Biotecnologia vegetal
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Tomado de: ISNAR, 2001; REDBIO/FAO, 2002.
Técnicas más utilizadas en I+D:
Recursos genéticos 21 %
Mejora de productividad 23 %
Protección de plantas 25 %
Otros 19 %
Grandes temas en I+D:
Agrobiotecnología
Introducción
Distribución de actividades en I+D en América Latina y el Caribe
Cultivo de tejidos 29%
Marcadores moleculares 27%
Diagnóstico 20%
Ingeniería genética 14%
Biotecnología Vegetal• Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos
micropropagación mejoramiento de plantas producción de compuestos de interés comercial
producción de metabolitos secundarios
producción de proteínas
producción de polímeros biodegradables establecimiento de plantas transgénicas
plantas resistentes a virus
plantas con rutas metabólicas modificadas
plantas mejoradas en cuanto a composición de proteínas, aceites, etc.
fitorremediación
remoción de xenobióticos
remoción de metales pesados
• Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular
- Desdiferenciación / Rediferenciación
- Balance de reguladores del crecimiento vegetal
Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• La teoría de la totipotencialidad celular, enunciadapor Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.
• La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la redifereciación de las células previamente desdiferenciadas.
• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Micropropagación vegetal
• Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis)
• Cultivo de meristemas
• Cultivo de suspensiones de células vegetales
• Cultivo de protoplastos
• Cultivo de anteras
• Cultivo de óvulos y embriones
Técnicasdel cultivo de células y tejidos vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Compuestos inorgánicosMacronutrientes: NO4
- , PO4
3- , K+, Ca2+, Mg2+, SO4
2-
Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I-
CarbohidratosSacarosa, glucosa, mio-inositol
VitaminasTiamina (B1)PiridoxinaAcido nicotínico (C)Biotina
AminoácidosGlicina
Reguladores del crecimientoAuxinasCitocininasGiberelinas
Soporte inerte (medios semisólidos)Agar (0,7 a 1%)Gelrite®
pH5,6 – 5,8
Esterilización1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave
Medios de cultivo: composición general
• Grupos básicos de reguladores del crecimiento:
- Auxinas- Citoquininas- Giberelinas- Acido abscísico- Etileno
• Generalidades:
- Actúan a bajas concentraciones
- Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).
- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.
- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.
Reguladoresdel crecimiento
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptile de gramíneas.
- Alargamiento y división celular- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventícias- Dominancia apical- Acción herbicida- Estimulación de la producción de etileno
• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.
• Su transporte es polar
• Auxinas sintéticas:
- Acido indol butírico (IBA) - Acido naftalen acético (ANA) - 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)
N
OH
O
Acido indol acético (AIA)(auxina endógena)
Auxinas: estos compuestos se emplean básicamente como promotores de la proliferación celular y la inducción de la
morfogénesis
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro.
• Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:
- Promoción de la división celular- Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos
• Citoquininas endógenas:
- Zeatina (Zea)- Isopenteniladenina (2iP)
• Citoquininas sintéticas:
- Kinetina (Kin)- Benziladenina (BAP)
• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentranen todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g/Kg.
• Su transporte es no polar.
Citoquininas: en combinación con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenéticas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Estructura química de las principales citoquininas
NH CH2 CH C
CH3
CH2OH
Zeatina
NH CH2 CH C
CH3
CH3
Isopenteniladenina(IP)
6-bencilaminopurina
N NH C
H
HN
N N
N
N
• Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo.
• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.
• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales- Crecimiento de yemas latentes- Germinación de semillas en dormición- Floración- Movilización de reservas en la semilla.
• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión.
• Su transporte no es polar.
O
HCH3
H COOHH
HO OH
CH3
C O
Acido giberélico (GA3)Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Iniciación
- Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre- Elección del explanto inicial y de la formulación
del medio de cultivo- Desinfección superficial de los explantos- Establecimiento del cultivo in vitro
• Multiplicación
- Multiplicación del material stock
• Enraizamiento
- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro
• Rusticación
- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo
Etapas de la micropropagación vegetal
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Posibles vías morfogenéticas:
- Organogénesis
- Embriogénesis
• Diferencias entre las dos posibles vías:
- La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas.
- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.Una célula del explanto se aísla y constituye el puntode partida para la obtención de un embrión somático.Se diferencian embriones o estructuras bipolaresque completan cada una de las etapas implicadasen la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa.
Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas en la diferenciación de novode brotes y/o plantas completas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Explanto (disco de hoja)
Explanto (células vegetales)
REGENERACIÓN
Suspensión celular
Embriones somáticos
ENCAPSULACIÓN
GERMINACIÓN
GERMINACIÓN Semilla artificial
Callo
Propagación vegetativa por embriogénesis somática
Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por
encapsulación en alginato
Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales
• Proliferación de yemas apicales o axilares
- Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas.
- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula en base al número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.
- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año, a partir de una única yema inicial.
- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta técnica.
Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Sistemas de micropropagación vegetalProliferación de tejidos desdiferenciados
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Consideraciones generales:
- Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, células en suspensión, etc.)
- Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos.
- Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala.
Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta
Sistemas de propagación vegetativain vitro
Propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Sistemas de micropropagación vegetalCultivo de meristemas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales.
• Constituyen el explanto ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias.
• Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservación y conservación de germoplasma.
Los meristemas son grupos de células indiferenciadas que retienenla capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta
Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
- El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción).
- El número de partículas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).
- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.
- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.
El cultivo de meristemas facilita la eliminación de patógenos
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Propagación vegetativa rápida y a gran escala
• Uniformidad seleccionada del material clonado
• Multiplicación de plantas recalcitrantesa las técnicas convencionales
• Reducción en el tiempo de multiplicacióny en el espacio requerido para tal fin
• Mayor control sobre la sanidad del material propagado
• Introducción rápida de nuevos cultivares
• Conservación de germoplasma
• Facilidades para el intercambio internacionalde material vegetal
Alcances de la micropropagación vegetal
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Sistemas de transferencia genéticaen plantas
Agrobiotecnología
Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens
• Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos
- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes.
- Sistemas basados en virus vegetales.
• Sistemas de transferencia directa de ADN
- Transferencia por biobalística.
- Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación
- Transferencia con whiskers de carburo de silicio. - Transferencia por microinyección.
Sistemas de transformacióngenéticaen plantas
Agrobiotecnología
Biobalísticay otros sistemas de transferencia directa de ADN
Biología de Agrobacterium tumefaciens
Agrobiotecnología
Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Tumor de tallo provocadopor Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Agrobiotecnología
Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens
Mapa genético del plásmido Ti de octopina
BI BD
Agrobiotecnología
Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens
Estructura de la región T de un plásmido Ti de octopina
Mecanismos moleculares implicados en la transformaciónpor Agrobacterium tumefaciens
Tomado de: Tzfira y Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002
Agrobacterium rhizogenes
Tumor de raíces producido por Agrobacterium rhizogenes en discos de remolacha
Agrobiotecnología
Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens Gentileza del Dr. Mark Tepfer
Cultivo de raíces de tabaco transformadaspor Agrobacterium rhizogenes
Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus
Agrobiotecnología
Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens
Gentileza del Dr. Mark Tepfer
Agrobacterium rhizogenes
La capacidadde Agrobacteriumtumefaciensde introducir ADNen el genomade la planta permitiódesarrollar vectoresplasmídicosbasadosen el plásmido Ti
Agrobiotecnología
Sistemasde transformaciónvegetal:Agrobacteriumtumefaciens
Ejemplos de vectores binarios
Mapa de restricciónde los plásmidospBIN19; pPZP111;pMON10098;pGreen0029.
Abreviaturas:BI: borde izquierdo;ori: origen dereplicación;BD: borde derecho.
Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.
Transformación mediante cocultivo deAgrobacterium tumefaciens y discos de hojas de tabaco
Explante inicial (hoja)
Disco foliar
Co-cultivo con una bacteria desarmada
en medio líquido
Co-cultivo en medio sólido sin antibióticos
Medio de inducción de brotes con antibiótico y
agente de selecciónMedio de enraizamiento con o sin agente de selección
Planta transgénica aclimatada en invernadero
A B
C D
E F
A B
C D
E F
Sistemas de transferencia directade ADN
Agrobiotecnología
Biobalísticay otros sistemas de transferencia directa de ADN
• Ventajas
- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal
- No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas transgénicas
- Requieren construcciones más simples y pequeñas
- Son apropiados para estudios de expresión transitoria
• Desventajas
- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del vector en varios sitios del genoma de las células transformadas
- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de re-arreglos en los transgenes
La transformación por biobalística depende de factores físicos, químicosy biológicos
Agrobiotecnología
Biobalísticay otros sistemas de transferencia directa de ADN
•Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia del ADN
- Método de aceleración de las micropartículas
- Naturaleza química y física, densidad y volumen de las micropartículas
- Naturaleza, preparación, adherencia y concentración
del ADN
- Vacío y distancias de bombardeo
- Diámetro de apertura de la placa de retención
- Número de bombardeos
• Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada
- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y
genes marcadores de selección
Sistemas alternativos de aceleración de micropartículas
Modelo comercialactual
Medidor de presión de helio
Tubo de aceleración de gas
Interruptores de control
Medidor de vacío
Portador del discode ruptura
Portador del macroproyectil
Ensamblaje del propulsorde microproyectiles
Cámara de bombardeo
Controles del flujode aire y de vacío
Células blanco
Soporte del blanco
Válvula de medición de helio
Modelo comercialactual
Medidor de presión de helio
Tubo de aceleración de gas
Interruptores de control
Medidor de vacío
Portador del discode ruptura
Portador del macroproyectil
Ensamblaje del propulsorde microproyectiles
Cámara de bombardeo
Controles del flujode aire y de vacío
Células blanco
Soporte del blanco
Válvula de medición de helio
Medidor de presión de helio
Tubo de aceleración de gas
Interruptores de control
Medidor de vacío
Portador del discode ruptura
Portador del macroproyectil
Ensamblaje del propulsorde microproyectiles
Cámara de bombardeo
Controles del flujode aire y de vacío
Células blanco
Soporte del blanco
Válvula de medición de helio
Acelerador de micropartículas PDS 1000/He
por descarga de helio a alta presión
Soporte del tejido blanco
Mecanismo de disparo de un cañón impulsado por He a alta presión (PDS 1000/He)
Estado del disco de ruptura, macroproyectil y malla de retención luego del
bombardeo
Transformación genética de plantas in vivo usando una pistola génica Helios
La pistola génica Helios permite la transformación de tejidosin vivo
Agrobiotecnología
Biobalísticay otros sistemas de transferencia directa de ADN
Expresión transitoria en hojas de Arabidopsis bombardeadas con una pistola Helios con y sin malla de difusión de micropartículas
Expresión transitoria en embriones inmaduros de centeno bombardeados con un cañón PDS 1000 He usando diferentes concentraciones de micropartículas. A: 200 g, B: 100 g y C: 30
g
Expresión transitoria del gen reportero uidA en explantos bombardeados con micropartículas
Tomado de: Helenius et al., Plant Molecular Biology Reporter, 2000..
Tomado de: http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/2002/pub/agrar/02H059/prom.pdf
A B C
- Transferencia de genes a células, tejidos y órganos vegetales
- Transferencia de genes a microorganismos y organelas
- Estudio de expresión transitoria
- Análisis de promotores y de delección de genes
- Estudio de mecanismos de expresión y regulación de genes
- Estudio de infecciones virales
- Transferencia de ARN viral
- Estudio de vías metabólicas
- Estudio del desarrollo de plantas
La biobalística puede utilizarse con diversos finesexperimentales
Agrobiotecnología
Biobalísticay otros sistemas de transferencia directa de ADN
Genes selectores para transformación de plantas
MetotrexatoPlásmido R67Dihidrofolato reductasadhfr
Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichus hindustanus
Resistencia a bleomicinaBle
Kanamicina, G418, paromomicina, neomicina
Tn5Neomicina fosfotransferasanptII
EstreptomicinaTn5Estreptomicina fosfotransferasa
SPT
Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV
CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetil transferasa
cat
GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa
EPSP
Fosfinotricina, bialofosStreptomices hygroscopicus
Fosfinotricin acetil transferasa
bar
GentamicinaSerratia marcescens; Klebsiella pneumoniae
Gentamicin-3-N-acetiltransferasa
aacC3, aacC4
SelecciónFuenteProducto genéticoGen de selección
MetotrexatoPlásmido R67Dihidrofolato reductasadhfr
Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichus hindustanus
Resistencia a bleomicinaBle
Kanamicina, G418, paromomicina, neomicina
Tn5Neomicina fosfotransferasanptII
EstreptomicinaTn5Estreptomicina fosfotransferasa
SPT
Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV
CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetil transferasa
cat
GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa
EPSP
Fosfinotricina, bialofosStreptomices hygroscopicus
Fosfinotricin acetil transferasa
bar
GentamicinaSerratia marcescens; Klebsiella pneumoniae
Gentamicin-3-N-acetiltransferasa
aacC3, aacC4
SelecciónFuenteProducto genéticoGen de selección
Genes reporteros usados en transformación de plantas
Genes reporteros
-glucuronidasa
Proteína de fluorescenciaverde
Cloranfenicolacetiltransferasa
Luciferasa
Luciferasa
Abreviatura
gus/uidA
GFP
Cat
Luc
luxA, luxB
Origen
E. coli
Aequorea victoria
E. Coli
Photinus pyralis
Vibrio harveyi
Detección
Fluorométrico (cuantitativo)o histoquímico (in situ),
no radiactivo
Fluorescencia,no destructiva
Ensayo radiactivosensitivo, semi cuantitativo
Luminiscencia
Luminiscencia
Genes reporteros
-glucuronidasa
Proteína de fluorescenciaverde
Cloranfenicolacetiltransferasa
Luciferasa
Luciferasa
Abreviatura
gus/uidA
GFP
Cat
Luc
luxA, luxB
Origen
E. coli
Aequorea victoria
E. Coli
Photinus pyralis
Vibrio harveyi
Detección
Fluorométrico (cuantitativo)o histoquímico (in situ),
no radiactivo
Fluorescencia,no destructiva
Ensayo radiactivosensitivo, semicuantitativo
Luminiscencia
Luminiscencia
A B C D
Expresióndel gen uidAen Arabidopsis thaliana
www.plantphysiol.org
Tinción de óvulos, sacos embrionarios y lóculos enterosde Arabidopsis thaliana mediante la reacción
histoquímica de la enzima -glucuronidasa luego de la infiltración con Agrobacterium
tumefaciens
Agrobiotecnología
Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens
Expresióndel gen GFP en plantas transgénicasde Nicotiana benthamiana
A B
C
La expresión del gen GFP produce color verde o amarillo bajo iluminación ultravioleta. En ausencia de GFP el tejido
se observa de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila.
Agrobiotecnología
Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens
Potencial económico de los metabolitos secundarios
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
El metabolismo secundario regulamuchas de las relacionesde la planta con el medio circundante
Concepto general
• La producción de metabolitos secundarios está estrechamente relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.
- Generalmente no está asociada al crecimiento.- Depende de condiciones determinadas de control hormonal. - Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y órganos (raíces, tallos, hojas y glándulas).- La biosíntesis y acumulación suele estar fuertemente compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidos y de órganos.
• Los metabolitos secundarios se producen ante situaciones de estrés o enfermedad.
- Factores bióticos- Factores abióticos
Cultivode tejidos y metabolismo secundario
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
- Insecticidas
- Saborizantes
- Colorantes
Las plantascomo fuentede metabolitos secundarios de interés comercial • Potencial
- 75 % de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las plantas.
- Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta.
- 25 % de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen vegetal.
- 75 % de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en
el uso de extractos provenientes de plantas.
- Medicinas
- Herbicidas
- Proteasas
- Fragancias
- Antimicrobianos
- Enzimas
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Natural Sources
Vincristine and vinblastine (anti- tumoral
extracted from leaves of Catharanthus
roseus)
Taxol (anti-tumoral, extracted from the
bark of Taxus brevifolia)
COOCH3
CH3
H
OH
N
N
N
OCOCH3
R
H3CO
H COOCH3
CH3
OHN
O
C
H
CH3 - C - O
O - C -CH3
O
O
O
O
OH
OH
OH
O O
O
CH33HC
C - NH - CH - CH - C - O
Biotechnological processes
Shikonin (anti-inflammatory, pigment
obtained by fermentation of Lithospermum
erythrorhizon cells)
Berberine ( antimicrobial, anti-inflammatory,
pigment obtained by fermentation of Coptis
japonica and Thalictrum minus )
Ginsenosides (stimulant of the nervous
system obtained from hairy roots of Panax
ginseng )
OOH
OHOOH
O
O
OCH3
OCH3
Glc-Glc-O
O-Glc-Glc
OH
Algunas de las medicinas más importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso terapéutico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$ Hiosciamina, escopolamina
Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos
Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca acuminata
Antineoplásico
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico Vinblastina, vincristina
Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico
Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Rubiaceae
Afrodisíaco
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$ Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de
ipecacuana Cephaelis ipecacuanha
Emético
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico
Producciónde metabolitos secundariospor cultivo in vitrode células y órganos vegetales: ¿por qué?
- Independizarse de factores externos tales como: cambios de temperatura, sequías, plagas, variabilidad de la producción, factores políticos y sociales, etc.
- Evitar la extinción de especies vegetales.
- Disponer de condiciones controladas en el proceso de producción y extracción.
- Posibilitar el mejoramiento vegetal en tiempos mas cortos.
- Hacer viable la producción de compuestos complejos con uno o más C quirales en forma más económica respecto de la síntesis química
- Posibilitar la obtención de nuevos compuestos no presentes en la planta madre.
- Establecer procesos de biotransformación sólo realizables por enzimas provenientes de plantas.
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Procesos industriales
Tipo de compuesto
Farmacéuticos
Pigmentos
Fragancias
Saborizantes
Depigmentadores
Producto
Shikonina
Berberina
Sanguinarina
Gingsenósidos
Taxol
Cartamina
Geraniol
Citronerol
Vanillina
Arbutina
Compañía
Mitsui Petrochemical Ind.
Mitsui Petrochemical Ind.
Vigont Researol Lab.
Nitto Denko Co.
Phyton USA
Kibun Kyoto University
Kanedo Co.
Kanedo Co.
Kanedo Co.
Mitsui Petrochemical Ind.
• Condiciones económicas:
- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)
- Alto rendimiento y productividad del cultivo comparado con la planta entera
- Buen crecimiento en biorreactores
- Crecimiento lento de la planta entera como fuente alternativa
• Parámetros principales:
- Productividad: g de producto/L/día
- Concentración máxima de producto: g de producto/L
- Rendimiento: g producto/g sustrato
Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Estrategias para incrementarla producción de metabolitos secundarios
• Selección de especies vegetales apropiadas
• Selección de líneas celulares mejoradas
• Optimización de las condiciones de cultivo
• Agregado de precursores
• Tipo de cultivo: suspensiones, órganos o células inmovilizadas
• Uso de elicitores microbianos y estrés abiótico
• Permeabilización y remoción in situ
Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
• Screening y selección de líneas sobreproductoras
- Se facilita cuando el metabolito de interés es un pigmento, ya que puede hacerse una selección
visual.- Es importante contar con un método rápido y sencillo para seleccionar líneas más productoras (por ejemplo, ELISA).
• Optimización del medio de cultivo (variables más ensayadas)
- Fuente de carbono- Limitación en nitrógeno- Limitación en fosfato- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)- Relación C/N
• Agregado de precursores
- Bajo costo- Baja toxicidad- No muy alejado del producto final en la ruta metabólica
Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Diferencias entre suspensiones de células vegetalesy de células microbianas
Tomado de: Scraag.. Plant Biotechnology, 1992.
Consecuencias paracultivos a gran escala
Sedimentación rápida;sensibilidad a fuerzas de corte;
formación de gradientes;dificultad para tomar muestras
Largos tiempos de proceso;baja productividad
Necesidad de grandescantidades de inóculo;
escalado más largo
Bajas velocidadesde agitación
Baja demanda de oxígeno:fermentadores con bajatransferencia de oxígeno
Permeabilización;remoción in situ
Célulasvegetales
Agregados de 10-200 m y
de hasta 2 mmde diámetro
Lenta; td ~ 2-5 días
5-20%
Sensible /Tolerante
Baja
Intracelular /a veces extracelular
Célulasmicrobianas
CélulasIndividuales
2-10 m
Rápida;td ~ 1-2 h
Pequeña
Insensible
Alta
Extracelular
Caracterización
Tamañoy morfología
Velocidadde crecimiento
Densidad de inoculación
Sensibilidad a fuerzas de corte
Aireación
Acumulacióndel producto
• Problemas a considerar:
- Tasa de crecimiento
- Volumen del inóculo
- Tamaño y agregación de las células
- Oxigenación
- Agitación
Cultivos en suspensión
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Cultivo de órganos: raíces transformadas
Propiedad
Forma de crecimiento
Patrón de crecimiento
Tiempo de duplicación
Biomasa final
(peso seco/L)
Background genético
Formación inicial de producto
Medio de crecimiento
Localización del producto
Tipo de proceso
Suspensiones
Células simples-agregados
Desorganizado; cada célula
puede dividirse y expandirse
15 h-días
30-60 g
Heterogéneo
Usualmente bajo
Complejo; hormonas
y vitaminas
Intracelular- extracelular
Batch; continuo, deben
ser inmovilizadas
Raíces transformadas
Red de ramificaciones
División celular localizada;
crecimiento linear con
ramificaciones laterales
36 h-días
30-60 g
Euploide
Similares a la planta madre
Simple, sales y azúcar
Intracelular- extracelular
Batch o continuo, no hay
necesidad de inmovilizar
Género
Nicotiana
CatharanthusCinchonaDuboisiaDatura
BetaLippia
ArtemisiaCoreopsis, Bidens
Tagetes
DigitalisCassiaPanax
ChaenactisPodophyllum
LinumLithospermum
Solanum
Metabolito
AlcaloideAlcaloides piridínicosIndoles Tropano
OtrosBetalaina Sesquiterpenos PoliacetilenosTiofenos
Glicósidos cardioactivosAntraquinonasSaponinasPolyinesLignanos NaftoquinonasEsteroides
Algunos metabolitos secundarios producidospor raíces transformadas
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Patrón de flujo de dos diseños de propulsor
Agitador de paletas inclinadasAgitador de paletas planas o Rushton
Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.
Biorreactor de tambor rotatorio Biorreactor de membranas
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Böhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.
Diseños alternativos para biorreactores con agitación mecánica
Bioreactor de lecho de niebla(nutrient mist reactor)
Bioreactor de lecho de goteocon malla para inmovilizar a las raíces
Biorreactores para el cultivo de raíces
Bomba de aire
Ro
tám
etro
Bo
mb
ap
eris
tált
ica
Generador de niebla
Cámarade cultivoControlador Controlador
On Off
Intensidad
Filtro de aire
Condensadorde niebla
Adición de nutrientes
Bomba
Salida de aire
AireAire
Inóculo
Reservorio
Malla de inmovilización
Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Compuesto
PiretrinasCardenólidosArtemisinina
Aceites esencialesAceites esenciales
Planta
Chrysanthemum spp. Digitalis spp.
Artemisia annuaMentha spp.
Pelargoium spp.
Cultivode tallos
• Ventajas
- Cultivos genética y bioquímicamente estables
- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos
presentes en tallos y hojas (glándulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales
- Niveles similares a los de la planta (no siempre se
cumple).
• Desventajas
- Sólo para productos sintetizados en tallos y hojas
- Vitrificación
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Elicitación
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
• Agentes bióticos
- Extractos de paredes de hongos o bacterias- Acido araquidónico- Quitosano- Metil jasmonato
• Agentes abióticos
- Metales pesados- Radiación UV- Presión osmótica- Ultrasonido
- DMSO
- Shock térmico
- Cambios de pH
- Limitación de fosfato y oxígeno
- Elicitación
- Detergentes y aceites de siliconas
- Electropermeabilización
Liberacióndel productoal medio
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
• Líquido-líquido:
Compuestos inmiscibles en agua, como solventesorgánicos o lípidos (sistemas de dos fases agua-orgánico).Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.
Compuestos miscibles en agua, como sales o solucionesde polímeros (sistemas de dos fases acuosas). Ejemplos: DEAE, PEG.
• Sólido-líquido:
La segunda fase es un material sólido como resinas u otrosabsorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.
• Requerimientos:
- Autoclavables- No tóxicos- Fácil separación del producto de interés
de la segunda fase- No modificación del medio de cultivo- Permanencia de las células en la fase acuosa
Remoción de producto in situ
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Diagrama de un tanque de agitación mecánica modificado para operar con remoción in situ del producto.
1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar raíces; 3: sensor de oxígeno; 4: malla acero inoxidable; 5:
medidor DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;
12: marco de la malla
Un bioreactor de agitación por líquidocon loop externo
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Adaptaciones para la extracción in situ del producto
Secuencia en laoptimización de un proceso para la producciónde metabolitos secundarios
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
Selección de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro
Establecimiento de cultivos in vitro
Estabilización y selección de cultivosin vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,
liberación al medio
Optimización de medio de cultivo para producciónpor diseño factorial: nutrientes, precursores, elicitación,
liberación y remoción in situ
Optimización en bioreactores: escaladoSistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusión,
en dos etapas. Extracción y purificación del producto
Estrategiaspara modificarel metabolismo secundariomediante manipulación genética
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
- Completar rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos.
- Amplificar rutas normales.
- Bloquear rutas alternativas.
- Bloquear rutas normales.
- Modificar la regulación de rutas normales.
- Modificar los mecanismos de secreción y exportación.
- Bloquear rutas de degradación.
Ingeniería metabólica del metabolismo secundario
Enzima
Triptofano decarboxilasa(TDC)
Hiosciamina-6-hidroxilasa(H6H)
Triptofano decarboxilasa (TDC)y estrictosidina sintasa (STR)
ORCA3 (factorDe transcripción)
(S)-esculerina 9-O-metiltransferasa (SMT)
Desoxixilulosa fosfatoreductoisomerasa (DXR)
C1 y R (factoresde transcripción)
Especie
Peganum harmala(suspensiones y raíces)
Hyosciamus muticus(raíces transformadas)
Catharanthus roseus(suspensiones)
Catharanthus roseus(suspensiones)
Coptis japonica(suspensiones)
Mentha spp.(planta)
Zea mays(callos)
Producto
Serotonina
Escopolamina
Alcaloides indólicos(TIAs)
Alcaloides indólicos(TIAs)
Berberina
Aceites esenciales
Antocianinas
Observaciones
Incremento de 10-20 vecesen producto
Contenido de producto 4 vecessuperior a planta control
Contenido de TIAs de 300 mg/Lcomparado con control 50mg/L.Líneas inestables
Incremento de la concentración de TIAsde 3 veces después de agregarel precursor secologanina
Incremento del flujo hacia la producciónde berberina de 15%
Incremento del 50% ene l contenidode aceites esenciales
Producción de antocianinas y fenolesque no se producían en los callos sin transformar.
Ejemplosde Ingeniería metabólica enel metabolismo secundario
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
• Problemas
- Clonado de genes
- Estabilidad
- Compartimentalización
- Transporte
- Limitaciones y arquitectura
de la ruta metabólica
- Canales metabólicos
Esquema de un proceso completo para la producción de un metabolito secundario por cultivo in vitro de células y órganos vegetales
Shikonina
• Planta entera
- La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 3 años.
• Suspensiones celulares
- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la producción.
- Las bajas concentraciones de nitrógeno y la elicitación inducen
la producción de shikonina.
- Se utilizan fermentadores de agitación mecánica y tambor rotatorio.
- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.
Producción de shikonina por suspensiones celularesde Lithospermum erythrorhizon
Yamasaki Plant Photo Gallery
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Proceso para la producción de shikonina a partir de célulasde Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.
Taxol®
• Planta entera
- La edad de los árboles para extraer el producto es de 50-100 años. - La concentración de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco. - Este método de producción podría llevar a la extinción de la especie.
• Semisíntesis
- El material vegeta empleado presenta variación en la concentración de precursores.
- Las plantas empleadas crecen lentamente.
- Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difícil la purificación del taxol.
Schoepke Plant Image Gallery
Producción de taxol por Taxus spp
Conclusiones
Agrobiotecnología
Cultivoscelulares
• Aspectos bioingenieriles
- Diseño de bioreactores especiales para cultivos de tejidos vegetales
- Instrumentación y control de los bioprocesos- Diseño de bioreactores más económicos- Métodos no letales para liberación de los metabolitos secundarios- Método adecuado para la remoción in situ
• Aspectos Biológicos
- Conocimiento de la regulación de las rutas biosintéticas: enzimas y factores de transcripción
- Conocimiento de la regulación del transporte y acumulación de los metabolitos secundarios- Conocimientos de los mecanismos de degradación del producto
Expresión de proteínas heterólogas en plantas(Molecular Farming)
•bajos costos de producción.•tiempos menores para poner en el mercado.•abastecimiento ilimitado.•procesamiento correcto de proteínas.•seguridad.
Fidelidad en la expresión de proteínas humanas o animales en plantas.
Producto Uso Planta huésped Integridad estructural
Actividad biológica
Hemoglobina y Sustituto de la sangre tabaco si si, (unión a O2/CO2) -interferon Anti-cáncer, antiviral arroz si Actividad antiviral in
vitro. EPO Estimulador del crecimiento de
glóbulos rojos Células de tabaco si, (glicanos) Sin testear
Sero albumina humana
papa si Sin testear
Factor de crecimiento epidérmico
Mitógeno tabaco Sin testear
Glucocerebrosidasa Enfermedad de Gaucher tabaco si, (glicanos) si Hirudina Anticoagulante canola si si NPI Defensina Antibiótico tabaco si
Expresión de proteínas heterólogas en plantas(Molecular Farming)
Expresión de proteínas heterólogas en plantas(Molecular Farming)
Plantas transgénicas Vectores virales Períodos más largos en el establecimiento de la línea transgénica
Períodos cortos en la preparación del vector
Niveles de expresión relativamente bajos Altos niveles de expresión
Posibilidad de expresar en tejido específico, expresarse en semillas o tubérculos con gran estabilidad de la proteína.
Fusión con proteínas de la cápside pueden facilitar el downstream processing aislando las partículas virales.
Más estables Dificultad para manipular material fresco (siempre se infecta sobre hojas)
Tamaño de la proteína no es limitante Tamaño de la proteína es limitante
Plantas usadas: Tabaco, papa, tomate, banana.
Virus usados: virus del mosaico del tabaco(TMV). Cowpea mosaic virus (CPMV)
Agrobiotecnología
Ventajas
• Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguascontaminadas (10-20 % del costo de métodos tradicionales):
- las plantas emplean energía solar- el tratamiento es in situ
• Algunos procesos degradativos ocurren en forma más rápida con plantas que con microorganismos.
• Es un método apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminación de áreas restringidas en plazos largos.
• Es una metodología con buena aceptación pública.
• Se generan menos residuos secundarios.
Fitorremediación
Fitorremediación
Agrobiotecnología
Limitaciones
• El proceso se limita a la profundidad de penetraciónde las raíces o a aguas poco profundas.
• La fitotoxicidad es un limitante en áreas fuertemente contaminadas.
• Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados.
• La biodisponibilidad de los compuestos o metaleses un factor limitante de la captación.
• Deben considerarse potenciales contaminacionesde la cadena alimentaria y napas de agua.
• Se requiere comprender mejor la naturalezade los productos de degradación (fitodegradación).
• Falta elaborar el marco regulatorio.
Fitorremediación
Fitorremediación
Agrobiotecnología
• Captación por las raíces:
- Movilización de los metales
• Quelación mediante fitosideróforos
• Unión a proteínas quelantes
• Acidificación por exudado de H+
- Captación por la raíz
• Via apoplástica
• Vía simplástica
• Transporte:- Almacenamiento en raíz y exportación al tallo por xilema
- Transporte por xilema o redistribución por floema
- Almacenamiento en vacuolas
• Mecanismos de evasión o tolerancia:
- Captación celular limitada (evasión)
- Metabolismo resistente a metales pesados
- Detoxificación por quelación, compartimentalización
o precipitación
Mecanismos más probables:- Compartimentalización en vacuolas y quelación con fitoquelatinas (Cd2+, Zn2+, Cu2+ )
- Precipitación como fitatos (Zn2+)
Biología de la acumulaciónde metalesen plantas
Fitorremediación
Agrobiotecnología
Tipos de plantas más utilizadas
Freatófitas- Plantas de raíces profundas (álamo, sauce, algodonero).
Pasturas- Por su tipo de raíz retienen el suelo.
Legumbres- Permiten enriquecer el suelo en N2.
Acuáticas- Permiten la degradación de contaminantes en ciénagas artificiales.
Fitorremediación
Fitorremediación
Agrobiotecnología
• FitoextracciónLas plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte aérea).
• RizofiltraciónLas raíces de las plantas se usan para absorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes líquidos contaminados.
• FitoestimulaciónSe usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).
• FitoestabilizaciónLas plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterráneas o al aire.
• Fitotransformación- Fitodegradación: Las plantas acuáticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgánicos para dar subproductos no tóxicos o menos tóxicos.
- Fitovolatilización: Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgánicos y los liberan a la atmósferacon la transpiración.
Tipos de fitorremediación
Fitorremediación
Tipos de fitorremediación
Lagunas de deshecho de yacimientos mineros.
Propuesto para fenólicos y compuestos clorinados.
Las plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterráneas o al aire. Contribuyen a estabilizar el suelo.
Fitoestabilización
Cd2+,Co2+,Cr2+,Ni2+,Hg2+,Pb2+,Se2+,Zn2+.Las raíces de las plantas se usan para absorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes líquidos contaminados.
Rizofiltración
Cd2+,Co2+,Cr2+,Ni2+,Hg2+,Pb2+,Se2+,Zn2+.Las plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte aérea).
Fitoextracción
Explosivos (TNT, DNT, RDX, nitrobenceno, ácido pícrico, nitrotolueno, nitrometano, nitroetano).
Atrazina, solventes clorinados, bromuro de metilo, tetrabromoeteno, tetracloroetano, DDT, pesticidas fosfatados, bifenoles policlorinados, fenoles y nitritos.
Las plantas acuáticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgánicos para dar subproductos no tóxicos o menos tóxicos.
Fitodegradación
Hg2+, Se2+ y solventes clorinados (tetraclorometano y triclorometano).
Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgánicos y los liberan a la atmósfera con la transpiración.
Fitovolatilización
Hidrocarburos poliaromáticos, benceno, tolueno, etil benceno, xileno, hidrocarburos del petróleo, perciorato, atrazina, ataclor, bifenilos policlorinados, otros compuestos orgánicos.
Se usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).
Fitoestimulación
Contaminación tratadaProceso involucradoTipo
Tomado de McCutcheon, PBI Bulletin 1998.