323Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

VIII.-Capítulo 9

Biotecnología aplicada al control deenfermedades fúngicas y bacterianas

Zappacosta, Diego

1 Introducción

Desde la domesticación de las plantas porel hombre las enfermedades han causadoenormes pérdidas en la producción. El usointensivo de monocultivos con baja diversi-dad genética en la agricultura moderna haredundado en una elevada susceptibilidad aalgunas enfermedades y en un incrementode la agresividad de algunos patógenos. Conexcepción de las enfermedades epidémicas,que llegan a destruir cultivos completos, seestima que las pérdidas ocasionadas porpatógenos en el plano mundial representanun 12% del potencial de producción, tenien-do mayor incidencia en hortalizas, frutales yarroz. Además de causar pérdidas en la pro-ducción, algunos patógenos también redu-cen la calidad de los alimentos, como es elcaso de algunas especies de Fusarium yAspergillus, que dejan en los tejidos infec-tados toxinas que afectan la salud humanay animal.

Existen varias formas de controlar lasenfermedades, entre los que podemos men-cionar: a) las prácticas culturales, como la ro-tación, la sanidad del material inicial, el con-trol de restos vegetales, etc., b) la aplicaciónde agroquímicos y c) la resistencia genética.Aunque las tres alternativas son utilizadas,la última, por su mejor implementación ymenor impacto ambiental, es una de lasmejores opciones. Es frecuente, sin embar-go, encontrar inconvenientes para su aplica-ción, tales como la falta de genes de resis-tencia, la rápida evolución de nuevas razasvirulentas del patógeno, etcétera.

La incorporación de genes de resisten-cia es uno de los mayores desafíos para losmejoradores durante el desarrollo de nue-vos cultivares. Tradicionalmente se ha lleva-do a cabo a través de métodos convencio-nales de mejoramiento, que involucran se-lección y evaluación de grandes poblacionesderivadas de cruzamientos entre materiales

susceptibles y resistentes y la posterior selec-ción bajo condiciones propicias para la en-fermedad.

Si bien estos métodos convencionaleshan resultado exitosos en muchos casos, sonlentos y laboriosos, ya que involucran cruzas,retrocruzas y selección, siendo además difícilseguir la evolución de nuevas razas virulentasde los patógenos. Esto ha llevado a un usomasivo de agroquímicos a pesar de su altocosto y su alto impacto ambiental.

La biotecnología y la biología molecularofrecen nuevas herramientas a losmejoradores, aumentando las posibilidadesy la eficiencia en la obtención de variabilidadgenética y en la selección de caracteres de-seables, brindando además alternativas via-bles para identificar, seleccionar y transferirgenes de resistencia.

El cultivo in vitro fue una de las primerasherramientas de la biotecnología utilizadasen la búsqueda de resistencia a enfermeda-des. Desde sus distintas alternativas brindasoluciones para sortear barreras en los cruza-mientos, colaborando además en la selecciónde genotipos resistentes. En lo que respectaa la ingeniería genética, la resistencia a en-fermedades fúngicas y bacterianas no ha al-canzado el mismo nivel de desarrollo que laresistencia a insectos o virus. Sin embargoexisten numerosos proyectos de investiga-ción en curso y se prevé un gran desarrollocomercial en los próximos años.

En este capítulo se intentará ofrecer unpanorama actualizado de las herramientasque la biotecnología vegetal brinda almejorador para el estudio y control de lasenfermedades fúngicas y bacterianas.

2 Cultivo in vitro

Es posible encontrar genes de resistenciaen muchas de las especies cultivadas o enespecies muy cercanas filogenéticamente ytransferirlos por cruzamientos convenciona-les a especies susceptibles. Sin embargo, aveces, es necesario recurrir a especies no tancercanas filogenéticamente, pudiendo exis-tir barreras de incompatibilidad. En estos ca-sos es posible obtener híbridos viables con lautilización de técnicas tales como el rescatede embriones, la hibridización somática, la

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fusión de protoplastos, la polinización invitro, etc. Estas técnicas ya fueron descriptasen capítulos precedentes y son utilizadaspara la incorporación de diversas característi-cas entre las que encontramos la resistenciaa enfermedades.

Una técnica promisoria es la selección invitro de materiales resistentes utilizando alpatógeno vivo o algún metabolito purifi-cado o no del mismo u otras sustancias quí-micas como agente de selección. Esta técni-ca será tratada con más detalle a continua-ción.

2.1 Selección in vitro de genotiposresistentes

Los ensayos para la selección de resisten-cia a patógenos («screening») y el estudiode la interacción hospedador-patógeno bajocondiciones de campo se encuentran sujetosa una gran variación entre experimentos.Esto se debe principalmente a la distribuciónno uniforme de los patógenos y a la falta decontrol sobre las variables ambientales. Porejemplo, en el caso de enfermedades delsuelo, los períodos relativamente largos decrecimiento favorecen el desarrollo de otrasenfermedades que pueden interferir y afec-tar la validez de los resultados. Por esta ra-zón, queda claro que los ensayos de selec-ción por resistencia a enfermedades debenrealizarse, en lo posible, bajo condicionescontroladas. Estas condiciones raramentepueden encontrarse a campo. Se han plan-teado alternativas utilizando invernáculos oambientes controlados, lo cual soluciona al-gunos de los problemas mencionados ante-riormente. En estas situaciones, la selecciónde genotipos resistentes se basa en la ob-servación de la respuesta de genotipos indi-viduales en la población de plantas ante lapresencia del patógeno. Otras metodologíasplantean el uso de metabolitos producidospor el patógeno, que en algunos casos handemostrado tener el mismo efecto que elmicroorganismo mismo. Esto último se ob-serva principalmente cuando las toxinas pro-ducidas por el hongo son factores de virulen-cia importantes.

La selección in vitro se basa en exponerplantas, órganos, tejidos o células vegetales

a patógenos o sus metabolitos simulando lainteracción hospedador-patógeno que tienelugar en la naturaleza. Esta técnica permiteestandarizar la evaluación, haciéndola repe-tible y confiable, con la ventaja adicional deque en un espacio reducido y en un cortoperíodo se puede chequear la resistencia otolerancia de gran cantidad de individuos.Esto brinda además la posibilidad de poderensayar callos y plántulas, sin necesidad detrabajar con plantas adultas. Presenta, sinembargo, algunos inconvenientes, tales comola falta de correlación in vitro-in vivo y la po-sible aparición de modificaciones genéticas nodeseables originadas por el pasaje por culti-vo in vitro. No obstante, en algunos casos,la respuesta obtenida in vitro ha demostra-do tener una estrecha correlación con la re-sistencia-tolerancia obtenida in vivo (Yoder,1980).

Diferentes técnicas in vitro pueden serexplotadas para seleccionar o inducir varian-tes con mayor resistencia a enfermedades opara establecer modelos de estudio deinteracciones planta-patógeno. Sin embargo,la elección de la estrategia experimental de-pende del sistema hospedador-patógenoconsiderado. Las principales variables a teneren cuenta son (Daub, 1986):

§ La naturaleza y complejidad de las téc-nicas de cultivo in vitro requeridas (cultivo deembriones, regeneración de plantas desdesuspensiones celulares, callos, etc.).§ El nivel en que se realiza la selección o

«screening» (in vitro o en plantas regenera-das luego de realizar manipulaciones in vitro)§ Los agentes utilizados para la selección

de resistencia (el patógeno mismo, filtrados,toxinas específicas o toxinas de otro patóge-no muy relacionado, agentes químicos, etc.).§ El origen de la nueva resistencia busca-

da (recuperación de variación existente, cam-bios espontáneos, mutagénesis, etc.).

Muchos microorganismos patógenos deplantas producen fitotoxinas, que sonmetabolitos tóxicos, no enzimáticos, que, noobstante hallarse a bajas concentraciones,dañan a las plantas (Tabla 1). Una toxinaespecífica es un metabolito producido por elpatógeno que posee la misma especificidadpor el material vegetal que el patógeno mis-

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mo. En cambio, las toxinas no específicas sonmetabolitos producidos por el patógeno quepueden tener alguna relevancia en el desa-rrollo de la enfermedad, pero no son respon-sables de todos los daños causados por elmismo. Sin embargo, en algunasinteracciones compatibles estas toxinas noespecíficas pueden ser necesarias para unainfección exitosa y en otros casos son sólodeterminantes secundarios de la enferme-dad. El mecanismo responsable de su toxici-dad varía con el patosistema y, en muchosde ellos, el(los) rol(es) de las toxinas en lapatogenicidad no está(n) claramenteestablecido(s), especialmente en los casos detoxinas no específicas, como por ejemplo elácido fusárico. En general se considera queactúan como factores de virulencia, debilitan-do al hospedador o inhibiendo o retardan-do las respuestas de defensa (Johal, 1995).Buscando resistencia a toxinas se puede ha-llar resistencia a patógenos, ya que la toxinapuede tener un rol decisivo en la patogénesis(McCormick y col., 1998).

En algunas especies de plantas se ha te-nido éxito en la selección de materiales resis-tentes a patógenos utilizando toxinas espe-cíficas como presión de selección in vitro.Entre las interacciones más estudiadas pode-mos mencionar el caso de avena-Cochliobolus victoriae, caña de azúcar-Drechslera sacchari y plátano-Mycosphaerella fijiensis.

También se pueden usar toxinas no es-pecíficas para la selección de materiales re-sistentes. Muchos patógenos producen es-

tos metabolitos tóxicosy la resistencia a algunode ellos puede mejorarla resistencia a la enfer-medad en forma cuali ycuantitativa. Ejemplosde selección usandotoxinas no específicasse encuentran en lasinteracciones: arroz-C.miyabeanus, tomate-Fusarium oxysporum,apio-Septoria apiicola,café-Colletotrichumkahawae, espárrago-F.o x y s p o r u m ,A r a b i d o p s i s - F .

moniliforme, cebolla-Phoma terrestris, en-tre otras.

Una de las principales limitaciones de estesistema de selección es precisamente el des-conocimiento del tipo de toxina(s) o la im-portancia de ellas en muchas enfermedades.También es de destacar que en algunasinteracciones donde se conocen toxinas es-pecíficas, las mismas no son activas en todoslos tejidos y células. Descifrar el fundamentobioquímico de la resistencia a una toxina fa-cilitaría el proceso de selección.

Aunque los comentarios anteriores seaplican fundamentalmente a patógenosfúngicos, las bacterias también producenfitotoxinas. En general, estas toxinas son noespecíficas y causan síntomas en muchas plan-tas que no son hospedadores del patógenoque las produce. Aunque las fitotoxinasbacterianas son generalmente no requeridaspara la patogénesis, ellas típicamente funcio-nan como factores de agresividad y su pro-ducción resulta en un incremento de la seve-ridad de la enfermedad (Bender, 1998).

Otra alternativa para la selección de ma-teriales resistentes es usar como presión deselección enzimas pectolíticas, cuando éstascumplen un rol importante en la patogénesis,como es el caso de los patógenos que pro-ducen la maceración de los tejidos que ata-can. Un ejemplo de ello lo constituye lainteracción entre Rhizoctonia fragariae yBotrytis cinerea con la frutilla, donde se lo-gró seleccionar plantas con mayor resisten-cia a los patógenos mencionados utilizando

Tabla 1: Principales toxinas de microorganismos patógenos de plantas

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enzimas pectolíticas purificadas a partir decultivos líquidos de los mismos.

La falta de toxinas relevantes en la pato-génesis de muchas enfermedades y/o acti-vas a nivel celular, ha llevado a establecer yestudiar sistemas in vitro con el patógenomismo. Uno de los mayores problemas enestos sistemas es controlar el crecimientoexcesivo del patógeno, sea bacteria u hon-go, sobre el material vegetal y sobre el me-dio de cultivo y la dificultad para interpretarlos resultados. Otro inconveniente es la co-rrelación entre las interacciones hospedador-patógeno in vitro e in vivo (la resistencia invitro puede no ser expresada in vivo o la si-tuación recíproca). Un prerrequisito para unaeficiente selección in vitro utilizando al pa-tógeno es que el sistema invitro sea consistente con loseventos que suceden a nivelde planta (hay que tener encuenta cuáles son los tejidossusceptibles, el estado fisio-lógico de la planta, etc.). Enel caso de hongos biótrofosobligados y en muchosnecrótrofos las técnicas decocultivo han resultado seruna solución para cultivarlosen condiciones controladas.El cultivo dual de hongosnecrótrofos y tejidos vegeta-les puede resultar óptimopara estudios básicos y apli-cados, constituyendo un sis-tema simplificado en el cualfactores nutricionales y am-bientales pueden ser cuida-dosamente controlados. Seha establecido exitosamen-te este sistema de cultivopara las interacciones alfalfa-P h y t o p h t h o r amegasperma, tabaco-P.parasitica var. nicotianae,t a b a c o - P e r o n o s p o r atabacina, caña de azúcar-Sclerospora sacchari, abe-to-Ceratocystis polonica yLamium purpureum-Coniothyrium palmarum,entre otras (Miller, 1985).

3 Obtención de resistencia utilizandoherramientas de ingeniería genética

Una de las alternativas biotecnológicasmás promisorias para obtener resistencia aenfermedades es la incorporación de genesde resistencia mediante tecnología génica.Estas técnicas han sido descriptas previamen-te (ver III.-3), por lo que en esta sección sólose tratarán las situaciones específicas de re-sistencia a bacterias y hongos patógenos.

Como resultado de los estudios tendien-tes a la identificación, clonación y caracteri-zación de genes involucrados en la resisten-cia a enfermedades han sido identificadosmuchos mecanismos que las plantas utilizanpara responder a la infección de patógenos,

Figura 1: Principales mecanismos de defensa que presentan las plantasfrente al ataque de microorganismos (modificado de Kombrink y Somssich,1995).

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lográndose avances en el conocimiento delos genes que participan en estas respuestas(Fig. 1). La identificación de estos genes per-mitió la evaluación de su rol específico y suforma de activación mediante el empleo deplantas transgénicas. Numerosos trabajosdetallan los distintos mecanismos de defen-sa que las plantas poseen para contrarrestar

el ataque de microorganismos y son reco-mendados como una lectura accesoria almaterial que sigue a continuación (Kombrinky Somssich, 1995; Durand-Tardif y Pelletier,2003).

3.1 Resistencia a hongos fitopatógenosLa selección de genes de resistencia para

ser introducidos en plantas por tecnologíagénica se basa, en parte, en la evaluación dela toxicidad de productos génicos sobre elcrecimiento y desarrollo de los patógenos invitro y del rol del gen en las respuestas deresistencia. Muchos productos génicos per-tenecen al grupo de las proteínas relaciona-das a la patogénesis (van Loon, 1999), mien-tras que otras pertenecen a las víasbiosintéticas de las fitoalexinas (compuestosantimicrobianos de bajo peso molecular pro-

ducto del metabolismo secundario) o forta-lecen las defensas estructurales (por ejemplofortificación de la pared celular). Algunas res-puestas normales de resistencia son relativa-mente lentas, detectándose, en algunos ca-sos la expresión 48 hs luego de la infección(Fig. 2).

En el caso de plantas transgénicas la ideasería lograr expresión temprana osobreexpresión del producto, general-mente a través de promotores cons-titutivos. Otros genes interesantesson aquellos que participan en las víasde inducción de los mecanismos na-turales de resistencia. Recientemen-te, la clonación de numerosos genesR (de resistencia) ha precipitado elinterés en el uso de estos genes paraobtener resistencias de amplio espec-tro.

Las principales estrategias de con-trol de enfermedades fúngicas me-diante el uso de plantas transgénicaspueden ser agrupadas en cinco cate-gorías (Punja, 2001):

• Expresión de productosgénicos que son directamente tóxi-cos para los patógenos o que redu-cen su crecimiento. Incluyen proteí-nas relacionadas a la patogénesis (pro-teínas PR), como enzimas hidrolíticas(quitinasas, 1,3-β-glucanasas), proteí-nas antifúngicas (osmotinas y tau-

matinas), péptidos antimicrobianos (tioninas,defensinas, lectinas), proteínas de transfe-rencia de lípidos (LPT), proteínas inactiva-doras de riboso-mas 28S rRNA fúngicos (RIP)y fitoalexinas.

• Expresión de productos génicos quedestruyen o neutralizan componentes deataque del patógeno. Por ejemplo:inhibidores de poligalacturonasas (enzimasque degradan algunos componentes de lapared celular vegetal), ácido oxálico o lipasas.

• Expresión de productos génicos quemejoran las defensas estructurales de laplanta. Consiste en la elevación de los nive-les de ligninas y peroxidasas asociadas a lapared celular.

• Expresión de productos génicos queparticipan en las vías de señales que regu-lan las defensas. Incluyen la producción de

Figura 2: Tiempo relativo de inducción de las principales defensascontra patógenos fúngicos (modificado de Kombrink y Somssich,1995).

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elicitores específicos, peróxido de hidrógeno(H2O2), ácido salicílico o etileno.

• Expresión de productos de genes deresistencia (genes R). Participan en la reac-ción de hipersensibilidad y en la interaccióncon factores de avirulencia.

3.2 Enzimas hidrolíticas

La estrategia más ampliamente utilizadaes la sobreexpresión de enzimashidrolíticas tales como 1,3-β-glucanasas oquitinasas, que degradan la pared celular dehongos y han demostrado tener actividadantifúngica in vitro.

Con la expresión de diferentes tipos dequitinasas en varias especies vegetales se halogrado reducir el tamaño, el número y eldesarrollo de lesiones causadas por varioshongos patógenos, algunos de amplio ran-go de hospedadores, como por ejemploBotrytis cinerea y Rhizoctonia solani. La ex-presión de quitinasas ha sido inefectiva, sinembargo, para el control de Cercosporanicotianae, Colletotrichum lagenarium yPythium spp., indicando que en los hongosexisten diferencias en la sensibilidad a estetipo de enzimas. Las diferentes quitinasaspresentan variación en características talescomo especificidad de sustrato, pH óptimo ylocalización celular, lo cual trae aparejadasdiferencias en su actividad antifúngica. Aun-que los resultados de estos estudios no hansido espectaculares en términos de niveles decontrol de la enfermedad, la tasa de progre-sión y la severidad de la misma pudieron sersignificativamente reducidas, como se hademostrado en cultivos transgénicos evalua-dos a campo (Melchers y Stuiver, 2000).

Los resultados obtenidos utilizando 1,3-β-glucanasas son similares a los dequitinasas. La expresión combinada de am-bas enzimas en varias especies ha reveladoun comportamiento mucho más efectivo enla prevención del desarrollo de varias enfer-medades que la expresión de una sola deellas, corroborando los resultados obtenidosen los ensayos in vitro. Lo mismo sucede conotras proteínas PR con actividad antifúngicain vitro, tales como osmotina y taumatina(TLP), que en plantas transgénicas muestranuna disminución de los daños causados porenfermedad, pero los resultados más alen-

tadores aparecen cuando se expresan encombinación con quitinasas y 1,3-b-glucanasas.

Como regla general, el uso de estrategiasde ingeniería genética que involucren la ex-presión de dos o más productos de genesantifúngicos en un determinado cultivo de-bería proveer un control de la enfermedadmás efectivo y de más amplio espectro queel uso de estrategias con un solo gen (Shah,1997).

3.3 Péptidos antimicrobianos

Las defensinas y tioninas son péptidos debajo peso molecular, ricos en cisteína, queposeen actividad antimicrobiana. Lasobreexpresión de estas proteínas en plan-tas transgénicas reduce el desarrollo de va-rios patógenos como Fusarium y Alternariay confiere resistencia a Verticillium en papaen condiciones a campo.

También se han desarrollado plantastransgénicas que expresan pequeñospéptidos antimicrobianos sintéticos (10-20aminoácidos) que pueden afectar a las hifas,a la pared celular o aumentar la permeabili-dad de las membranas celulares fúngicas. Lahabilidad para crear recombinantes sintéti-cos o variantes combinadas de péptidos ofre-ce nuevas oportunidades para lograr resisten-cia a un amplio rango de patógenos de ma-nera simultánea, siendo alternativaspromisorias para mejorar la eficacia de lasplantas transgénicas en el futuro (Lassner yBedbrook, 2001).

3.4 Fitoalexinas

Son otro grupo de compuestosantimicrobianos, productos del metabolismosecundario, presentes en un amplio rango deespecies vegetales cuya expresión es induci-da por la infección de patógenos y elicitores.Son sintetizados a través de complejas víasbioquímicas, como la del shikimato. La mani-pulación genética para suprimir o mejorar laproducción de fitoalexinas no es sencilla, yaque se hallan involucradas varias enzimas.

Como en el caso de las enzimashidrolíticas, no se ha demostrado conclu-yentemente su rol en mejorar la resistenciaa enfermedades en muchas interacciones

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hospedador-patógeno. En plantas transgé-nicas se ha demostrado que la sobreexpre-sión de genes que participan en la síntesisde ciertas fitoalexinas como el resveratrol yla medicarpina resulta en una demora en eldesarrollo de la enfermedad y en la apariciónde los síntomas producidos por variospatógenos en distintas especies vegetales.Sin embargo, hay que tener en cuenta quelas fitoalexinas son potencialmente tóxicaspara los animales y tienden a no ser específi-cas en su acción, por lo tanto es necesariorealizar más evaluaciones de los riesgos po-tenciales de su utilización, además de las re-lacionadas con sus características de conferirresistencia a enfermedades (Essenberg,2001).

3.5 Compuestos que mejoran lasdefensas estructurales de la planta

La pared celular vegetal es una barreraque los patógenos tienen que superar en suataque y lo logran a través de enzimas quela degradan (como las poligalacturonasas) omediante la acción de toxinas. Se han dise-ñado plantas transgénicas que expresaninhibidores de poligalacturonasas, pero losresultados por el momento no son conclu-yentes. Otra estrategia considerada ha sidola sobreexpresión de peroxidasas, enzimasque participan en la lignificación de la paredcelular. La lignificación alrededor de los sitiosde infección es un mecanismo natural quepresentan las plantas para restringir el ata-que de patógenos. Mediante esta estrate-gia se logró un aumento en los niveles delignina de la planta, que no brindó, sin em-bargo, una mejora en la resistencia a enfer-medades en varios sistemas hospedador-patógeno estudiados.

Una opción más reciente es la expresiónde enzimas que degradan toxinas fúngicas,como la expresión en tabaco de una enzimadegradadora de tricotecenos de Fusariumsporotrichloide, que reduce el daño a los te-jidos y mejora la emergencia de plántulas enpresencia de la toxina. La inactivación de fac-tores de virulencia específicos por productosgénicos expresados en plantas transgénicases una estrategia promisoria para reducir eldesarrollo de patógenos específicos.

3.6 Elicitores

Las vías de señales que coordinan las res-puestas de defensa en las plantas, que inclu-yen la reacción de hipersensibilidad (RH), laproducción de proteínas PR y de fitoalexinas,pueden ser activadas por moléculas llamadaselicitores. La inducción de RH y necrosis, queresulta en la activación de respuestas de de-fensa, podría resultar en una inducción deresistencia a un amplio espectro de enferme-dades. El uso de estas estrategias requeriría,sin embargo, de la cuidadosa manipulaciónde vías metabólicas complejas, cuya altera-ción podría tener efectos secundarios nodeseables sobre otros caracteres del cultivo,ya que intervienen en varios procesos vege-tales. Mediante el uso de plantastransgénicas se han disectado genéticamen-te muchas de estas vías, identificándose mu-chos de los compuestos intervinientes en lasrespuestas de defensa a patógenos.

El peróxido de hidrógeno (H2O2) inhibe elcrecimiento de patógenos y activa ciertas víasde trasmisión de señales que inducen res-puestas de defensa. La expresión de niveleselevados de H2O2 en plantas transgénicas através de la expresión de la glucosa oxidasareduce los efectos causados por patógenoscomo Rhizoctonia, Verticillium,Phytophthora y Alternaria en varias espe-cies cultivadas. Hay que tener en cuenta, sinembargo, que niveles elevados de H2O2 sonfitotóxicos.

Otros activadores de defensas son el áci-do salicílico, el etileno y el ácido jasmónico.La manipulación de los niveles de ácidosalicílico en plantas transgénicas tiene un granpotencial para mejorar la resistencia a enfer-medades, ya que no sólo inducen la expre-sión de proteínas PR, sino también la deotros productos de defensa, los cuales, enconjunto, han demostrado tener unainteracción sinérgica y conferir elevados nive-les de resistencia (Lawton, 1997).

3.7 Genes R

Estos genes son los más utilizados enmejoramiento convencional ya que son de-terminantes simples de una resistencia efec-tiva y específica. En su mayoría, los produc-tos de estos genes actúan reconociendo in-

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directamente factores de avirulencia depatógenos a través de correceptores, perotambién hay casos de interacción directa (Fig.3). Existen varios ejemplos de plantastransgénicas que expresan genes R; sin em-bargo, debido a la complejidad de las vías deseñales involucradas en las respuestas dedefensa, es improbable que la expresión deun solo gen mejore la tolerancia a enferme-dades. Se dispone de una gran cantidad degenes R clonados cuyo análisis permitirá laobtención de genes R sintéticos con domi-nios funcionales adecuados que confieranresistencias de amplio espectro (Rommens yKishore, 2000).

4 Perspectivas

El desarrollo de plantas transgénicas conresistencia a enfermedades fúngicas no haalcanzado el éxito logrado en el desarrollode otras resistencias, como por ejemplo aherbicidas, insectos o virus. La mayoría de losestudios se han realizado sobre sistemasmodelo como tabaco, habiendo pocos estu-dios a campo, estimándose la aparición en elmercado de materiales transgénicos con re-sistencia a hongos en los próximos años.

En la mayoría de los casos mencionadosanteriormente, la expresión de lostransgenes ha sido constitutiva, lo cual espositivo para el control de patógenos que

afectan al mismo tiempo varios ti-pos de órganos como hojas, tallosy frutos. Sin embargo, cuando la ac-ción de los patógenos es específicade órganos o tejidos es recomenda-ble el uso de promotores específicos.En ciertos casos la actividadantifúngica de determinados com-puestos mejora cuando actúan enel espacio apoplástico o son volca-dos en la vacuola. En este aspectoes necesario orientar los esfuerzoshacia la búsqueda de promotoresespecíficos inducibles por patógenosy a la evaluación de los sitios másadecuados de expresión de lostransgenes a fin de desarrollar plan-tas transgénicas con elevados nive-les de resistencia a un amplio espec-tro de enfermedades.

Las expectativas puestas en eldesarrollo de plantas transgénicas son gran-des, ya que podrían brindar soluciones parael control de distintas enfermedades, comolas provocadas por patógenos de amplio ran-go de hospedadotes, entre los que se en-cuentran Rhizoctonia solani y Botrytiscinerea, para los cuales existen muy pocasfuentes convencionales de resistencia.

Las plantas transgénicas expresando re-sistencia a enfermedades podrían ser cues-tionadas porque:

§ Los productos génicos antimicrobianospodrían tener efectos adversos sobre lamicroflora no patogénica que habita sobreo en las inmediaciones de las plantas.§ Los productos antifúngicos expresados

podrían tener efectos indeseables en la sa-lud de los organismos que consumen dichasplantas, en particular el hombre.§ Una fuerte presión sobre los patógenos

podría llevar a la aparición de nuevas cepasresistentes y la ruptura de genes de resisten-cia nuevos o existentes.§ Algunos productos de genes de resis-

tencia, como las proteínas PR, los compues-tos antifúngicos y los inhibidores depoligalacturonasas (PGIP), reducen el desarro-llo de la enfermedad, pero no la previenentotalmente.§ La inducción de muerte celular y de RH

pueden ser peligrosas, ya que si no son co-

Figura 3: Modelos de interacción entre productos de avirulenciadel patógeno (Avr), sitio target de este producto en la célula vegetal(T) y productos de genes de resistencia R (R1 y R2). (modificado deHammond-Kosack y Parker, 2003).

331Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

rrectamente controladas pueden provocarimportantes alteraciones metabólicas.§ La existencia de un escudo general de

resistencia, que es lo que se busca con nive-les elevados de resistencia de amplio espec-tro, puede llevar a la pérdida de genes me-nores de resistencia en el cultivo y, si un pa-tógeno logra eludir esta barrera, no existiríanotras para detener su avance.

5 Resistencia a bacterias

Sólo una pequeña proporción de las bac-terias son fitopatogénicas y han desarrolla-do mecanismos para invadir y colonizar plan-tas hospedadoras y causar enfermedades. Porello los esfuerzos invertidos en lograr resis-tencia a bacterias por tecnología génica hansido escasos. La mayoría de los mismos se hancentrado en una bacteriosis importante enel ámbito mundial para la cual no se han ha-llado genes de resistencia potencialmentetransferibles por cruzamientos convenciona-les, como es el caso de la podredumbre blan-da y pie negro de la papa, causados porErwinia carotovora (During, 1996).

Las principales estrategias para lograr re-sistencia a bacterias fitopatógenas son lassiguientes:

• Expresión de péptidos bactericidas(cecropinas) provenientes de insectos y ra-nas, que actúan a nivel de la membranabacteriana.

• Expresión de tioninas, que sonpolipéptidos ricos en cisteína presentes enendosperma y hojas de los cereales, cuya ac-ción, no específica, se basa en la permea-bilización de las membranas celulares.

• Expresión de la lisozima delbacteriófago T4 y de huevo de gallina.

• Cambio de la enzima blanco de toxi-nas bacterianas o expresión de enzimasdetoxificantes provenientes del mismo pató-geno u otro organismo.

• Síntesis de fitoalexinas, que general-mente involucra la modificación de víasbiosintéticas complejas, las cuales no siem-pre son accesibles a la ingeniería genética.

Los resultados, en algunos casos, han sidopromisorios, aunque la estrategia más inten-

samente investigada, la expresión dececropinas, no ha producido resultados con-cluyentes, especialmente en los ensayos acampo. Este péptido es degradado porenzimas vegetales, por lo cual sería necesa-rio el desarrollo de análogos resistentes aproteasas.

La expresión de tioninas de cereales entabaco mejora la resistencia a Pseudomonassyringae. Estas proteínas poseen actividadantimicrobiana in vitro y su expresión cons-titutiva trae aparejada una disminución sig-nificativa del crecimiento de la bacteria y unareducción en el porcentaje de lesionesnecróticas.

Las lisozimas son enzimas que catalizanla hidrólisis de la mureína, constituyente dela pared celular bacteriana. Se localizan en lasvacuolas de varias especies vegetales y co-múnmente poseen fuerte actividadquitinasa. Antes del inicio de una enferme-dad las bacterias patógenas se acumulan engrandes cantidades en los espaciosintercelulares de la planta. Las lisozimas sóloentran en contacto con las mismas luego dela ruptura de la célula, cuando las bacteriasson demasiado numerosas como para serefectivamente controladas. Por ello, las es-trategias se han centrado en dirigir laslisozimas hacia el espacio intercelular. Pocaslisozimas vegetales han sido caracterizadas yclonadas, por lo que se han buscado lisozimasde otros orígenes para ser expresadas enplantas transgénicas, como la del bacteriófa-go T4 y la de huevo de gallina. Esta estrate-gia ha dado buenos resultados en varios ca-sos y es una de las más prometedoras.

Algunas bacterias producen toxinas queson clave en el desarrollo de la enfermedad,como por ejemplo la tabtoxina dePseudomonas syringae pv. tabaci, que ac-túa sobre la síntesis de glutamina, provocan-do clorosis. La expresión del gen trr que co-difica para una enzima bacteriana que pro-tege de la acción de la tabtoxina ha logradodisminuir los síntomas de la enfermedad, me-jorando la resistencia. Otra ejemplo es la ex-presión en plantas de tabaco de ornitiltranscarbamilasas insensibles a la toxina deP. syringae pv. phaseolicola, que inhibe laactividad de la misma en poroto.

Los hospedadores resistentes y algunosno hospedadores son capaces de reconocer

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y combatir las bacterias fitopatógenas. Estasplantas resistentes reaccionan con una muer-te celular localizada en el sitio de infección(RH), que es inducida por compuestosbacterianos llamados elicitores, tales comoproteínas de avirulencia (proteínas Avr), queson reconocidos por proteínas receptoras delhospedador (Fig. 1). La dilucidación de losmecanismos de resistencia en hospedadoresresistentes posibilita la obtención de plantastransgénicas que expresen diferentes recep-tores que reconozcan una variada gama deelicitores bacterianos (harpinas, proteínasAvr, etc.) y que activen las respuestas de de-fensa.

Varias de las estrategias mencionadaspreviamente son potencialmente aplicablesen el control de bacterias fitopatógenas. Lasque implican la expresión de proteínasantibacterianas, tales como cecropinas ylisozimas, tienen la ventaja de implicar a unsolo gen y conferir resistencia amplia. Lainactivación de toxinas bacterianas o la mo-dificación del sitio blanco de dichas toxinaspuede brindar una estrategia mucho másespecífica y eficiente.

6 Genómica y enfermedades causadaspor bacterias

En este área también está incursionandola genómica. Xylella fastidiosa es una bac-teria que vive en el xilema de las plantas, cau-sando enfermedades que producen grandespérdidas económicas, incluyendo clorosisvariegada en cítricos. Un grupo debiotecnólogos brasileños seleccionó este pa-tógeno para secuen-ciación genómica debi-do a la gran importancia de los cítricos parala economía de Brasil. Los frutos de las plan-tas afectadas son más pequeños y no tienenvalor comercial. Utilizando programas de pre-dicción de secuencias se han encontrado enel genoma de esta bacteria, que consta demás de 2.5 millones de pares de bases, unos2.904 genes. A la mitad de los mismos se lesha asignado funciones sobre la base de com-paraciones realizadas con otros genomas. En-tre estos genes se encuentran algunos queestán involucrados en la patogenicidad, ge-nerando compuestos que actúan en diferen-tes procesos, como:

- Proteínas involucradas en la síntesis ysecreción de toxinas.

- Enzimas involucradas en la ruptura delas paredes celulares.

- Enzimas para detoxificar de compues-tos de defensa de la planta.

- Transportadores eficientes de azúcares,que permiten la existencia en el xilema, po-bre en nutrientes.

- Proteínas regulatorias, que ayudan aregular la expresión génica para mantener elcrecimiento en distintos ambientes.

- Síntesis y excreción de polisacáridosextracelulares.

- Genes involucrados en la eliminación deantibióticos, que podrían se producidos porla planta para matar a la bacteria.

- Captación y secuestro de hierro y otrosmetales.

7 Situación en la Argentina

La Comisión Nacional Asesora deBiotecnología Agropecuaria (CONABIA) havenido autorizando la realización de pruebasde laboratorio-invernáculo o a campo deplantas transgénicas que expresan resisten-cia a enfermedades. Del total de autorizacio-nes realizadas en el periodo 1998-2002, 39(aproximadamente el 10%) corresponden asolicitudes presentadas por distintas empre-sas o instituciones para la evaluación de dis-tintos materiales con resistencia a enferme-dades. En la tabla 2 se presenta una lista dealgunas de las liberaciones autorizadas.

8 Resumen

Los hongos y bacterias fitopatógenos sonresponsables de gran parte de las pérdidasque se producen sobre los cultivos. Una delas formas de control más eficiente es a tra-vés de la resistencia genética. Sin embargo,no siempre es posible incorporar genes deresistencia en plantas de cultivo por mejora-miento convencional. La biotecnología brin-da al mejorador nuevas herramientas parala búsqueda e incorporación de resistenciasa través del cultivo in vitro y la ingenieríagenética. Mediante el cultivo in vitro es posi-ble sortear barreras a la hibridización y selec-cionar rápida y eficientemente materialesresistentes a enfermedades. La selección invitro se basa en exponer plantas, órganos,tejidos o células vegetales a patógenos o susmetabolitos simulando la interacción

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hospedador-patógeno que tiene lugar en lanaturaleza. Mediante tecnología génica esposible transferir genes que confieren resis-tencia a enfermedades. Las estrategias másutilizadas son la expresión de compuestosantimicrobianos (enzimas hidrolíticas, proteí-nas antimicrobianas), la expresión de enzimaso compuestos que neutralizan componentesde ataque del patógeno (inhibidores depoligalacturonasas, inactivadores de toxinas),fortalecimiento de las defensas estructurales(aumento en los niveles de ligninas operoxidasas) o la modificación de las vías deseñales que regulan las defensas por la pro-ducción de elicitores específicos (peróxido dehidrógeno, ácido salicílico o etileno). Lagenómica brinda nuevas herramientas parala detección de genes involucrados en lapatogénesis y, aunque actualmente no exis-ten en el mercado plantas transgénicas queexpresen resistencia a enfermedades fúngicaso bacterianas, el nivel de desarrollo alcanza-do indica que en un futuro muy próximo apa-recerán plantas resistentes a enfermedadeslogradas por ingeniería genética.

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Tabla 2: Lista de algunas de las liberaciones de plantas transgénicas con resistencia aenfermedades autorizadas por la CONABIA (recopilación de la página web de laCONABIA, http://www.sagpya.mecon.gov.ar)

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