (Sandoval, 1996). Lograr unabase clonal relativamente amplia resultasumamente importante, entre otras co-sas, para evitar que el exceso de unifor-midad genética haga vulnerable el culti-vo al ataque de una nueva enfermedad,plaga o a razas más virulentas (Ventura,1993). Sin lugar a dudas el plátano es lavianda fundamental en las condicionesde Cuba, sobre todo en los meses de ve-rano y otoño, tan escasos en posibilida-des en el caso de los cultivos de produc-ción subterránea (Rodríguez, 1991).


Se utilizaron los clones ‘Burro CEMSA’(ABB), ‘Saba’ (ABB), ‘Americani’ (AAA),‘Abagba’ (AAB), ‘Zanzíbar’ (AAB),‘Navolean’ (AAB), ‘Montaña de Baracoa’(AAB), ‘SH 3436’ (AAAA) y otros. Se em-pleó en todos los casos el medio de cul-tivo Murashige y Skoog (1962), (MS); solovariaron las concentraciones de auxinasy citoquininas, según el caso.

Inducción de la variación somaclonal

El origen de la variación somaclonal y susmecanismos de expresión aún no están

completamente definidos. Se elaboró unametodología que incluyó el uso de altasconcentraciones de BAP y Kinetina, asícomo el aumento del número desubcultivos provocando la aparición demultiyemas.

Uso de radiaciones ionizantes

En colaboración con la Agencia Interna-cional de la Energía Atómica se desarro-lló una metodología para inducir muta-ciones a través de radiaciones ionizantes(Co 60) en los clones ‘Navolean’ (AAB),‘Montaña de Baracoa’ (AAB), ‘Zanzíbar(AAB), ‘Burro CEMSA’ (ABB) y otros. Seutilizó una frecuencia de radiación de 8Gy/minuto. Se realizaron tres subcultivosen la fase de multiplicación.

Estudios de campo

Se evaluaron lotes de plantas de losclones ‘Burro CEMSA’, ‘Zanzíbar’ y otros,provenientes del cultivo in vitro y plantasirradiadas. Se seleccionaron las mejoresplantas (selección positiva, para obtenerfamilias clonales, evaluándose estos dosciclos, con testigos). Se determinaron losíndices de variación somaclonal y susprincipales características. Las evaluacio-nes se realizaron en el momento de lacosecha con los siguientes parámetros:Días a la floración, altura de la planta (m),grosor del pseudotallo a 1 m (m), núme-ro de hojas (u), número de hojas activas(u), área foliar (m ), número de dedos porracimo, número de dedos de la segundamano, número de manos y peso del ra-cimo. Otras evaluaciones se hicieron res-pecto a la presencia de plagas y enfer-medades, fundamentalmente de Sigatokanegra, nemátodos, etc.


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Inducción de la variación somaclonal

Se diseñó una metodología para lograruna mayor expresión de la variaciónsomaclonal, utilizando combinaciones de6 BAP y Kinetina de acuerdo a losgenotipos, lo cual produce la formaciónde multiyemas. La selección de la Línea9 y el somaclon Saba fueron los mejoresresultados los cuales se generalizan enCuba y otros países.

Uso de radiaciones ionizantes

Se elaboró una metodología basada enla diseñada por Novak (1987), que pro-vocó un alto porcentaje de variación to-tal, fundamentalmente en los clones‘Zanzíbar’ y ‘Parecido al Rey’ seleccio-nando 15 somaclones a partir del‘Zanzíbar’, siendo las principales varia-ciones en una reversión de Horn a Frenchdel 41,3%, disminución de altura, cam-bio de coloraciones y ordenamiento delahijamiento. Detrimento total de los com-ponentes de rendimiento fue el resulta-do en el banano utilizado.

Estudios de campo y selección desomaclones

Durante tres años fueron evaluados, enla Estación del INIVIT en Camagüey, lossomaclones seleccionados por variaciónsomaclonal de los clones ‘SH 3436’, ‘Bu-rro CEMSA’ y ‘Saba’ concluyéndose quelas líneas ‘SH 3436 L6’ y ‘SH 3436 L9’fueron las de mejor comportamiento enrendimiento (52,09 y 56,19 ton/ha res-pectivamente) y los menores grados pon-derados de infestación (GPI) frente a laSigatoka negra (1,33 y 1,33) demostran-do su tolerancia a esta enfermedad.Se muestran los resultados de las líneasseleccionadas por irradiación a partir delclon ‘Zanzíbar’, observando que las líneas6; 9; 10; 30; 30A y 13 ofrecen perspec-tivas por su rendimiento, eliminación delos cormos superficiales, disminución dealtura y ahijamiento ordenado. No seencontró tolerancia a Sigatoka negra,pero siguiendo la metodología propues-ta por Pino (1996), puede ser una alter-nativa apropiada para rescatar los pláta-nos viandas. Con el empleo de técnicasmoleculares (PCR), se demostró que exis-

ten diferencias entre las líneas y pormétodos de selección temprana se de-terminó que la Línea 13 presenta unaposible tolerancia a Sigatoka negra (Pino,1998).

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIO-NES

. La inducción de mutaciones físicas(Co 60) provocó una alta variabili-dad genética, la cual puede ser apro-vechada para el mejoramientogenético de Musa spp., fundamen-talmente para los clones tipo vianda(AAB) en caracteres agronómicosdeseables.. Utilizar los esquemas propuestos acorto plazo para la inducción de mu-taciones, tanto por variaciónsomaclonal como por radiaciones.. Se recomienda generalizar lossomaclones ‘SH 3436 L9’ y el‘Somaclon Saba’, para aumentar lavariabilidad de estos cultivares, porsus características agronómicas de-seables y su tolerancia a la Sigatokanegra, nemátodos, etc., con una es-trategia adecuada.

BIBLIOGRAFÍA

Novak, F. J.,1987. Micropropagation andradiation sensitivity in shott tip cultureof banana and plantain. Intern. Symp.on Nuclear Techn. an in vitro culturefor plant improv. Vienna 1:12.

Pino Algora, J. A.,1996. Una producciónsostenible del plátano vianda ‘CEMSA3/4’ Santo Domingo: INIVIT, 10 p.

Rodriguez Nodals, A. A., 1991. Avancesen el programa de mejoramientogenético del banano y el plátano enCuba. Infomusa Vol. 1, No.1.

Sandoval, J. A. y P. Acuña, 1996. Pers-pectiva de la nueva biotecnología enel cultivo del banano. CORBANA 21,(45):63 65.

Ventura Martin y J. de la C., 1993. Elmejoramiento genético del plátano(Musa spp.) en Cuba y su repercusiónsocial. Santo Domingo: INIVIT, 28p.


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2-09 Curva dosis efecto para la inducción de mutaciones in vitro dela yuca, por radiaciones Gamma.

Víctor R. Medero, Jorge López, Sergio Rodríguez, J. de la C. Ventura, MagalyGarcía, M. Cabrera, Luis Del Sol, Marilyn Martínez, Marlenys Torres, YadenysTorres y Miguel Alvarez.

Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT), Apartado 6, Santo Domingo,CP: 53000, Villa Clara, Cuba. E-mail: [email protected]

Palabras claves: mutagénesis, radiaciones Gamma, yuca, mejoramiento genético.

INTRODUCCIÓN

El mejoramiento de la yuca a través demétodos convencionales ha sido usadopor varios programas e instituciones(CIAT, INIVIT, NRCRI, IITA) lograndoobtener clones de mayor potencial derendimiento y tolerancia o resistenciaa plagas y enfermedades (Mbanoso etal., 1992). Además, la combinación degenotipos con varios caracteresdeseables resulta difícil para la mejorapor cruzamientos, lo que dificulta elmejoramiento por esta vía de cultivaresque poseen buena adaptabilidad adeterminados ecosistemas y altaaceptabi l idad pero con bajosrendimientos y susceptibilidad al estrésbiótico. Por lo anterior, la integraciónde un sistema de mejoramiento desdelos cruzamientos, la inducción demutaciones y la t ransgénesisconstituyen una estrategia para lamejora de esta raíz tuberosa en Cuba.

El mejoramiento por mutaciones através del cultivo de tejidos in vitroabre grandes posibilidades en lainducción y selección de mutantes enplantas de propagación vegetativa(Novak et al., 1990).Resultados alentadores en yuca han

sido reportados por Mbanoso et al.,(1992); Afza et al., (1992) y Zapatas(1995).Teniendo en cuenta lo anterior, serealizó el presente trabajo con elobjetivo de establecer un sistema parala mejora genética de la yuca porinducción de mutaciones a través delcultivo in vitro.

MATERIALES Y METODOS

El trabajo se realizó en el Laboratoriode Biotecnología del INIVIT con losclones cubanos ‘Señorita’ y ‘CEMSA74-6329’ del banco de germoplasma.

El material vegetativo fue seleccionadodel banco de germoplasma a partir deplantas plus según características decada genotipo. El stock de plantasdonantes in vitro se estableció segúnmetodología de Medero (1995).

Para la determinación de la curva dosisefecto se usaron 20 secciones nodalesde cada clon, las cuales se irradiaronen el Centro Nacional de EstudiosAplicados a la Energía Nuclear(CEADEN) en una fuente de Co60

(Rayos Gamma) a dosis de 0, 10, 15,20, 25, 30, 35, 40 y 50 Gy. Después


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del tratamiento se pasaron a mediofresco y se evaluó a los 30 días lasobrevivencia y muerte de losexplantes para el cálculo de la dosisletal media (DL50).

Para el análisis de la Dosis Letal Mediacalculada se utilizó el Programa deRaymond (1992) titulado Rrohit Analy-sis.


Al evaluar el efecto de los diferentestratamientos mutagénicos se observóque independientemente del clon amedida que aumentaron las dosis deirradiación aumentó la muerte de losexplantes con los valores más altos(letales) a partir de los 35 a 50 Gy.

Para el clon ‘Señorita’ la dosis máspróxima a la DL50 fue 20 Gy, con lamuerte total de 12 explantes y para elc lon ‘CEMSA 74-6329’ tambiéncoincidiendo con la dosis de 20 Gy(DL50) donde murieron 14 explantes.Resultados similares fueron obtenidospor Mbonaso et al., (1992) en otrosgenotipos que fueron irradiados a dosisde 20 y 25 Gy según DL50 obtenidas.Otros autores (Afza et al., 1992) engenotipos diferentes obtuvieronresultados similares al usar dosis entre20 y 35 Gy, pero cuando usaron dosisde 40 Gy reportaron la inhibición deldesarrollo de la planta.

Para corroborar los resul tadosanteriores al aplicar el Analysis deProhit (Raymond, 1992) para el cálculode la DL50 se pudo observar que parael clon ‘Señorita’ la DL50 calculada fuede 20,22 Gy con un nivel de confianza

de 95 % y que puede fluctuar en unrango de 17,23 Gy a 23,64 Gy. En elcaso del clon ‘CEMSA 74-6329’ la DL50

calculada fue de 17,67 Gy para unnivel de confianza del 95 % y quepuede oscilar de 15,71 a 19,59 Gy.

BIBLIOGRAFÍA

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Mbanoso, E.N.A; E.C. Nwachukwu yL.S.O. Ene, 1992. Progress on cas-sava improvement through biotech-nology at National Root Crops Re-search Institute, Umudike, Nigeria.Proceeding CBN First internationalScientific Meeting of the CassavaBiot. Network Colombia 25-28August, p. 111.

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Novak, F.; R. Afza; M. Vandure y M.S.Omar, 1990. Mutation inductionby ganma irradiation of in vitro cul-ture shoot-tips of banana and plan-tain (Musa spp.). Trop. Agric.(Trinidad) Vol. 67 No. 1 January.

Raymond, M., 1992. Probit AnalysisProgram. U.S.T.L. France


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2-10 Efecto de la inducción de mutaciones in vitro en poblacionesde la variedad de caña de azúcar ( Saccharum spp híbrido.) My 5514.

Juan Vidal1, Juan N. Pérez Ponce2, Pedro Orellana2, Elio Jiménez2, Rafael Gómez.Kosky.2

1Facultad Agropecuaria de Montaña del Escambray, FAME, UCLV.2Instituto de Biotecnología de Las Plantas, Universidad Central «Marta Abreu» de LasVillas, Carretera a Camajuaní km. 5,5, Santa Clara, Villa Clara. Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras claves: mutagénesis, caña de azúcar, variabilidad, mejoramiento genético.

INTRODUCCIÓN

Mejorar y obtener nuevas variedades decaña es una necesidad propia de laagroindustria azucarera, debido entre otrascausas a la degeneración varietal, elcreciente incremento de enfermedades yotros factores ambientales que en conjuntohacen disminuir las potencialidades de lasvariedades comerciales en explotación (Milanés, 1996). La inducción demutaciones in vitro ha sido utilizada paragenerar variabilidad y seleccionarsomaclones útiles ( Nagatoni et al, 1996;Ahloowalla, 1994; Pérez et al, 1995), porlo que el estudio del comportamiento delas poblaciones mutadas in vitro puedecontribuir a mejorar su manejo en laevaluación y selección de mutantes concaracterísticas mejoradas.


Para la realización de esta investigación seutilizaron varias cepas obtenidas de plantasregeneradas de callos de la variedad My5514 inducidos a mutar in vitro, en elInstituto de Biotecnología de las Plantas,estudiadas en campo en suelos pardos concarbonato del CAI “Uruguay” ycomparadas con la variedad donante eniguales condiciones edafoclimáticas,evaluándose varios caracteres deimportancia agrícola e industrial.

RESULTADOSLos datos obtenidos en la población devitroplantas mutadas, evaluada a los docemeses, mostró altos coeficientes devariabilidad ( CV) en los caracteres brixsuperior, diámetro de los tallos y hábitosde crecimiento en relación con la variedaddonante, observándose un incremento de

la incidencia de la roya; el retoño de lasvitroplantas mutadas mostró valoresabsolutos superiores a la variedad donanteen los caracteres relacionados con elpotencial azucarero ( brix superior, brixinferior, brix medio e índice de madurez )y con CV bajos y estables, la incidencia deroya fue significativamente inferior a lavariedad donante y el hábito decrecimiento mejoró en igual sentido peroambos con un alto CV. La primeramultiplicación vegetativa de lasvitroplantas mutadas mostró uncomportamiento similar al retoño, conexcepción del hábito de crecimiento quese mantuvo constante en esta población.Las selecciones realizadas en cada una delas poblaciones estudiadas, permitieronobtener mutantes con característicassuperiores a la variedad donante y bajocoeficientes de variabilidad; los mutantesde mejor comportamiento se repiten enlas tres selecciones realizadas, lo queconfirma la posibilidad de obtenersomaclones estables para caracteresespecíficos. Del análisis multivariado de losdatos obtenidos se concluye que loscaracteres relacionados con el potencialazucarero determinan la mayorvariabilidad de las poblaciones estudiadas.

BIBLIOGRAFÍA

Milanés, N., 1996. Proceso de obtenciónde variedades de caña en Cuba, INICA.

Nagatomi et al., 1996. Technical News,64:1-2-

Ahloowalla, B.S., 1994. Abstract VIII In-ternational Congress of Plant Tissueand Cell Culture, Firenze.

Pérez, J.N et al., 1995. En: Libro deResúmenes III Coloquio Internacionalde Biotecnología Vegetal, Instituto deBiotecnología de Las Plantas.


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2-11 Establecimiento de las condiciones óptimas de producción demetabolitos en filtrados de Fusarium oxysporum var. cubense y suefecto en plantas de banano (Musa sp.).

Bárbara Companioni, Orlando Borrás, Yanet Quiñones, Mayda Arzola, YaniaRodrígez, Marais Mosqueda.

Centro de Bioplantas. UNICA. Carretera Ciego - Morón Km 9. Ciego de Ávila. CP- 69450.Cuba.

Palabras claves: banano, Fusarium oxysporum, cultivo filtrado, Mal de Panamá.

INTRODUCCIÓN

El Mal de Panamá o Fusariosis como seconoce comúnmente es causada por elhongo del suelo inhabitado Fusariumoxysporum var. cubense (Foc), esta es unade las enfermedades más destructivas delBanano (Stover, 1962) y la más difundidala cual constituye un desafío para elmontaje de grandes experimentos(Ploetz, 1997). La enfermedad ha sidoreportada en todas las regiones donde secultiva el Banano, con excepción dealgunas islas del Pacífico, incluyendoNueva Guinea.

El objetivo de este trabajo consistió enobtener las condiciones óptimas deproducción de metabolitos en filtrados deFusarium oxysporum var. cubense ycomparar el efecto fitotóxico del filtradocrudo sobre plantas adaptadas devariedades susceptibles, tolerantes yresistentes a la fusariosis del Banano.


Microorganismo fungal: El aislado de Focutilizado en los experimentos paraobtener filtrados crudos se obtuvo a partirde restos de cosecha de cultivares deBanano infectados con el hongo yconservados en agar de papa glucosadoal 2 % (PDA) a 26 OC durante una semana.

Desarrollo de un bioensayo: Las plántulasde cada uno de los cultivares fueron tes-tadas cuando presentaban de 5 - 8 ho-

jas. El bioensayo utilizado consistió en elpunteado de fragmentos de hojas de laparte central de la hoja, añadiendo des-pués en el daño producido, 5 μL de fil-trado crudo. Se evaluó la expresiónsintomatológica de necrosis alrededor delpunto de aplicación a través del tamañode la lesión

Preparación del cultivo del hongo en lasdiferentes condiciones: A partir del culti-vo monospórico de Foc cultivado sobrePDA (2%) durante una semana, se toma-ron discos de 10 mm de diámetro y sesembraron en erlenmeyers de 250 ml arazón 1 disco/ erlenmeyer en las siguien-tes condiciones:Condición # 1. Medios de cultivo(encondiciones dinámico):1) Medio de Caldo Czapek .2) ” líquido de Extracto Malta .

Condición # 2. Condiciones de cultivo(en medio Caldo Czapek):1) Cultivo dinámico .2) ” estático .

Condición # 3. Luminosidad (en medioCaldo Czapek y cultivo dinámico):1) Luz.2) Oscuridad.

Preparación del filtrado crudo del hon-go: A intervalos de cuatro días de cultivodurante 28 días, se procedió al filtrado yesterilización del medio mediante gasa,papel de filtro y filtros millipores de 0. 22micras en cada una de las condicionesdescritas.


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Se aprecia la presencia de un máximo deabsorción en la zona cercana a los 220nm y en 270 nm de longitud de ondasiendo mayor en este último, a los 16 díasde inoculado el patógeno en el medioCaldo Czapek, lo cual nos indica la pre-sencia de metabolitos producidos por Focen el medio de cultivo, no comportán-dose así en el cultivo líquido de ExtractoMalta.

Novak (1991) plantea que el cultivo dela raza 1 y raza 4 de Fusarium oxysporunvar. cubense han sido utilizado para lapreparación de filtrados crudos en me-dio Caldo Czapek incubado en la oscu-ridad a 25 0C y condiciones estático, de-tectándose en los mismos un máximode absorción entre los 270 - 274 nm.

Se obtuvo un comportamiento similar aldescrito, también con un máximo de ab-sorción de producción de metabolitosproducidos por el patógeno, en la zonacercana a 220 nm y 270 nm, en condi-ciones de cultivo dinámico y luz, duran-te el período evaluado. Por su parte Ta-pia et al. (1998) encontraron a los 21 díasde cultivo de Fusarium subglutinans enfiltrados crudos de medio Caldo Czapeken condiciones luz y estático, la presen-cia de una fuerte absorción en la zonacercana a los 270 nm indicando la pre-sencia de grupos orgánicos coninsaturaciones conjugadas.

El filtrado crudo de Fusarium oxysporumvar. cubense mostró una actividadfitotóxica a las 48 horas (Tabla 1) másmarcada en las variedades susceptiblesque en las resistentes y tolerantes. Di-cha actividad se expresó por el tamañode la lesión y el tratamiento estadísticode los resultados, lo cual nos da la evi-dencia que el filtrado crudo obtenidobajo las condiciones de cultivo dinámi-co y luminosidad, puede ser utilizadocomo herramienta para futuras estrate-gias en el campo del mejoramientogenético, con el propósito de seleccio-nar resistencia a Foc en el cultivo delBanano.

Tabla 1. Efecto fitotóxico del filtrado crudo pro-ducido por Fusarium oxysporum var. cubensesobre diferentes cultivares de Banano.

Experimentos con aislados de Fusariumsolani han mostrado la presencia en el fil-trado del cultivo de una fitotoxina de bajopeso molecular, el cual inhibe labrotación y el crecimiento de las raíces,además de causar necrosis en los tallos yhojas de Soja (Baker, 1994).

BIBLIOGRAFÍA

Baker, R.A., 1994. Soybean Suddendeath Syndrome: Isolation andidentification of a new phytotoxinfrom cultures of the causal agentFusarium solani . (Abstr.)Phytopathology 84: 1144..

Novak, F. J., 1991. In vitro mutationsystem for crop improvement. En:Plant Mutatation Breeding for CropImprovement. IAEA, Vienna. 2: 327- 342

Ploetz, R. C., 1997. The major diseasesof banana in the subtropic. Bookof Abstracts. Internat ionalSymposium on Banana in theSubtropics. November: 51.

Stover, R. H., 1962. Fusarial wilt(Panama Disease) of Bananas andother Musa species.Commonwealth MycologicalInstitute, Kew.

Tapia, R; R. Santos; Magalis Quincose;L. M. Peña; O. Borrás; BárbaraCompanioni; María A. Blanco y J.L. González, 1998. Estandarizacióndel proceso para la obtención demetabol i tos de Fusariumsubglutinans y su efecto en callosde piña. Cultivos Tropicales 19(2):51 – 55.

Cultivares Influencia de filtados crudosArea de la lesión en mm2

FHIA-01 (R) 0.1aGran Enano (R) 2.5b

FHIA-18 (T) 3.6bManzano (S) 9.2c


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2-12 Ciclo de la enfermedad, sintomatología e histopatología de lapudrición del corazón de la piña causado por Phytophthoranicotianae var. parasitica sobre vitroplantas.

Yania Rodríguez, Marais Mosqueda, Orlando Borrás, Maida Arzola, María C.Pérez y Bárbara Companioni.

Centro de Bioplantas. UNICA. Carretera a Morón Km. 9. CP 69450. E-mail:[email protected]

Palabras claves: Phytophthora nicotianae var parasitica, piña, pudrición del corazón dela piña..

INTRODUCCIÓN

La piña es afectada por múltiplesenfermedades, ya sea de índoleparasitario o no parasitario, que influyendesfavorablemente en los rendimientos,una de las más importantes es lapudrición del corazón, alcanzandopérdidas considerables. La pudrición delcorazón de la piña, causada porPhytophthora nicotianae var. parasiticafue reportada en Hawai (Coppens yMatos, 1994) y generalmente estaenfermedad aparece en áreas donde secultiva la piña.El agente causal es capaz de atacar aplantas de diferentes edades, pero lasplantas jóvenes resultan ser las mássusceptibles. El microorganismo provocacambio de coloración en las hojas y olorfétido, en algunos casos el síntoma sehace solo visible cuando las hojas sondesprendidas fácilmente (Pegg, 1993). Elobjetivo de este trabajo fue hacer unestudio sintomatológico,histopatológico, y del ciclo de laenfermedad para profundizar más en elconocimiento de la misma, con vistas atrabajos futuros de resistencia yselección de la enfermedad.


Aislamiento del Patógeno

El microorganismo se aisló a partir deplantas que presentaban síntomas de laenfermedad. Las muestras se lavaron conagua corriente durante 15 minutos, sedesinfectaron con hipoclorito de calcioal 2 % y se sembraron en cámaras

húmedas durante 72 horas a 28 oC,posteriormente se pasaron a PDA al 2% a 28 0 C durante una semana.

Ciclo de la enfermedad ysintomatología

Para el estudio de las formas depenetración del patógeno, ciclo de laenfermedad, y sintomatologia seinocularon vitroplantas de la variedadCayena lisa de la Serrana mediantediferentes técnicas con una dilución deesporangios y zoosporas de 106 esporas/ml (para la obtención de las zoosporasse mantuvo la dilución de esporangiosa 4 0C durante 15 minutos). Para el casode la técnica del pinchazo y corte de raízlas plantas estuvieron sumergidas en lasolución durante 24 horas,posteriormente fueron plantadas enmacetas con suelo + cachaza (1:1) encasas verdes. Se realizaron observacionescualitativas diarias a cada uno de lostratamientos hasta la aparición de lossíntomas. En el estudio sintomatológicose evaluaron los síntomas típicos de laenfermedad como cambio de coloraciónen la base de las hojas, olor fétido ydesprendimiento de las hojas.

Histopatología

Para el análisis histopatológico setomaron hojas de vitroplantas de lavariedad Cayena lisa de la Serrana,inoculadas en el experimento anterior.Las muestras se fijaron 48 horas en FAA(Formol-alcohol-ácido acético), y selavaron en agua corriente durante 24horas. La deshidratación se realizó con


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TBA (alcohol butíl ico terciario)(Johansen, 1940). Las muestras seincluyeron en bloques de parafina y secortaron entre 5 y 8 micras. Se usó latécnica de tinción doble safranina yverde rápido. Los cortes teñidos semontaron en bálsamo de Canadá y serealizaron las observaciones en elmicroscopio óptico.


Phytophthora nicotianae var. parasiticapresenta un micelio ramificado,plurinucleado, no tabicado cuando esjoven, los esporangios son papilados yen forma de limón, también se puedenencontrar clamidosporas de tamaño vari-able. En vitroplantas de piña inoculadasel hongo germina directamente enpresencia de agua y con altastemperaturas, emite un tubo germinativoel cual puede penetrar por las axilas delas hojas, por las raíces y por heridas ode forma indirecta por medio dezoosporas, las que se forman a bajastemperaturas. Después de la penetracióndentro de la hoja se forma un micelioramificado, el cual se disemina pordentro y fuera del tejido a medida queavanza la enfermedad. A vitroplantas depiña que presentaban los primerossíntomas se les eliminaron lascondiciones óptimas de temperatura yhumedad y la infección se detuvo , porlo que se infiere que el desarrollo de laenfermedad está regido principalmentepor la temperatura y la humedad.

Urquijo et al. (1971) en un estudiorealizado en papa y tomate señalan queel ataque a la planta por hongos de estegénero depende en gran medida de lascondiciones atmosféricas,

En observaciones realizadas avitroplantas de piña inoculadas con P.nicotianae var. parasitica se determinóque en las plantas infectadas el primersíntoma es un cambio de color en lashojas más jóvenes, pasando de verde averde amarillento, a medida que laenfermedad avanza las hojas pueden serfácilmente desprendidas de la planta. Eltejido blanco de la base de la hoja tomauna apariencia húmeda y un olor fétido.Se aprecia una franja carmelita que

separa la parte verde y blanca de la hoja.La parte basal de hojas infestadasmuestran lesiones que aumentanrápidamente que pueden llegar a cubrirtoda la hoja causando la muerte de laplanta. El punto de crecimiento del tallotiene una apariencia blanda con unacoloración amarillo carmelitosa. Todaslas plantas infectadas mostraron estasintomatología Coppens y Matos (1994),plantean que las plantas de piñainfectadas por la pudrición del corazónmuestran inicialmente alteraciones en elcolor de la hoja, principalmente aquellasmás jóvenes que la hoja D, cambiandodel verde al verde amarillento y acarmelita comenzando por la punta.Matos (1995) en un estudio realizado enplantaciones de piña infectadas conPhytophthora nicotianae var. parasiticaplantean que las hojas jóvenes infectadasse desvanecen y elongan, poniéndosecloróticas.

En cortes realizados a las 36 horas seapreció crecimiento del hongo dentro delos tejidos. A las 48 horas se comenzó aobservar una franja parda que separabael tejido sano del afectado. En cortesrealizados en esta zona se observa cómolas paredes de la células ibanadquiriendo una coloración carmelita,probablemente por la degradación dealgunos de los componentes de la paredcelular.

BIBLIOGRAFIA

Coppens. G; A.P. Matos, 1994.Pineapple Compending of Tropi-cal Fruit Diseases. (Eds) Ploetz, R.C;Zwtmyer, W.T; Nishijime; K.G.Rohabach and H.D.Ohr. pp: 45-55.

Johansen, D.A, 1940. Plant microtech-nique. McGraw-Hill, New York.

Matos, A.P, 1995. Pathological aspect ofthe pineapple crop with emphasis onthe fusariose. Revista de la facultadde Agronomía (Maracay). 21: 179-197.

Pegg, K.G,1993. Diseases. PineapplePest and Disorders. (Eds) R.H.Broadley, R.C. Wassman, E. Sinclair.pp: 11-13.

Urquijo. P; J.R. Sardiña; G. Santaolalla,1971. Patología Vegetal Agrícola.Ediciones Mundi-Prensa. España.


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2-13 Caracterización morfofisiológica de aislados de Alternaria solaniSor. para su uso en el mejoramiento genético por biotecnología

Miguel Angel Dita Rodríguez, Mayra Acosta Suárez y Novisel Veitía.

Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de lasVillas. Carretera a Camajuaní km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras claves: Tizón temprano, papa, mejoramiento genético, cultivo filtrado, selecciónin vitro.

INTRODUCCIÓN

El agente causal del tizón temprano (Al-ternaria solani Sor.) es un patógeno al quesólo se le conoce su estado asexual; noobstante presenta una gran variabilidadbajo las condiciones de Cuba y ha sidoreportada por varios autores la presenciade un número variado de biotipos, loscuales difieren en diversos parámetrosque van desde su comportamiento enmedios de cultivo hasta la virulencia ypatogenicidad en condiciones de campo.

Para desarrollar programas demejoramiento genético a estaenfermedad mediante técnicasbiotecnológicas como la selección invitro, utilizando como agente selectivolas toxinas del patógeno, es necesariotrabajar con aislados del hongo quepresenten alta patogenicidad y virulencia.De lo anterior se deriva la necesidad derealizar estudios para determinar estosparámetros, seleccionar los que mayoresíndices posean, e introducirlos en losprogramas de mejora. De esta forma seseleccionarán individuos resistentes a unaislado que presente alta patogenicidad,presumiblemente similar a la encontradaen condiciones de campo.

Teniendo en cuenta lo anteriormenteplanteado el presente trabajo se tuvocomo objetivos estudiar la variabilidadpresente en varios aislados de Alternariasolani para el establecimiento deparámetros en la selección de aisladospara su uso en la selección in vitro.


Se realizaron aislamientos monospóricosde Alternaria solani a partir de lesionesde plantas obtenidas en camposcomerciales de papa var. Desirée en zo-nas productoras de las provincias Pinar

del Río, La Habana, Villa Clara y Ciegode Ávila y se identificaron atendiendo alos criterios taxonómicos descritos porEllis (1971); Barnett y Hunter (1987).

Caracterización y diferenciación de losaislados de Alternaria solani

Determinación de la velocidad me-dia ( mm/día) diaria de cada aislado,así como el color, textura superficialy tipo de crecimiento de la colonia,y la pigmentación del medio decultivo PDA.Evaluación de la esporulación invitro. Para ello se utilizó el métodopropuesto por Izquierdo (1977). Lasevaluaciones se realizaron a los 5, 8y 10 días de incubación yconsistieron en contar la cantidadpromedio de conidios por 0.5 cm.Se registraron además los conidios enfase de formación.Evaluación de la patogenicidad so-bre plantas de papa. Una suspensiónconidial a una concentración de 104

conidios/mL de cada uno de los ais-lados fue asperjada sobre vitroplantasde papa de la variedad Desirée y laespecie S. chacoense de 35 días deplantadas. Las cuales fueron coloca-das en casa de cristal con condicio-nes semicontroladas (Temperaturamedia de 27.6 ºC y Humedad rela-tiva media de 80.3%). Las evaluacio-nes consistieron en determinar eltiempo de aparición de los síntomas,así como el grado de afectación pro-vocado por cada uno de los aisladossobre las variedades estudiadas, se-gún la escala aprobada por el Comi-té de Expertos de Sanidad Vegetalampliada a la definición de catego-ría de ataque citada por Mayea et al.,(1990). Se determinó la dinámica dela enfermedad de cada uno de losaislados.


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Estudio del comportamiento en Me-dio de Richard para determinar elcomportamiento y establecer dife-rencias en cuanto a diferentesparámetros así como una posible co-rrelación entre la patogenicidad delos aislados y la fitotoxicidad del cul-tivo filtrado.Se estudió el efecto del cultivo defiltrado sobre vitroplantas de 30 díasde cultivo de la variedad Desirée(susceptible) y la especie silvestreSolanum chacoense L. (resistente). Elmétodo de aplicación del cultivo fil-trado fue el de inmersión de raícesdescrito por Hernández et al.,(1991). Las evaluaciones se realiza-ron a las 72 horas y consistieron endeterminar el número total de plan-tas afectadas por variedades y trata-mientos, así como el grado de afec-tación según la escala propuesta porDita (1998).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Se obtuvieron 8 aislados de Alternariasolani. HAs46 (San José , Habana),PAs114(San Cristóbal, Pinar del Río),VAs4 ( Las Antillas , Villa Clara), VAs9(Valle del Yabú, Villa Clara), CAs241(ISACA, Ciego de Ávila), CAs242 ( Morón,Ciego de Ávila).

Al hacer un análisis integral de los estudiosrealizados para la caracterización ydiferenciación de los aislados, se observóque VAs4 y PAs114 fueron los que mayorvelocidad de crecimiento mostraron,produjeron mayor cantidad de conidios,provocaron mayores grados de afectaciónen la inoculación artificial sobre Desiréey S. chacoense . De igual forma al estudiarel comportamiento de los aislados enmedio líquido de Richard se apreció queVAs4 y PAs114 mostraron los mayoresvalores de pH, peso seco, pigmentacióndel medio de cultivo, así como en elconsumo de sacarosa y el efecto de sucultivo filtrado fue el que mayoresafectaciones provocó sobre lasvitroplantas estudiadas. Esto indica quepudiera existir una correlación entre estosparámetros, los nos sirven como patronespara la selección de aislados patogénicosde interés en la mejora de plantas a estaenfermedad.

Cuando se comparan los resultadosobtenidos en este estudio con los de lainoculación artificial se hace notable lacoincidencia en los valores de afectaciónprovocados por los aislados en ambosestudios. Los aislados VAs4 y PAs114, que

mostraron las mayores afectaciones en lainoculación artificial con conidios, son asu vez los que mayores afectacionesprovocaron cuando se aplicó su cultivofiltrado sobre vitroplantas, en los restantesaislados también se observó ciertacorrelación. Este resultado sugiere elpapel primario que tiene la producciónde toxinas por el patógeno en eldesarrollo de la enfermedad tizóntemprano en papa, esto si tenemos encuenta que desde el punto de vistafisiopatológico A. solani es un parásitonecrotrófico. Además evidencia que laselección de genotipos realizada con elcultivo filtrado de A. solani puede estarcorrelacionada con la resistencia a nivelde invernadero y campo. Martínez (1994)plantea que esta resistencia esproporcional y que es altamenteheredable en las progenies siguientes.

BIBLIOGRAFIA

Barnett, H.L.; Hunter, B.B. 1986.Ilustrated Genera of imperfect fungi.Fourth Edition. Macmillan,Publishing Company. CollierMacmillan Publisher. London. p 132-133.

Dita, M.A., Rojas, M. 1998. Estudio delcomportamiento in vitro de diferen-tes aislados de Alternaria solani Sor.Trabajo de Diploma IBP. 45 pp.

Ellis, M.B. 1971. Dematiaceos,Hyphomycetes. CommonwealthMycological Institute. Kew. Sorrey.Englan. p. 464 - 497.

Hernández, M.M; Kowalski, B; Loren-zo, P y Ortíz, U, 1991. Efectividaddel empleo de filtrados de Alternariasolani Ellis y Martin (Jones y Grout)en la selección in vitro de formas re-sistentes en papa (Solanumtuberosum L.). Cultivos Tropicales,12 (2): 48-50.

Izquierdo,F. 1977. Un rápido y sencillométodo para provocar laesporulación de Alternaria solani encultivo puro. Revista CENIC. SerieBiológica. 8, :155-162.

Martínez, P.R.; Sinclair, M, 1994. Selec-ción in vitro de resistencia al tizóntemprano (Alternaria solani Sorauer)en la papa criolla (Solanum phurejaJunz, et. Buk.) Fitopatología Colom-biana, 18 (2): 90-100

Mayea S., Perdomo, O. 1990. Sistema delucha integrada contra el tizón tem-prano (Alternaria solani Sor) en la papa(Solanum tuberosum L.) Trabajo deDiploma UCLV. 70 p


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2-13 Estudio in vitro de cuatro nuevos somaclones seleccionadosde FHIA-21 (Musa spp) usando irradiaciones.

Dion Daniels, Juan N. Pérez Ponce e Idalmis Bermúdez.

Instituto de Biotecnología de Las Plantas, Universidad Central «Marta Abreu» de LasVillas. Carretera a Camajuaní km 5.5.Santa Clara, Villa Clara. Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras claves: FHIA-21, Musa.

INTRODUCCIÓN

Los plátanos y bananos (género Musa)están entre los cultivos más importan-tes en los países tropicales ysubtropicales. Juntos ocupan el cuartolugar de importancia como alimentosdespués del arroz, trigo y maíz en to-neladas de producción (Afza et al,1994). Sin embargo la producción estáseriamente amenazada por varias en-fermedades causadas por hongos, bac-teria, virus y nemátodos. La inducciónde mutaciones significa crear variabili-dad genética, que es la base para laselección de características mejoradas(Vuylsteke y Swennen, 1992). La va-riación somaclonal como tal, no ofre-ce grandes posibilidades para la mejo-ra y no es superior que la variabilidadpor la mutagénesis (Pérez Ponce,1998). Este trabajo pretendió hacer unestudio de los cuatro somaclones se-leccionados del FHIA-21 irradiado ycompararlos con el FHIA-21 original.


Como material vegetal en este trabajose empleó el FHIA-21 (Musa spp) quetiene el genoma AAAB y fue desarro-llado por la Fundación Hondureña de

Investigación Agrícola (FHIA). Tambiéncomo material vegetal se emplearon loscuatro somaclones (8-14), (14-23),(24-14) y el (17-13) seleccionados enel campo por poseer un bajo porte,cierta resistencia a la enfermedadsigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis)y altos rendimientos.

Todos los trabajos de laboratorio serealizaron en condiciones estériles. Losinstrumentos se esterilizaron en estufaa 180oC durante 2 horas y todas lasoperaciones de inoculación y transfe-rencia se realizaron en la cabina de flu-jo laminar.

Para el medio de cultivo en este traba-jo se empleó como medio basal las sa-les propuestas por Murashige y Skoog(1962). El medio de cultivo fue esteri-lizado en la autoclave vertical a 121oCde temperatura y una presión de 1.2Kg/cm2 durante 20 minutos. El pH delmedio se ajustó a 5.8 previo a la este-rilización. El medio de cultivo estácompuesto por las sales MS, 3% saca-rosa, 4 mg/L de 6-BAP y 0.65 mg/L deAIA. Se emplearon frascos de cultivode 250mL de capacidad, los cualescontenían 30 mL de medio de cultivoen estado sólido y se colocaron 5


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explantes/frasco.

Para las condiciones de incubación seusaron cámaras de cultivo de luz na-tural y una iluminación entre 2500 y3000 lux, el fotoperíodo propio de laépoca del año y a temperatura de27±2oC.

Las evaluaciones se realizaron duran-te tres subcultivos, el 5to, 6to y 7mo. Losparámetros a evaluar fueron: númerode brotes, número de raíces, la presen-cia de multiyemas y el coeficiente demultiplicación.


Al analizar los cuatro parámetros eva-luados durante los tres subcultivos, sepudo apreciar que el somaclon 17-13tuvo un mejor comportamiento conrespecto a los otros somaclones, inclu-yendo el FHIA-21 original. Este mismosomaclon mostró un coeficiente demultiplicación cerca de 2 y presentóla menor cantidad de multiyemas, unaforma de regeneración en la propaga-ción masiva de plantas, la cual no es lamás adecuada por la inestabilidadgenética que provoca.

El somaclon 24-14 resultó ser el de másbajo coeficiente de multiplicación, sinembargo mostró un aumento progre-sivo durante los tres subcultivos reali-zados. En los dos primeros subcultivosel coeficiente fue de 1 y en el últimoalcanzó 1.61, algo todavía inferior a loque lograron los otros somaclones es-tudiados.

El somaclon 17-13 presentó una supe-rioridad in vitro en cuanto a losparámetros evaluados, con respecto alresto, incluyendo el FHIA-21 original.Se concluye que el somaclon de másbajo comportamiento fue el 24-14.Esto resultados confirman una vez másla importancia de los estudios in vitrode diferentes líneas dentro de un mis-mo cultivar, para la micropropagaciónde cualquier genotipo.

BIBLIOGRAFÍA

Afza, R; N. Roux; H. Brunner; M, vanDuren; R. Morpurgo. 1994. In vitroMutation Tecniques for Musa. En:The improvement and Testing ofMusa: a Global Partnership. Hon-duras.

Murashige, T y F. Skoog. 1962. Physiol.Plant. 15: 473-497.

Pérez Ponce, J. 1998. Mutagenésis invitro. En: Propagación y Mejora dePlantas por Biotecnología. J. N.Pérez Ponce (Ed.)Instituto deBiotecnología de las Plantas. SantaClara, Cuba.

Vuylsteke, D. y R. Swennen., 1992.Genetic Improvement of Plantain.San José, Costa Rica.


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CULTIVO DE TEJIDOS Y CÉLULAS.

3-01 Cinética del crecimiento de callo de Tilia mexicana ( SCHL).

Blanca Lilia Nader G. y Martín López del Valle

Facultad de Biología (Xalapa), Universidad Veracruzana (Mex). Fax 0128185233 E-mail:[email protected]

Palabras claves: Tilia mexicana, callos, cinética del crecimiento.

INTRODUCCIÓN

Tilia mexicana ( Schl.), es una especiede importancia económica y medici-nal ( Arqueta et al., 1994). Esta especiese ubica en el estrato arbóreo delbosque mesófilo de montaña (Robert,1985) y en ocasiones asociadas abosques tropicales caducifolio ysubcaducifolio, bosque espinoso y enterrenos de cultivo; es originario deMéxico, crece entre los 1000 y 2000m.s.n.m. Árbol con follaje vistoso,hojas en forma de corazón, flor coloramarillento formando ramos situadasen una hoja angosta. Su flor es utilizadapara preparar té de “ t i la” muyempleado en la zona centro del país(Veracruz, Hidalgo, Tlaxcala, etc.)(Arqueta et al., 1994) como calmantede nervios, o contra enfermedades delcorazón, presión arterial, contracólicos menstruales etc., Por otro lado,debido a las actividades humanas, eltipo de vegetación de bosque mesófilode montaña, está tendiendo adesaparecer, principalmente por laganadería extensiva y estrategiasagrícolas de monocultivos.

El cultivo in vitro de células vegetalesy su rediferenciación hasta plantascompletas abre un sinnúmero deposibilidades experimentales a lainvestigación genética y bioquímica delos vegetales. El potencial es enorme y

las aplicaciones que de ello se derivenrevolucionarán la producción agrícolay producción industrial de algunassubstancia naturales (Rzedowski,1978). Las técnicas del cultivo detej idos son un importanteprocedimiento en la multiplicación, elmejoramiento, la conservación deplantas út i les al hombre. Lamicropropagación es una de lastécnicas que se aplican en la actualidady que reporta muy buenos resultadosen la obtención masiva de plantasanuales y bianuales incluyendohortalizas, frutillas y plantas de ornato.Sin embargo, la micropropagación deespecies perennes no ha progresado almismo ritmo encontrándose que enestos casos los tejidos y órganosaltamente diferenciados (maduros) sonpoco sensibles a condiciones in vitro.El interés por micropropagar especiesárboreas es principalmente paradisminuir los largos ciclos de vida,mismos que han hecho difícil laaplicación de la genética convencionalen el mejoramiento de estas especies (Villalobos, 1985).

Objetivo

Determinar por vez primera losrequerimientos nutr ic ionales,hormonales y de factores físicos, quepudieran ofrecer grandes cantidades de


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callo de Tilia mexicana y contar conantecedentes para futuros estudiosbiosintéticos.


Esquejes de árboles adultos de Tiliamexicana fueron colectados en elMunicipio de Miahuatlán, localizado a19 º 42' latitud norte y 96º 52' longitudoeste, situado entre el rango de 1200a 2000 m.s.n.m. con clima templadohúmedo, típico de la región en la cual,la vegetación es de bosque mesófilo demontaña, comprendiendo granvariedad de especies leñosas yabundancia de herbáceas y epífitas.

Los esquejes se utilizaron de untamaño de 7 centímetros de largo,fueron seleccionados de ramas denuevo crecimiento; se empacaron enbolsas de plástico para transportarlosal laboratorio de Cultivo de Tejidos dela Facultad de Biología (Xalapa), dondese preservaron en refrigeración a 8 º Chasta su desinfestación.

Desinfestación

Los esquejes fueron colocados en al-cohol al 70 % durante 2' ,inmediatamente enjuagados con aguadesionizada estéril, a continuación seles aplicó cloro al 10 % adicionado congotas de Tween 80 y microdín,manteniéndolos en agitación durante8 ‘, se enjuagaron 4 veces por 5’ cadavez con agua desionizada estéril, secolocaron en solución fungicida(Benlate) a una concentración de 400mg L-1 durante 10 ‘ y en agitaciónconstante, al final fueron enjuagados4 veces por cinco minutos, cada vez,con agua desionizada estéril y secolocaron en solución antioxidante deácido cítrico y ácido ascórbico , am-bos en concentración de 2.0 mg L -1.

Extracción de yemas laterales

La extracción de las yemas se efectuódentro de la cámara de flujo laminar yse realiza con ayuda de escalpelo ypinzas desinfectadas con alcohol al 80% y flameadas.Se sujetó el tallo por labase, se el iminaron las hojasexpandidas, aunque las yemasdisectadas pueden llevar de 3 - 4primordios foliares cercanas almeristemo. Las yemas así obtenidas, seintrodujeron en los frascos de cultivocuidando que la base de la misma(yema ), quedara “sentada” sobre lasuperficie del medio previamenteformulado, se colocó una yema porfrasco.

Medios de cultivo

El medio MS (Murashige y Skoog 1962)se utilizó para la inducción de yemaslaterales complementado con 30 gL-1

de sacarosa , 6.2 g L-1 de agarbacter iológico, reguladores decrecimiento como; Benzilaminopurina(BAP) en concentraciones de 0.4, 0.6,0.8, 1.0 y 2.0 mgL-1. Acidonaftalenacét ico (ANA) enconcentraciones de 0.2, y 0.4 mgL-1,además, se adicionó 100 mgL-1 de mio-inositol 1.0mgL-1 de ácido nitcotínico,2.0mgL-1 de tiamina, 1.0mgL-1 depiridoxina y 20 mgL-1 de adeninasulfatada, como antioxidante se aplicó10mgL-1 de ácido cítrico e igualconcentración de ácido ascórbico.

El medio WPM (Smith y McCown1983), utilizado ampliamente paraplantas leñosas, fue complementadocon 30g L-1 de sacarosa, 6.2 gL-1 de agarbacteriológico, los reguladores BAP yANA fueron agregados en las mismasconcentraciones estipulada para el (MS utilizado ), 100 mgL-1 de myo -inositol, 1.0 mgL-1 de tiamina, 0.5 mgL-

1 de ácido nicotínico y piridoxina ,glicina y glutamina en concentración


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de 2.0 mgL-1 ambas y 20 mgL- 1 deadenina sulfatada, el antioxidanteagregado fue ácido cítrico y ascórbicoen las concentraciones semejantes a lasusadas en el medio MS, se manejocomo regulador alternativo el ácidogiberélico en concentración de 1. 0 mgL-1

El pH se ajustó a 5.7 ± 0.1 con HCl1N o Na OH 1N. Los medios fueronautoclaveados a 121º C y 1.2 Kg/ cm2

de presión durante 18 minutos.

Medio para inducción de callo

MS y WPM con las variacionessiguientes: 1.0 mgL-1 de Furfuril aminopurina (kinetina) y de BAP; (2,4-D)ácido 2,4 - Diclorofenoxiacético, enconcentraciones de 4,2 y 1.0 mg L-1

Medio para mantenimiento yaumento de callo

Medio MS, MS + adenina y MS2. Serealizaron tres réplicas de cadatratamiento para peso fresco, tomandolecturas cada tercer día durante 21días. Para peso seco sólo se usó unamuestra por cada tratamiento tomandodatos a los mismos intervalos detiempo que para peso fresco.

Condiciones de cultivo

Todas las siembras realizadas, semantuvieron en condiciones deintensidad lumínica de 1000 a 2000lux, a una temperatura de 26 o C ± 2con un fotoperíodo de 16 horas luz y8 de obscuridad, con una humedadrelativa del 80 al 90 % excepto, en lainducción de callo, el cual fue llevadoa obscuridad en su primera etapa(inducción) y posteriormente para suproliferación, se mantuvo en lacondiciones ya mencionadas.

RESULTADOS

De los medios probados para lainducción de yemas, tanto el MS comoWPM con sus complementos yreguladores de crecimiento etc.,resultaron tener la misma eficacia encuanto a liberación de las yemas, peroninguno generó brotes. En cuanto a losreguladores de crecimiento probadosy su correlación con la oxidación delos explantes, se encontró que lasconcentraciones de 0.4, 0.6 y 0.8 mgL-

1 de BAP, fueron las que evitaronoxidación no así las al tasconcentraciones, en donde ésta(oxidación ) se sigue presentando.El medio WPM + ácido giberélicopropició a nivel de yemas liberación dehojas rudimentarias protectoras dehojas verdaderas y meristemo,observándose una elongación de éstashojas verdaderas.

Las yemas que se elongaron, seindujeron a la formación de callo y lascombinaciones de Kinetina y 2,4-Dreportaron un rendimientoinsignificante en la formación de éste,así como la combinación de 1.0 mgL-1

de BAP y 2,4-D en el medio WPM, sinembargo, la poca formación de calloen éste medio, al transferirse a MS +BAP + 2,4-D dio como resultado unaproducción constante y abundante decallo , siendo éste de color verde limóna verde hoja, con algunas partesblancas, su abundancia encomparación con la sembrada fuemultiplicada en aproximadamente de5 a 8 veces su tamaño, es un callo deapariencia uniforme y friable en unperiodo de 15 días.

Cinética

Se cuantificó a partir de los resultadosobtenidos en los medios MS, MS+Adenina y MS2. Estas pruebas


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arrojaron resultados interesantes comofueron; que con la adición de Adeninasulfatada se observó una eficienciasignificativa en cuanto al crecimientodel callo seguido por el tratamientocon el medio MS2 y el de menorrendimiento fue el MS.

Por otro lado, los resultados de pesoseco denotan que el medio MS2propicia un “arranque” activo encuanto al crecimiento del callo, peroese rendimiento disminuye después de9 días y por último en el medio MS éste“arranque” tarda un poco, pero se in-crementa ampliamente superando altratamiento anterior y se estabilizadespués de 15 días.

DISCUSIÓN

En el caso específico de Tilia mexicanael medio WPM adicionado conci tocininas y auxinas enconcentraciones equivalentes oincluso en concentraciones mayoresde auxina que de citocina , no ofrecióun resultado satisfactorio desde elpunto de vista cuantitativo y fenotípicoen la producción de callo , aunque sifue el medio (WPM) que adicionadocon AG3 permitió a nivel de yemas;liberación de hojas rudimentarias,verdaderas y meristemo, aspecto quepodría tomarse como precedente parauna producción constante y abundantede callo en medio MS + BAP+ 2,4,Dpor lo que se considera el adecuadopara tal objetivo en Tilia mexicana.

Como en tantos otros cultivos, lasaltas concentraciones de reguladores,en éste caso 1.0 y 2.0 mgL-1 de BAPnos parece producen habituación, ypermiten la presencia de oxidación,por lo que fue necesario buscar lasconcentraciones adecuadas paraevitarla y, que en éste caso fueron lasmenores ( 0.4, 0.6 y 0.8 mgL-1 de BAP)El medio MS + BAP+ 2,4-D se

considera el adecuado para laobtención de grandes cantidades decallo con caracteres cuantificablespara la especie Tilia mexicana.

El medio MS2(1/2 de Macronutrientes)puede ser el efectivo para propiciar el“arranque” de crecimiento de callo encorrelación a los primeros días delcultivo,( lo cual podría implicar unahorro en reactivos ).

BIBLIOGRAFÍA

Argueta, V.A. , A.L.M. Cano y M., F.Rodarte., 1994. Atlas de las plantasde la medicina t radicionalmexicana.Vol.III Edit. I.N.I. MéxicoD.F. p. 1337.

Murashige, T., y Skoog., 1962. A re-vised medium for rapid growth andbio -assay with tobaco tissue cul-ture. Physiol. Plant. 15 : 473 - 497

Robert, M.L., 1985. El potencial delcultivo in vitro de células vegetalesen el mejoramiento genético de lasplantas (Robert y Loyola comp.). Elcultivo de tejidos vegetales enMéxico. CONACYT, México. C.U.pp. 89-108.

Rzedowski, J., 1978. Vegetación deMéxico. Edit. Limusa méxico. pp.432,

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3-02 Sistema para el manejo de la información del banco degermoplasma in vitro (Bioconser).

Delly Lien González1, Carmen Pons1, Osmany Molina1, Héctor Rodríguez2,Víctor Medero1, Irelio Sánchez1, Magaly García1, Jorge López1, José de la C.Ventura1 y Marylis Milián1.

1Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT). Apdo. 6, Santo Domingo,CP 53000, Villa Clara, Cuba. Teléf. 4-2344, 4-2103. Fax: 4-2201. E-mail:[email protected] Central «Marta Abreu» de Las Villas (UCLV), Cuba.

Palabras claves: conservación, software, banco de germoplama.

INTRODUCCIÓN

Los recursos fitogenéticos constituyenpatrimonio de la humanidad y garantíade la preservación de la vida vegetal ysu diversidad en el planeta. Muchoslugares del mundo se dedican a suconservación y entre ellos, en elInstituto de Investigaciones en ViandasTropicales (INIVIT) de Cuba, seencuentra uno de los bancos degermoplasma de las raíces y tubérculostropicales, plátanos y bananos másgrandes de América Latina (Rodríguez,1990). El mantenimiento en campo deestas colecciones resulta muy costosoincluso para países de alto desarrolloeconómico por lo que se ha tratado deencontrar nuevas y más avanzadasformas de conservación de estosrecursos naturales y el cultivo detejidos constituye una vía de ampliasperspectivas (Medero, 1995).

Para contribuir en la puesta a punto delas técnicas de conservación in vitro sepropone el presente software para elcontrol, almacenamiento, manejo ydistribución de la información sobre loscaracteres a evaluar desde el punto devista biotecnológico en la conservaciónde los cultivos: boniato, yuca, pláta-no, malanga y ñame.


El trabajo fue desarrollado en el INIVIT,en el período comprendido entre 1997y 1998.Para su concepción fue decisiva, en pri-mer lugar, la participación de los inves-tigadores especializados en la aplica-ción de la biotecnología a los cultivosque se conservan in vitro y a los quese encargan de su conservación encondiciones de campo, quienes apor-taron sus conocimientos y experienciasy recomendaron la literatura científi-co-técnica a consultar sobre dichastemáticas. Luego se analizó el tipo deinformación manejada, sus relacionesy características, la forma de presen-tarla al hacer la entrada y salida de losdatos, la frecuencia de uso que tendríael sistema, las necesidades de los in-vestigadores al usarlo, así como su apa-riencia final.

La implementación del sistema se hizosobre una plataforma Windows y seutilizó Borland Delphi, un lenguaje conexcelentes posibilidades para la progra-mación visual, que permite diseñaraplicaciones de forma rápida, cómoday fácil y que ofrece herramientas muyútiles y prácticas para el trabajo con


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bases de datos tal y como lo requiereun sistema de este tipo (González,1997). Los requerimientos técnicospara usarlo son los siguientes:• Computadora 486 o superior.• Plataforma Windows 3.1 o supe-

rior.• Contar con las bibliotecas de en-

lace dinámico (dll).• 4 Mb de RAM.• Cierta cantidad de espacio dispo-

nible en disco según volumen deinformación.

RESULTADOS

BIOCONSER contribuye a facilitar eltrabajo de controlar la información in-herente a los cultivos que forman par-te del Banco de Germoplasma in vitrodel INIVIT. El sistema se concibió utili-zando las facilidades de la programa-ción sobre Windows. La aplicaciónconsta de dos formas fundamentales.La primera es la presentación que dapaso a la segunda, la más importante,en la cual aparecen los elementos deinteracción con el usuario. En ésta apa-recen las opciones de entrada de da-tos sobre los diferentes cultivos, losreportes sobre la información proce-sada y por último, la posibilidad deconcluir la sesión de trabajo o consul-ta, saliendo del sistema por el botón«Salir».

La entrada de datos se resuelve de for-ma cómoda captándolos a través de laedición que hace el usuario de la in-formación que sobre cada cultivo ycultivar específico se le pide (Figura 1).

Para la implementación del sistema seutilizaron las herramientas que ofrecela programación visual y BorlandDelphi en part icular. Entre los

elementos más usados se encuentran:las formas, las multipáginas, algunas delas facilidades para bases de datoscomo las tablas, la barra de“navegación”, los ComboBox ,GroupBox y RadioGroup; los tipos im-age para hacer más agradable la interfazcon el usuario ubicando imágenes delcultivo, las etiquetas y los botones,entre otros.

La información que maneja el sistemaestá almacenada en los ficheros debases de datos llamados Bonivit.dbf(boniato), Yucavit.dbf (yuca), Platvit.dbf(plátano), Colvi t .dbf (malangaColocasia) y Namevit.dbf (ñame), quese actualizan con los datos que intro-duce el usuario y cuya estructura es,fundamentalmente, la siguiente: No.introducción, Cultivar, Subcultivo,Explante, Fecha de evaluación, No. deexplante, Temperatura, Iluminación,Medio de cultivo, No. de tallos porplanta, Hojas activas, amarillas, muertas;Raíces activas, Raíces muertas,Sobrevivencia, Contaminación, Altura dela vitroplanta, No. de entrenudos portallo, Planta atípica, Callo basal, Fechade implantación, Multiyemas, Grupogenómico, Grosor de los explantes,Yemas axilares, Yemas adventicias,Grado de oxidación, Microcormo yFenolización. Dicha estructura varíaindistintamente según el cultivo encuestión pues cada uno tiene susespecif ic idades, más aún encondiciones de cultivo in vitro .

Sobre estos datos almacenados serealizan las acciones que el usuarioejecuta para obtener los resultadosdeseados. Estos se ofrecen en forma dereportes a través de la consola o laimpresora de la manera sugerida porlos investigadores (por cultivo, fecha de


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BIBLIOGRAFÍA

González, D., 1997. Agrotecnia de Cuba,27(3)

Medero, V., 1995. Regeneración porembriogénesis somática en yuca(Manihot esculenta, Crantz). Tesis(Master of Science). IBP - UCLV, —50 p.

evaluación, implantación, etc.).La aplicación de este sistema ofrece laposibilidad de un trabajo de gestióncómodo y rápido a través de unainterfaz amigable y agradable alusuario. Como resultado de aplicarlo,se conoce y se mantiene actualizadoel estado de los cultivos que seconservan por esta vía biotecnológica.

CONCLUSIONES

• La aplicación informática ofrece laposibil idad de un trabajo de

gestión cómodo y rápido para losinvestigadores a través de unainterfaz amigable y agradable alusuario.

• Const i tuye una val iosaherramienta para la actualizacióny consulta del mater ialalmacenado y permite una mayoref ic iencia en el t rabajo deinvestigación.

Figura 1. Forma donde se capta la información referente al cultivo del boniato.

Rodríguez, S., 1990. Mejoramiento de layuca en la República de Cuba. Cruzdas Almas, Brasil, 21-25 Mayo. Tallerde Trabajo “Fitomejoramiento deyuca”.


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3-03 Determinación de las condiciones adecuadas para la obtenciónde callos en el clon de ñame Blanco o Pelú (Dioscorea alata).

Luis A. del Sol, Victor Medero, Jorge López, Magaly García, José Ventura, ManuelCabrera, Yadenis Torres, Miguel Alvarez.

Instituto de Investigación en Viandas Tropicales (INIVIT), Apartado 6, Santo Domingo,Villa Clara. E-mail: [email protected]

Palabras claves: ñame, callos, cultivo in vitro.

INTRODUCCIÓN

El ñame comprende más de 600 espe-cies, repartidas desde las regiones tem-pladas hasta las zonas tropicales húme-das (Malaurie, 1995), el que representael 12% de la alimentación base de las po-blaciones de las regiones tropicales hú-medas. Este cultivo se encuentra afecta-do por numerosas enfermedades causa-das por virus, nemátodos, hongos y bac-terias; por lo cual requiere de técnicas demicropropagación adecuadas que permi-tan una rápida y eficiente propagación delos materiales libres de enfermedades. Elcultivo de callos tiene un amplio rangode aplicaciones, por ejemplo es emplea-do directamente como fuente de mate-rial celular para estudios bioquímicos,producción de metabolitos secundarioso regeneración de plantas para obtenervariación somaclonal (con o sin la apli-cación de mutágenos). También los ca-llos son muy usados como paso inme-diato para la iniciación de suspensionescelulares (Hall, 1991).


Como fuente de material vegetal se em-plearon vitroplantas del clón Blanco oPelú iniciadas de segmentos nodales deplantas desarrollas en condicionescontroladas(Mederos, 1997). En el primerexperimento se probó la influencia dediferentes hormonas (Kinetina, 2,4-D yPicloram) sobre 3 tipos de explantes (seg-mentos de hojas jóvenes, peciolos y seg-mentos de tallos). Para lo cual se aplica-ron los siguientes tratamientos:

1-Kinetina 5mg/l2-2,4-D 1mg/l3-2,4-D 2mg/l4-2,4-D 3mg/l5-2,4-D 4mg/l

6-2,4-D 6mg/l7-Picloram 1mg/l8-Picloram 2mg/l9-Picloram 4mg/l10-Picloram 2mg/l y 2,4-D 3mg/l

Estas hormonas se probaron sobre unmedio basal MS (Murashige y Skoog,1962) suplementado con Biotina 1mg/l,ANA 1mg/l y AIA 1mg/l. En otro experi-mento se probó el efecto de la luz en laformación de callos partiendo de seccio-nes de hojas y 2,4-D en concentraciónde 4 mg/l. Los experimentos se evalua-ron a los 60 días de cultivo, analizandola presencia o no de callos compactos ycon aspecto nodular. Los datos se anali-zaron estadísticamente mediante el pro-cedimiento no paramétrico K-W.


Al evaluar el efecto de las diferentes com-binaciones hormonales sobre los distin-tos tipos de explantes, pudo comprobar-se que existió una respuesta de cada tipode estos ante las hormonas estudiadas en-contrándose diferencia altamente signifi-cativa (X2=38.53 p< 0.01), la hormona2,4-D en la concentración de 4mg/l fuela que proporcionó el mayor porcentajede callos (66.6%), como puede verse enla figura 1. De los 3 tipos de explantes


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estudiados el más adecuado resultó serlos segmentos de hojas jóvenes (40.9%),seguido de los peciolos (27.5%), comopuede verse en la figura 2 (X2=3.69 p>0.05). Esta respuesta de los explantespuede explicarse si nos basamos en laedad fisiológica de los mismos y en el gra-do de diferenciación, ya que las hojas ylos peciolos por ser más jóvenes que lossegmentos de tallos ofrecen una mejorrespuesta(Litz y Jarret, 1993; Gómez,1998) . Al analizar la influencia de la luzsobre la formación de estos callos se pudocomprobar que la oscuridad favorece esteproceso, alcanzando niveles superiores ala luz (oscuridad 66% y luz 15% y dife-rencias altamente significativas entre ellasX2=22.34 p< 0.01) como se puede apre-ciar en la figura 3, estos resultados coin-ciden con las condiciones propuestas porHall (2) para formar callos a partir de raí-ces de Daucus carota.

Figura 1: Efecto de los diferentestratamientos sobre la formación de callos.

05

1015202530354045

%

Tallo Hoja Peciolo

0

10

20

30

40

50

60

70%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tratamientos

Figura 2:Influencia de los diferentes tiposde explantes sobre la formación de callos.

0

10

20

30

40

50

60

70%

Luz Oscuridad

Figura 3: Efecto de la iluminación sobrela formación de callos

BIBLIOGRAFÍA

Malaurie, Bernard., 1995. Les ignames.En: Biotechnologies végétales. Ed. C.Teisson. CIRAD GERDAT.(Montpellier) pp.49-77.

Hall, R.,1991. The initiation andmanteinance of callus cultures of car-rot and tobaco. En: Plant tissue cul-ture manual. Ed. K. Lindsey pp. A2:1-19.

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Murashige, T. y Skoog, F., 1962. PlantPhysiol. 15: 473-497.

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3-04 Organogénesis directa de Aporocactus flagelliformis ( Zucc) Lem.

Maribel Hernández Torres y Blanca Lilia Nader.

Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales, Universidad Veracruzana, México. E-mail:[email protected]

Palabras claves: organogénesis directa, cactáceas, cultivo in vitro.

INTRODUCCIÓN

Aporocactus flagelliformis es una plantaepifita que pertenece a la familia de lascactáceas, pueden encontrarse tanto enzonas desérticas como semidesérticas,soportando temperaturas extremas, sonusadas en la industria medicinal, en elforrajeo , en la industria cosmetológica,etc.

(Bravo, 1978). Aporocactus flagelliformises una especie que dentro del Diariooficial de la Federación está consideradacomo cómo una especie rara yendémica, posee además importanciamédica ya que sus flores en infusiónsirven para tratar padecimientoscardíacos.

La micropropagación es una de lastécnicas aplicadas en la actualidad conresultados satisfactorios, debido a quea través de ellos se obtiene unamultiplicación masiva de plantasanuales y bianuales, incluyendo a lascactáceas y otro tipo de plantas comolas orquídeas( Rublou, 1993).

Los primeros intentos de propagaciónmasiva de cactus in vitro inició hacemás de 30 años (King, 1957). Lapropagación que se obtiene portécnicas in vitro en cactus facilita lareproducción clonal rápida de especiescuyos factores productivos se limitanpor efectos tanto ambientales comofisiológicos de la planta ayudándola

con la uni formidad genét ica ymorfológica y al mismo tiempo puedeesta producirse bajo estrictas normasfitosanitarias logrando una alta calidad.Los avances en este campo son aúnlimitados debido a que la metodologíaes relativamente nueva y a que elconocimiento de la genética y labioquímica de muchas plantas es muyescaso o nulo.

OBJETIVO

Obtener brotes múltiples a partir detallo como explante de Aporocactusflagell i formis ( Zucc) Lem comoalternativa para su producción masiva.

COLECTA Y DESINFESTACIÓN

La especie se colectó en la región deChiconquiaco, zona localizada a unaaltitud promedio de 2300 m.s.n.m. Fuetrasladado a la Facultad de Biología enbolsas de plástico y mantenidos encondiciones de invernadero para suposterior tratamiento.

La desinfestación del explante se iniciócon lavados superficiales de aguacorriente y detergente por 15 minutos,se sumergió en alcohol 70% por unminuto y se enjuagó con aguadesionizada estéril, posteriormente seexpuso a una solución de cloro al 30%más Tween 80 y Microdin durante 15minutos, en agitación, se realizaron tresenjuagues de 5 minutos cada uno con


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agua estéril, es mantenido en unasolución fungicida (Benlate 400 mg L-

1) durante 10 minutos y sometido a tresenjuagues como los anteriores,después del último enjuague se le dejóen agua para su posterior siembra.

MEDIO Y CONDICIONES DECULTIVO

El medio utilizado fue el MS (Murashigey Skoog, 1962) suplementado con 0.1mgL-1 de ANA, 2.0 mgL-1 de BAP, 30gL-1 de sacarosa, 6.0 gL-1 de Agarbacteriológico. Como antioxidante, alinicio se aplicó 1.0 gL-1 de carbónactivado, después ácido cítrico y ácidoascórbico en concentraciones de 2.5mgL-1 para cada uno, posteriormenteesta concentración fue aumentada a3.25 mgL-1 en ambos reactivos, 1.0mgL-1 de Glicina e igual concentraciónde Adenina sulfatada, el complementovitamínico fue: 100 mgL-1 de Myo-Inositol, 2.0 mgL-1 de Tiamina, 1.0 mgL-

1 de Piridoxina e igual concentraciónde Ácido nicotínico. El pH fue ajustadoa 5.7 ± 1 con NaOH 1N o HCL 1N(Cárdenas, 1991), el medio fueesterilizado por 18 min. a 1.2 kg/cm2

de presión. Los cultivos fueron llevadospara su incubación a las siguientescondiciones de temperatura, 24-28 oC,con un fotoperíodo de 16/8 hrs luz/obscuridad y una humedad relativa de85 a 90%.

CULTIVO DE BROTES

El explante utilizado fue el tallo, el cualposterior a su desinfección se lerealizaron cortes transversales ylongitudinales de aproximadamente 1cm., los cuales fueron colocados sobrefrascos que contenían 20 ml de medioMS y subcultivados cada 3 semanas.

INDUCCIÓN DE LA RAIZ

Brotes de 4cm de longitud sontransferidos a medio MS adicionadocon 1.5mg L-1 de AIB + 1.0mg L-1 dekinetina y colocados en lotes de 10frascos en oscuridad y otro lote con lamisma cantidad de frascos sometidosa fotoperíodo de 18/6h. En eltranscurso de un mes , empiezan aaparecer de 2 a 4 raicillas por brote yen algunos se presentaron raícesadventicias.

ADAPTACIÓN AL SUELO

Los brotes fueron retirados del mediode cultivo y lavados con agua destiladaestéril para remover restos de agar, sesumergen en solución bactericidaformulada por 400 mgL-1 deestreptomicina disuelta en agua estérildonde se mantienen por 30', de aquíse pasan a solución fungicida de 400mgL-1 de Benlate disuelto en aguadesionizada estéril por 30' . Los brotesson pasados a recipiente plástico (vaso)de aproximadamente 4 cm de alto ycon una mezcla de tierra, arena yarenilla en proporciones en peso 1:1:1( que previamente había sidoautoclaveada a 1,2 kg./cm2 por 30' ),en donde se conservan cubiertos conbolsas de polietileno por 15 díassiendo regadas con solución MSreducida a un tercio en su contenidode sales, las bolsas son perforadas parael libre paso de aire del exterior al in-terior. En otros 15 días más, estepolietileno es retirado y la planta estáadaptada y se continúa regando conagua desionizada estéril.


Se probó carbón activado comoantioxidante con resultados negativos,


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al cambiar a ácido ascórbico y cítricoen una concentración total de 5.0 mgL-

1 los resultados tampoco fueronsatisfactorios ya que todas las siembrasmanifestaron oxidación en la base delexplante, se optó por aumentar lasconcentraciones de estos mismosácidos en 7.5 mgL-1 y los resultadosfueron los esperados.

Con respecto a los brotes, cadaexplante formó aproximadamente 3,los cuales crecieron a diferentestiempos, es decir, unos emergieronantes que otros; la presencia de estos,se manifestó en 20 días posteriores asu siembra. La longitud de los brotesfue aproximadamente de 1 a 13 mmen su etapa inic ial y conconcentraciones de 2.0 mgL-1 de BAP,sin embargo, cuando se usa unaconcentración menor es bajo, como espara los casos de 1.0 mgL-1 y 0.5 mgL-

1.El enraizamiento de los brotes que secolocaron en oscuridad se etiolaron,pero aportaron mayor presencia deraíces adventicias, en cambio losexplantes sometidos a fotoperíodo,reportaron los mejores resultados encuanto a número de raíces, longitud,así como, menor cantidad de raícesadventicias y se generaban más brotes.

Para establecer la técnica dedesinfestación se realizó un barridocloral, encontrando que la mejorconcentración fue de 30% por 15min.Debido a la presencia de hongos fuenecesario apl icar una soluciónfungicida. Para controlar la presenciade oxidación en los explantes se usócarbón activado sin embargo, este nocontroló el problema por lo que seoptó usar como antioxidante ácidocítr ico y ácido ascórbico encombinación en concentraciones de

5.0 mgL-1 y 7.5 mgL-1, siendo la últimaconcentración la que reportaresultados altamente satisfactorios.

La formación de brotes fue mejor a unaconcentración de 2.0 mgL-1 de BAPde y 1.0 mgL-1 de ANA, pues fue enesta donde se obtuvo un mayornúmero. Y para el crecimiento de éstosse usó 0.2 mgL-1 de BAP y 1.0 mgL-1 deANA. La presencia de callo en losexplantes aún cuando no fue inducido,revela la capacidad de la planta deproducir lo. Durante la etapa deenraizamiento se manifestó lapresencia de raíces adventicias y laetiolación de los brotes colocados enla oscuridad a diferencia de lossometidos a iluminación.

BIBLIOGRAFÍA

Bravo, H., 1978. Las cactáceas deMéxico. Segunda edición, UNAM.México.

King, R.M., 1957. Studies in the tissueculture of cact i . Cactus andsuculent Journal ( US). 29: 102-104.

Murashige, T y Skoog, F. 1962. A re-vised medium for rapid growth andbioassay with tobacco tissue cul-tures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

Rublou, A.; V, Chávez, P. Martínez y M.Vázquez., 1993. Strategies for therecovery of endargered orchids andcacti through in vitro culture. PlantBiotechnology and Genetic. Labo-ratory the botanical Garden Insti-tute, at Biology. UNAM, 163-169.


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3-05 Establecimiento in vitro de ápices de plantas adultas de dosnuevos híbridos cubanos de Papaya (Carica papaya L.)

Laisyn Posada Pérez, R. Gómez Kosky, Maritza Reyes, J. Pérez Ponce y NiurkaGonzález.

Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central “Marta Abreu” de LasVillas. Carretera a Camajuaní km. 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras claves: papaya, híbridos, fase de establecimiento, desinfección, cultivo in vitro.

INTRODUCCIÓN

La multiplicación in vitro de la papayasolo se justifica económicamente si lamisma se realiza para un genotipo híbrido(Drew, 1997). Uno de los grandesproblemas que tiene esta metodología eslos altos porcentajes de contaminaciónin vitro (bacterias y hongos) cuando seemplea como explante inicial ápices omeristemos de plantas adultas creciendoen campo.


Como material vegetal se emplearonplantas adultas de dos nuevos híbridosobtenidos por el programa decruzamiento del Instituto deBiotecnología de las Plantas, los cualestenían 11 meses de plantadas en campo.

Pretratamiento en campo

Antes de la toma de los brotes, las plantasfueron divididas en dos grupos, el primergrupo se le realizó el decapitado de lazona apical de la planta y el segundogrupo quedaron las plantas intactas.Posteriormente a ambos grupos deplantas se les realizaron aplicacionesfoliares de una solución compuesta pordos reguladores del crecimiento 500 mg/L de 6-BAP y 1000 mg/L de ácidogiberélico, semanalmente, durante 3semanas consecutivas para inducir eldesarrollo de las yemas laterales. Despuésde 1 mes de la última aplicación se

comenzó la toma de los brotes jóvenes,para ser implantados in vitro ,realizándose el conteo del número debrotes obtenidos por semana en ambosgrupos.

Desinfección

Como primer paso los brotes jóvenes conun tamaño aproximado de 2 cm fueronlavados con agua corriente durante 5horas de forma continua, posteriormen-te fueron tratados con una solución condetergente en agitación en zaranda du-rante 10 minutos. Luego de este tiempose enjuagó con agua corriente nuevamen-te durante 10 minutos. Al transcurrir estetiempo se desinfectaron con diferentesproductos para lo cual se realizaron va-rios experimentos utilizando estos soloso en combinación: alcohol al 70 %;Hipoclorito de sodio al 0.5, 1, 1.5, 2 y 3% de cloro activo y una mezcla deantibióticos (50 mg/ L de gentamicina, 25mg/ L de estreptomicina y 50 mg/ L decefatoxima). Los brotes una vez desinfec-tados fueron cortados en la cabina de flu-jo laminar a un tamaño de 1 cm e im-plantados en tubos de ensayo de 25 x150 mm, con 1 mL de agua azucaradaestéril (20 g/ L de sacarosa). A los 5 díasse realizó la evaluación del porcentaje decontaminación por bacterias y hongos.Los ápices libres de contaminantesdetectables por observación visual fue-ron pasados a tubos de ensayo con 10mL de medio MS líquido, suplementadocon 6-BAP, 2 mg/ L y ANA 0.1mg/ L so-bre soporte de papel de filtro para eva-


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luar la supervivencia de los explantes alos 30 días.


No se obtuvieron diferencias significativasrespecto al número de brotes cuando lasplantas fueron o no decapitadas,alcanzándose un total de 68 y 63 brotespor planta, respectivamente durante 3semanas. La solución de reguladores delcrecimiento aplicada jugó un papel fun-damental en el rompimiento del efectodominante de la yema apical, similaresresultados reportan Reuveni y Shlesinger(1990).

Con relación a las sustanciasdesinfectantes utilizadas durante eltrabajo, el mejor tratamiento fue lacombinación de Hipoclorito de sodio al1 % durante 10 minutos y posteriormentela sumersión de los explantes en lasolución de antibióticos durante 30minutos, logrando porcentajes deestablecimiento entre 68-75 %. En el casodel alcohol, aunque se aplicó solamentedurante 2 segundos, provocóquemaduras en los brotes. Varios autoresemplean hipoclorito de sodio para ladesinfección de los brotes o yemas de lapapaya plantadas en invernadero ocampo con concentraciones de cloroactivo de 0.3, 1, 1.25 y/o 5.25% (Reuveniy Shlesinger, 1990; Reuvini et. al., 1990;Kataoka e Inoue, 1991; Castillo et al.,1997; De Winnaar, 1997). Singh et.al.(1997) emplean solos o encombinación diferentes antibióticos paraeliminar la contaminación bacteriana,alcanzando altos valores deestablecimiento (78 %), similares a los delpresente trabajo y utilizando brotes deplantas con 14 meses en campo.

El estado juvenil de los brotes empleadoscon activo crecimiento ayudó en granmedida a los resultados alcanzados en ladesinfección y el establecimiento de losmismos, similares resultados planteanFitch et al. (1997).

BIBLIOGRAFÍA

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Fitch, M.; P. Moore and T.Leong., 1997.Progress in transgenic papaya re-search: transformation for broaderresistance among cultivars andmicropropagating selected hybridtransgenic plants.Proceedings of In.Symp. Biotechnology of Tropical andSubtropical species. R.A.Drewed.Queensland, Australia. 29september –3 octuber. pp 514.

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3-06 Cultivo in vitro de Ananas comosus (L.) Merr., ( piña ), cultivarCabezona.

Luis Enrique Rodríguez de Francisco, Yerina Santiago Bardón,Yamila RosalesSimonot. Yanet Igarza Castro y Elena Fornet Hernández.

Centro de Biotecnología Vegetal. Holguín. Carretera a Bayamo. Km. 2.5 Holguín, Cuba.E-mail: [email protected]

Palabras claves: piña, fase de establecimiento, desinfección, cultivo in vitro.

INTRODUCCIÓN

Ananas comosus (L.) Merr., ( Piña ), esuna planta diploide ( 2n=50cromosomas ), con excepción de laCabezona, la cual es un triploide natu-ral, autoincompatible y sólo producesemillas por cruzamientos entrevariedades de diferentes grupos.

La piña es económicamente la másimportante especie de la familiaBromeliaceae. En 1995 ocupó elséptimo lugar en la producción mundialcon 11.7 millones de toneladas, fue lacuarta fruta más exportada y la segundade mayor popularidad en los países declima templado.

La propagación vegetativa es el métodofundamental de multiplicación, en elcultivo de la piña el hombre haaprendido a utilizar todos los tipos demateriales de propagación producidospor la planta, pero sólo una parte de ellosse encuentra a disposición del productor.La tasa de multiplicación es muy baja porlo que se ha elaborado todo un arsenalde técnicas que permiten sumultiplicación clonal.

La multiplicación acelerada por cultivode tejidos permite incrementar ladisponibilidad de material valioso comoen caso de la selección clonal, para lasespecies con multiplicación asexual lenta

(especies leñosas como los frutales yárboles forestales) o para especiesheterocigóticas multiplicadas porsemillas.

Estas técnicas tienen gran interés por suaplicación en los últimos años,fundamentalmente en plantas con pobreproducción de semillas y una insuficientepropagación vegetativa como ocurre conla piña. En este cultivo el método demultiplicación clonal in vitro ofrece unanueva dimensión al productor al permitirla rápida propagación de una variedadpariendo de un escaso número deplantas.

El objetivo de este trabajo fue desarro-llar la desinfección y establecimiento deyemas axilares de la corona de piña cul-tivar Cabezona, para la obtención deexplantes asépticos que serán utilizadoscomo punto de partida para lamicropropagación masiva del cultivo.


Para el presente trabajo se utilizó lametodología propuesta por Daquinta etal. (1989), para la micropropagación depiña cv. Cayena lisa.

Los materiales (coronas) fuerondeshojados con cuidado. Seguidamentese realizó el lavado con detergentecomercial con ayuda de una esponja,con el objetivo de eliminar las


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suciedades que se adhieren en las partesdonde estaban insertadas las hojas,dejándose los troncos de corona 30minutos en agua corriente, estaoperación se realizó tres veces.

Se util izaron cinco variantes dedesinfección, empleando el Hipocloritode Sodio y Calcio a concentracionesdesde 0.5 % hasta 1.5 % durante 10 y20 minutos, respectivamente, además elBicloruro de mercurio a razón de 0.2 %durante 2 , 3 y 5 minutos.

El medio de cultivo basal utilizado fue elMurashige y Skoog, 1962. Los mediosde cultivo fueron esterilizados en auto-clave a 121 °C, a 1.2 Kg / cm de presióndurante 15 minutos. El pH se ajustó a5.7 previo a la esterilización.

El crecimiento de los explantes tuvo lugaren cámaras de luz natural con unaintensidad luminosa de 2500- 3000 lux,una humedad relativa de 75 ± 5 % ytemperatura de 24 ± 2 °C.

Los medios de cultivo secomplementaron con myo-inositol (100mg / L); vitaminas de Heinz (10 mL/ L);sacarosa 3 % y agar 5 % y diferentesvariantes hormonales en dependencia dela fase a estudiar.

Para el procesamiento estadístico de losresultados se emplearon análisis deANOVA simple, auxiliándonos delprocesador estadístico CCS. Los datos enporcentajes se transformaron según laecuación x= 2 arcsen v % , si no teníanuna distribución normal. Las compara-ciones de medias se realizaron median-te la prueba de Duncan.


Comportamiento de los diferentesmétodos de desinfección de las yemas

La desinfección del cultivo comprendedesde la siembra hasta el rompimientode la latencia, hecho que se manifiestapor el enverdecimiento de las yemas ysu aumento de tamaño. Es la etapa másdifícil del cultivo, debido a la altacontaminación que presentaocasionando la pérdida de numerososexplantes.

Los resultados obtenidos en nuestrotrabajo en cuanto a la desinfección delinóculo son los siguientes: lasconcentraciones bajas de NaClO ( 0.5% ) y CaClO ( 0.5 % ), fueron inefectivasy la concentración de HgCl2 ( 0.2 % )durante 5 y 3 minutos fue letal para losexplantes. Los tratamientos de HgCl2 al0.2 % por 3 minutos y el NaClO al 1.5% durante 20 y 10 minutosrespectivamente dieron los mejoresporcentajes de desinfección con 70 y 80% de efectividad.

Nuestros resultados difieren de losobtenidos por Daquinta et al. 1989,quienes utilizaron CaClO al 0.5 % du-rante 20 y 10 minutos (al tronco de co-ronas y a las yemas) respectivamente,para el cv. Cayena lisa serrana, losresultados antes mencionados seutilizaron como testigo.

Cisneros et al., 1994, obtuvieronresultados satisfactorios utilizando HgClal 0.2 % durante 3 minutos, obteniendoaltos porcentajes de brotación y bajacontaminación de las yemas,coincidiendo con el tratamiento 4 delpresente trabajo, en el cual se obtuvoun 70 % de eficiencia.

Comportamiento de la brotación deyemas en los diferentes medios deimplantación

La iniciación del crecimiento implica elrompimiento de la latencia de las yemas


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axilares o laterales de piña, hecho quese ve favorecido por la presencia desustancias inductoras como las auxinasy las citocininas, planteamiento este quedifiere y concuerda indistintamente condiversos autores.

Para la inducción de brotes se utilizaroncinco tratamientos . Los mejoresresultados se obtuvieron en los medioslibre de hormonas y con 0.3 mg / L dekinetina, aunque no existierondiferencias marcadas en el número debrotes. El porcentaje de brotación fuebajo en todos los casos y elcomportamiento de este proceso porefecto de los tratamientos conreguladores no mostró tendencia algunaque permita atribuir a las fitohormonasel desarrollo de las yemas.

Daquinta 1989, obtuvo porcentajes debrotación hasta de un 45 % en yemasde la corona de los cultivars Cayena lisaserrana y Española roja, utilizando elmedio MS más 1 mg /L de ANA y BArespectivamente.

Comportamiento de los explantes enlos diferentes medios demultiplicación

El mejor comportamiento se obtuvo enel medio de cultivo que contenía 2.1mg./L de Benciladenina más 0.3 mg/Lde Ac. Naftylacético, en el cual seobtuvieron coeficientes demultiplicación de 12. El medio de cultivosuplementado con 1.5 mg/L deBenciladenina más 0.3 mg/L de Ac.Naftylacético fue el de menor niveles demultiplicación con 5. Estos resultadoscoinciden con los obtenidos porDaquinta et al. (1998) y similar a losalcanzados por Boxus et al. (1991) y su-perior a los obtenidos por Smith y Drew(1990) de cuatro brotes en cadasubcultivo. Gutiérrez (1988) obtuvo

como máximo cinco brotes en mediosólido, Fitchet (1988) en medio líquidoalcanzó siete brotes de cada yema yGuzmán (1988) en medio líquido enmovimiento logró hasta 34 brotes.

Comportamiento del enraizamiento exvitro de los brotes

Se logró el 100 % de enraizamiento y desupervivencia de los brotes al utilizar elpolvo enraizador a 250 mg/Kg de ANA;aunque no existió diferencias con el de125 mg/Kg de ANA, este disminuyó amedida que se incrementó laconcentración hormonal del polvo.Nuestros resultados son similares a losobtenidos por Daquinta et al (1998),pero en su caso el mejorcomportamiento lo obtuvieron con laconcentración de 125 mg/Kg.

En el comportamiento del número dehojas emitidas no se encontró diferenciasentre los tratamientos, aunque los polvosde menor concentración del reguladorpresentaron un ligero incremento en elnúmero de hojas emitidas.

CONCLUSIONES

Se pueden obtener plantas de piña cul-tivar Cabezona a través de las técnicasde cultivo in vitro, incrementando elnúmero de plantas en menor tiempo decultivo.


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3-07 Estudio de la interacción genotipo- explante- medios de cultivoen la respuesta in vitro de tomate (Lycopersicon esculentum, Mill).

Amelia Capote, Zoila Fundora, Maribel González-Chávez y Odalys Pérez.

Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical “Alejandro deHumboldt” (INIFAT). Ciudad Habana, CUBA. e-mail: [email protected]

Palabras claves: tomate, callos, interacción genotipo-explante-medios de cultivo, cultivoin vitro.

INTRODUCCIÓN

Muchos sistemas de cultivo de diferentesgrados de complejidad pueden serutilizados como la base de una selecciónin vitro y su elección dependerá de laestrategia de selección que será aplicaday la capacidad de los cultivos para sermanipulados. Para llevar a cabo estosestudios muchos autores estudian laresistencia de los callos propiamente,mientras que otros toman enconsideración la resistencia de las plantasregeneradas a partir de éstos odirectamente de los explantesseleccionados.

Por tal razón, el conocimiento y controldel proceso de crecimiento yregeneración en las células y tejidoscultivados son pre-requisitos indispens-ables para el uso eficiente de los métodosy técnicas in vitro y consecuentementepara una óptima utilización de la genéticade las células somáticas en investigacionesrelacionadas con el mejoramiento y laobtención de nuevos cultivares.

El objetivo del presente trabajo fueevaluar el comportamiento in vitro dediferentes cultivares de tomate para suposterior utilización en los esquemas deselección a factores bióticos y/o abióticos.


Los cultivares empleados fueron Cuba C-2781, Cubanacán-1243 y Campbell-28,los cuales muestran diferentes hábitos decrecimiento y grados de susceptibilidad

al ataque de patógenos. Para la obtenciónde callos, los segmentos de hojas ehipocótilos de plántulas germinadas invitro, fueron cultivados en el medio MSsuplementado con 2 mg/L de ácidonaftalén acético (ANA) y 1 mg/L dediferentes citocininas: (M1) 6- bencilamino purina (BAP), (M2): 6-furfurilamino purina (KIN) y (M3) 6 g,g dimetilalilamino purina (2iP).

La capacidad para la callogénesis(inducción y crecimiento) y la rizogénesisespontánea se evaluó de forma cualitativamediante una escala de rangos,analizándose los datos por dos métodosno paramétricos (Kruskal-Wallis y Fried-man) y las diferencias detectadas por laprueba de Student-Newman-Keuls. Seaplicó el estadístico de Spearman paraevaluar la correlación entre el crecimientode los callos y la rizogénesis en cadamedio estudiado.

Para inducir la regeneración de plantasdirectamente a partir del explante seutilizaron segmentos de hojas, hojascotiledonales e hipocótilos de los tresgenotipos, los cuales fueron cultivados enel medio MS suplementado con 0.175mg/L de ácido indol acético (AIA) y 1.5mg/L de BAP. La capacidad morfogenéticafue evaluada mediante las variablesporcentaje de formación de callos, callosmorfogenéticos y callos con desarrollo debrotes y el número de vástagos/ explante.Los datos fueron evaluados mediante unANOVA de clasificación doble y lasdiferencias detectadas mediante laprueba de Newman-Keuls al 5%.


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Los resultados obtenidos demuestran queel análisis de Friedman fue más efectivopara detectar las diferencias significativasque el análisis de Kruskal-Wallis en losexperimentos realizados, lo cual pudieradeberse a la manera de expresar losrangos.

Se observaron diferencias significativasentre los medios de cultivo y lasinteracciones genotipo-medio yexplante-medio utilizado, tanto para lainducción como crecimiento de loscallos. Esta respuesta varió endependencia del genotipo , ya queaunque no se detectaron diferenciassignificativas entre ellos, se observó uncomportamiento diferencial del cultivarCampbell-28. El cv. Cubanacán-1243mostró los mejores resultados en lainducción y crecimiento de los callos,correspondiendo al explante hipocótilolas mejores respuestas.Los mejores medios para la inducción decallos correspondieron a lossuplementados con BAP y KIN, mientrasque para el crecimiento de los mismosresultó más efectivo el medio con 2iP, elcual se considera que tiene un fuerteefecto como citocinina y por tanto puedeproducir una mayor estimulación delcrecimiento celular.

La correlación de rangos de Spearmanmostró una correlación negativa entre losparámetros crecimiento y rizogénesis,siendo solamente significativa cuando seutilizó el medio M2.

En cuanto a los resultados obtenidos alestudiar la capacidad morfogenética seobtuvieron diferencias significativas entrelos genotipos, explantes y la interacciónde ambos factores, excepto para la vari-able porcentaje de formación de callosdonde no se obtuvieron diferenciassignificativas entre los explantesutilizados.

Para las variables porcentaje de callos

morfogenéticos y callos con desarrollo debrotes se observó un comportamientosimilar entre los cvs. Cubanacán-1243 yCuba C-2781, mientras que para la vari-able número de vástagos fue evidente lasuperioridad del cv. Cubanacán-1243. Elcv. Campbell-28 mostró elcomportamiento más recalcitrante antela diferenciación in vitro.

En cuanto a los explantes, las hojascotiledonales mostraron una mayorcapacidad para el desarrollo de losvástagos, obteniéndose la mayorrespuesta con el cv. Cubanacán-1243(12.9 vástagos/ explante).

CONCLUSIONES

• Se demostró que existen diferenciasen la inducción y crecimiento de loscallos en dependencia de factorescomo genotipo, explante y medios decultivo.

• El método estadístico utilizado parael análisis de los resultados obtenidosinfluye en la respuesta resultando eneste caso más efectivo el análisis devarianza de Friedman.

• La capacidad morfogenética difieresignificativamente entre los genotiposy explantes utilizados, por lo que esnecesario estudiar en cada caso lascondiciones adecuadas para lograr elcontrol eficiente del proceso deregeneración en las células y tejidoscultivados in vitro.

• Fue evidente el comportamientodiferente del cv. Campbell-28, dondese obtuvieron los valores más bajosen todos los índices evaluados, tantopara la callogénesis como lacapacidad morfogenética,independiente del explante utilizado.

• Estos resultados permitieron lacaracterización de los materialesobjeto de estudio, lo que posibilita laaplicación de las técnicasbiotecnológicas con fines demejoramiento genético.


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3-08 Regeneración in vitro de especies aromáticas del noroesteargentino.

Maritza Vacca Molina, 1,3; M.I.C Bonomo de Villa, 2,3; F. Murature de Sureda2;S. López3 y R. Neumann3

1Cátedra de Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias Naturales. Universidad Nacional deSalta. Buenos Aires 177. 4400 Salta. Argentina.2 Cátedra de Introducción a la Biología, Facultad de Ciencias Naturales. UniversidadNacional de Salta. Buenos Aires 177. 4400 Salta. Argentina.3 Laboratorio de Cultivo de Tejidos, Banco de Germoplasma. EERA- INTA- Cerillos. 4400Salta. Argentina.

Palabras clave: especies aromáticas, regeneración, fase de establecimiento, cultivo invitro.

INTRODUCCIÓN

La región del Noroeste Argentino presen-ta una gran variabilidad ecológica. Lasespecies aromáticas nativas representanuna riqueza potencial alternativa para lareactivación económica de diferentesáreas agroecológicas de la provincia deSalta (Argentina).

De la experiencia acumulada por institu-ciones nacionales, técnicos y producto-res, en cuanto al valor económico de al-gunas especies aromáticas, surgió la ne-cesidad de desarrollar protocolos de re-generación in vitro para Aloysia citriodoraP. (cedrón), Aloysia polystachya (Griseb.)Moldenke (té de burro), Lippia turbinatia(Griseb.) (poleo), Lippia alba (Mill.) Britton(yerba señorita), Origanum vulgare L. (oré-gano), con el objeto de definir una me-todología tendiente a lograr una produc-ción masiva de plantas.


Para la iniciación in vitro de los cultivosse utilizaron dos fuentes de explantos:ápices meristemáticos y segmentosuninodales.

El crecimiento de los explantos se ensayósobre distintos tratamientos que conteníanlas sales y compuestos orgánicos deMurashige – Skoog (MS), completo o re-ducido a la mitad. Dependiendo de la es-pecie, los medios se suplementaron condiferentes fitorreguladores (6bencylaminopurina, 2- Isopenteniladeninaácido naftalenacético, ácido indolbutírico),en distintas concentraciones. A los me-

dios de cultivo se adicionó sacarosa al 3%p/v, la concentración de agar empleadafue de 0,7 ó 0,35 % p/v (según la espe-cie). El pH se ajustó a 5,8 antes de la es-terilización en autoclave durante 20 mi-nutos a 120 ºC. Los cultivos se incuba-ron a 25ºC ± 2ºC, con un fotoperíodode 16 horas (10 W/m2).

Se evaluaron las siguientes variables: lon-gitud promedio del vástago, longitud pro-medio de raíces, número promedio deyemas, porcentaje de explantosenraizados. Las experiencias se diseña-ron en bloques completos al azar (DBCA),se aplicó el test de Tuckey para el análisisde la diferencia entre medias de trata-mientos.En el 60% de los tratamientos ensayados,para orégano y yerba señorita, se obtu-vieron plántulas deseables.

RESULTADOS

En cedrón, té de burro y poleo, solo el10 % de los tratamientos promovió eldesarrollo de plántulas, en el 90% res-tante se observó a lo largo de todo el cul-tivo, una oxidación permanente, la queno pudo evitarse, con el agregado de car-bón activado ni repiques continuos.

Es posible lograr una propagación clonalvía cultivo in vitro de Lippia alba (Mill.)Britton (yerba señorita) y Origanumvulgare L. (orégano) y esta técnica puedeser utilizada en programas de mejora-miento. En Aloysia citriodora P. (cedrón),Aloysia polystachya (Griseb.) Moldenke (téde burro) y Lippia turbinatia (Griseb.) (po-leo) se deben ajustar las condiciones parahacer eficiente esta metodología.


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3-09 Desarrollo de técnicas biotecnológicas para la conservación dehíbridos de papaya (Carica papaya L.).

Leyanis García Aguila, Laisyn Posada Pérez, Rafael Gómez Kosky, Elisa QuialaMendoza, Blanca Pérez, Yudit Martínez y Zoe Sarría.

Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de las Vi-llas. Carretera a Camajuaní, Km 5.5, Santa Clara, Villa Clara. Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras claves: conservación, híbridos, papaya, reguladores osmóticos, bajas temperatu-ras.

INTRODUCCIÓN

Los recursos fitogenéticos constituyen lasuma de todas las combinaciones degenes producidas durante el proceso evo-lutivo de una especie. Comprenden des-de las especies silvestres de uso agrícolahasta genes clonados (Anónimo, 1998).

Los recursos fitogenéticos de Carica pa-paya han sido conservados tradicional-mente a través del almacenaje de semi-llas certificadas, siendo esta además suprincipal vía de propagación. Por tantolos productos resultantes de los trabajosde mejoramiento genético son vulnera-bles a la conservación tradicional y resul-ta necesario establecer alternativas parala conservación de híbridos o nuevas va-riedades, los cuales deben propagasevegetativamente.

El desarrollo de las técnicas de cultivo invitro ha permitido el establecimiento denuevos métodos de propagación y conellos nuevas alternativas para la conser-vación ex sito del germoplasma. El em-pleo del método de crecimiento mínimoy las técnicas de crioconservación son dosde las estrategias que garantizan la con-servación durante períodos medianos yprolongados de tiempo, siendo factiblesu empleo en especies de propagaciónvegetativa y semillas recalcitrantes.

Durante el desarrollo de la investigaciónse persiguió desarrollar el método del cre-cimiento mínimo en la conservación dehíbridos de Carica papaya, por lo cual nospropusimos los siguientes objetivos: de-sarrollar condiciones de cultivo in vitro

que permitan conservar ápices de papa-ya, sin afectarse la supervivencia, a travésdel estudio de la temperatura deincubación y el empleo de reguladoresosmóticos en los medios de cultivos, asícomo lograr la recuperación del materialconservado y su incorporación a la pro-pagación in vitro.


Técnicas y Procedimientos generales

Los ensayos se realizaron con ápices deplantas procedentes de embrionessomáticos cultivados in vitro y correspon-dientes a la variedad Maradol Rojo. Losápices, de 0.5 cm de longitud, conteníanla yema apical, una axilar y estaban libresde hojas. Las plantas fueron desarrolla-das en medio de cultivo de multiplica-ción (MM) compuesto por las sales deMurashige y Skoog (MS) (1962), 0.22 mg/L de 6 bencilaminopurina (6-BAP),0.11mg/L de kinetina, 1 mg/L de tiamina,0.66 mg/L de vitamina B 2 y 30 g/L desacarosa.

Como medio de cultivo basal (MB) parala conservación se utilizó la formulaciónMS (1962), con 30 g/L de sacarosa, vita-mina B 12 y sin la presencia de los regu-ladores del crecimiento.

Encapsulación de los ápices para laconservación

Durante la realización del ensayo se pro-cedió a la encapsulación de los ápices,utilizando 4 % de alginato de sodio go-teado por un tiempo de 20 minutos enCloruro de Calcio (CaCl2), quedando con-


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formadas cápsulas de 0.7 mm de diáme-tro. La composición química de las mis-mas, incluía el medio basal y reguladoresosmóticos como el manitol y el sorbitolen dosis de 0, 5, 10, 20 y 30 g/L, respec-tivamente. Las cápsulas fueron colocadasen placas de Petri estériles y almacena-das a temperaturas de 15, 18 y 26 ºC.

Las evaluaciones se efectuaron cada 30días, teniendo en cuenta el porcentaje debrotación y el período de conservación(meses). Posterior a la conservación, losápices fueron transferidos a medio demultiplicación con el objetivo de evaluarel porcentaje de supervivencia y su recu-peración en las condiciones normales decrecimiento, a través del análisis del pesofresco y el número de brotes por plantasalcanzado por los mismos.


La conservación de los ápices de papayain vitro fue posible combinando dosis ele-vadas de reguladores osmóticos (manitolo sorbitol) y temperatura de incubaciónde 15 ºC.

Durante el desarrollo del ensayo y a par-tir de los dos meses se observó crecimien-to en los ápices y ruptura de la cápsulaen los diferentes tratamientos. Los trata-mientos que contenían el manitol comoregulador osmótico, presentaron losmáximos porcentajes de brotación, en lascápsulas almacenadas a 26 ºC, indepen-dientemente de la dosis utilizada. Sinembargo, los conservados en 15 ºC mos-traron porcentajes menores de brotación,existiendo la tendencia a disminuir en lamedida que se incrementan las dosis delregulador osmótico. Cuando se utilizó elsorbitol, la brotación de los ápices fuereprimida con la dosis de 30 g/L, inde-pendientemente de la temperatura a lacual se encontraban incubados.

El menor período de conservación fue decuatro meses y se obtuvo en los ápicesconservados a 26 ºC de temperatura, enlos cuales se observó clorosis y alta mor-talidad. Sin embargo, el mayor períodode conservación fue de doce meses y sealcanzó en los ápices conservados a 15y 18 ºC.Roca (1994) señala el deterioro irreversi-

ble de explantes de papa a los seis mesesde conservación en 24 ºC, sin embargoa temperaturas de 8 y 10 ºC el crecimien-to fue lento y se mantuvo alta la viabili-dad.

Los máximos valores de supervivencia, delos ápices almacenados a 15 ºC, corres-pondieron a los tratamientos que conte-nían 30 g/L de los diferentes reguladoresosmóticos. Suksa et al (1997) señala unefecto perjudicial del manitol en la con-servación de ápices de papaya, por lasuculencia proporcionada al material ve-getal, este comportamiento no se presen-ta en este trabajo.

El comportamiento de los mismos des-pués del subcultivo a medio de multipli-cación resultó satisfactorio al comparar-se con ápices sin el estado de conserva-ción. El peso fresco de las plantas des-pués del de la primera transferencia pre-sentó valores en correspondencia con eltestigo; pero el número de brotes de lasplantas conservadas resultósignificativamente superior en los trata-mientos que contenían dosis elevadas dereguladores osmóticos. Este comporta-miento pudo estar dado por la acumula-ción, en los tejidos, de aminoácidos comola prolina, el cual proporciona la recupe-ración rápida de las plantas después quecesa el estrés proporcionado.

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3-10 Influencia de las vitaminas en la tasa de multiplicación del ñame(Dioscorea alata L.)

Gastón F. Saborit V.1, Gerardo de la Cruz L.2, Silvio Meneses R.3, Jorge A. Estrada1,Zucel Infante1, Aida García1, Milvia Fonseca 1 y Aracelis Rodriguez1.

1 Instituto de Investigaciones Agropecuarias “Jorge Dimitrov” GP 2140, Bayamo 85 100,Gramna Cuba. e-mail: [email protected] Centro Nacional de Electromagnetismo Aplicado. Santiago de Cuba. Cuba.3 Universidad de Granma, Cuba.

Palabras claves: ñame, vitaminas, cultivo in vitro.

INTRODUCCIÓN

Krikorian (1991) expone que todos losmedios parecen beneficiarse en ciertogrado con los suplementos vitamínicos,a menos que las células se vuelvan verdeso hasta que ello ocurra; los aditivosmínimos usuales son la tiamina, el ácidonicotínico y la piridoxina. En el presentetrabajo, se estudió la influencia de lasvitaminas en la tasa de multiplicación delñame (Dioscorea alata L.).


Se utilizaron vitroplantas provenientes decondiciones asépticas, con tressubcultivos en el medio a experimentar.Se empleó un diseño completamentealeatorizado con arreglo factorial 26,replicado un cuarto en bloques de cuatrounidades, donde los niveles fueronausencia o presencia de las vitaminas. Launidad muestra fue de 96 vitroplantas portratamiento. Se realizó un análisis deregresión paso a paso.


La regresión lineal múltiple obtenida parala tasa de multiplicación, ajustósignificativamente (P<0.05) a la siguien-te ecuación:

Y=2.59 ± 0.04 + 0.20 ± 0.05X2 + 0.18± 0.05X3 - 0.20 ± 0.05X1X2 + 0.41 ±0.06 X2X3X4 – 042 ± 0.07X2X3 - 0.44 ±0.07X2X4 + 0.93 ± 0.10 X2X3X4 - 0.68± X1X3X4.

(r = 0.99; R2 =0.98).

Cuando se realizó el análisis de laregresión lineal múltiple, para la tasa demultiplicación se observó que losmayores coeficientes estaban dados porla combinación de los reactivos ácidonicotínico, piridoxina y mioinositol(X2X3X4), así como la combinación tiaminay mioinositol (X1X4). También se pudoobservar que las combinaciones detiamina, piridoxina y mioinositol (X1X3X4);ácido nicotínico y piridoxina (X2X3);tiamina y ácido nicotínico (X1X2) y ácidonicotínico y mioinositol (X2X4), fueroninhibitorios de la tasa de multiplicación yque la combinación de dos o másreactivos influyeron más en la misma; osea por estímulo o inhibición, que unreactivo solo, independientemente a queel ácido nicotínico (X2) y la piridoxina (X3)pueden ser utilizadas solas.


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3-11 Cultivo in vitro del pimiento Capsicum annuum cv. ‘ Verano 1´.

Arlene Rodríguez Manzano, Amelia Capote Rodríguez y Dayamí Pérez.

Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical ¨Alejandro deHumboldt¨ (INIFAT), Ciudad Habana, CUBA. E-mail: [email protected]

Palabras claves: pimiento, cultivo in vitro, desinfección, callos.

INTRODUCCIÓN

El pimiento Capsicum annuum consti-tuye la segunda hortaliza de mayor im-portancia para Cuba, debido a su grandemanda tanto para el consumo fres-co como para el uso industrial.

En el INIFAT existen variedadespromisorias donde es importante la ob-tención de semilla original para su ex-tensión y generalización, sin embargoesta puede verse afectada en muchasocasiones por el área disponible parala siembra, ya que al ser plantasautógamas facultativas las posibilidadesde cruzamientos entre las variedadesson altas, por lo que se limita el desa-rrollo acelerado de los programas demejoramiento genético a la par de laproducción de semilla.

Por otra parte, la aplicación de las téc-nicas de biotecnología en el mejora-miento de esta especie está muy limi-tada por la baja capacidad de regene-ración que muestran sus células y teji-dos cultivados in vitro. Es por eso queel objetivo del presente trabajo fueestudiar el comportamiento in vitro delpimiento cv. ‘Verano 1´, para su posi-ble propagación y obtención de semi-l la de al ta cal idad por víasbiotecnológicas.


La desinfección de las semillas de pi-miento cv.‘ Verano 1´ se realizó encondiciones estériles con un tratamien-to de alcohol durante 2 minutos yposteriormente con bicloruro de mer-curio durante 5’, 10’ y 15’.

Las plántulas se desarrollaron en me-dio de germinación Knop, en condicio-nes controladas y a las cuatro o cincosemanas, los ápices y nudos fueronsegmentados y cultivados en el medioMS (Murashige y Skoog, 1962) suple-mentado con diferentes concentracio-nes en forma combinada e indepen-diente, de 6 bencil amino purina (BAP),acido indol acético (AIA) y ácido indolbutírico (IBA). Además se estudió elefecto de la adición de la urea combi-nada con las auxinas.

A los 30 días de cultivo se determinóel porcentaje de callos y raíces y seevaluaron las variables: índice de mul-tiplicación, altura de las plantas y nú-mero de nudos por tratamiento. Estosdatos se sometieron a un análisis devarianza con un diseño completamen-te aleatorizado con 12 repeticiones ylas diferencias significativas fueron de-tectadas por una prueba de Duncan5%.


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Con el objetivo de estimular la rege-neración directa de plantas a partir delas hojas, estas se colocaron en el me-dio MS modificado suplementado conBAP y AIA en las proporciones: 1:1,1:1.6 y 1:2.5. La capacidadmorfogenética de los explantes fueevaluada a los 2 meses de cultivo, ana-lizándose para ello el porcentaje decallos, brotes y el número de brotesmediante una escala cualitativa.


Se logró la desinfección de las semillascon todos los tratamientos estudiados,por lo que se recomienda el uso delmenor t iempo de exposición enbicloruro de mercurio.

Los resultados obtenidos mostraronque los mayores porcentajes de forma-ción de callos se obtuvieron en losmedios suplementados con diferentesconcentraciones de BAP, cuando secombinó con AIA (0.5 y 0.5 mg/L deAIA), y cuando se utilizaron estas con-centraciones de AIA de forma indepen-diente, aspecto negativo cuando sedesea obtener la propagación del ma-terial vegetal. Sin embargo a concen-traciones más bajas de AIA (0.1 mg/L)no se estimuló la formación de callos.

La mejor respuesta en la propagaciónse obtuvo en los medios MS suplemen-tados con IBA (3mg/L) más Urea (10mg/L) con un promedio de 3.25 nu-dos/explante y un índice de multipli-cación (IM) de 2.42. Además tambiénse logró la formación de raíces y laadaptación de las vitroplantas a con-diciones controladas en bandejas conmateria orgánica y suelo (50% c/u). Este

medio no tuvo diferencias significati-vas en el IM con los medios que se lesadicionó 5 mg/L de AIA y 5 mg/L deurea, ni con 1 mg/L de AIA y 10 mg/Lde urea.

Los ápices mostraron diferencias sig-nificativas en el alargamiento de losbrotes y en el IM en comparación conlos nudos, por lo que se requieren tra-bajos más profundos en la interaccióntipo de explante con diferentes mediosde cultivo para lograr mejores resulta-dos.

En la regeneración directa deprimordios a partir de hojas se obtu-vieron diferencias en los tres mediosde cultivo analizados, obteniendo elmayor número de brotes en el medioMS con la proporción de 1:2.5 (BAP/AIA) entre ellos. El medio con la pro-porción 1:1 estimuló la formación decallos.

CONCLUSIONES

• El mejor medio de cultivo para lapropagación de los nudos y ápi-ces fue el MS suplementado con3mg/L de IBA más 10 mg/L deUrea.

• Se encontraron diferencias signi-ficativas en la propagación entrelos ápices y nudos.

• El BAP combinado con el AIA tuvoun efecto negativo en la propaga-ción del cultivar ‘ Verano 1´

• Se logró la mayor regeneración di-recta de primordios a partir dehojas en los medios MS modifica-do y suplementado con BAP y AIA(1:2.5).


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3-12 Influencia del campo electromagnético y el tipo de explante enla callogénesis de Dioscorea alata L.

Ana María Botta Gómez, Gerardo de la Cruz Licea, Yilán Fung Boix, AlbysEsther Ferrer Dubois, Yaquelín Terrero Lores, Sandra Cots Vicente, Irina NovoaColás, Elizabeth Isaac Alemán.

Centro Nacional de Electromagnetismo Aplicado - Universidad de Oriente, AvenidaLas Américas s/n. GP 4830 , Teléfono (0226) – 43721. Santiago de Cuba. Cuba. E-mail: [email protected]

Palabras claves: callos, campo electromagnético, ñame.


Con el objetivo de determinar elefecto de la acción del campo elec-tromagnético de frecuencia e induc-ción bajas y el mejor tipo de explanteen la callogénesis de Dioscoreaalata L., se realiza el cultivo in vitrode esta especie a part i r de 40explantes de tallos y 40 explantesde hojas procedentes devitroplantas. Para la formación ymantenimiento de los callos se uti-lizó un medio de cultivo basal cons-tituido por macronutrientes D-567(de la Cruz, 1992), micronutrientessemiconcentrados Murashige ySkoog (1962), vitaminas Murashigey Tucker (1969), Fe-EDTA, 20 mg/Lde cisteína, 4.5 mmM de 2,4 - D,sacarosa al 3 % y agar al 0.8 %; elpH se ajustó a 5.8. A las 24 horas derealizarse la siembra, 20 frascos conhojas y 20 frascos con tallos se so-metieron a la acción de un campo elec-tromagnético con un nivel de induc-ción de 40 G, frecuencia 60 Hz y ondatrapezoidal. La aplicación electromag-nética se efectuó de forma crónica(una hora semanal), con unestimulador electromagnético regio-nal para cultivos in vitro BioNaK – 03diseñado y construido en el CNEA.(Domínguez et al., en proceso edito-rial). A la cuarta semana se evaluó lavariable masa fresca de los callos (g).Para el procesamiento estadístico serealizó un ANOVA de clasificación do-ble y una prueba aproximada deWelch para igualdad de medias dedos muestras independientes convarianza desiguales (Sigarroa, 1985).


Al analizar los resultados, se pudo apre-ciar que los mayores valores de masa fres-ca (g) se obtuvieron partiendo deexplantes de hoja (P < 0.001); tambiénse observó un efecto marcadamentepositivo del campo electromagnético,tanto en hojas como en tallos se ob-servaron diferencias altamente signi-ficativas (P < 0.001).

La exposición de células vegetales acampos electromagnéticos puedetener una marcada influencia positivasobre las mismas.

BIBLIOGRAFÍA

A. Millan; G. Saborit; N. Aguilera; A. de la Cruz, G.; M. Labrada; O.

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Murashige, T. y D.P.H. Tucker., 1969.Growth factor requirements of cit-rus tissue culture. pp. 1155 - 1161in Chapman H.D. (ed.) Proc. 1st Int.Citrus Symp. Vol. 3. Univ. Calif., Riv-erside Publication.

Sigarroa, A., 1985. Biometría y DiseñoExperimental, Tomo II. EditorialPueblo y Educación. Ciudad de LaHabana.


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3-13 Influencia de la relación N:P:K en el coeficiente de multiplicaciónpara el establecimiento in vitro de yemas de boniato ( Ipomea batatas(L) Lam).

J. Estrada1 ; G. Saborit 1; A. Espinosa2; A. Millán 3 ,A. García 1; M. Fonseca4; Z.Infante1 y E. Montero4.

1Instituto de Investigaciones Agropecuarias “ Jorge Dimitrov”, GP 2140, Bayamo 85100,Granma, Cuba. E-mail: [email protected] Universidad de Granma.3 Delegación CITMA, Granma.4 Instituto Superior Pedagógico “ Blas Roca Calderío”, Granma.

Palabras claves: boniato, macronutrientes, fase de establecimiento, cultivo in vitro.

INTRODUCCIÓN

El 80% de los trabajos de cultivo in vitrodel boniato se han realizado a partir delmedio basal de Murashige y Skoog (1962), sin un estudio preliminar de lainfluencia de la relación de los elementosmacronutrientes. El objetivo del presentetrabajo fue determinar la influencia de larelación N:P:K en el establecimiento invitro de yemas de boniato ( Ipomeabatatas (L). Lam).


Se utilizaron yemas de boniato del clonJewel, proveniente de macetas bajocondiciones naturales. Las condicionesde cultivo fueron: iluminación natural(36μmol.m-2.s-1), humedad relativa 80%y temperatura 24 ± 2 0C. Se montó enun diseño completamente aleatorizadocon arreglo trifactorial y 24 explantes portratamiento. Para el procesamientoestadístico de los datos se utilizo el análisisde varianza de clasificación triple paracontrastes ortogonales establecidos apriori ( Oestle, 1974). Los tratamientosconsistieron en diferentesconcentraciones iónicas de los elementosmacronutrientes.


En la tabla 1 se muestra la comparaciónentre los contrastes seleccionados, dondese aprecia que no existió diferenciassignificativas en los medios con diferentesniveles de nitrógeno

(Contraste C1), sin embargo conindependencia al nivel de nitrógeno,siempre que el potasio mostró nivelesbajos, se obtuvo un mayor coeficiente demultiplicación ( p< 0,001, contraste C3).El análisis del fósforo en los medios conbajos niveles de este elemento evidenciómejores resultados en presencia denitrógeno alto y con independencia delas concentraciones del potasio, con unmayor coeficiente de multiplicación ( p< 0,001, contraste C5), lo contrarioocurrió con una concentración baja denitrógeno, donde los coeficientes demultiplicación aumentaron en los medioscon altos niveles de fósforo conindependencia a la concentración depotasio sin diferencias significativas entreellos. La evaluación integral de loscontrastes establecidos mostró mayorescoeficientes de multiplicación en el


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establecimiento de yemas de boniato conlas relaciones 30: 1: 10 y 10: 3: 10 ( tabla2).

Las medias obtenidas por tratamientospara la variable analizada se compararoncon el medio de Murashige y Skoog (1962), donde se determinó que no hubodiferencias significativas entre lostratamientos 2 y 3, correspondientes a lasrelaciones planteadas anteriormente, sinembargo se observaron plantas másvigorosas, pigmentadas y en muchoscasos enraizadas en el tratamiento 30: 1:10. Si valoramos que la variable más

importante para determinar el númerode plantas que se alcanzará porprogresión geométrica es el coeficientede multiplicación, la utilización de estetratamiento nos permite obtenerresultados alentadores en elestablecimiento in vitro de yemas deboniato. Resultados similares se hanreportado por Saborit et al.,(1997) en elcultivo del ñame, así como en la papa, locual indica que para las plantas que sepropagan por tubérculos en condicionesnormales, al propagarse in vitro, larelación óptima de elementosmacronutrientes N: P: K es de 30: 1: 10.

BIBLIOGRAFÍA

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Saborit, G. J. Estrada y G. de la Cruz,1997. Influencia de la relación N:P:Ken la micropropagación de la papa (Solanum tuberosum L., var Desiree).Revista Agricultura, Año 8, no. 47:34-36, julio-agosto, 1997.

Tabla 1. Análisis comparativo entre los contrates seleccionados.

Contraste Niveles Coeficiente demultiplicación

Significación

C1 N bajo vs N alto 2.50 vs 2.72 NSC2 K bajo vs K alto ( N alto) 3.11 vs 2.34 NSC3 K bajo vs K alto ( N bajo) 3.50 vs 1. 45 ***C4 P bajo vs P alto ( N alto, K alto) 2.50 vs 2.17 NSC5 P bajo vs Palto ( N alto, K bajo) 4.62 vs 1.60 ***C6 P bajo vs P alto ( N bajo, K alto) 1.40 vs 1.50 NSC7 P bajo vs P alto ( N bajo, K bajo) 3.00 vs 4.11 NS

ESx 0.17*** : p < 0.001 ; NS : No significativo.


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3-14 Aplicación de la Biotecnología en la conservación de los recursosfitogenéticos de caña de azúcar (Saccharum spp. Híbrido).

Leyanis García Aguila, Mayelin Rodríguez Urquiza, Yudith Martínez, BlancaPérez, Zoe Sarria y Tatiana Pichardo.

Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central “ Marta Abreu” de LasVillas, Carretera a Camajuaní Km 5.5, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras Claves: conservación, caña de azúcar, reguladores osmóticos, bajastemperaturas.

INTRODUCCIÓN

Los recursos fitogenéticos permitendesarrollar cultivos productivos,resistentes y de calidad. Ayudan a lasnaciones a incrementar la productividady sostenibilidad de su agricultura e inclusoa desarrollarse (Anónimo, 1998).

Los recursos fitogenéticos de caña deazúcar constituyen la base del desarrollode los programas de mejoramientogenético y de producción de semilla.

El Banco de germoplasma en Cubacuenta con 2 575 formas que incluyeespecies originales, híbridos nacionales oextranjeros y géneros afines. Esta cifraaumenta sistemáticamente, a partir de lasnuevas variedades destacadas que surgendel programa de mejora y delintercambio con otros países. A pesar delos esfuerzos por su conservación, de lacolección han desaparecido decenas degenotipos y esto ha sido un problematambién en otros países (Pérez, 1997).

El desarrollo de las técnicas de cultivo invitro permite el establecimiento de dosestrategias de conservación: el empleodel crecimiento mínimo y con ello segarantiza la conservación a medianoplazo (8 a 12 meses) y la paralización to-tal del crecimiento la cual solo es factibleaplicando las técnicas decrioconservación, que garantiza laconservación por períodos de tiemposprolongados.

Durante el desarrollo de la investigaciónse pretende ampliar los conocimientossobre la utilización de los métodosbiotecnológicos de conservación y suutilización práctica en el mantenimientode los recursos fitogenéticos de caña deazúcar.

Para lo cual se proponen los siguientesobjetivos: desarrollar medios y técnicasdel cultivo in vitro que permitan retardarel crecimiento de los explantes de cañade azúcar prolongando los períodos desubcultivos a medio fresco y evaluar larecuperación, a través de la tecnología demicropropagación, en el materialconservado.


Técnicas y procedimientos generales.

Las muestras correspondieron a la zonaapical o spindle de la variedad IBP 87-100 y la desinfección superficial seefectuó con etanol al 70% durante dosminutos e hipoclorito de sodio al 2% por15 minutos. La disección de los tejidos ylas transferencias a medio de cultivofresco se efectuaron bajo condicionesasépticas en cámara de flujo laminar.

Las líneas diagnosticadas como negativasa microorganismos fitopatógenos fuerontestadas a contaminantes bacterianos queafectan los procesos in vitro, a través dela siembra de fragmentos de tejido veg-


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etal en medios de cultivo bacteriológicos(Leifert, et al., 1994). Los explantes de laslíneas negativas constituyeron el materialde partida en los estudios deconservación, seleccionando plantas de1.5 a 2 cm de altura.

Evaluación del efecto de dosformulaciones de sales en los mediosde cultivo para retardar el crecimiento.

Con el objetivo de retardar el crecimientode los explantes se estudiaron dosformulaciones de sales minerales, laspropuestas por Murashige y Skoog (1962)y las sales propuestas por White (1963),en ambas se evaluaron diferentesconcentraciones con respecto al 100 %o total de las mismas.• Concentraciones minerales

estudiadas.Sales MS en concentraciones de 25%,50%, 75% y 100%.Sales White en concentraciones de 75%,100% y 125%.

Las diferentes variantes estudiadascontenían 30 g/L de sacarosa y carecíande reguladores del crecimiento. Despuésde la siembra se incubaron a 18 ± 2°Cde temperatura en cámara climatizada,bajo fotoperíodo de 16 horas luz eintensidad luminosa de 3500 a 4000 luxy a 26 ± 2°C de temperatura en cámarade luz natural. Se consideró como réplica25 plantas por variante, evaluando elestado fisiológico, la supervivencia y elperíodo de conservación.

Influencia de las bajas temperaturas yla adición de reguladores osmóticos alos medios de cultivo en el retardo delcrecimiento.

Teniendo en cuenta los resultados delexperimento anterior se estudia laincidencia de las temperaturas menoresde 18 °C en el retardo del crecimiento,evaluando el comportamiento de losexplantes a 12 y 15 ± 2 °C,respectivamente. La formulación mineral

utilizada en los medios de cultivo fue laMS y se suplementó con diferentesniveles de manitol (0; 10; 20; 30 mg/L),con el objetivo de incrementar el nivelosmótico de los medios de cultivo.

Evaluación de la recuperación del ritmode crecimiento de los explantesconservados.

En los tratamientos donde se alcanzaronlos máximos períodos de conservaciónfue necesario evaluar la recuperación delmaterial conservado, transfiriédolos amedio de cultivo solidificado demultiplicación propuesto por Jiménez(1995). Después de los 21 días seprocedió a evaluar el comportamiento delos explantes conservados, a través delanálisis del coeficiente de multiplicación,la supervivencia y la presencia devariaciones morfológicas propias de loscultivos in vitro de caña de azúcar, comoson las plantas con crecimiento enrosetas y variegadas. Los explantesrecuperados se transfirieron a medio decultivo líquido suplementado con 1.3 mg/L de AIA, evaluándose después de 15 díasel porcentaje de plantas enraizadas.


Evaluación del efecto de dosformulaciones de sales en los mediosde cultivo para retardar el crecimiento.

Los explantes de caña de azúcarconservados bajo la formulación de salespropuesta por Murashige y Skoog (1962)alcanzaron mayor longevidad y períodode conservación que los almacenados enla formulación propuesta por White(1963). La utilización de las sales MS enla conservación de germoplasma ha sidoreportada por varios autores en diferentesespecies, como papa, yuca, caña deazúcar y papaya. (Roca, 1987; Taylor,1993; Suka et al., 1997; Toledo et al.,1998 y Pinto de Lemos, 1998).

El comportamiento negativo, en laconservación, de los explantes bajo laformulación de sales White, pudiera estar


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dado por los bajos niveles de nitrógenoque presenta, incrementándose lamortalidad a partir de los 2 meses dealmacenaje y presentando el 70.7 % delos explantes en mal estado fisiológico.Roca (1994) refiere un efecto perjudicialen el cultivo in vitro de la yuca, nivelesde nitrógeno por debajo de 10 mM.

La temperatura de incubación resultódeterminante en la prolongación de losperíodos de conservación,independientemente de lasconcentraciones minerales estudiadas,en los tratamientos que contenían lassales MS. Los tratamientos donde secombinaron estas sales con latemperatura de 18 ºC se alcanzaron losmáximos períodos de conservación, sindiferencias estadísticas en el porcentajede supervivencia. Taylor (1993) reportala utilización de 18 ºC de temperaturaen el mantenimiento in vitro de caña deazúcar por un período de 8 meses.Mientras que Pinto de Lemo (1998)recomienda la temperatura de 27 ºC parala conservación, de esta especie enmedios líquidos.

Influencia de las bajas temperaturas yla adición de reguladores osmóticos alos medios de cultivo en el retardo delcrecimiento

La supervivencia de los explantes seafectó cuando se incubaron a 12 ºC detemperatura, ocurriendo la mortalidadtotal después de los seis meses dealmacenaje. Considerando por tanto, queel grado de susceptibilidad de losexplantes de caña de azúcar a las bajastemperaturas se encuentra por debajo delos 12 ºC.Los mayores períodos de conservaciónse alcanzaron en las variantesconservadas a 15º C de temperatura(doce meses), mientras que los incubadosa 18 ºC lograron los máximos valores desupervivencia a los seis meses y a partirde los ocho meses se incrementóconsiderablemente la mortalidad. Estedeterioro estuvo dado por mantenerse unalto ritmo de crecimiento durante el

período de almacenaje, alcanzando hasta6 cm de altura.Durante la conservación de los explantesde caña de azúcar a 15ºC de temperaturase observó, a los 12 meses, un retardosignificativo del crecimiento cudo seutilizó la menor concentración de sales,correspondiente al 25 %. Este resultadocorrobora lo planteado por varios autores,los cuales afirman que la disminución delcontenido mineral en los medios decultivos favorece el retardo delcrecimiento debido a las alteraciones queocurren en el metabolismo celular.

La presencia de brotes resultó unacaracterística distintiva en cada uno delos tratamientos, de forma general, seobservó un estímulo significativo en lainducción de brotes axilares en lostratamientos que contenían las diferentesdosis de manitol, independientemente dela concentración de sales minerales delmedio de cultivo. Este reguladorosmótico proporcionó a los explantesalmacenados a 15 ºC de temperatura unarelación inversa entre la altura y elnúmero de brotes, permitiendo alcanzarlongevidad. Pinto de Lemos (1998) refierela presencia de brotes axilares enexplantes de caña de azúcar a los seismeses de conservados, utilizando el to-tal de las sales MS.

Los resultados alcanzados durante eldesarrollo de la investigación le confierena las condiciones de crecimiento entemperatura de 15 ºC la posibilidad dealmacenar por un período de 12 meseslos explantes de caña de azúcarcultivados in vitro de la variedad IBP 87-100. La eficiencia de la conservación seincrementó cuando la concentraciónmineral del medio de cultivo se redujo a¼ o ½ de su concentración total,alcanzando valores superiores al 80 % desupervivencia.

Evaluación de la recuperación del ritmode crecimiento de los explantesconservados.

A causa del almacenaje se afectó elcoeficiente de multiplicación de losexplantes recuperando su ritmo de


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crecimiento, de forma paulatina, con lassucesivas transferencias a medio demultiplicación

Durante las dos transferenciasrealizadas no sé observó la presenciade variaciones morfológicas, comoplantas con crecimiento en rosetas yvariegadas. La respuesta de losexplantes en medio de enraizamientoresultó satisfactoria, alcanzando losmejores porcentajes en lostratamientos carentes de manitol sindiferencias estadísticas con el testigo.

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White, P.R., 1963. The cultivation ofanimal and plant cell. Ronal Press,New York.


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3-15 Establecimiento clonal in vitro de explantes procedentes de rebrotesde Swietenia mahagoni x Swietenia macrophylla. Inducción de callogénesis.

Lucia Maribel Medina y Rogelio Sotolongo Sospedra.

Laboratorio de Biotecnología de las Plantas. Universidad de Pinar del Río. Carretera aSan Juan y Martínez. Km. 5 “El Vizcaíno”. Pinar del Río 20100. Cuba. E-mail:[email protected]

Palabras claves: caoba, callogénesis

INTRODUCCIÓN

Las caobas son unas de las especies demadera valiosas más codiciadas en elmercado por su calidad y utilidad. Pro-cedentes de Centroamérica se introdu-jo en Cuba la especie S.macrophylla,King; ésta introducciónconllevó a la formación de un híbridointerespecífico cuando las dos especies(S. macrophylla y S. mahagoni) se en-contraban próximas y con cierto gra-do de heterosis que ha demostradoposeer cualidades superiores a sus pro-genitores en cuanto a crecimiento, ren-dimiento y susceptibilidad al taladradorde brotes de las Mel iaceas(Betancourt,1987). El objetivo del pre-sente trabajo consistió en el estableci-miento de hojas procedentes derebrotes de esta especie, el uso de unmedio apropiado para lograr lacallogénesis así como el estudiohistológico de las masas celulares ob-tenidas como punto de partida para co-nocer la posibilidad de su diferencia-ción.


Los experimientos se llevaron a caboen el Laboratorio de Biotecnología delas Plantas de la Universidad de Pinar

del Río. Se usaron como explanteshojas provenientes de rebrotes de es-tacas de Swietenia macrophylla, King xSwietenia mahagoni,Jacq.

Experimento 1. Establecimiento deexplantes.

Este experimento tuvo como objetivoestablecer asépt icamente losexplantes, para ello se realizaronfumigaciones preventivas cada dos díasa las estacas, esto permitió, disminuirlos niveles de contaminación una vezestablecidos los explantes. Para el es-tablecimiento se utilizó un medio MScon el doble de los macronutrientes,como medio de base y se mostraron 2tratamientos uno con carbón activado1g/L y otro sin carbón activado ni ca-seína hidrolizada, se utilizó PVP comoantioxidante en los medios de cultivos.

Experimento 2 . Inducción decallogénesis.

Los explantes establecidos fuerontransferidos a un medio MS y se desa-rrollaron soa tratamientos hormonalescon 0,5mg/L de 2,4-D y 1mg/L de 2,4-D, respectivamente. Se usó PVP comoantioxidante en el medio de cultivo.

Una vez logradas las masas celulares


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se realizaron cortes histológicos parasu estudio y determinación de tejidosembriogenéticos.

RESULTADOS

Para el establecimiento de losexplantes utilizados resultó que las va-riantes que incluyó las sales de MS conel doble de los macronutrientes, caseí-na hidrolizada 250mg/L, carbón acti-vado 1g/L y el PVP comoantioxidantes; fue la mejor. Se pudoapreciar que los explantes (hojas entre16mm- 20mm de longitud) al cabo de15 días aún conservaban su coloraciónverde tierno e incluso se produjo unaactivación del crecimiento de las ho-jas utilizadas, al parecer por la inclu-sión de caseína hidrolizada en el me-dio de cultivo ya que ésta influye posi-tivamente en procesos de síntesis a ni-vel celular, otro constituyente del me-dio que favoreció el resultado es elcarbón activado, el cual redujo los ni-veles de oxidación fenólica ya que escapaz de absorver estos compuestosque se liberan al medio de cultivo yque es una de las principales dificulta-

des para establecer el cultivo en espe-cies forestales (Mier-Dinkel,1993).

En la formación de callos resultó favo-rable la variante en que se usó 1mg/Lde 2,4-D al parecer ésta concentraciónfue factible para activar la división ce-lular y formar las masas celulares,obteniéndose callos a los cuales se lehicieron cortes histológicos para deter-minar la capacidad de diferenciaciónde las células, resultando éstas con ca-racterísticas anatómicas favorables quehacen factible la posibilidad de rege-nerar plantas a partir de estos callosformados.

BIBLIOGRAFÍA

Betancourt,B.A., 1987. Silvicultura Es-pecial de Árboles Maderables Tro-picales. Editorial Científico-Técni-ca. Ciudad de la Habana.432p.

Mier-Dinkel, A.; Becker, D.B., 1993.Micropropagation and ex vitrorooting of several clones of late-floshing Quercus robus Lin. En:Annales des sciences forestieres.


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EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA Y SEMILLA ARTIFICIAL.

4-01 Influencia de diferentes factores en Embriogénesis somática deCoffea canephora P.

María Esther González 1, Nancy Santana 2, M. Ferrer 1 y Mireya Cabrera 1

1 Estación Central de Investigaciones de Café y Cacao, Finca La Mandarina, Cruce de losBaños, Santiago de Cuba. CP 92700. CUBA. E-mail: [email protected] Instituto nacional de Ciencias Agrícolas ( INCA), Carretera San José-Tapaste Km. 3 1/2.Gaveta Postal 1. San José de las Lajas, La Habana. E-mail: [email protected]

Palabras claves: embriogénesis somática, café, influencia del genotipo, callos.

INTRODUCCIÓN

Las técnicas de cultivo de tejidos y dentrode ellas, la embriogénesis somática,constituyen una herramienta versátil parael estudio de problemas básicos yaplicados de la biología de plantas yofrecen aplicaciones prácticas como lamultiplicación masiva de genotipospromisorios, considerando estaposibilidad y teniendo en cuenta laimportancia para la práctica productivade cuatro clones seleccionados de lavariedad Robusta, especie Coffeacanephora P. caracterizada por su altapotencialidad productiva que oscila en-tre 1.5 y 2 t/ha de café comercial, surusticidad, resistencia a plagas yenfermedades, tolerancia al estrés hídrico,entre otras; se realizó el presente trabajocon el objetivo de evaluar la incidenciade diversos factores en el procesos deembriogénesis somática, tales como:efecto de la auxina Picloram en lainducción de la callogénesis, influenciadel genotipo y de la época del año enque se tomaron las hojas sobre lainducción de callos embriogénicos dealta frecuencia de formación deembriones, además de la edad del calloy la densidad del inóculo inicial para elestablecimiento de suspensionescelulares embriogénicas.


Para el desarrollo del trabajo se utilizaronexplantes foliares procedentes de losclones C-R, M-229, K-234 y M-28 deplantaciones establecidas en campo, lascolectas, desinfección y disección de lashojas se realizaron según la metodologíapropuesta por Santana ( 1983). Comomedio de cultivo basal se utilizó elMurashige y Skoog (1962). Se estudiarondósis de Picloram comprendidas entre0.1 y 1 g/L con la finalidad de evaluar lafactibilidad de sus usos en el medio decultivo como agente inductor de lacallogénesis a través de las variables pesofresco y niveles de proteínas totales(determinados por el método de Bradford(1976), se inocularon 15 explantes portratamiento. Para el estudio del efecto delgenotipo las hojas fuente de los explantesse colectaron en el mes de julio y fueroncultivadas sobre los medios de formaciónde callos MFC-1 ( 0.5 mg/L de 2,4-D y 2mg/L de BAP) y MFC-2 ( 0.5 mg/L de Pi-cloram y 2 mg/L -1 de BAP). Para evaluarel efecto de la época del año las colectasse realizaron durante los meses de enero,marzo, abril, junio, julio, octubre,noviembre y diciembre a partir de losclones C-R y M-229, los explantes seinocularon en el medio MFC-2, en am-bos casos se utilizaron 15 explantes portratamiento y se realizaron observacionessemanales hasta los 60 días de cultivo.


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Para determinar la densidad óptima deinóculo inicial se utilizaron callos de 28 y35 días de edad de los cuatro clonesestudiados. Las siembras en medio sólidose incubaron a la oscuridad bajocondiciones de temperatura de 28 oC yhumedad relativa de 70-80%. Para elestudio en medio liquido se utilizaronerlenmeyers de 100 mL de capacidad,una vez inoculados se colocaron enzaranda orbital a 110 r.p.m., 27 oC detemperatura y fotoperíodo de 16 horasluz. Se aplicó un diseño completamentealeotorizado con arreglos bi y trifactorial.Los datos se procesaron estadísticamenterealizándose un ANOVA y docimándoselas medias según Duncan en caso designificación al 5%.


Los niveles de peso fresco obtenidos encada uno de los tratamientos evaluadosdifirieron significativamente para lascombinaciones hormonales estudiadas.La combinación hormonal 3 quecontenía 2mg/L -1de BAP y 0.5 mg/L -1 dePicloram fue la de mejor resultado conun valor de 1.5 g de peso fresco del calloen el clon M-229, seguido por este mismotratamiento para el clon C-R ( 1.40 g). Losmenores valores correspondieron a lascombinaciones 5 y 7 ( 0.1 y 1.0 mg/L dePicloram). Se pudo observar que laincorporación del Picloram en el mediode cultivo favoreció notablemente laformación del callo embriogénico de altafrecuencia, sin embargo elcomportamiento de los clones sobre cadamedio evaluado (MFC-1 y MFC-2) difiriósignificativamente, siendo el clon M-229el que mayor capacidad de formación decallos expresó en ambos medios ( 89 y98.7%, respectivamente). En cuanto a laépoca del año en que fue tomado elexplante, pudo observarse variación enlos dos clones en estudio desde 59 a 99%para el clon C-R obteniéndose losmejores resultados con explantescolectados en abril y junio y para el clonM.229 valores entre 61 y 99% durantelos meses abril, junio y julio, esto coin-

cide con el período de floración yfructificación temprana de los materialesevaluados lo cual pudiera atribuirse a lapresencia de hormonas endógenas yotros compuestos en concentracionesfavorables debido a la movilizacióninterna de nutrientes que tiene lugar enla planta.

Los clones M-229 y K-234 mostraron unamayor concentración de células en lassuspensiones celulares difiriendo el restode los materiales y aunque no hubodiferencia significativas entre estos dosclones es bueno destacar que no sealcanzó la mayor concentración decélulas en el mismo momento dedesarrollo del callo.

Las densidades del inóculo inicialcomprendidas entre 0.5 y 1.0 g MFL -1

resultaron las más efectivas para lamultiplicación y producción de célulasembriogénicas en medio líquido.

BIBLIOGRAFÍA

Berthouly, M y N.M Michaux-Ferrieri.,1996. High frecuency somatic em-bryogenesis in Coffea canephora. In-duction conditions and histologicalevolution. Plant Cell Tissue and Org.Culture, 44, 169-176.

Curvetto, N, J. Desh y P. Marinangeli.,1998. Inducción de callos yregeneración en Lilium longiflorum.En: Libro de Resúmenes. IIIEncuentro Latinoamericano deBiotecnología vegetal, REDBIO 98, LaHabana 1-5 Junio de 1998. 516 P.


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4-02 Análisis morfométrico de la embriogénesis somática en Coffeacanephora P. var Robusta.

Marcelo Cevallos V1., Silvia Montes 2 y Esperanza Niubó3

1Universidad Agraria de la Habana, San José de Las Lajas, La Habana, Cuba. E-mail: [email protected] Nacional de Ciencias Agrícolas, San José de Las Lajas, La Habana,Cuba3Centro Nacional de Investigaciones Científicas, Cuba.

Palabras claves: café, embriogénesis somática, análisis morfométrico.

INTRODUCCIÓN

La embriogénesis somática de plantasconsiste en la obtención de embrionessomáticos a partir de una célula o un gru-po de células, esta vía de regeneraciónen la actualidad se ha logrado inducir enunas 140 especies procedentes de 86géneros y 34 familias (Luskse et al., 1997).

En el cafeto varios trabajos describen laobtención de embriones somáticos a par-tir de la inducción de callosembriogénicos formados de segmentosde hojas (Van Boxtel y Berthouly, 1996).Esta vía de regeneración todavía no estatotalmente dilucidada y aún faltan pordilucidar algunos eventos morfológicos,bioquímicos y moleculares (Menéndez etal., 1994). Una de las etapas más crucialesen el proceso embriogénico es lasincronización de poblacionesembriogénicas homogéneas, así como labúsqueda de marcadores tempranos re-lacionados con el potencial embriogénicoque permitan predecir la formación delos embriones somáticos antes que esténpresentes, especialmente al inicio del cul-tivo donde el número de las célulasembriogénicas es pequeño y deben serseleccionadas para obtener frecuenciasde regeneración adecuadas (Sterk y DeVries, 1993). Es por ello que resulta in-dispensable el estudio morfométrico delproceso morfogenético., nuestro trabajopor lo tanto se propuso analizar

morfométricamente la embriogénesissomática de C. canephora var. Robusta,mediante el empleo de un sistema parael procesamiento digital y análisismorfométrico de imágenes IMAGCELL(Vinarde et al., 1995).


Los embriones somáticos fueron obteni-dos a partir de suspensiones celularesestablecidas en un medio MS suplemen-tado con Tiamina (4 mg/L), Inositol (100mg/L), Cisteína (25 mg/L), Sacarosa (20g/L), ANA (0.5 mM) y Kinetina (2.3 mM).Se cultivaron en erlenmeyers de 250 mlde capacidad con 70 ml de medio, losmismos fueron colocados en una zaran-da orbital termostatada a 110 r.p.m. , 27± 2 0C y 16 h luz. El análisis morfométricose realizó en cada estadio de desarrollode los embriones somáticos (células,agregados, preglobulares, globulares,acorazonados, torpedos y cotiledonares)con el empleo del sistema IMAGCELL,evaluándose cinco variables: diámetro(variable 1), área (variable 2), perímetro(variable 3), talla (variable 4) y compaci-dad (variable 5). Con los valores obteni-dos de las mediciones morfométricas delas cinco variables, se realizó un análisisfactorial discriminante (Linares et al.,1986). Se utilizó el paquete estadísticoSTATISTICAL para Windows.


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El análisis de varianza evidenció diferen-cias significativas en la mayoría de loscasos. Se encontró que en el estadio aco-razonado no existían diferencias signifi-cativas para la variable 2 (área) y para lavariable 4 (talla). Así como en el estadiocélulas y globulares para la variable 5(compacidad). El comportamiento de estaúltima variable en estos dos estadios (cé-lulas y globulares) es lógico ya que lamedida de la compacidad refleja la for-ma espacial que tienen estos y que mien-tras más se acerque al valor máximo de1, el cuerpo tiende a ser una esfera, y portanto las células embriogénicas y los em-briones globulares toman casi esta forma,puesto que los valores medios están muycercanos a 1.

El comportamiento de los valores mediosdel diámetro en las diferentes fases estu-diadas fueron superiores a los encontra-dos por Cevallos (1995) cuando caracte-rizó la embriogénesis somática de C.arabica var. 9723 en estadios tempranosutilizando un sistema semiautomatizadopara medición e interpretación de imá-genes.

Los resultados del análisis factorial dis-criminante, para cada estadio se pre-sentan en la Tabla 1a y b.

Para el estadio células, agregados,preglobulares, globulares, torpedos ycotiledonares las diferencias mayoresestuvieron dadas para la talla (variable 4).En todos estos estadios se tomo el eje 1por tener una contribución a lavariabilidad superior al 68%.

En la revisión bibliográfica no se hanencontrado trabajos antecedentes conrelación a la morfometría de la ES. Laaplicación de sistemas semiautomatizadoso automatizados para el monitoreo de loscultivos in vitro se han limitado únicamentea la interpretación de imágenes, tal es elcaso de un sistema señalado por Guevaray Castillo (1998) quienes utilizaron unsistema de interpretación de imágenespara clasificar embriones somáticos decaña de azúcar. Otros sistemasautomatizados han hecho énfasis en elconteo de células o estructuras quepermitan sustituir el conteo visualhumano, así se refleja en un sistemaautomatizado para el conteo yclasificación de células en suspensionesde caña de azúcar obtenido por Báez etal. (1998).

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