Canales de iones

8 de abril 2010

http://einstein.ciencias.uchile.cl/CURSOS_2010 FISIOLOGIA GENERAL

En los trabajos prácticos de los días lunes se usará programas Excel que están junto con la guía correspondiente en http://einstein.ciencias.uchile.cl.

El trabajo práctico lo pueden desarrollar en la sala de computación del Edificio G que estará disponible los días lunes entre las 14:30 y las 18 horas en forma exclusiva para este curso, y con apoyo de los ayudantes. Pero lo pueden desarrollar en cualquier momento durante la semana y en cualquier computador que tenga acceso a la red.

Los estudiantes trabajarán en grupos de 4 personas

La ejecución del trabajo práctico es obligatoria y se controlará por la entrega de un informe por cada grupo de trabajo.

El informe se debe redactar en un documento legible bajo MS Word (.doc o .docx) comprimido (.zip o .rar) que se debe enviar como adjunto a una carta electrónica dirigida a fisigral@gmail.com, antes de las 23:59:59 del lunes siguiente de la fecha del trabajo práctico.

Se recomienda que el nombre al archivo contenga claves que lo identifique con los integrantes del grupo.

Proyecto escolar Telégrafo

Estudio de canales de iones

incorporados en membrana

artificiales hechas de fosfolípidos.

Los canales de iones tiene dos estados, abierto y cerrado: conductor y no-conductor. Tal como el interruptor del telégrafo

Fosfolípidos

Fosfatidil colina, PC

Fosfatidil etanolamina, PE

Fosfatidil serina, PS

Fosfatidil inositol, PI

Estudio de canales de iones incorporados en membrana

artificiales hechas de fosfolípidos.

Un poco de estructura.

Fosfolípidos

Fosfatidil colina, PC

DPPC = Di Palmitoleoyl Phosophatidyl Choline

Fosfatidil serina, PS

Fosfolípidos

Fosfatidil etanolamina, PE

Fosfolípidos

Fosfatidil inositol, PI

Fosfolípidos

A diagonal molecular slab from the DPPC lipid bilayer simulation1; color scheme: PO4 - green, N(CH3)3 - violet, water - blue, terminal CH3 - yellow, O - red, glycol C - brown, chain C - grey. Image taken from a research page of Dr. Richard W. Pastor. (NIH)

250 m

KCl 100mM

KCl 1M KCl 1M

Experimentos en membranas bicapas de lípidos

La membrana se forma pincelando en la perforación una solución de fosfolípidos en decano.

El proceso de formación de la bicapa se observa con una lupa y midiendo la capacidad eléctrica.

SeparaciónPerforación

Ag/AgClAg/AgClKCl 100mM

¿Cómo se puede medir la capacidad eléctrica?

V V V

Vóltmetro de 10 k Vóltmetro de 100 k Vóltmetro de 1 M

Vóltmetro ideal debe tener resistencia infinita

Ampérmetro ideal debe tener resistencia cero

A A A

Ampérmetro de 10 k Ampérmetro de 1 k Ampérmetro de 100

0.50 V 0.91 V 0.99 V

0.050 mA 0.091 mA 0.099 mA

+

-

o VVAVO

510A

OO VVAV

AVAVV OO

VVO

VVEsto se cumple para todo circuito con realimentación negativa

Vóltmetro idealRealimentación negativa,negative feedback

Ganancia 1

+

-

o VVAVO

510A

f

O

R

VVI

I

Rf VV

f

O

R

VI

0

fO IRV

Ampérmetro

0V

Para cualquier intensidad de corriente. Resistencia = 0: ampérmetro ideal

Membrana

Vm

Generador de ondas

Osciloscopio

Rf Vo = -IRf

Rf = 109 Ohm = 1 G

Vm -IRf

0

dt

dVC

R

VI m

mm

m Tiempo 2 ms / división

Potencial: 100 mV / división 5 V / división

MembranaVm

-IRf

Generador de ondas

Osciloscopio

Rf

250 m

dt

dVC

R

VI m

mm

m Tiempo 2 ms / división

Potencial: 100 mV / división 5 V / división

MembranaVm

-IRf

Generador de ondas

Osciloscopio

Rf

IRfVo RfVo

I

910

10VI AI 810

dt

dVC

R

VI m

mm

m I

VR m

m

MAV

Rm 101010

8

1

dt

dVC

R

VI m

mm

m Tiempo 2 ms / división

Potencial: 100 mV / división 5 V / división

MembranaVm

-IRf

Generador de ondas

Osciloscopio

Rf

Tiempo 2 ms / división

Potencial: 100 mV / división 5 V / división

MembranaVm

-IRf

Generador de ondas

Osciloscopio

Rf

IRfVo RfVo

I

910

4VI AI 9104

dt

dVC

R

VI m

mm

m t

V

dt

dV mm

V/s405

195 ms

mVdt

dVm

100pFF10V/s 40

A104 109

mC

12 de abril 2010

Canales de iones

En los trabajos prácticos de los días lunes se usará programas Excel que están junto con la guía correspondiente en http://einstein.ciencias.uchile.cl.

El trabajo práctico lo pueden desarrollar en la sala de computación del Edificio G que estará disponible los días lunes entre las 14:30 y las 18 horas en forma exclusiva para este curso, y con apoyo de los ayudantes. Pero lo pueden desarrollar en cualquier momento durante la semana y en cualquier computador que tenga acceso a la red.

Los estudiantes trabajarán en grupos de 4 personas

La ejecución del trabajo práctico es obligatoria y se controlará por la entrega de un informe por cada grupo de trabajo.

El informe se debe redactar en un documento legible bajo MS Word (.doc o .docx) comprimido (.zip o .rar) que se debe enviar como adjunto a una carta electrónica dirigida a fisigral@gmail.com, antes de las 23:59:59 del lunes siguiente de la fecha del trabajo práctico.

Se recomienda que el nombre al archivo contenga claves que lo identifique con los integrantes del grupo.

100mM KCl

100mM KCl

KCl 1M KCl 1M

Experimentos en membranas bicapas de lípidos

SeparaciónPerforación

Ag/AgClAg/AgCl

Vm

Im

Vm es la variable que se controlaIm es la variable que se mide

0

En la membrana pondremos muy pocos canales. La intensidad de la corriente será muy baja por lo que esperamos que las reacciones en los electrodos estén muy cerca del equilibrio.

AI 9104

dt

dVC

R

VI m

mm

m t

V

dt

dV mm

V/s405

6.193

ms

mV

dt

dVm

100pFF10V/s 40

A104 109

mC

Corriente, -10-9 amper/volt

Voltaje

Canal B, salida del ampérmetro = 4 volt de sensibilidad -10-9 A/V

T1 T2

Canal B, voltaje.

Incorporación de canales a la bicapa

V = 100mVIntensidad de corriente a V=100mV, KCl 100mM / KCl 100mM

Incorporación de canales a la bicapa

V = 100mV

pS 500V 0.1

pA 50 gConductancia de

1 canal, g:

Intensidad de corriente a V=100mV, KCl 100mM / KCl 100mM

90mV

70mV

50mV

30mV

10mV

Corriente de 1 canal a KCl 100 mM/KCl 100mM

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100

Voltaje, mV

Co

rrie

nte

eve

nto

, p

A

Corriente del canal abierto a diferentes voltajes.

)( iVVgi

pS 500 Volt 0.8

pA40g

mV 0iV

Con esta observación comprobamos esta suposición: iVVgi Con comprobación sólo vale para estos canales y hay que comprobarla para cada canal que estudiemos.

im VV

ig

90mV

70mV

50mV

30mV

10mV

Corriente de 1 canal a KCl 100 mM/KCl 100mM

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100

Voltaje, mV

Co

rrie

nte

pro

me

dio

, p

ACorriente promedio de 1 canal en a diferentes voltajes.

)( iVVgi

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100

Voltaje, mV

Co

rrie

nte

pro

med

io,

pA

)( im VVgi

La conductancia de la membrana es función del potencial eléctrico, Vm

Conductancia cuerda im VV

ig

0

100

200

300

400

500

600

0 20 40 60 80 100

Voltaje, mV

Co

nd

uct

anci

a, p

S

Conductancia promedio del canal a diferentes voltajes.

)50(1.01

1500

mVe

g

)/( im VVig

¿Cómo explicar que la conductancia dependa del potencial?

90mV

70mV

50mV

30mV

10mV

Corriente de 1 canal en KCl 100 mM/KCl 100mM

Cálculo del promedio de la corriente.

Si sólo se dan dos clases de resultados:i1 = 0 con una probabilidad q yi2 = i con una probabilidad p = 1-q:

k

kkipi

ipipqi 0

La corriente promedio para una membrana con N canales con corriente unitaria i es:

NipI

Es la suma de cada valor de corriente ik multiplicado por la probabilidad de cada valor pk

Cálculo de la varianza de la corriente

k

kk iipI

22

Si sólo se dan dos clases de resultados:i1 = 0 con una probabilidad q yi2 = i con una probabilidad p = 1-q, y el promedio es ip.

pipiqipI222 0

ppqpiI2222 )1( pqqpiI

2222

pqiqppqiI222

Demostrar que para una membrana con 2 canales la varianza es:

pqiI22 2

Demostrar que para una membrana con N canales la varianza es:

pqNiI22

Es la suma de los cuadrados de la diferencia entre cada valor y el promedio multiplicado por la probabilidad de cada valor pk

NipI pqNiI22

im VV

ig

NgpG pqNgG22

Intensidad de la corriente y su varianza para una membrana con N canales

Conductancia y su varianza para una membrana con N canales

ppNgG 122

2222 pNgpNgG N

GgGG

22

GN

gdG

d G 22

gdG

d

G

G

0

2

lim

GNg 2En el máximo de la parábola se cumple que

2

maxGG ?lim

2

maxGG

G

dG

d

Parábola

OgPg

cerradoabierto

abierto

tt

tP

0

abierto canal el encontrar de adProbabilid

abierto canal del iaConductanc

promedio iaConductanc

===

P0

g

g

cerradoabierto

abiertoO nn

nP

Historia de 1 canal en el tiempo.

Fotografía instantánea de muchos canales.

Si las dos determinaciones de Po dan el mismo resultado entonces el sistema es ergódico

cerradoabierto

abierto

tt

tP

0

cerradoabierto

abiertoO tt

tP

cerradoabierto

abiertoO nn

nP

abierto

cerradoO

tt

P

1

1

abierto

cerradoO

nn

P

1

1

K = Constante de equilibrio

Abierto Cerrado

KPO

1

1

Como Po depende del potencial eléctrico, constante de equilibrio, K, debe depender del potencial eléctrico. La llamamos entonces KV

Extracelular

Intracelular

Bicapa

Estructura de los canales de K dependientes de voltaje.

S1

S3a

S6

Doyle et al 1998 Science 280:69-77. Jiang et al 2003 Nature 423:33-41. (Temas de seminario)

Estructura de los canales de K dependientes de voltaje.

1

2 3

45

6

Jiang et al 2002 Nature 417:515-522. Jiang et al 2002 Nature 417:523-526. Jiang et al 2003 Nature 423:33-41. Jiang et al 2003 Nature 423:42-48.Long et al 2007 Nature 450:376-383.

Más detalles estructurales en (tema de seminario):

15 de Abril de 2010

Canales activados por voltaje

+ +

+ +

Vm = +60 mV Vm = -60 mV

Posible movimiento del segmento S4 impulsado por las diferencias de potencial eléctrico.

Despolarizar

Hiperpolarizar

Compuerta abierta Compuerta cerrada

Filtro de selectividad ( Na+, K+, Ca2+ )

Papers para seminarios sobre este punto:Aggarwal y MacKinnon. (1996) Neuron 16, 1169–1177.Larsson, et al 1996. (1996) Neuron, 16, 387–397.Ahern y Horn 2004 TINS 27:303-307.

V0 = 0 V0 = 0

CerradoAbierto

+ +

+ +V0 = 0

Vi = Vm

+ +

+ +

CerradoAbierto

mol

joule

n

G

inPTii

,,

Potencial químico del componente i = cambio de la energía libre del sistema al agregar 1 mol del componente i a temperatura, presión, y el número de moles de los otros componentes constantes.

CerradoAbierto

mabierto

cerrado zFVn

nRT ln0

+ +

+ +V0 = 0

Vi = Vm

abiertocerrado

abiertoabiertoabierto nn

nRT

ln0

+ +

+ +

mabiertocerrado

cerradocerradocerrado zFV

nn

nRT

ln0

CerradoAbierto

abiertocerrado 0000 abiertocerrado

CerradoAbierto

mabierto

cerrado zFVn

nRT ln0

+ +

+ +V0 = 0

Vi = Vm

En equilibrio, = 0

m

eqabierto

cerrado zFVn

nRT

ln0 0

mV zFVKRT ln0 0

En equilibrio, = 0

mV zFVKRT ln0 0)(ln 0

mV zFVKRT RTzFV

VmeK /)( 0

¿A que Vm se encuentra ncerrado = nabierto, Kv = 1?

000 zFV 0

0 zFV

RT

VVzFRTzFVzFV

V

m

m eeK)(

/)(0

0

RT

VVzF m

e

P )(0 0

1

1

RT

VVzF mgg )( 0

exp1

1

RT

VVzF mP )(0 0

exp1

1

0gPg

0

100

200

300

400

500

600

0 20 40 60 80 100

Voltaje, mV

Co

nd

uct

anci

a, p

S

)50(1.01

1500

mVe

g

RT

VVzF

e

gg )( 0

1

1

)50(1.01

500

Ve

g

)(V 001 (mV) 1.0 1-1- RTzF

mV 500 V

ol)(coulomb/m 96500

(K) 298 K) (J/mol 31.8)V(100

100 1-FRT

z

)V(0.025 )V(100 -1z

5.2z

Significado de la valencia z.

Al aplicar un potencial positivo el canal se abre.

La apertura de un mol de canales implica una disminución de la energía libre. Una carga de 2.5 veces el número de Faraday (zF) se mueve desde un lugar en que el potencial es Vm (positivo) a otro en que el potencial es 0.

+ +

+ +

Vm = +60 mV

Vo = 0 mV

Significado de la valencia z.

Al aplicar un potencial negativo el canal se cierra.

El cierre de un mol de canales implica una disminución de la energía libre. Una carga de 2.5 veces el Número de Faraday (zF) se mueve desde un lugar en que el potencial es 0 a otro en que el potencial es Vm (negativo).

+ +

+ +

Vm = -60 mV

Vo = 0 mV

¿Cómo se entiende que no sea un número entero?

Significado del producto zV0.

El producto zV0 es una medida de la diferencia de potencial químico estándar entre el estado cerrado y el abierto.

00 zFV

kJ/mol 12 J/mol 0.05 96500 5.20

Estos canales están cerrados a Vm = 0

Para abrirlos en un 50% se necesita entregar 12 kJ/mol.

Cinética

Ya estudiamos la probabilidad de encontrar un canal abierto en función de la diferencia de potencial a través de la membrana.

Ahora estudiaremos la probabilidad de encontrar un canal abierto en función del tiempo.

CerradoAbierto

+ +

+ +V0 = 0

Vi = Vm

Abierto Cerrado

Este equilibrio depende de Vm, por lo tanto , , o ambas, deben ser funciones de Vm

El modelo de dos estados

El modelo de dos estados

Abierto Cerrado

Probabilidad por unidad de tiempo que se abra un canal cerrado. (s-1)

Probabilidad por unidad de tiempo que se cierre un canal abierto (s-1)

Po(t) Probabilidad de encontrar el canal abierto a un tiempo t.

)(1)()(

tPotPodt

tdPo

)(1)()(

tPotPodt

tdPo

)()(

tPodt

tdPo

)()( tPotx

)()(1

txdt

tdx

dt

tdPodt

tdx )()(

0)()(1

tx

dttdx

011

tcetx

La constante c se determina para t = 0 cx )0( textx )0()(

Determinamos que para t ∞ x(∞) = 0

0)()( Pox

)(Po

)()(

txdt

tdPo

textx )0()(

tePotPo 0

)(Po

tePotPo 0

tePoPoPotPo 0

/0 tePoPoPotPo

1

)()( tPotx

/0 tePoPoPotPo

Calcular Po(t) para Po(0)=1 y Po(∞)=0Calcular Po(t) para Po(0)=0 y Po(∞)=1

/0 tePoPoPoitiPoi

Cálculo de a y b a partir de Po() y t

)(Po

1

)(Po

)(1 Po

¿Qué nos enseña el análisis de la duración de los eventos

abiertos y cerrados?

90mV

70mV

50mV

30mV

10mV

Corriente de 1 canal a KCl 100 mM/KCl 100mM

)(Po

/)()0()()( tePoPoPotPo

1

El canal se cierra para nunca más abrirse, entonces Po() = 0, = 0 y = -1

tt ep

)(

El canal está abierto a tiempo cero, entonces Po(0) = 1.

La probabilidad que un canal abierto a tiempo cero siga abierto a tiempo t es p(>t).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 50 100

Tiempo, segundos

Probabilidad que un canal abierto dure al menos un tiempo t sin cerrarse.

t

t ep

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0 50 100

Tiempo, segundos

Función de densidad de probabilidad.

tt edt

dp

Área = 1

La probabilidad que un canal abierto a t = 0 dure un tiempo entre t y t+dt es be-btdt

Cálculo de la duración promedio de los eventos.

00dttedtett tt

abierto

1

abiertot1

cerradot

Se puede calcular as constantes y midiendo la duración promedio de los eventos cerrados y abiertos.

12

axa

edxxe

axax

02 1tet tabierto

0

1

tabierto et

t

¿Cómo cambian con el voltaje las constates

a y b?.

Vextracelular = 0

Vintracelular = Vm

+ +

+ +

Abierto Cerrado

Tránsito del estado abierto al cerrado pasa por un estado activado “a medio camino” entre el inicial y el final:

La carga se mueve desde un potencial 0 hasta un lugar en que el potencial es una fracción x de Vm:

La energía de activación del proceso es:

mcaca xzFVGG *,0

*

*caG

xVm

+ +

+ +

Abierto Cerrado

Tránsito del estado cerrado al abierto pasa por un estado activado “a medio camino” entre el inicial y el final:

La carga se mueve desde un potencial Vm hasta un lugar en que el potencial es una fracción x de Vm:

La energía de activación del proceso es:

mmacac zFVxzFVGG *,0

*

macac zFVxGG 1*,0

*

xVm

Vextracelular = 0

Vintracelular = Vm

Extracelular Intracelular

CerradoAbierto

0 mV

0 mV

0 mV

mcaca xzFVGG *,0

*

G Jmol-1

Extracelular Intracelular

mcaca xzFVGG *,0

*0 mV

Vm mV

0 mV

xVm mV

0 mVCerradoAbierto

G Jmol-1

Extracelular Intracelular

0 mV

0 mV

0 mV

mmacac zFVxzFVGG *,0

*

CerradoAbierto

G Jmol-1

Extracelular Intracelular

0 mV

Vm mV

0 mV

xVm mV

0 mVCerradoAbierto

mmacac zFVxzFVGG *,0

*

G Jmol-1

Extracelular Intracelular

0 mV

Vm mV

0 mV

xVm mV

0 mVCerradoAbierto

macac zFVxGG 1*,0

*

G Jmol-1

mcaca xzFVGG *,0

*

macac zFVxGG )1(*,0

*

La constante cinética de la transición de abierto a cerrado es .

RTxzFVG mcae /*,0

RTzFVxG mace /)1(*,0

La constante cinética de la transición de cerrado a abierto es .

mcaca xzFVGG *,0

*

macac zFVxGG 1*,0

*

Hay un potencial al cual se igualan la energías de activación y por lo tanto las constantes cinéticas

0*,00

*,0 1 zFVxGxzFVG acca

La dos constantes cinéticas para V = V0 son iguales y la llamamos 0 = 0

RTxzFVG cae /0

0*

,0 RTzFVxG ace /)1(

00

*,0

Suponiendo de los factores de proporcionalidad son todos iguales podemos escribir .

RTxzFVG

RTxzFVG

ca

mca

e

e/

/

00

*,0

*,0

RTVVxzF me /(0

0

RTzFVxG

RTzFVxG

ac

mac

e

e/)1(

/)1(

00

*,0

*,0

RTVVzFx me /)()1(0

0

RTVVxzF me /)(0

0

RTVmVxzFRTVmVzFx ee /)0(/)0()1(0

1

RTVVzFx me /)(10

0

En la función Po no aparece x.

RTVmVzFRTVmVzF ee 2/)0(2/)0(0

1

0

0

22/)(sech

RTVVzF m

xx eex

2sech

RT

VVzF m

e

P )(0 0

1

1

Para el caso x = 0.5

))(()( imo VVtNgPtI

Fin.