Biotecnologia vegetal

Tomado de: ISNAR, 2001; REDBIO/FAO, 2002.

Técnicas más utilizadas en I+D:

Recursos genéticos 21 %

Mejora de productividad 23 %

Protección de plantas 25 %

Otros 19 %

Grandes temas en I+D:

Agrobiotecnología

Introducción

Distribución de actividades en I+D en América Latina y el Caribe

Cultivo de tejidos 29%

Marcadores moleculares 27%

Diagnóstico 20%

Ingeniería genética 14%

Biotecnología Vegetal• Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos

micropropagación mejoramiento de plantas producción de compuestos de interés comercial

producción de metabolitos secundarios

producción de proteínas

producción de polímeros biodegradables establecimiento de plantas transgénicas

plantas resistentes a virus

plantas con rutas metabólicas modificadas

plantas mejoradas en cuanto a composición de proteínas, aceites, etc.

fitorremediación

remoción de xenobióticos

remoción de metales pesados

• Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciación / Rediferenciación

- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidosvegetales

• La teoría de la totipotencialidad celular, enunciadapor Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.

• La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la redifereciación de las células previamente desdiferenciadas.

• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.

Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales

Agrobiotecnología


• Micropropagación vegetal

• Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis)

• Cultivo de meristemas

• Cultivo de suspensiones de células vegetales

• Cultivo de protoplastos

• Cultivo de anteras

• Cultivo de óvulos y embriones

Técnicasdel cultivo de células y tejidos vegetales

Agrobiotecnología


Compuestos inorgánicosMacronutrientes: NO4

- , PO4

3- , K+, Ca2+, Mg2+, SO4

2-

Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I-

CarbohidratosSacarosa, glucosa, mio-inositol

VitaminasTiamina (B1)PiridoxinaAcido nicotínico (C)Biotina

AminoácidosGlicina

Reguladores del crecimientoAuxinasCitocininasGiberelinas

Soporte inerte (medios semisólidos)Agar (0,7 a 1%)Gelrite®

pH5,6 – 5,8

Esterilización1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Medios de cultivo: composición general

• Grupos básicos de reguladores del crecimiento:

- Auxinas- Citoquininas- Giberelinas- Acido abscísico- Etileno

• Generalidades:

- Actúan a bajas concentraciones

- Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).

- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.

- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.

Reguladoresdel crecimiento

Agrobiotecnología


• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptile de gramíneas.

- Alargamiento y división celular- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventícias- Dominancia apical- Acción herbicida- Estimulación de la producción de etileno

• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.

• Su transporte es polar

• Auxinas sintéticas:

- Acido indol butírico (IBA) - Acido naftalen acético (ANA) - 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

N

OH

O

Acido indol acético (AIA)(auxina endógena)

Auxinas: estos compuestos se emplean básicamente como promotores de la proliferación celular y la inducción de la

morfogénesis

Agrobiotecnología


• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro.

• Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:

- Promoción de la división celular- Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos

• Citoquininas endógenas:

- Zeatina (Zea)- Isopenteniladenina (2iP)

• Citoquininas sintéticas:

- Kinetina (Kin)- Benziladenina (BAP)

• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentranen todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g/Kg.

• Su transporte es no polar.

Citoquininas: en combinación con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenéticas

Agrobiotecnología


Estructura química de las principales citoquininas

NH CH2 CH C

CH3

CH2OH

Zeatina

NH CH2 CH C

CH3

CH3

Isopenteniladenina(IP)

6-bencilaminopurina

N NH C

H

HN

N N

N

N

• Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo.

• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.

• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales- Crecimiento de yemas latentes- Germinación de semillas en dormición- Floración- Movilización de reservas en la semilla.

• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión.

• Su transporte no es polar.

O

HCH3

H COOHH

HO OH

CH3

C O

Acido giberélico (GA3)Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo

Agrobiotecnología


• Iniciación

- Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre- Elección del explanto inicial y de la formulación

del medio de cultivo- Desinfección superficial de los explantos- Establecimiento del cultivo in vitro

• Multiplicación

- Multiplicación del material stock

• Enraizamiento

- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro

• Rusticación

- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo

Etapas de la micropropagación vegetal

Agrobiotecnología


• Posibles vías morfogenéticas:

- Organogénesis

- Embriogénesis

• Diferencias entre las dos posibles vías:

- La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas.

- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.Una célula del explanto se aísla y constituye el puntode partida para la obtención de un embrión somático.Se diferencian embriones o estructuras bipolaresque completan cada una de las etapas implicadasen la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa.

Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas en la diferenciación de novode brotes y/o plantas completas

Agrobiotecnología


Explanto (disco de hoja)

Explanto (células vegetales)

REGENERACIÓN

Suspensión celular

Embriones somáticos

ENCAPSULACIÓN

GERMINACIÓN

GERMINACIÓN Semilla artificial

Callo

Propagación vegetativa por embriogénesis somática

Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por

encapsulación en alginato

Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales

• Proliferación de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas.

- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula en base al número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.

- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año, a partir de una única yema inicial.

- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta técnica.

Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes

Agrobiotecnología


Sistemas de micropropagación vegetalProliferación de tejidos desdiferenciados

Agrobiotecnología


• Consideraciones generales:

- Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, células en suspensión, etc.)

- Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos.

- Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala.

Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro

Agrobiotecnología


Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta

Sistemas de propagación vegetativain vitro

Propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta

Agrobiotecnología


Sistemas de micropropagación vegetalCultivo de meristemas

Agrobiotecnología


• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales.

• Constituyen el explanto ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias.

• Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservación y conservación de germoplasma.

Los meristemas son grupos de células indiferenciadas que retienenla capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta

Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos

Agrobiotecnología


- El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción).

- El número de partículas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.

El cultivo de meristemas facilita la eliminación de patógenos

Agrobiotecnología


• Propagación vegetativa rápida y a gran escala

• Uniformidad seleccionada del material clonado

• Multiplicación de plantas recalcitrantesa las técnicas convencionales

• Reducción en el tiempo de multiplicacióny en el espacio requerido para tal fin

• Mayor control sobre la sanidad del material propagado

• Introducción rápida de nuevos cultivares

• Conservación de germoplasma

• Facilidades para el intercambio internacionalde material vegetal

Alcances de la micropropagación vegetal

Agrobiotecnología


Sistemas de transferencia genéticaen plantas

Agrobiotecnología

Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens

• Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos

- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes.

- Sistemas basados en virus vegetales.

• Sistemas de transferencia directa de ADN

- Transferencia por biobalística.

- Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación

- Transferencia con whiskers de carburo de silicio. - Transferencia por microinyección.

Sistemas de transformacióngenéticaen plantas

Agrobiotecnología

Biobalísticay otros sistemas de transferencia directa de ADN

Biología de Agrobacterium tumefaciens

Agrobiotecnología


Agrobacterium tumefaciens

Tumor de tallo provocadopor Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Agrobiotecnología


Mapa genético del plásmido Ti de octopina

BI BD

Agrobiotecnología


Estructura de la región T de un plásmido Ti de octopina

Mecanismos moleculares implicados en la transformaciónpor Agrobacterium tumefaciens

Tomado de: Tzfira y Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002

Agrobacterium rhizogenes

Tumor de raíces producido por Agrobacterium rhizogenes en discos de remolacha

Agrobiotecnología

Sistemasde transformación vegetal:Agrobacterium tumefaciens Gentileza del Dr. Mark Tepfer

Cultivo de raíces de tabaco transformadaspor Agrobacterium rhizogenes

Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus

Agrobiotecnología


Gentileza del Dr. Mark Tepfer

Agrobacterium rhizogenes

La capacidadde Agrobacteriumtumefaciensde introducir ADNen el genomade la planta permitiódesarrollar vectoresplasmídicosbasadosen el plásmido Ti

Agrobiotecnología

Sistemasde transformaciónvegetal:Agrobacteriumtumefaciens

Ejemplos de vectores binarios

Mapa de restricciónde los plásmidospBIN19; pPZP111;pMON10098;pGreen0029.

Abreviaturas:BI: borde izquierdo;ori: origen dereplicación;BD: borde derecho.

Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.

Transformación mediante cocultivo deAgrobacterium tumefaciens y discos de hojas de tabaco

Explante inicial (hoja)

Disco foliar

Co-cultivo con una bacteria desarmada

en medio líquido

Co-cultivo en medio sólido sin antibióticos

Medio de inducción de brotes con antibiótico y

agente de selecciónMedio de enraizamiento con o sin agente de selección

Planta transgénica aclimatada en invernadero

A B

C D

E F

A B

C D

E F

Sistemas de transferencia directade ADN

Agrobiotecnología


• Ventajas

- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal

- No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas transgénicas

- Requieren construcciones más simples y pequeñas

- Son apropiados para estudios de expresión transitoria

• Desventajas

- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del vector en varios sitios del genoma de las células transformadas

- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de re-arreglos en los transgenes

La transformación por biobalística depende de factores físicos, químicosy biológicos

Agrobiotecnología


•Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia del ADN

- Método de aceleración de las micropartículas

- Naturaleza química y física, densidad y volumen de las micropartículas

- Naturaleza, preparación, adherencia y concentración

del ADN

- Vacío y distancias de bombardeo

- Diámetro de apertura de la placa de retención

- Número de bombardeos

• Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada

- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y

genes marcadores de selección

Sistemas alternativos de aceleración de micropartículas

Modelo comercialactual

Medidor de presión de helio

Tubo de aceleración de gas

Interruptores de control

Medidor de vacío

Portador del discode ruptura

Portador del macroproyectil

Ensamblaje del propulsorde microproyectiles

Cámara de bombardeo

Controles del flujode aire y de vacío

Células blanco

Soporte del blanco

Válvula de medición de helio

Modelo comercialactual




Medidor de vacío






Células blanco

Soporte del blanco





Medidor de vacío






Células blanco

Soporte del blanco


Acelerador de micropartículas PDS 1000/He

por descarga de helio a alta presión

Soporte del tejido blanco

Mecanismo de disparo de un cañón impulsado por He a alta presión (PDS 1000/He)

Estado del disco de ruptura, macroproyectil y malla de retención luego del

bombardeo

Transformación genética de plantas in vivo usando una pistola génica Helios

La pistola génica Helios permite la transformación de tejidosin vivo

Agrobiotecnología


Expresión transitoria en hojas de Arabidopsis bombardeadas con una pistola Helios con y sin malla de difusión de micropartículas

Expresión transitoria en embriones inmaduros de centeno bombardeados con un cañón PDS 1000 He usando diferentes concentraciones de micropartículas. A: 200 g, B: 100 g y C: 30

g

Expresión transitoria del gen reportero uidA en explantos bombardeados con micropartículas

Tomado de: Helenius et al., Plant Molecular Biology Reporter, 2000..

Tomado de: http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/2002/pub/agrar/02H059/prom.pdf

A B C

- Transferencia de genes a células, tejidos y órganos vegetales

- Transferencia de genes a microorganismos y organelas

- Estudio de expresión transitoria

- Análisis de promotores y de delección de genes

- Estudio de mecanismos de expresión y regulación de genes

- Estudio de infecciones virales

- Transferencia de ARN viral

- Estudio de vías metabólicas

- Estudio del desarrollo de plantas

La biobalística puede utilizarse con diversos finesexperimentales

Agrobiotecnología


Genes selectores para transformación de plantas

MetotrexatoPlásmido R67Dihidrofolato reductasadhfr

Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichus hindustanus

Resistencia a bleomicinaBle

Kanamicina, G418, paromomicina, neomicina

Tn5Neomicina fosfotransferasanptII

EstreptomicinaTn5Estreptomicina fosfotransferasa

SPT

Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV

CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetil transferasa

cat

GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa

EPSP

Fosfinotricina, bialofosStreptomices hygroscopicus

Fosfinotricin acetil transferasa

bar

GentamicinaSerratia marcescens; Klebsiella pneumoniae

Gentamicin-3-N-acetiltransferasa

aacC3, aacC4

SelecciónFuenteProducto genéticoGen de selección

MetotrexatoPlásmido R67Dihidrofolato reductasadhfr

Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichus hindustanus

Resistencia a bleomicinaBle

Kanamicina, G418, paromomicina, neomicina

Tn5Neomicina fosfotransferasanptII

EstreptomicinaTn5Estreptomicina fosfotransferasa

SPT

Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV

CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetil transferasa

cat

GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa

EPSP

Fosfinotricina, bialofosStreptomices hygroscopicus

Fosfinotricin acetil transferasa

bar

GentamicinaSerratia marcescens; Klebsiella pneumoniae

Gentamicin-3-N-acetiltransferasa

aacC3, aacC4

SelecciónFuenteProducto genéticoGen de selección

Genes reporteros usados en transformación de plantas

Genes reporteros

-glucuronidasa

Proteína de fluorescenciaverde

Cloranfenicolacetiltransferasa

Luciferasa

Luciferasa

Abreviatura

gus/uidA

GFP

Cat

Luc

luxA, luxB

Origen

E. coli

Aequorea victoria

E. Coli

Photinus pyralis

Vibrio harveyi

Detección

Fluorométrico (cuantitativo)o histoquímico (in situ),

no radiactivo

Fluorescencia,no destructiva

Ensayo radiactivosensitivo, semi cuantitativo

Luminiscencia

Luminiscencia

Genes reporteros

-glucuronidasa

Proteína de fluorescenciaverde

Cloranfenicolacetiltransferasa

Luciferasa

Luciferasa

Abreviatura

gus/uidA

GFP

Cat

Luc

luxA, luxB

Origen

E. coli

Aequorea victoria

E. Coli

Photinus pyralis

Vibrio harveyi

Detección

Fluorométrico (cuantitativo)o histoquímico (in situ),

no radiactivo

Fluorescencia,no destructiva

Ensayo radiactivosensitivo, semicuantitativo

Luminiscencia

Luminiscencia

A B C D

Expresióndel gen uidAen Arabidopsis thaliana

www.plantphysiol.org

Tinción de óvulos, sacos embrionarios y lóculos enterosde Arabidopsis thaliana mediante la reacción

histoquímica de la enzima -glucuronidasa luego de la infiltración con Agrobacterium

tumefaciens

Agrobiotecnología


Expresióndel gen GFP en plantas transgénicasde Nicotiana benthamiana

A B

C

La expresión del gen GFP produce color verde o amarillo bajo iluminación ultravioleta. En ausencia de GFP el tejido

se observa de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila.

Agrobiotecnología


Potencial económico de los metabolitos secundarios

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

El metabolismo secundario regulamuchas de las relacionesde la planta con el medio circundante

Concepto general

• La producción de metabolitos secundarios está estrechamente relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.

- Generalmente no está asociada al crecimiento.- Depende de condiciones determinadas de control hormonal. - Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y órganos (raíces, tallos, hojas y glándulas).- La biosíntesis y acumulación suele estar fuertemente compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidos y de órganos.

• Los metabolitos secundarios se producen ante situaciones de estrés o enfermedad.

- Factores bióticos- Factores abióticos

Cultivode tejidos y metabolismo secundario

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

- Insecticidas

- Saborizantes

- Colorantes

Las plantascomo fuentede metabolitos secundarios de interés comercial • Potencial

- 75 % de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las plantas.

- Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta.

- 25 % de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen vegetal.

- 75 % de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en

el uso de extractos provenientes de plantas.

- Medicinas

- Herbicidas

- Proteasas

- Fragancias

- Antimicrobianos

- Enzimas

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Natural Sources

Vincristine and vinblastine (anti- tumoral

extracted from leaves of Catharanthus

roseus)

Taxol (anti-tumoral, extracted from the

bark of Taxus brevifolia)

COOCH3

CH3

H

OH

N

N

N

OCOCH3

R

H3CO

H COOCH3

CH3

OHN

O

C

H

CH3 - C - O

O - C -CH3

O

O

O

O

OH

OH

OH

O O

O

CH33HC

C - NH - CH - CH - C - O

Biotechnological processes

Shikonin (anti-inflammatory, pigment

obtained by fermentation of Lithospermum

erythrorhizon cells)

Berberine ( antimicrobial, anti-inflammatory,

pigment obtained by fermentation of Coptis

japonica and Thalictrum minus )

Ginsenosides (stimulant of the nervous

system obtained from hairy roots of Panax

ginseng )

OOH

OHOOH

O

O

OCH3

OCH3

Glc-Glc-O

O-Glc-Glc

OH

Algunas de las medicinas más importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002

Nombre Tipo Origen Uso terapéutico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$ Hiosciamina, escopolamina

Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos

Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca acuminata

Antineoplásico

Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico Vinblastina, vincristina

Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico

Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Rubiaceae

Afrodisíaco

Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$ Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de

ipecacuana Cephaelis ipecacuanha

Emético

Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico

Producciónde metabolitos secundariospor cultivo in vitrode células y órganos vegetales: ¿por qué?

- Independizarse de factores externos tales como: cambios de temperatura, sequías, plagas, variabilidad de la producción, factores políticos y sociales, etc.

- Evitar la extinción de especies vegetales.

- Disponer de condiciones controladas en el proceso de producción y extracción.

- Posibilitar el mejoramiento vegetal en tiempos mas cortos.

- Hacer viable la producción de compuestos complejos con uno o más C quirales en forma más económica respecto de la síntesis química

- Posibilitar la obtención de nuevos compuestos no presentes en la planta madre.

- Establecer procesos de biotransformación sólo realizables por enzimas provenientes de plantas.

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Procesos industriales

Tipo de compuesto

Farmacéuticos

Pigmentos

Fragancias

Saborizantes

Depigmentadores

Producto

Shikonina

Berberina

Sanguinarina

Gingsenósidos

Taxol

Cartamina

Geraniol

Citronerol

Vanillina

Arbutina

Compañía

Mitsui Petrochemical Ind.


Vigont Researol Lab.

Nitto Denko Co.

Phyton USA

Kibun Kyoto University

Kanedo Co.

Kanedo Co.

Kanedo Co.


• Condiciones económicas:

- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)

- Alto rendimiento y productividad del cultivo comparado con la planta entera

- Buen crecimiento en biorreactores

- Crecimiento lento de la planta entera como fuente alternativa

• Parámetros principales:

- Productividad: g de producto/L/día

- Concentración máxima de producto: g de producto/L

- Rendimiento: g producto/g sustrato

Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Estrategias para incrementarla producción de metabolitos secundarios

• Selección de especies vegetales apropiadas

• Selección de líneas celulares mejoradas

• Optimización de las condiciones de cultivo

• Agregado de precursores

• Tipo de cultivo: suspensiones, órganos o células inmovilizadas

• Uso de elicitores microbianos y estrés abiótico

• Permeabilización y remoción in situ

Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

• Screening y selección de líneas sobreproductoras

- Se facilita cuando el metabolito de interés es un pigmento, ya que puede hacerse una selección

visual.- Es importante contar con un método rápido y sencillo para seleccionar líneas más productoras (por ejemplo, ELISA).

• Optimización del medio de cultivo (variables más ensayadas)

- Fuente de carbono- Limitación en nitrógeno- Limitación en fosfato- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)- Relación C/N

• Agregado de precursores

- Bajo costo- Baja toxicidad- No muy alejado del producto final en la ruta metabólica

Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Diferencias entre suspensiones de células vegetalesy de células microbianas

Tomado de: Scraag.. Plant Biotechnology, 1992.

Consecuencias paracultivos a gran escala

Sedimentación rápida;sensibilidad a fuerzas de corte;

formación de gradientes;dificultad para tomar muestras

Largos tiempos de proceso;baja productividad

Necesidad de grandescantidades de inóculo;

escalado más largo

Bajas velocidadesde agitación

Baja demanda de oxígeno:fermentadores con bajatransferencia de oxígeno

Permeabilización;remoción in situ

Célulasvegetales

Agregados de 10-200 m y

de hasta 2 mmde diámetro

Lenta; td ~ 2-5 días

5-20%

Sensible /Tolerante

Baja

Intracelular /a veces extracelular

Célulasmicrobianas

CélulasIndividuales

2-10 m

Rápida;td ~ 1-2 h

Pequeña

Insensible

Alta

Extracelular

Caracterización

Tamañoy morfología

Velocidadde crecimiento

Densidad de inoculación

Sensibilidad a fuerzas de corte

Aireación

Acumulacióndel producto

• Problemas a considerar:

- Tasa de crecimiento

- Volumen del inóculo

- Tamaño y agregación de las células

- Oxigenación

- Agitación

Cultivos en suspensión

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Cultivo de órganos: raíces transformadas

Propiedad

Forma de crecimiento

Patrón de crecimiento

Tiempo de duplicación

Biomasa final

(peso seco/L)

Background genético

Formación inicial de producto

Medio de crecimiento

Localización del producto

Tipo de proceso

Suspensiones

Células simples-agregados

Desorganizado; cada célula

puede dividirse y expandirse

15 h-días

30-60 g

Heterogéneo

Usualmente bajo

Complejo; hormonas

y vitaminas

Intracelular- extracelular

Batch; continuo, deben

ser inmovilizadas

Raíces transformadas

Red de ramificaciones

División celular localizada;

crecimiento linear con

ramificaciones laterales

36 h-días

30-60 g

Euploide

Similares a la planta madre

Simple, sales y azúcar

Intracelular- extracelular

Batch o continuo, no hay

necesidad de inmovilizar

Género

Nicotiana

CatharanthusCinchonaDuboisiaDatura

BetaLippia

ArtemisiaCoreopsis, Bidens

Tagetes

DigitalisCassiaPanax

ChaenactisPodophyllum

LinumLithospermum

Solanum

Metabolito

AlcaloideAlcaloides piridínicosIndoles Tropano

OtrosBetalaina Sesquiterpenos PoliacetilenosTiofenos

Glicósidos cardioactivosAntraquinonasSaponinasPolyinesLignanos NaftoquinonasEsteroides

Algunos metabolitos secundarios producidospor raíces transformadas

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Patrón de flujo de dos diseños de propulsor

Agitador de paletas inclinadasAgitador de paletas planas o Rushton

Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.

Biorreactor de tambor rotatorio Biorreactor de membranas

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Böhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.

Diseños alternativos para biorreactores con agitación mecánica

Bioreactor de lecho de niebla(nutrient mist reactor)

Bioreactor de lecho de goteocon malla para inmovilizar a las raíces

Biorreactores para el cultivo de raíces

Bomba de aire

Ro

tám

etro

Bo

mb

ap

eris

tált

ica

Generador de niebla

Cámarade cultivoControlador Controlador

On Off

Intensidad

Filtro de aire

Condensadorde niebla

Adición de nutrientes

Bomba

Salida de aire

AireAire

Inóculo

Reservorio

Malla de inmovilización

Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Compuesto

PiretrinasCardenólidosArtemisinina

Aceites esencialesAceites esenciales

Planta

Chrysanthemum spp. Digitalis spp.

Artemisia annuaMentha spp.

Pelargoium spp.

Cultivode tallos

• Ventajas

- Cultivos genética y bioquímicamente estables

- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos

presentes en tallos y hojas (glándulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales

- Niveles similares a los de la planta (no siempre se

cumple).

• Desventajas

- Sólo para productos sintetizados en tallos y hojas

- Vitrificación

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Elicitación

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

• Agentes bióticos

- Extractos de paredes de hongos o bacterias- Acido araquidónico- Quitosano- Metil jasmonato

• Agentes abióticos

- Metales pesados- Radiación UV- Presión osmótica- Ultrasonido

- DMSO

- Shock térmico

- Cambios de pH

- Limitación de fosfato y oxígeno

- Elicitación

- Detergentes y aceites de siliconas

- Electropermeabilización

Liberacióndel productoal medio

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

• Líquido-líquido:

Compuestos inmiscibles en agua, como solventesorgánicos o lípidos (sistemas de dos fases agua-orgánico).Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.

Compuestos miscibles en agua, como sales o solucionesde polímeros (sistemas de dos fases acuosas). Ejemplos: DEAE, PEG.

• Sólido-líquido:

La segunda fase es un material sólido como resinas u otrosabsorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.

• Requerimientos:

- Autoclavables- No tóxicos- Fácil separación del producto de interés

de la segunda fase- No modificación del medio de cultivo- Permanencia de las células en la fase acuosa

Remoción de producto in situ

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Diagrama de un tanque de agitación mecánica modificado para operar con remoción in situ del producto.

1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar raíces; 3: sensor de oxígeno; 4: malla acero inoxidable; 5:

medidor DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;

12: marco de la malla

Un bioreactor de agitación por líquidocon loop externo

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Adaptaciones para la extracción in situ del producto

Secuencia en laoptimización de un proceso para la producciónde metabolitos secundarios

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

Selección de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro

Establecimiento de cultivos in vitro

Estabilización y selección de cultivosin vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,

liberación al medio

Optimización de medio de cultivo para producciónpor diseño factorial: nutrientes, precursores, elicitación,

liberación y remoción in situ

Optimización en bioreactores: escaladoSistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusión,

en dos etapas. Extracción y purificación del producto

Estrategiaspara modificarel metabolismo secundariomediante manipulación genética

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

- Completar rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos.

- Amplificar rutas normales.

- Bloquear rutas alternativas.

- Bloquear rutas normales.

- Modificar la regulación de rutas normales.

- Modificar los mecanismos de secreción y exportación.

- Bloquear rutas de degradación.

Ingeniería metabólica del metabolismo secundario

Enzima

Triptofano decarboxilasa(TDC)

Hiosciamina-6-hidroxilasa(H6H)

Triptofano decarboxilasa (TDC)y estrictosidina sintasa (STR)

ORCA3 (factorDe transcripción)

(S)-esculerina 9-O-metiltransferasa (SMT)

Desoxixilulosa fosfatoreductoisomerasa (DXR)

C1 y R (factoresde transcripción)

Especie

Peganum harmala(suspensiones y raíces)

Hyosciamus muticus(raíces transformadas)

Catharanthus roseus(suspensiones)

Catharanthus roseus(suspensiones)

Coptis japonica(suspensiones)

Mentha spp.(planta)

Zea mays(callos)

Producto

Serotonina

Escopolamina

Alcaloides indólicos(TIAs)

Alcaloides indólicos(TIAs)

Berberina

Aceites esenciales

Antocianinas

Observaciones

Incremento de 10-20 vecesen producto

Contenido de producto 4 vecessuperior a planta control

Contenido de TIAs de 300 mg/Lcomparado con control 50mg/L.Líneas inestables

Incremento de la concentración de TIAsde 3 veces después de agregarel precursor secologanina

Incremento del flujo hacia la producciónde berberina de 15%

Incremento del 50% ene l contenidode aceites esenciales

Producción de antocianinas y fenolesque no se producían en los callos sin transformar.

Ejemplosde Ingeniería metabólica enel metabolismo secundario

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

• Problemas

- Clonado de genes

- Estabilidad

- Compartimentalización

- Transporte

- Limitaciones y arquitectura

de la ruta metabólica

- Canales metabólicos

Esquema de un proceso completo para la producción de un metabolito secundario por cultivo in vitro de células y órganos vegetales

Shikonina

• Planta entera

- La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 3 años.

• Suspensiones celulares

- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la producción.

- Las bajas concentraciones de nitrógeno y la elicitación inducen

la producción de shikonina.

- Se utilizan fermentadores de agitación mecánica y tambor rotatorio.

- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.

Producción de shikonina por suspensiones celularesde Lithospermum erythrorhizon

Yamasaki Plant Photo Gallery

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Proceso para la producción de shikonina a partir de célulasde Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Taxol®

• Planta entera

- La edad de los árboles para extraer el producto es de 50-100 años. - La concentración de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco. - Este método de producción podría llevar a la extinción de la especie.

• Semisíntesis

- El material vegeta empleado presenta variación en la concentración de precursores.

- Las plantas empleadas crecen lentamente.

- Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difícil la purificación del taxol.

Schoepke Plant Image Gallery

Producción de taxol por Taxus spp

Conclusiones

Agrobiotecnología

Cultivoscelulares

• Aspectos bioingenieriles

- Diseño de bioreactores especiales para cultivos de tejidos vegetales

- Instrumentación y control de los bioprocesos- Diseño de bioreactores más económicos- Métodos no letales para liberación de los metabolitos secundarios- Método adecuado para la remoción in situ

• Aspectos Biológicos

- Conocimiento de la regulación de las rutas biosintéticas: enzimas y factores de transcripción

- Conocimiento de la regulación del transporte y acumulación de los metabolitos secundarios- Conocimientos de los mecanismos de degradación del producto

Expresión de proteínas heterólogas en plantas(Molecular Farming)

•bajos costos de producción.•tiempos menores para poner en el mercado.•abastecimiento ilimitado.•procesamiento correcto de proteínas.•seguridad.

Fidelidad en la expresión de proteínas humanas o animales en plantas.

Producto Uso Planta huésped Integridad estructural

Actividad biológica

Hemoglobina y Sustituto de la sangre tabaco si si, (unión a O2/CO2) -interferon Anti-cáncer, antiviral arroz si Actividad antiviral in

vitro. EPO Estimulador del crecimiento de

glóbulos rojos Células de tabaco si, (glicanos) Sin testear

Sero albumina humana

papa si Sin testear

Factor de crecimiento epidérmico

Mitógeno tabaco Sin testear

Glucocerebrosidasa Enfermedad de Gaucher tabaco si, (glicanos) si Hirudina Anticoagulante canola si si NPI Defensina Antibiótico tabaco si



Plantas transgénicas Vectores virales Períodos más largos en el establecimiento de la línea transgénica

Períodos cortos en la preparación del vector

Niveles de expresión relativamente bajos Altos niveles de expresión

Posibilidad de expresar en tejido específico, expresarse en semillas o tubérculos con gran estabilidad de la proteína.

Fusión con proteínas de la cápside pueden facilitar el downstream processing aislando las partículas virales.

Más estables Dificultad para manipular material fresco (siempre se infecta sobre hojas)

Tamaño de la proteína no es limitante Tamaño de la proteína es limitante

Plantas usadas: Tabaco, papa, tomate, banana.

Virus usados: virus del mosaico del tabaco(TMV). Cowpea mosaic virus (CPMV)

Agrobiotecnología

Ventajas

• Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguascontaminadas (10-20 % del costo de métodos tradicionales):

- las plantas emplean energía solar- el tratamiento es in situ

• Algunos procesos degradativos ocurren en forma más rápida con plantas que con microorganismos.

• Es un método apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminación de áreas restringidas en plazos largos.

• Es una metodología con buena aceptación pública.

• Se generan menos residuos secundarios.

Fitorremediación

Fitorremediación

Agrobiotecnología

Limitaciones

• El proceso se limita a la profundidad de penetraciónde las raíces o a aguas poco profundas.

• La fitotoxicidad es un limitante en áreas fuertemente contaminadas.

• Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados.

• La biodisponibilidad de los compuestos o metaleses un factor limitante de la captación.

• Deben considerarse potenciales contaminacionesde la cadena alimentaria y napas de agua.

• Se requiere comprender mejor la naturalezade los productos de degradación (fitodegradación).

• Falta elaborar el marco regulatorio.

Fitorremediación

Fitorremediación

Agrobiotecnología

• Captación por las raíces:

- Movilización de los metales

• Quelación mediante fitosideróforos

• Unión a proteínas quelantes

• Acidificación por exudado de H+

- Captación por la raíz

• Via apoplástica

• Vía simplástica

• Transporte:- Almacenamiento en raíz y exportación al tallo por xilema

- Transporte por xilema o redistribución por floema

- Almacenamiento en vacuolas

• Mecanismos de evasión o tolerancia:

- Captación celular limitada (evasión)

- Metabolismo resistente a metales pesados

- Detoxificación por quelación, compartimentalización

o precipitación

Mecanismos más probables:- Compartimentalización en vacuolas y quelación con fitoquelatinas (Cd2+, Zn2+, Cu2+ )

- Precipitación como fitatos (Zn2+)

Biología de la acumulaciónde metalesen plantas

Fitorremediación

Agrobiotecnología

Tipos de plantas más utilizadas

Freatófitas- Plantas de raíces profundas (álamo, sauce, algodonero).

Pasturas- Por su tipo de raíz retienen el suelo.

Legumbres- Permiten enriquecer el suelo en N2.

Acuáticas- Permiten la degradación de contaminantes en ciénagas artificiales.

Fitorremediación

Fitorremediación

Agrobiotecnología

• FitoextracciónLas plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte aérea).

• RizofiltraciónLas raíces de las plantas se usan para absorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes líquidos contaminados.

• FitoestimulaciónSe usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).

• FitoestabilizaciónLas plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterráneas o al aire.

• Fitotransformación- Fitodegradación: Las plantas acuáticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgánicos para dar subproductos no tóxicos o menos tóxicos.

- Fitovolatilización: Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgánicos y los liberan a la atmósferacon la transpiración.

Tipos de fitorremediación

Fitorremediación

Tipos de fitorremediación

Lagunas de deshecho de yacimientos mineros.

Propuesto para fenólicos y compuestos clorinados.

Las plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterráneas o al aire. Contribuyen a estabilizar el suelo.

Fitoestabilización

Cd2+,Co2+,Cr2+,Ni2+,Hg2+,Pb2+,Se2+,Zn2+.Las raíces de las plantas se usan para absorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes líquidos contaminados.

Rizofiltración

Cd2+,Co2+,Cr2+,Ni2+,Hg2+,Pb2+,Se2+,Zn2+.Las plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte aérea).

Fitoextracción

Explosivos (TNT, DNT, RDX, nitrobenceno, ácido pícrico, nitrotolueno, nitrometano, nitroetano).

Atrazina, solventes clorinados, bromuro de metilo, tetrabromoeteno, tetracloroetano, DDT, pesticidas fosfatados, bifenoles policlorinados, fenoles y nitritos.

Las plantas acuáticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgánicos para dar subproductos no tóxicos o menos tóxicos.

Fitodegradación

Hg2+, Se2+ y solventes clorinados (tetraclorometano y triclorometano).

Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgánicos y los liberan a la atmósfera con la transpiración.

Fitovolatilización

Hidrocarburos poliaromáticos, benceno, tolueno, etil benceno, xileno, hidrocarburos del petróleo, perciorato, atrazina, ataclor, bifenilos policlorinados, otros compuestos orgánicos.

Se usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).

Fitoestimulación

Contaminación tratadaProceso involucradoTipo

Tomado de McCutcheon, PBI Bulletin 1998.

Biotecnologia vegetal

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