La Pirazinamidasa (PZAsa) de Mycobacterium Tuberculosis : Aspectos Moleculares del Mecanismo de Resistencia

BSc. Jun Sotelo Romero

Unidad de Bioinformática y Biología ComputacionalLID-UPCH

Laboratorio de Enfermedades Infecciosas LID-UPCH

Mycobacterium tuberculosis Agente etiológico de la Tuberculosis, la enfermedad infecciosa que más muertes provoca en el mundo.

La Tuberculosis es un complejo de fenómenos microbiológicos e inmunológicos que escapa a una definición simple.

Nuevos Problemas:

• Asociación con la infección del virus del VIH.• Resistencia a la acción de los fármacos.• El Mycobacterium tuberculosis es capaz de causar tanto un proceso agudo de enfermedad como una infección latente asintomática. Un tercio de la población mundial puede estar infectada con el bacilo en este estado.

Tuberculosis mata a 2 persona en el mundo cada 15 segundos

Problemática de la Tuberculosis

GLOBAL

Países Industrializados

NACIONAL

Países en Desarrollo

•Reemergencia.

•Asociación a HIV.

•2/3 personas infectadas con TB.

•Problema endémico

•Asociado a “pobreza”, desnutrición, drogadicción y otras enfermedades.

•Concentrado en “bolsones”.

90% TB del Perú → Lima.

Transmisión de la TB Vía aérea ( partículas suspendidas en el aire ).

Existe alta transmisión de TB en el grupo de 15-20 años.

Existen factores que predisponen la manifestación clínica de la enfermedad.

Poca o ninguna hipersensibilidad.Negátividad con la tuberculina

Enfermedad sístemica progresiva y Muerte

De estos

91% sin enfermedad

6% TBC Clínica- 2% Pulmonar- 3% extratorácica- 1% ambos casos

3% Enfermedad sistémica progresiva y Muerte.

Hipersensibilidad de tipo retardado e inmunidad mediada por células

Positividad con la tuberculina

Se contiene la enfermedadLas bacterias viven pero no se multiplican

LATENCIA

Infección en los alvéolos

Los bacilos se multiplican y se movilizan hacia los ganglios linfáticos traqueobronquiales

Vacunas para TB

No existe vacuna efectiva contra TB.

BCG (La vacuna de bacilo de Calmette-Guérin ).

● No protege para la TB pulmonar.

● Si protege para TB meningea

- Muy rara.

- Necesario si se trata de una zona endémica.

Diagnóstico de TB

No existen pruebas serológicas (ELISA, Western Blot ).

En general, no existen pruebas tradicionales rápidas.

Método convencional → “cultivo” 2-3 meses ( para conocer la susceptibilidad a las drogas ).

MAYOR PROBLEMA : Dar el tratamiento específico para cada paciente.

Tratamiento de TB

Drogas de 1° Línea.

Un gran problema es el incremento de la TB MDR.

Una DROGA MUY IMPORTANTE→Pirazinamida- Única droga que mata al Myc. Tub. en estado latente.- Tratamiento estándar + PZA → Mejores resultados.

Rifampicina

Isoniazida

Las más efectivas y con menos efectos laterales pero ↑ RESISTENCIA

TB MDR es resistente al menos a Rifampicina e Isoniazida.

►Estimados de niveles de resistencia a Estimados de niveles de resistencia a drogas en pacientes que ingresan al drogas en pacientes que ingresan al esquema de tratamiento esquema de tratamiento Estandarizado (1997-2003)Estandarizado (1997-2003) Etionamida (E)Etionamida (E) 40%40%

Etambutol (Et)Etambutol (Et) 45%45%Pirazinamida (Z)Pirazinamida (Z) 30%30%Ciprofloxacina (C) Ciprofloxacina (C) 4% 4%Kanamicina (K)Kanamicina (K) 3% 3%

Datos de la Unidad Técnica TBMDR- MINSA

El problema de la Tuberculosis El problema de la Tuberculosis multidrogo resistente en el Perúmultidrogo resistente en el Perú

Estructura de la Pirazinamida (PZA) y sus análogos

Hidrólisis de la PZA por parte de la Hidrólisis de la PZA por parte de la enzima Pirazinamidasa PZAaseenzima Pirazinamidasa PZAase

Mecanismo antibacteriano de la PZAMecanismo antibacteriano de la PZA

CAUSAS DE RESISTENCIA :

Falla funcional de la PZAase.

Falla del sistema de flujo/eflujo.

Falla del ingreso de la PZA.

Mutaciones en el promotor???

► J Bacteriol. 2000 Jul;182(13):3881-4.J Bacteriol. 2000 Jul;182(13):3881-4.RelatedRelated ArticlesArticles,, Links Links      

Mycobacterium smegmatis has two pyrazinamidase Mycobacterium smegmatis has two pyrazinamidase enzymes, PncA and pzaA.enzymes, PncA and pzaA.

GuoGuo M M, , SunSun Z Z, , ZhangZhang Y Y..

Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Hygiene and Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, Hygiene and Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland 21205, USA.Maryland 21205, USA.

The Mycobacterium smegmatis pncA gene, encoding The Mycobacterium smegmatis pncA gene, encoding nicotinamidase/pyrazinamidase, was identified. While it was nicotinamidase/pyrazinamidase, was identified. While it was similar to counterparts from other mycobacteria, the M. similar to counterparts from other mycobacteria, the M. smegmatis PncA had little homology to the other M. smegmatis smegmatis PncA had little homology to the other M. smegmatis pyrazinamidase/nicotinamidase, encoded by the pzaA gene. pyrazinamidase/nicotinamidase, encoded by the pzaA gene. Transformation of Mycobacterium bovis strain BCG with M. Transformation of Mycobacterium bovis strain BCG with M. smegmatis pncA or pzaA conferred susceptibility to pyrazinamide.smegmatis pncA or pzaA conferred susceptibility to pyrazinamide.

PMID: 10851013 [PubMed - indexed for MEDLINE]PMID: 10851013 [PubMed - indexed for MEDLINE]

► Identification, cloning, and expression of the Escherichia coli pyrazinamidase Identification, cloning, and expression of the Escherichia coli pyrazinamidase and nicotinamidase gene, pncA.and nicotinamidase gene, pncA.

FrothinghamFrothingham R R, , MeekerMeeker--O'ConnellO'Connell WA WA, , TalbotTalbot EA EA, , GeorgeGeorge JW JW, , KreuzerKreuzer KN KN..

Infectious Diseases Section, Durham Veterans Affairs Medical Center, North Carolina Infectious Diseases Section, Durham Veterans Affairs Medical Center, North Carolina 27705, USA. rfr@galactose.mc.duke.edu27705, USA. rfr@galactose.mc.duke.edu

Pyrazinamide (PZA) is one of the three most important drugs for treatment of Pyrazinamide (PZA) is one of the three most important drugs for treatment of Mycobacterium tuberculosis infections. The antibacterial activity of PZA requires a Mycobacterium tuberculosis infections. The antibacterial activity of PZA requires a bacterial enzyme, pyrazinamidase (PZAase), which hydrolyzes PZA to form pyrazinoic bacterial enzyme, pyrazinamidase (PZAase), which hydrolyzes PZA to form pyrazinoic acid and ammonia. Most PZA-resistant clinical M. tuberculosis isolates lack PZAase acid and ammonia. Most PZA-resistant clinical M. tuberculosis isolates lack PZAase activity. With the goal of eventually identifying and characterizing the M.tuberculosis activity. With the goal of eventually identifying and characterizing the M.tuberculosis PZAase gene, we began with the more tractable organism, Escherichia coli, which also PZAase gene, we began with the more tractable organism, Escherichia coli, which also has PZAase activity. We screened a transposon-generated E. coli insertion mutant library, has PZAase activity. We screened a transposon-generated E. coli insertion mutant library, using a qualitative PZAase assay. Two PZAase-negative mutants out of 4,000 colonies using a qualitative PZAase assay. Two PZAase-negative mutants out of 4,000 colonies screened were identified. In each mutant, the transposon interrupted the same 639-bp screened were identified. In each mutant, the transposon interrupted the same 639-bp open reading frame (ORF), ORF1. The expression of ORF1 on a multicopy plasmid open reading frame (ORF), ORF1. The expression of ORF1 on a multicopy plasmid complemented a PZAase-negative mutant, leading to PZAase activity levels complemented a PZAase-negative mutant, leading to PZAase activity levels approximately 10-fold greater than those of the wild type. PZA has a structure similar to approximately 10-fold greater than those of the wild type. PZA has a structure similar to that of nicotinamide, a pyridine nucleotide cycle intermediate, so we tested our strains for that of nicotinamide, a pyridine nucleotide cycle intermediate, so we tested our strains for nicotinamidase activity (EC 3.5.1.19) (genetic locus pncA). The construct with multiple nicotinamidase activity (EC 3.5.1.19) (genetic locus pncA). The construct with multiple plasmid copies of ORF1 had an approximately 10-fold increase in levels of nicotinamidase plasmid copies of ORF1 had an approximately 10-fold increase in levels of nicotinamidase activity. This overexpressing strain could utilize nicotinamide as a sole nitrogen source, activity. This overexpressing strain could utilize nicotinamide as a sole nitrogen source, through wild-type E. coli cannot. We conclude that a single E. coli enzyme accounts for through wild-type E. coli cannot. We conclude that a single E. coli enzyme accounts for both PZAase and nicotinamidase activities and that ORF1 is the E.coli PZAase and both PZAase and nicotinamidase activities and that ORF1 is the E.coli PZAase and nicotinamidase gene, pncA. nicotinamidase gene, pncA.

Publicación del genóma de Publicación del genóma de Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis : :Deciphering the biology of Mycobacterium Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequencetuberculosis from the complete genome sequence. . S. T. Cole, y ColS. T. Cole, y Col Nature 393, 537 Nature 393, 537--544 (1998).544 (1998).

Secuencias de ADN y aminoácidos de la Secuencias de ADN y aminoácidos de la PZAasePZAaseTB TB cepa H37rvcepa H37rv gi|1706963|gb|U59967.1|gi|1706963|gb|U59967.1|

MTU59967MTU59967

1 atgcgggcgt tgatcatcgt cgacgtgcag aacgacttct gcgagggtgg ctcgctggcg 1 atgcgggcgt tgatcatcgt cgacgtgcag aacgacttct gcgagggtgg ctcgctggcg 61 gtaaccggtg gcgccgcgct ggcccgcgcc atcagcgact acctggccga agcggcggac 61 gtaaccggtg gcgccgcgct ggcccgcgcc atcagcgact acctggccga agcggcggac 121 taccatcacg tcgtggcaac caaggacttc cacatcgacc cgggtgacca cttctccggc 121 taccatcacg tcgtggcaac caaggacttc cacatcgacc cgggtgacca cttctccggc 181 acaccggact attcctcgtc gtggccaccg cattgcgtca gcggtactcc cggcgcggac 181 acaccggact attcctcgtc gtggccaccg cattgcgtca gcggtactcc cggcgcggac 241 ttccatccca gtctggacac gtcggcaatc gaggcggtgt tctacaaggg tgcctacacc 241 ttccatccca gtctggacac gtcggcaatc gaggcggtgt tctacaaggg tgcctacacc 301 ggagcgtaca gcggcttcga aggagtcgac gagaacggca cgccactgct gaattggctg 301 ggagcgtaca gcggcttcga aggagtcgac gagaacggca cgccactgct gaattggctg 361 cggcaacgcg gcgtcgatga ggtcgatgtg gtcggtattg ccaccgatca ttgtgtgcgc 361 cggcaacgcg gcgtcgatga ggtcgatgtg gtcggtattg ccaccgatca ttgtgtgcgc 421 cagacggccg aggacgcggt acgcaatggc ttggccacca gggtgctggt ggacctgaca 421 cagacggccg aggacgcggt acgcaatggc ttggccacca gggtgctggt ggacctgaca 481 gcgggtgtgt cggccgatac caccgtcgcc gcgctggagg agatgcgcac cgccagcgtc 481 gcgggtgtgt cggccgatac caccgtcgcc gcgctggagg agatgcgcac cgccagcgtc 541 gagttggttt gcagctcctg a 541 gagttggttt gcagctcctg a

MRALIIVDVQNDFCEGGSLAVTGGAALARAISDYLAEAADYHHVVATKDFHIDPGDHFSGTPDYSSSWPPHCVSGTPGADFHPSLDTSAIEAVFYKGAYTGAYSGFEGVDENGTPLLNWLRQRGVDEVDVVGIATDHCVRQTAEDAVRNGLATRVLVDLTAGVSADTTVAALEEMRTASVELVCSS

El alineamiento múltiple de aprox. 120 genes de PZAase El alineamiento múltiple de aprox. 120 genes de PZAase secuenciados a partir de cepas “peruanas” sensibles y secuenciados a partir de cepas “peruanas” sensibles y

resistentes muestran una alta conservación de la región resistentes muestran una alta conservación de la región promotorapromotora

Región promotora

TATA Box

Start codon

Distribución de mutaciones ‘únicas’ halladas en el gen de PZAsa

Clonación y Purificación de Clonación y Purificación de PZAase H37RV y mutantesPZAase H37RV y mutantes

► Expresar el gen recombinante en E. coli.Expresar el gen recombinante en E. coli.► La clonación adiciona 6 His al extremo COO- La clonación adiciona 6 His al extremo COO-

de la enzima.de la enzima.► La purificación se realiza mediante La purificación se realiza mediante

Cromatografia de Afinidad por Columna de Cromatografia de Afinidad por Columna de Níquel. Níquel.

► Las His terminales se enlazan al Niquel. Las His terminales se enlazan al Niquel. Luego se realiza un lavado con solución de Luego se realiza un lavado con solución de imidazol.imidazol.

Purificación de la enzima Purificación de la enzima PZAsaPZAsa

Parámetros cinéticos y la Parámetros cinéticos y la actividad enzimática de PZAsas actividad enzimática de PZAsas

mutantesmutantes

Búsqueda de una explicación a nivel :

Estructura-Función !!!

► No existen cristales de PZAase de No existen cristales de PZAase de Mycobacterium tuberculosis.Mycobacterium tuberculosis.

► Se modelaron las estructuras utilizando el Se modelaron las estructuras utilizando el expassy server.expassy server.

► Buena homologia (37%).Buena homologia (37%).

- PZAase de - PZAase de Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis

- PZAase de - PZAase de Pyrococcus horikoshi (pdb 1IM5 )Pyrococcus horikoshi (pdb 1IM5 )► Disposicion espacial del backbone aceptable Disposicion espacial del backbone aceptable

(prochek).(prochek).

Análisis Estructural y Creación del

Modelo

PZAase de PZAase de Pirococcus horikoshii Pirococcus horikoshii pdb 1IM5pdb 1IM5

► Debido a la analogía entre la PZAase de Pyrococcus Debido a la analogía entre la PZAase de Pyrococcus horikoshii (PH999) y la de Mycobacterium horikoshii (PH999) y la de Mycobacterium tuberculosis; PH999 brinda las bases estructurales tuberculosis; PH999 brinda las bases estructurales para entender la resistencia a la PZA en para entender la resistencia a la PZA en Mycobacterium tuberculosis ocasionada por Mycobacterium tuberculosis ocasionada por mutaciones de PZAase.mutaciones de PZAase.

Sitio Activo de la PZAase de Sitio Activo de la PZAase de Pirococcus horikoshiiPirococcus horikoshii

Metaloenzima de Zinc N.C. 6 (2His, 1Asp,3H2O)

Anillo catalítico de la PZAsa de Anillo catalítico de la PZAsa de pyrococcus hirokoshii pyrococcus hirokoshii (Ala129, (Ala129,

Cys133, Lys94, Asp10)Cys133, Lys94, Asp10)

Mecanismo de Acción propuesto Mecanismo de Acción propuesto en PZAase de en PZAase de Pirococcus Pirococcus

horikoshiihorikoshii

Sitio activo “Anclaje” de la PZA

C133→D10 Transferencia protónica

1). Rxn C133→PZA 1° ataque nucleofílico

C de PZA sp2→sp3. O de PZA sp2→sp3

PZA unido covalentemente a PZAase.

D10 : protona a NH2 de PZA.D10 : protona a NH2 de PZA.

2). Rxn2). Rxn Se libera NHSe libera NH33. . O de PZA sp3→sp2O de PZA sp3→sp2

3). Rxn ZNOH→PZA 2° ataque nucleofílico

C de PZA sp2→sp3. O de PZA sp2→sp3

N.C. Zn de 6→5

4). Rxn H2O del medio N.C. Zn de 5→6

Protonación de D10

5). Rxn C-S de PZA desprotona D10

O de PZA sp2→sp3

Se libera ácido pirazinoico.

Se regenera la enzima

►En resumen :En resumen :

Dinámica Molecular por “Manual Dinámica Molecular por “Manual Bonding” - Bonding” - César Lopez & Mirko ZimicCésar Lopez & Mirko Zimic

► Las reacciones químicas no Las reacciones químicas no ocurren a 2D. Ocurren en 3D.ocurren a 2D. Ocurren en 3D.

► Se debe estudiar el mecanismo Se debe estudiar el mecanismo de reacción de reacción tridimensionalmente. “ En tridimensionalmente. “ En tiempo real ”.tiempo real ”.

► La Dinámica molecular nos La Dinámica molecular nos permite estudiar un proceso permite estudiar un proceso físico-químico en tiempo real físico-químico en tiempo real siempre y cuando no se formen siempre y cuando no se formen o rompan enlaces químicos o rompan enlaces químicos (tratamiento cuánticos muy (tratamiento cuánticos muy costosos).costosos).

Dinámica Molecular por “Manual Dinámica Molecular por “Manual Bonding” - GROMACSBonding” - GROMACS

► Propuesta :Propuesta : Realizar Dinámica Molecular a Realizar Dinámica Molecular a cada etapa de la reacción química.cada etapa de la reacción química.

► Cuando estemos ante una “inminente” Cuando estemos ante una “inminente” formación o ruptura de enlace químico formación o ruptura de enlace químico detenemos la dinámica.detenemos la dinámica. Distancias interatómicasDistancias interatómicas Ángulos interatómicos.Ángulos interatómicos. Energías de activaciónEnergías de activación

► Formamos el nuevo enlace “manualmente” Formamos el nuevo enlace “manualmente” y continuamos con la dinámica molecular.y continuamos con la dinámica molecular.

Dinámica Molecular por “Manual Dinámica Molecular por “Manual Bonding” - GROMACSBonding” - GROMACS

► LaLa PZA se “dockeo” a la PZAase empleando PZA se “dockeo” a la PZAase empleando el software AUTODOCK. el software AUTODOCK.

Localizacion de la Pyrazinamida en el sitio activo

Dinámica Molecular por “Manual Dinámica Molecular por “Manual Bonding”. Hidrólisis de PZA en PZAase Bonding”. Hidrólisis de PZA en PZAase

PH999PH999

Sitio activo

ResultadosResultados

► La PZA interacciona mediante puentes La PZA interacciona mediante puentes hidrógenos adicionales, no descritos por Du. hidrógenos adicionales, no descritos por Du. Parametrizarla en HParametrizarla en H22O.O.

► La PZA se estabiliza por interacciones La PZA se estabiliza por interacciones -stacking.-stacking.► Se corrobora el mecanismo general propuesto Se corrobora el mecanismo general propuesto

por Du, en la medida que cada una de las etapas por Du, en la medida que cada una de las etapas de las reacciones se muestran favorecidas por de las reacciones se muestran favorecidas por medio de distancias, orientaciones y energías medio de distancias, orientaciones y energías que se dan luego de los pasos de DM.que se dan luego de los pasos de DM.

ResultadosResultados

►La PZAsa sufre cambios La PZAsa sufre cambios conformacionales (reversibles y conformacionales (reversibles y prevalentes en ciertas zonas: alfa prevalentes en ciertas zonas: alfa helice entre el loop y el sitio de helice entre el loop y el sitio de coordinación del zinc).coordinación del zinc).

►Congruencia de la predicción de Congruencia de la predicción de Autodock con las predicciones de DM Autodock con las predicciones de DM de gromacs (la DM no 'mueve' mucho a de gromacs (la DM no 'mueve' mucho a la PZA del sitio que lo dejo Autodock). la PZA del sitio que lo dejo Autodock).

Aplicaciones del “Manual Aplicaciones del “Manual Bonding”Bonding”

►En el caso de enzimas mutantes con En el caso de enzimas mutantes con actividad nula confirmada actividad nula confirmada experimentalmente, se puede experimentalmente, se puede identificar el punto exacto en el que el identificar el punto exacto en el que el camino de hidrólisis se bloquea, camino de hidrólisis se bloquea, provocando la falta de hidrólisis de la provocando la falta de hidrólisis de la PZA.PZA.

Influencia del Zn en la Influencia del Zn en la estructura de PZAase de estructura de PZAase de

Pyrococcus horikoshiiPyrococcus horikoshii►RMSD de la enzima y de la apoenzima RMSD de la enzima y de la apoenzima

muy cercanos.muy cercanos.►Aumenta el valor del factor B. Da Aumenta el valor del factor B. Da

mayor estabilidad (disminuye el grado mayor estabilidad (disminuye el grado de movimiento).de movimiento).

►D52D52 y y H71H71 prácticamente no varían. prácticamente no varían. ¡¡ H54 H54 gira 180° !, de manera que se gira 180° !, de manera que se alcanza una estabilidad electrostática alcanza una estabilidad electrostática (rotámeros). Se produce un (rotámeros). Se produce un acercamiento entre estos 3 Aa.acercamiento entre estos 3 Aa.

Obtención del Modelo de PZAase Obtención del Modelo de PZAase de Mycobacterium Tuberculosis de Mycobacterium Tuberculosis

cepa h37rvcepa h37rv► Modelamiento por homología empleando la Modelamiento por homología empleando la

PZAase de PZAase de Pyrococcus horikoshiiPyrococcus horikoshii..► SwissModel serverSwissModel server..► Refinamiento estructural mediante Dinámica Refinamiento estructural mediante Dinámica

Molecular. Molecular.

► Cluster Linux - TcpLINDA de 24 PCsCluster Linux - TcpLINDA de 24 PCs (aula (aula interactiva)interactiva)

► Publicación Protein Data Bank : 1X8A.Publicación Protein Data Bank : 1X8A.

•Insight II (Accelerys Inc.)•Gaussian03 (Gaussian.com)•Gromos96 (BIOMOS) •Gromacs (H.Berendsen’s group)

Modelo de PZAase H37RV

PZAase PH999PZAase PH999

H37RV v.s. PH999H37RV v.s. PH999

Alineamiento Estructural Alineamiento Estructural de Pirazinamidasasde Pirazinamidasas

PZAsa Pyrococus Horikoshi

H37rv

Comparación del Sitio ActivoComparación del Sitio Activo

Influencia del Zn en la Influencia del Zn en la estructura de PZAase de estructura de PZAase de

Pyrococcus horikoshiiPyrococcus horikoshii► Zn presenta Zn presenta

un rol un rol CATALÍTICO, CATALÍTICO, no no estructural; estructural; es decir no es decir no modifica en modifica en gran medida gran medida la estructura la estructura de la de la PZAase.PZAase.

Reducción de la actividad de la Reducción de la actividad de la PZAase H37RV por el efecto de PZAase H37RV por el efecto de

una quelación con EDTAuna quelación con EDTAIncubacion con EDTA por 6 horas ph=8

tiempo 0control 6H 10mM EDTA 20mM EDTA

40mM EDTA

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

1 2 3 4 5

OD

EDTA, 6horas, pH=8

Quelación de la PZAase Quelación de la PZAase H37RVH37RV

Incubacion con EDTA por 6 horas ph=6.45

tiempo 0 control 6H

10mM EDTA20mM EDTA

40mM EDTA

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

1 2 3 4 5

OD

EDTA, 6horas, pH=6.45

Incubacion con EDTA por 24 horas ph=6.45

Tiempo 0

Control 24H

10mM EDTA 20mM EDTA10mM EDTA

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

1 2 3 4 5

OD

EL EDTA disminuye la actividad.

→ Muy probablemente ocurre la quelación de la metaloenzima.

Un ion metálico es importante en el mecanismo de acción de la PZAase H37RV. Cuál???

Reactivación de la PZAsa H37RV Reactivación de la PZAsa H37RV quelada mediante de la adición de quelada mediante de la adición de

ionesiones

Porcentaje de actividad (No qx-100%)- t rxn 3 min

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

180.00

200.00

noquelada

quelada ylavada

Ca Cd Co Cu Fe2+ Fe3+ Mg Mn Zn

%

iones 1mM iones 0.1mM iones 0.1mM

►No necesariamente el ion que mejor activa es el No necesariamente el ion que mejor activa es el que se encuentra en la proteína (p.Ejem. Coque se encuentra en la proteína (p.Ejem. Co+2+2 y y ZnZn+2+2). Se relaciona con la abundancia del elemento ). Se relaciona con la abundancia del elemento en la naturaleza.en la naturaleza.

►Se necesitan pruebas experimentales más directas Se necesitan pruebas experimentales más directas : :

- - Absorción Atómica (UNI)Absorción Atómica (UNI)-- Fluoresencia de Rayos X (IPEN) Fluoresencia de Rayos X (IPEN)

Determinación de Zinc en Determinación de Zinc en PZAase H37R por PZAase H37R por

Espectroscopía de Absorción Espectroscopía de Absorción AtómicaAtómica

► Quim. Cristhian Jacinto. Quim. Cristhian Jacinto. Dpto. Qúimica, UNI Dpto. Qúimica, UNI

► Equipo Equipo : : Perkin Elmer Perkin Elmer Precisely Aanalyst 200 Precisely Aanalyst 200 Atomic Absorption Atomic Absorption Spectrometer. Spectrometer.

► Lámpara de Zinc.Lámpara de Zinc. ► Método de Adición Método de Adición

EstándarEstándar

Determinación de Zinc en Determinación de Zinc en PZAase H37R por PZAase H37R por

Espectroscopía de Absorción Espectroscopía de Absorción AtómicaAtómica

•Estos métodos se basan en la obtención de espectros de emisión de la muestra ‘atomizada’ mediante la excitación de arcos eléctricos o chispas eléctricas.

•Estos espectros permiten la determinación cuantitativa de elementos metálicos.

•En las fuentes de arco y chispa la excitación de la muestra se produce en el pequeño espacio existente en un par de electrodos.

Adicion estandar

y = 0,03726x + 0,00423

R2 = 0,95627

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

-1 1 3 5 7

ug de Zn agregado

Ab

so

rba

nc

ia

►No se detecto Zinc.No se detecto Zinc.

Determinación de Zinc en Determinación de Zinc en PZAase H37R por PZAase H37R por

Espectroscopía de Absorción Espectroscopía de Absorción AtómicaAtómica

Determinación Metálica en Determinación Metálica en PZAase H37R por PZAase H37R por

Espectrometría de Fluorescencia Espectrometría de Fluorescencia de Rayos Xde Rayos X

► Fís. Dr. José Solis (UNI-IPEN)Fís. Dr. José Solis (UNI-IPEN)► Equipo Equipo : : EPSILON5 de EPSILON5 de

Panalytical Panalytical ► Excitación por R-X deExcitación por R-X de los los

electrones internos y su electrones internos y su posterior decaimientoposterior decaimiento

► El espectro fluorescente de El espectro fluorescente de decaimiento es característico decaimiento es característico para cada átomopara cada átomo

► Es un análisis NO-destructivoEs un análisis NO-destructivo

Determinación Metálica en PZAase Determinación Metálica en PZAase H37R por Espectrometría de H37R por Espectrometría de

Fluorescencia de Rayos XFluorescencia de Rayos X

•Este método se basa en la excitación de los electrones más internos por medio de Rayos X.•El decaimiento de estos electrones obedece a un proceso de fluorescencia generando un patrón único y típico de cada átomo.

►Se detecto NiSe detecto Ni+2+2, Fe, Fe+3+3 y Pb y Pb+2+2..

Determinación Metálica en PZAase H37R Determinación Metálica en PZAase H37R por Espectrometría de Fluorescencia de por Espectrometría de Fluorescencia de

Rayos XRayos X

CONCLUSIÓN GENERAL : El Co CONCLUSIÓN GENERAL : El Co reactiva en 1° lugar; 2° el Zn; y 3° el reactiva en 1° lugar; 2° el Zn; y 3° el

Fe+3.Fe+3.Medio de Expresión : Medio de Expresión : E. ColiE. Coli

Porcentaje de actividad (No qx-100%)- t rxn 3 min

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

180.00

200.00

noquelada

quelada ylavada

Ca Cd Co Cu Fe2+ Fe3+ Mg Mn Zn

%

iones 1mM iones 0.1mM iones 0.1mM

Química BioinorgánciaQuímica Bioinorgáncia

►Es el estudio de los sistemas inorgánicos Es el estudio de los sistemas inorgánicos en los seres vivos.en los seres vivos.

►Debemos entender por sistemas Debemos entender por sistemas inorgánicos a todos los elementos y inorgánicos a todos los elementos y compuestos que habitualmente son parte compuestos que habitualmente son parte del estudio de la química inorgánica.del estudio de la química inorgánica.

►Enfasis en Metaloenzimas (Hemoglobina Enfasis en Metaloenzimas (Hemoglobina Fe; Clorofila Mg; Vitamina 12 CoFe; Clorofila Mg; Vitamina 12 Co

Interacción de Iones Metálicos con Interacción de Iones Metálicos con ProteínasProteínas

► Interacciones tienen lugar en sitios Interacciones tienen lugar en sitios específicos de las cadenas proteicas (restos específicos de las cadenas proteicas (restos de aminoácidos). Algunas veces el O del de aminoácidos). Algunas veces el O del anillo peptídico ( grupo amida ) refuerza la anillo peptídico ( grupo amida ) refuerza la coordinación.coordinación.

► Los ligantes más frecuentes son los grupos:Los ligantes más frecuentes son los grupos:

N:

HN

H2C CH2 CH2 C

O-

O

CH2 S

O-CH2

CH2 CH2 S CH3

Imidazol(His, H)

Tiolato(Cys, C)

Carboxilato(Glu G,Asp A)

TioéterMet, M)

Fenolato(Tyr, Y)

Interacción de Iones Metálicos con Interacción de Iones Metálicos con ProteínasProteínas

► La esfera de coordinación que las proteínas La esfera de coordinación que las proteínas generan alrededor del ión metálico, presenta generan alrededor del ión metálico, presenta geometría irregular.geometría irregular.

► Diferente a los ligantes monodentados, el ión Diferente a los ligantes monodentados, el ión metálico no puede organizar a su alrededor la metálico no puede organizar a su alrededor la esfera de coordinación, tiene que adaptarse al esfera de coordinación, tiene que adaptarse al entorno que le ofrece la proteína.entorno que le ofrece la proteína.

► La propia estructura de la proteína determina el La propia estructura de la proteína determina el número y la orientación espacial de los grupos número y la orientación espacial de los grupos dadores que pueden unirse al metal. Rol dadores que pueden unirse al metal. Rol Catalítico.Catalítico.

NH

CH2

H O

SM

NH

CH2

H O

SMM

M

NH

CH2

H O

NH

N

M

NH

CH2

H O

N

NH

Cys-M Cys-M2 His-M His-M

M

NH

CH2

H O

COO

M

NH

CH2

H O

COO

M M

NH

CH2

H O

COO

Asp-M(monodentado)

Asp-M(puente,quelante)

Asp-M(puente,bidentado)

*Se forman estruturas semejantes con el Glu

SCH3M

NH

CH2

H O

CH2

M

NH

CH2

H O

O

Met-Me Tyr-M

Base de Datos Metalo-Base de Datos Metalo-ProteínasProteínas

Residuos coordinantes 2 ó Residuos coordinantes 2 ó 33

Nótese el patrón No 1Asp – His – His = 19

Residuos coordinantes 2 ó Residuos coordinantes 2 ó 33

Ahora nótese el patrón No 3Asp – His = 28 ocurrencias

Distancias de coordinaciónDistancias de coordinación

Distancias de coordinaciónDistancias de coordinación

Interacción de Iones Metálicos con Interacción de Iones Metálicos con ProteínasProteínas

►→→→→Si se cuenta con la estructura de una Si se cuenta con la estructura de una apoenzima se puede predecir mediante criterios apoenzima se puede predecir mediante criterios geométricos cuántos potenciales sitios de geométricos cuántos potenciales sitios de coordinación presentaría. Script en PERL. coordinación presentaría. Script en PERL.

Carboxipeptidasa Zn; Anhidrasa carbónica Zn; Carboxipeptidasa Zn; Anhidrasa carbónica Zn; Plastocianina Cu; etc. Plastocianina Cu; etc. Metaloenzimas Metaloenzimas mononucleares, en donde el ion es el único mononucleares, en donde el ion es el único cofactor.cofactor.

► Aplicaremos lo anterior a nuestro modelo de Aplicaremos lo anterior a nuestro modelo de PZAase H37RV.PZAase H37RV.

►PZAas H37RV presenta 2 potenciales PZAas H37RV presenta 2 potenciales sitios de coordinación :sitios de coordinación :

►HIS51HIS51 (ND1), (ND1), HIS71HIS71( NE2), TYR64(OH), ( NE2), TYR64(OH), ASP49ASP49 ( OD1 y O ). ( OD1 y O ).

►TYR41(OH), HIS43(ND1), ASP86 (OD1), TYR41(OH), HIS43(ND1), ASP86 (OD1), SER88(OG).SER88(OG).

Cristalización de PZAaseCristalización de PZAase

► En UPCH estudiamos las En UPCH estudiamos las condiciones de precristalización.condiciones de precristalización.

► En “Hampton-Woodward” En “Hampton-Woodward” Medical Institute, University of Medical Institute, University of Buffalo NY. USA. (Dr. Willliam Buffalo NY. USA. (Dr. Willliam Duax)Duax)

automatizadamente se automatizadamente se estudiaron estudiaron 1536 condiciones 1536 condiciones distintas de cristalización.distintas de cristalización.

► Se obtuvieron fotos de Se obtuvieron fotos de crecimiento de microcristales.crecimiento de microcristales.

► Es probable que el cristal Es probable que el cristal difracte rayos xdifracte rayos x

http://www.hwi.buffalo.edu/http://www.hwi.buffalo.edu/

► El crecimiento de El crecimiento de cristales se realizará en cristales se realizará en UPCHUPCH

► El análisis de difracción El análisis de difracción se planea realizar en se planea realizar en las facilides de las facilides de Radiación Sincrotrón en Radiación Sincrotrón en Campinas, Sao Paulo, Campinas, Sao Paulo, Brazil.Brazil.

Buffer de control 4 semanas

PZAase 1semana

PZAase 3semana

PZAase 2 semanas

►Mejorar el modelo de la PZAase H37RV. Mejorar el modelo de la PZAase H37RV. ( Ion ).( Ion ).

►Cristalizar PZAase H37RV y obtener su Cristalizar PZAase H37RV y obtener su estructura.estructura.

►Proponer un mecanismo de reacción y Proponer un mecanismo de reacción y contrastarlo con DM por “Manual Bonding” a contrastarlo con DM por “Manual Bonding” a PZAase H37RV.PZAase H37RV.

►Estudiar por qué PZAases de ciertas cepas Estudiar por qué PZAases de ciertas cepas resistentes son NO-funcionalesresistentes son NO-funcionales

►Estandarizar y validar la determinación del Estandarizar y validar la determinación del contenido metálico en potenciales contenido metálico en potenciales metaloenzimas mediante Fluorescencia de metaloenzimas mediante Fluorescencia de rayos X.rayos X.

Futuros trabajosFuturos trabajos

►Reactivar a la cepa mutante D49N. Cepa Reactivar a la cepa mutante D49N. Cepa muy importante por su alta prevalencia en la muy importante por su alta prevalencia en la población peruana TB-VIH.población peruana TB-VIH.

►OBJETIVO GLOBAL : Mejorar la PZA.OBJETIVO GLOBAL : Mejorar la PZA.Es una prodroga.Es una prodroga.G críticoG crítico ni muy alto (+) ni muy bajo (-). ni muy alto (+) ni muy bajo (-).Problema estructural a nivel atómico.Problema estructural a nivel atómico.

Futuros trabajosFuturos trabajos

Laboratorio de Bioinformática:Laboratorio de Bioinformática:

César LópezCésar LópezWilfredo EvangelistaWilfredo EvangelistaJun Sotelo Jun Sotelo Daniel GuerraDaniel GuerraMirko ZimicMirko Zimic

Laboratorio de Enfermedades Infecciosas:Laboratorio de Enfermedades Infecciosas:Patricia FerrerPatricia FerrerJon LópezJon LópezPatricia SheenPatricia Sheen

Miembros del EquipoMiembros del Equipo