CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y ULTRAESTRUCTURALES DE CIGOTOS Y EMBRIONES ANORMALES TRAS FIV /...

F O R M A C I Ó N C O N T I N U A D A

M. Boada y M. Ponsá. Características morfológicas y ultraestructurales de cigotos y embriones anormales tras FIV/ICSI.

La valoración de los ovocitosinseminados in vitro a las 16-22 horaspost inseminación es el procedimientocomúnmente aceptado para evaluar lafecundación. No obstante, en ovocitosinseminados por microinyecciónespermática (ICSI) la formación depronúcleos acostumbra a ser másrápida por lo que este periodo suelerestringirse a las 16-19 horas postinseminación para evitar unaobservación excesivamente tardía en laque los pronúcleos ya hayan empezadoa desaparecer (ASEBIR, 2008).

Si bien la observación de dospronúcleos más o menos centrados enel interior del citoplasma y dos

corpúsculos polares en el espacioperivitelino (2PN+2CP), al día siguientede la inseminación (D+1), se considerael estado correspondiente a unacorrecta fecundación, existen otrassituaciones con las que podemosencontrarnos generalmente comoconsecuencia de procesos erróneos.Una activación partenogenética delovocito, la polipenetración por parte demás de un espermatozoide o unareactivación anómala de la meiosis quecomporte alteraciones en los procesosde formación de los pronúcleos y/o enla extrusión del segundo corpúsculopolar pueden originar situaciones queen la mayoría de los casos se considerananómalas y en consecuencia, cigotos

y/o embriones no transferibles quedeben ser descartados (ASEBIR, 2008).

CIGOTOS ANORMALES (D+1) 3PN+2CP

Generalmente el estado de 3PN+2CP se produce en la inseminaciónmediante FIV convencional y el origensuele ser masculino (diándrico) comoconsecuencia de la fecundación porparte de dos espermatozoides(dispermia). La polipenetración pormás de dos espermatozoides es menosfrecuente pero también puedeproducirse cuando el fallo en el bloqueocontra la polispermia ha sido mayor(>3PN+2CP). Las causas de lapolipenetración tanto pueden ser por

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y ULTRAESTRUCTURALESDE CIGOTOS Y EMBRIONES ANORMALES TRAS FIV / ICSIMorphological and ultraestructural characteristics of abnormal zygotes andcleavage embryos after IVF / ICSI

M.Boada (1), M. Ponsà (2) (1) Servicio de Medicina de la Reproducción. Departamento de Obstetricia y Ginecología. Institut Universitari Dexeus(2) Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología. Universitat Autònoma de Barcelona. Dirección para correspondencia: MontserratBoada Servicio de Medicina de la Reproducción. Institut Universitari Dexeus Gran Vía Carlos III, 71-75 08028 Barcelona [email protected]

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RESUMEN

La presencia de dos pronúcleos y dos corpúsculos polares a las 16-22 horas post inseminación in vitro mediante FIV/ICSI, seconsidera signo inequívoco de una correcta fecundación. Al realizar la valoración de la fecundación otros estados puedenobservarse como consecuencia de un fallo de fecundación, una fecundación anómala o un desarrollo incorrecto. En este trabajose describen las distintas situaciones anómalas que pueden observarse en las primeras fases de desarrollo embrionario:3PN+2CP, 3PN+1CP, 2PN+1CP, 1PN+1CP, 1PN+2CP y No PN+2CP en D+1, así como los embriones parados en 2PN+2CP, embrionesfragmentados y embriones multinucleados en D+2 o D+3. Se detallan las características morfológicas y ultraestructurales decada caso y se describen los posibles orígenes y su posible viabilidad para la transferencia uterina.

Palabras clave: Ultraestructura / Desarrollo embrionario / Embriones humanos anormales / Polispermia / Fragmentacióncelular / Multinucleación.

SUMMARY

The presence of two pronuclei and two polar bodies 16-22 hours after in vitro insemination (IVF/ICSI) is considered as theunequivocal sign of correct fertilization. When fertilization is being evaluated, other stages can be observed as a consequenceof a fertilization failure, an anomalous fertilization or an abnormal development. In this paper we describe the differentanomalous situations that can be detected at the first stages of embryo development: 3PN+2PB, 3PN+1PB, 2PN+1PB, 1PN+1PB,1PN+2PB and No PN+2PB at D+1, as well as embryos arrested at stage 2PN+2PB, fragmented embryos and multinucleatedembryos at D+2 or D+3. The morphological and ultrastructural characteristics of each case are described, together with theirpossible origins and viability for uterine transfer.

Key words: Ultrastructure/ Embryo development/ Abnormal human embryos/ Polyspermy/ Cell fragmentation/ Multinucleation

af.interior2:Maquetaci n 1 19/01/2009 10:39 PÆgina 26


inmadurez como por hipermadurez delos ovocitos tras inseminaciones conco-incubaciones largas. También se harelacionado la polipenetración con lapresencia de alteraciones de la zonapelúcida ya sean naturales oproducidas durante la manipulación,con una incompleta reacción cortical,con la edad de la paciente, con elprotocolo de estimulación y con laconcentración de espermatozoidesutilizada en la inseminación (Austin,1974; Sathananthan and Trounson,1982; Trounson et al., 1982; Ducibella1996).

En la inseminación por ICSI en la queciertamente se ha introducido un soloespermatozoide, la presencia de más dedos pronúcleos suele ser de origenfemenino (digínico) y la observaciónde 3PN+2CP generalmente correspondea una no extrusión del 2º corpúsculopolar y fragmentación o división del 1ercorpúsculo polar que se ha confundidocon la presencia de dos corpúsculospolares. En realidad sería 3PN+1CP.

La extrusión del 2º CP suele producirsemuy cerca de donde se encuentra el 1erCP que corresponde al polo animal delovocito (Antezak and Van Blerkom,1999). El primer corpúsculo polar sediferencia del segundo corpúsculo polarpor presentar gránulos corticales (GC),microtúbulos y material nuclear enforma de cromosomas en su interior(Fig. 1). Los orgánulos citoplasmáticos

que presenta son los mismos que seencuentran en el citoplasma del ovocito.Frecuentemente se observa dividido o

fragmentado. En el segundo corpúsculopolar se observan los mismos orgánuloscitoplasmáticos que en el primero perono suelen observarse GC y el materialnuclear se presente envuelto pormembrana nuclear en forma de núcleo omicronúcleos.

En los ovocitos 3PN fruto de una polispermia, se observanesporádicamente algunos gránuloscorticales residuales en la periferia delcitoplasma. Si la inseminación de losovocitos se ha realizado precozmente(ovocitos inmaduros) es frecuenteobservar los gránulos corticales enregiones más internas del citoplasmaformando pequeñas agrupaciones (Fig.2). En el ovocito maduro los GC se

encuentran dispuestos en la periferiadebajo de la membrana plasmática. Laformación de los GC ocurre en losprimeros estadios de la maduración delos ovocitos aunque el momento varía según las especies (Berg andWessel, 1997). Se originan a partir delcomplejo de Golgi que se hipertrofiaformándose unas vesículas decontenido electrodenso que migranhacia la periferia de la célula gracias a lared de microfilamentos citoplasmáticos(Dimaggio et al., 1997, Wessel et al.,2002). La migración de los GC y lamaduración del ovocito son procesosparalelos en la mayoría de las especies.Como consecuencia de lafecundación del ovocito por partede un espermatozoide, se producenormalmente la reacción cortical paraevitar la polispermia. Durante lareacción cortical, la membrana que

limita los GC se fusiona con lamembrana plasmática (oolema) y elcontenido de los gránulos se vierte alespacio perivitelino iniciándose lasreacciones químicas que provocan elendurecimiento de la zona pelúcida(ZP) haciéndola menos vulnerable a losenzimas proteolíticos del acrosomaespermático. Los cambios producidosen la matriz extracelular producen unaseparación tanto física como bioquímicaentre la célula y los espermatozoidesexternos. Actualmente, observacionesde microscopia electrónica y estudioscitoquímicos utilizando lectinasparecen indicar que en el oocitohumano existen diferentes tipos de GC(Jimenez-Movilla et al., 2004) quepodrían desempeñar distintasfunciones: modificación de la ZP paraevitar la reacción acrosómica,modificación de la membrana delovocito evitando la fusión con lamembrana de otros espermatozoides, eincluso podrían estar relacionados conprocesos previos a la fusión demembranas (Liu et al., 2003). Delcontenido de los GC se conoce que variasegún las especies demostrándose lapresencia de determinados carbohidratosreactivos a las Lectinas y tipo N-glycanos en los GC de la especiehumana (Jimenez-Movilla et al., 2004).

La falta o escasez de GC adyacentes a la membrana en los ovocitospolipenetrados, indica que la reaccióncortical ya se ha realizado cuandose procede a la fijación de la muestrapara su estudio ultraestructural.Generalmente se observan los doscorpúsculos polares en el espacioperivitelino más o menos degeneradosy/o fragmentados en función del tiempotranscurrido antes de su fijación.En el citoplasma, se observa unamayor concentración de orgánuloscitoplasmáticos alrededor de lospronúcleos. Los orgánulos másabundantes son las mitocondrias queson redondas o ligeramente ovales y conpocas crestas, y las vesículas de retículoendoplasmático liso (REL). Igual que enlos ovocitos y otros cigotos no evolutivoses frecuente observar asociacionesde grandes vesículas de REL conmitocondrias redondas dispuestas a sualrededor. También se observan deforma esporádica, agrupaciones de gran

Diciembre 2008 Vol. 13 · Nº 227

Figura 1. Detalle del primer corpúsculo polar de uncigoto parado en 2PN+2CP en el que se vencromosomas y algunos gránulos corticales(5.000X).

Figura 2. Detalle del citoplasma de un cigoto3PN+2CP en el que se observa una agrupación degránulos corticales situada cerca de los pronúcleos(20.000X).




tamaño de pequeñas vesículas deretículo endoplasmático liso (AREL) (Fig.3) que algunos autores relacionan con

ovocitos envejecidos (Sathananthanand Gunasheela, 2007). Al microscopioóptico, las AREL parecen grandesvacuolas aunque difieren de estas porsu aspecto translúcido y según se havisto al microscopio electrónico detransmisión (MET), por carecer demembrana que las delimite. Según sutamaño y posición, pueden llegarse aconfundir con un pronúcleo. Laexistencia de AREL podría serconsecuencia de niveles elevados deestradiol en el día de administración dela hCG y su presencia se ha relacionadocon bajas tasas de embarazo (Otsuki etal., 2004). Estos autores sugieren queun patrón anormal en la formación ydistribución de REL podría comportaranomalías en el mecanismo deregulación del Ca2+ y por tanto llegar aafectar el desarrollo embrionario.Alteraciones en el mecanismo reguladordel calcio que modifiquen lasoscilaciones que regulan la expresióndel RNAm del ovocito pueden afectar lacorrecta formación y funcionamientode los pronúcleos en el cigoto,comprometiendo la activación de lasíntesis de RNA nuclear, la primerasíntesis de DNA durante la fase S y laposterior unión de los dos genomas enun único genoma embrionario (Tesariket al., 2007).

En el interior de los pronúcleos, seobservan pequeños grumos de cromatinay precursores nucleolares densos ycompactos, polarizados hacia la zona queconvergen los tres pronúcleos (Fig. 4).Los paquetes de láminas anilladascitoplasmáticas están presentes

también en los cigotos (Fig. 5). Tienenunas características ultraestructuralescomo las de la envoltura nuclearobservándose en sus cisternasnumerosos poros complejos. Tambiénpueden encontrarse en el interior delnúcleo en forma de fragmentos simples,preferentemente convergiendo hacía lazona de confluencia de los pronúcleos.Esta característica se considera comoun signo de apoptosis igual que unabaja concentración de poros en lamembrana nuclear, típico de estados noevolutivos (Rawe et al., 2003). Lapresencia de pequeños complejos deGolgi indica que ya hay actividad puestoque en los ovocitos maduros parados enmetafase II, es raro observar vesículaso cisternas de Golgi. Realizando unestudio secuencial de todo el cigoto ytras una observación minuciosa delcitoplasma, se pueden observar restosde los axonemas espermáticos con losnueve pares de microtúbulos, los dosmicrotúbulos centrales y las nuevefibras densas, mientras que no esposible identificar las mitocondriasprocedentes de las piezas intermedias.Generalmente, los restos espermáticosse encuentran muy cerca de los PN(Fig. 6) y raras veces se han descritoobservaciones que permitan asegurar

que hay restos de distintosespermatozoides aunque algunasimágenes parecen sugerirlo (VanBlerkom et al., 1984; Boada and Ponsà1987; Boada 1992; Sathananthan et al.,1999). La presencia de más de uncentrosoma espermático, estructura degran importancia en las primerasdivisiones mitóticas por actuar comocentro organizador de los microtúbulosy encargado de dirigir la organizaciónde la placa metafásica y delcitoesqueleto, puede comportar unasegregación tripolar o una segregacióntotalmente desorganizada con dispersiónde los cromosomas. En los 3PN+2CPque pasan a dos células tras unadivisión aparentemente normal,pero cromosómicamente anormal, laexplicación más probable es que sehaya producido una segregaciónbipolar quedando uno de los doscentrosomas espermáticos excluido delproceso (Sathananthan et al., 1999).

La mayoría de los embriones con trespronúcleos no evolucionan, observándoseen su interior, signos estructuralestípicos de degeneración como son:fragmentación citoplasmática, aumentode vesículas de REL que evolucionanhacia vacuolas con mitocondriasasociadas y posición excéntrica delos pronúcleos. Su capacidad dedivisión es inferior a la de los cigotoscorrectamente fecundados pero si sedividen, los cambios que ocurren no sedistinguen de los que se producen enlos cigotos 2PN: migración de los PN,interdigitación de las envolturasnucleares y posición convergente de lacromatina, precursores nucleolares ydemás estructuras nucleares. Cuando se

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Figura 3. Detalle del citoplasma de de un cigoto3PN+2CP en el que se observa una agrupación depequeñas vesículas de retículo endoplasmático liso(AREL) (12.000X).

Figura 4. Imagen ultraestructural de un cigoto3PN+2CP en la que se observan los tres pronúcleoscon las estructuras intranucleares polarizadas haciala región donde convergen los pronúcleos (6.000X).

Figura 5. Paquete de láminas anilladascitoplasmáticas dispuestas paralelamente ysituadas junto a una mitocondria (26.000X).

Figura 6. Restos del flagelo de un espermatozoideen la región del citoplasma próxima a los PN de uncigoto 3PN+2CP. En los pronúcleos se observaninvaginaciones de la membrana nuclear,precursores nucleolares y fragmentos simples deláminas anilladas (12.000X).




bloquean y no se dividen, lascaracterísticas morfológicas sonequivalentes a las de los cigotosparados en estado de 2PN que noavanzan en el desarrollo embrionario.El timing de división de los cigotos contres pronúcleos suele verse alterado(Van Blerkom, 1989), observándosenormalmente retrasos (Sathananthanet al., 1999). La división de cigotos 3PNgenera frecuentemente blastómerosmultinucleados. Se ha visto que loscigotos 3PN pueden llegar al estado deblastocisto pudiendo incluso llegar aimplantar ya que se conocen tantofetos como recién nacidos triploides(69XXX o 69XXY) (Edwards, 1986). Losestudios citogenéticos de embrionespolipenetrados demuestran que enmuchos casos se trata de mosaicos enlos que coexisten blastómerosnormales y blastómeros con un númeroanómalo de cromosomas (Munné andCohen, 1998; Sathananthan et al,1999)

Es importante destacar que lasobservaciones al estereomicroscopio oal microscopio invertido si no serealizan con suficiente detenimiento,pueden en ocasiones llevar aconfusiones. Un cigoto fecundadonormalmente (2PN+2CP) que ademáspresente grandes AREL, o una o másvesículas de tamaño similar al de lospronúcleos, puede interpretarse comoun cigoto con tres o más PN. Enestos casos, una observación másprecisa o por un embriólogo másexperimentado permitiría distinguir elpseudopronúcleo (PPN) de losverdaderos pronúcleos. Los PPN sedistinguen fácilmente de los PN por nopresentar precursores nucleolares ni lasmodificaciones típicas de la membranaen las regiones de convergencia de lospronúcleos (Van Blerkom, 1987). Esimportante una observación detalladay responsable ya que a diferencia de los3PN, el desarrollo de los cigotos con2PN y un pseudopronúcleo debería sernormal.

3PN+1CP

La explicación de esta situación sueleser la no segregación del 2º corpúsculopolar. Se presenta más frecuentementeen casos de ICSI aunque también puededarse en la FIV convencional. En estoscasos correspondería también a una

fecundación correcta por parte de unsolo espermatozoide y la no extrusióndel segundo corpúsculo polar queformaría un segundo pronúcleo deorigen femenino (digínia). Lascaracterísticas ultraestructurales de los3PN+1CP son parecidas a los 3PN+2CP adiferencia de que en estos casos sólopodrían encontrarse restos de unespermatozoide en el interior delovocito. Igual que los anteriores, estoscigotos pueden dividirse normalmentey llegar a término por lo que debendescartarse desde un principio para suutilización clínica.

2PN+1CP

Puede tratarse de una activaciónpartenogenética sin extrusión delsegundo corpúsculo polar y formaciónde dos pronúcleos femeninos (Kaufan,1983), o bien ser el producto de unafecundación normal por parte de unespermatozoide pero con la noextrusión del segundo corpúsculo polarpor lo que el pronúcleo femeninotendría dotación diploide y el cariotipofetal correspondería a una triploidía.Los fetos triploides de origen digínicosuelen presentar retraso delcrecimiento, macrocefália y placenta noquística (Carceller et al., 2004).Únicamente el estudio cromosómico omolecular del material nuclearpermitiría establecer el origen de estoscasos que bajo ninguna circunstanciadeberían ser transferidos por el riesgode patologías fetales que puedencomportar. Es importante realizar unaobservación detallada antes dedescartar dichos cigotos con el fin deconfirmar la existencia de un solocorpúsculo polar único y biendiferenciado.

En el análisis ultraestructural al MET, lavisualización de restos espermáticos enel interior del citoplasma constituiría laprueba irrefutable del origen nopartenogenético de estos cigotos.

1PN+1CP

Generalmente se trata de una activaciónpartenogenética sin extrusión delsegundo corpúsculo polar y formación deun solo pronúcleo femenino (Kaufman,1983). Otras explicaciones como lafecundación normal por parte de un

espermatozoide pero con ausencia deformación de uno de los dos pronúcleos yno extrusión del segundo corpúsculopolar son menos probables. Igual que enel caso anterior, únicamente laobservación de restos espermáticos o elestudio del material nuclear puedeesclarecer el origen de dichos cigotos queno deben considerarse para latransferencia uterina a pesar de quegeneralmente no evolucionan más alládel estado de 6-8 células (Sathananthanand Gunasheela, 2007).

1PN+2CP

La viabilidad de los cigotos 1PN +2CPvaria según su origen. Mientras que losprocedentes de FIV con inseminaciónconvencional acostumbran a tener una dotación cromosómica diploide y en consecuencia son consideradosgeneralmente como embrionestransferibles, los procedentes de ICSIse ha visto que solamente soncromosómicamente normales el 14-28% de los casos (Staessen and VanSteirteghem, 1997; Balaban et al.,2004) por lo que suelen considerarsecomo no aptos para uso reproductivo.

Otsu y colaboradores (2004) postulanque cuando el pronúcleo mide 29 μm omás, lo más probable es que sea diploidemientras que si el tamaño de éste esinferior, el cigoto es cromosómicamenteanormal en la mayoría de los casos.Generalmente, los 1PN+2CP de ICSIson producto de una activaciónpartenogenética (Kaufman, 1983;Balakier et al 1993) y raras veces (7%)consiguen llegar a estado de blastocisto(Campos et al., 2007). Su composicióngenética acostumbra a ser haploide (31-47%) (Balaban et al., 2004; Sultanet al., 1995) sin embargo en losembriones que derivan de estasestructuras también pueden encontrarseaneuploidias simples o complejas eincluso mosaicos y embriones caóticos(Campos et al., 2007).

En general, la existencia de embrionesdiploides procedentes de cigotos1PN+2CP, fenómeno mucho másfrecuente en FIV convencional que enICSI, puede tener distintos orígenes ysuele interpretarse como consecuenciade una fecundación normal pero conasincronía en la formación de los dos

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pronúcleos que dificulta visualizarlossimultáneamente (Sultan et al., 1995;Payne et al., 1997) o comoconsecuencia de la fusión del pronúcleomasculino y femenino dando lugar a unúnico pronúcleo diploide de grantamaño (Levron et al., 1995). Laposibilidad de una diploidizacióntemprana de cigotos haploides es laexplicación menos probable.

En FIV convencional, la observación decigotos con solo 1PN+2CP sueleconsiderarse normal y se interpretacomo una asincronía en la aparición delos dos pronúcleos. Payne et al (1997)observa sincronización en la formaciónde los dos pronúcleos en un 63% de loscasos. Para la formación del pronúcleomasculino es necesario que sedescondense la cromatina espermática,altamente compactada gracias a lasprotaminas nucleares, mediante laacción de histonas ovocitarias. Unadisponibilidad insuficiente de histonaspuede comportar un retraso en latransformación del núcleo espermáticoen pronúcleo masculino y con ello, unaasincronía de los pronúcleos.

Para detectar los posibles casos deasincronía, en los cigotos 1PN+2CP serecomienda la realización de unasegunda observación para constatar lapresencia o ausencia del segundopronúcleo. Staessen et al (1993)observan que el 25% de estos cigotosforman un segundo pronúcleoasincrónico al cabo de 4-6 horas.

A pesar de que se haya demostrado queun gran número de los cigotos 1PN+2CPson cromosómicamente normales, si lasobservaciones se han realizado en eltiming adecuado y no se observaron los2PN+2CP, debe tenerse en cuenta queúnicamente con microscopía óptica nopuede descartarse un posible origenpartenogenético por lo que en igualdadde score embrionario, preferentementese seleccionarán para la transferenciaembriones en los que se hayanobservado los dos pronúcleos. Tan solola observación ultraestructural derestos espermáticos en el interior delcitoplasma del cigoto o el estudio delmaterial nuclear puede esclarecerdefinitivamente el origen de dichoscasos.

No PN+2CP

La no observación de pronúcleos perocon presencia de dos corpúsculospolares frecuentemente se mal catalogacomo “no fecundado” (NF+2CP). Esteestado es susceptible de distintasinterpretaciones aunque estudiosgenéticos han demostrado que en un40% de los casos se trata de cigotosdiploides con una tasa de blastocisto dehasta el 56% lo que parece indicar quepodría tratarse de embriones con unavelocidad de división distinta (Camposet al., 2007). Para esclarecer lasituación, en estos casos se requiereuna segunda observación al cabo deunas horas. Pasado este tiempo, sisiguen sin observarse estructurasnucleares, se aconseja repetir laobservación a las 25-27 horas postinseminación para valorar la divisióntemprana o early cleavage (EC).

En caso de observarse división, laexplicación más probable es que lafecundación hubiera sido muytemprana y/o la velocidad de divisiónmuy rápida por lo que en el momento devalorar la fecundación, los pronúcleosya no fueran visibles y el cigoto seestuviera preparando para la primeradivisión embrionaria. Si por elcontrario, a las 25-27 horas postinseminación se observan por primeravez los dos pronúcleos corresponderíaa una fecundación tardía.

Cuando las observaciones se hanrealizado en el timing adecuado y enningún momento se han observado losdos PN y dos CP, no se puede excluir unposible origen partenogenético por loque preferentemente se escogerán parala transferencia uterina, aquellosembriones en los que se hayanobservado los dos pronúcleos.

Si no se observa división ni a las 25-27hpost inseminación (EC D+1) ni al díasiguiente (D+2), la explicación másprobable es la no fecundación delovocito con división o fragmentacióndel 1er CP o un paro muy precoz en elcorrecto desarrollo hacia el estado decigoto, justo después de la extrusióndel 2º CP pero antes de la formación delos PN, lo que se conoce como unafecundación silenciada. En estos casos,el estudio ultraestructural permite

observar estructuras espermáticas en el interior del ovocito que confirman la penetración del espermatozoide.Generalmente se observa lacromatina espermática más o menosdescompactada y restos de laestructura axonemática del flagelo.También es posible observar fragmentosde membrana nuclear alrededorde los cromosomas del ovocitoy/o de la cromatina espermática,dispuestos desordenadamente indicandodeficiencias en la formación de lamembrana nuclear (Fig. 7).

EMBRIONES ANORMALES EN ESTADOSPRECOCES DE DIVISIÓN (D+2 /D+3)

La valoración de las primeras divisionesembrionarias debe realizarse a las 44-47 horas post inseminación en D+2 o alas 67-71 horas en D+3. Los criteriospara evaluar el desarrollo embrionarioincluyen la valoración del número decélulas o blastómeros, simetría,presencia de núcleos y grado defragmentación, como parámetros mássignificativos (ASEBIR, 2008). Elnúmero y la semejanza de tamaño delos blastómeros se consideran unos delos parámetros más importantes ya quela coexistencia de blastómeros dedistinta medida se relaciona conelevadas tasas de aneuploidía ymultinucleación (Hardarson et al.,2001).

Existen distintos métodos para laclasificación y selección de losembriones de mejor pronósticobasándose en la observación de dichosparámetros existiendo unanimidad enconsiderar embriones de malpronóstico los que presentan una tasa

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Figura 7.- Detalle de la región del citoplasma dondese encuentran los cromosomas de un ovocito en elque no se han visualizado pronúcleos (No PN+2CP),y en la que se observan fragmentos de membrananuclear dispuestos de forma anómala. (8.000X).


de fragmentación superior al 25% y/omultinucleación en alguna de suscélulas.

En D+2, el embrión debería estar enestado de cuatro células o blastómerossimilares, fruto de dos divisionesmitóticas. En D+3, una nueva divisióndebería haberse producido en todas suscélulas dando lugar a un embrión deocho células. Embriones con un timingde división lento o excesivamenterápido se consideran embriones de malpronóstico. Estados distintos suelen serdebidos a una mayor o menor velocidadde división de las células así como a unaasincronía entre ellas que origina lacoexistencia de blastómeros de distintotamaño, procedentes de distintasdivisiones o ciclos celulares.

EMBRIONES PARADOS EN 2PN+2CP END+2

La ausencia de división es un fenómenoque se produce ocasionalmente ycorresponde a una interrupción deldesarrollo en la transición entre laprimera interfase y la primera mitosis.En estos casos, la condensación delDNA en cromosomas, la rotura de lamembrana nuclear y la formación delhuso mitótico bipolar no se producen(Asch et al., 1995). Algunos autorescorrelacionan este fenómeno concigotos con pronúcleos separados queno consiguen disponerse en aposición(Tesarik et al., 2007). Estudios deepifluorescencia lo asocian confenómenos de condensación anómala yfragmentación del DNA no visibles conmicroscopía óptica (Rawe et al., 2003).

Estudios ultraestructurales de estoscigotos parados muestran un mayornúmero de paquetes de láminasanilladas citoplasmáticas cerca de lospronúcleos en comparación con loscigotos evolutivos, menor número deporos en la membrana de lospronúcleos, fragmentos de láminasanilladas atrapadas en el interiorde los pronúcleos y presenciade numerosas mitocondrias coninclusiones. Dichas observacionessugieren una comunicación núcleo-citoplasma comprometida que podríaser la responsable de la interrupción deldesarrollo embrionario y de la ausenciade las primeras divisiones mitóticas

(Rawe et al., 2003). Entre las dos capasde la membrana nuclear de los embrionesparados en fase de pronúcleos seobservan frecuentemente pequeñoscuerpos ovales, electrodensos y conmembrana propia que los delimita. Seencuentran preferentemente en la zonadonde convergen los pronúcleos igualque los fragmentos de láminas anilladasy otras estructuras nucleares. Son de0,15-0,30 μm y parece que se proyectandel núcleo hacia el citoplasma ya que esla lámina externa de la membrana laque se encuentra dilatada hacia elcitoplasma (Fig. 8) (Boada,1992). La

presencia de estas vesículas o cuerposovales intermembrana también se haobservado en cigotos polispérmicos y enembriones tempranos, y su función ycontenido sigue estando por determinar.

EMBRIONES DIVIDIDOS

El estudio ultraestructural deembriones humanos en D+2/ D+3 nosmuestra la presencia de blastómeros deforma oval o redondeada de 75-85 μmde diámetro máximo y 50-60 μmde diámetro mínimo. La membranacitoplasmática es prácticamente lisa. Seobservan pocos microvilli en la región dela membrana correspondiente a la partedel blastómero que queda libre mientrasque en la región que se encuentra encontacto con los otros blastómerospresenta más microvilli frecuentementeinterconectados entre sí, unionescelulares primitivas y pequeñas vesículasofragmentos citoplasmáticos de distintaelectrodensidad. Generalmente, lasuniones intercelulares son másabundantes en D+3 que en D+2 y seobservan como un engrosamiento de la

membrana de mayor electrodensidad.Uniones celulares más complejas, gap ytigh junction, no empiezan a aparecerhasta estadios más avanzados (Lopataet al.,1983). La comunicaciónintercelular juega un papel importanteen la diferenciación celular. Parececomúnmente aceptado que lapolarización y diferenciación celular delos embriones se produce bajo controlgenético sin embargo, queda muchopor conocer sobre los efectos de losdistintos productos génicos queintervienen en dichos procesos(Scott, 2000). Tanoue y Takeichi(2004) describen la existencia dedeterminadas proteínas responsablesde regular la organización delcitoesqueleto de la periferia de lascélulas, modulando así los contactosentre blastómeros y la polaridad.Estudios recientes en bovino sugierenque la diferencia de longitud en lospuntos de contacto intercelularespodría estar relacionada con elcomportamiento de los blastómeros alinicio de la diferenciación celular(Bhojwani et al., 2007).

Los orgánulos suelen distribuirse portodo el citoplasma aunque se observaun ligero incremento alrededor delnúcleo y en algunos casos, una menordistribución en la región periférica delos blastómeros más externos encontacto con la zona pelúcida, pero novisible en la región del córtexcitoplasmático que se encuentra enaposición con otros blastómeros.Las mitocondrias siguen siendopreferentemente redondas, de matrizmuy electrodensa con inclusiones ypocas crestas normalmente aplanadas.Se observan también algunasmitocondrias alargadas y con crestastransversales, típicas de estadios másavanzados con mayor actividad tras ladiferenciación celular. Las mitocondriaspueden presentarse libres oformando complejos con vesículasde retículo endoplasmático. Elretículo endoplasmático se presentaexclusivamente en forma de retículoliso. Se observan vesículas de distintostamaños (50-500 nm) distribuidas por todo el citoplasma. Además de los complejos vesícula–mitocondrias,también se observa REL asociado a lasuniones intercelulares y a paquetesde láminas anilladas, formando

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Figura 8.- Detalle de la membrana de uno de lospronúcleos de un ovocito fecundado parado en2PN+2CP, en el que se pueden ver láminas anilladasintranucleares y la presencia de cuerpos ovales quese proyectan hacia el citoplasma entre las doscapas de la membrana nuclear (28.000X).



continuidad con éstas. La frecuencia deláminas anilladas es mucho menor enlos embriones que en los ovocitos ocigotos. Se observan también algunoscomplejos de Golgi en forma depequeñas asociaciones de túbulos quese presentan de forma esporádica yaislada en el citoplasma de estosembriones. Puntualmente se observa lapresencia de algún lisosoma secundarioen forma de cuerpo multivesiculado. Enla periferia del citoplasma se puedeencontrar aisladamente algún gránulocortical y paquetes de microtúbulos (40o más) dispuestos paralelamente entresí y con la membrana citoplasmática. Lapresencia de microtúbulos en laperiferia de los blastómeros serelaciona con el importante papel queéstos desempeñan durante la divisióncelular. En el citoplasma de losembriones de pocas células empiezan aobservarse también algunos ribosomasaunque la concentración de estosorgánulos en forma libre o de polisomasincrementa a medida que transcurrenlas primeras divisiones embrionariassiendo muy abundantes en embrionesde 14-16 células (Lopata et al., 1983).La presencia de ribosomas al tercer díade desarrollo coincide con la activacióndel genoma. En la especie humana, laactivación del genoma embrionarioempieza en el estadio de cuatro célulascon la activación de la síntesis de RNAnuclear y justo a continuación,entre cuatro y ocho células, empiezana aparecer los primeros signosbioquímicos y morfológicos de laexpresión génica embrionaria (Tesariket al., 2007). Si bien durante losprimeros tres días el embrión sobrevivemayoritariamente gracias a las reservasovocitarias y según estudios recientes,también a los RNAm que aporta elespermatozoide (Ostermeier et al.,2004; Ambartsumyan y Clark, 2008), apartir de este momento debe iniciarsela actividad transcripcional del DNA delpropio embrión.

El núcleo de los blastómeros es pocoelectrodenso, tiene forma esférica (20-25μm) y suele estar en el centro de lacélula. La membrana nuclear es doblecon numerosos poros y dilatacionesde la membrana externa en lasque se encuentran pequeños cuerposovales (Dvorak et al.,1982;Sathananthan, 1984; Boada, 1992). En

el interior del núcleo se encuentrandistintos precursores nucleolares deaproximadamente 2μm de diámetropróximos a la membrana nuclear. Enembriones de 2-4 células, tienen formaesférica y son extremadamente densosy compactos similares a los que seobservan en los pronúcleos de loscigotos. En estadios posteriores (8-16células), los nucleolos ya presentan unaspecto granular y reticulado, menoscompacto y con menor electrodensidadindicativo de actividad nucleolar tras laactivación de la expresión del genomaembrionario (Lopata et al., 1983;Sathananthan, 1993). En el interior delnúcleo se observan también pequeñosagregados de heterocromatina deforma dispersa y en ocasiones, algúnfragmento simple de láminas anilladasintranucleares.

EMBRIONES FRAGMENTADOS

La presencia abundante defragmentos citoplasmáticos puedellegar a comprometer la viabilidad y potencial implantatorio del embrión.Dependiendo del tamaño y distribuciónde los fragmentos, la existencia defragmentación puede tener distintopronóstico (Alikani and Cohen, 1995;Alikani et al., 2000). Se ha sugeridoque algunos patrones de fragmentaciónconllevarían la pérdida total o parcial de algunas proteínas reguladorasespecíficas de los blastómeros loque podría comportar consecuenciasnegativas para el desarrolloembrionario tanto de los blastómerosfragmentados como del embrión en sutotalidad (Antezak and Van Blerkom,1999).

Algunos autores relacionan lafragmentación con fenómenosapoptóticos (Jurisicova et al., 1996)aunque la existencia de dicha relaciónsigue siendo controvertida. Estudiosrealizados con Anexina V, proteínacalcio-dependiente con gran afinidadpor los fosfolípidos internos de lamembrana citoplasmática, parecenindicar que no existe correlación(Antezak and Van Blerkom, 1999).Según un estudio de Spanos ycolaboradores (2002) en el que evalúan la capacidad fagocitaria de los blastómeros, los fenómenosapoptóticos se encuentran inhibidos

durante las primeras fases dedesarrollo embrionario y no se inicianhasta después de la fase decompactación. Sin embargo, estudiosmás recientes demuestran que lafragmentación podría estar reguladapor ciertos componentes del programagenético de la apoptosis como el genCaspase-3, inductor de la muertecelular (Jurisicova et al., 2003).

Algunos autores atribuyen la reducida viabilidad de los embrionesfragmentados a la presencia defragmentos per se, sin embargo, losbeneficios de efectuar una extracciónde los fragmentos previamente a latransferencia embrionaria parecenlimitados. Según Alikani (2007),únicamente se observa un aumento dela tasa de implantación tras laaplicación de esta técnica en losembriones con 15-35% de fragmentos.En los embriones con <15% o >35% defragmentos la influencia es menor en lamayoría de los casos ya sea por que lafragmentación es muy leve y apenascomporta consecuencias negativas parael embrión o bien por que el daño esexcesivo y probablemente irreversible.

Trabajos con video-filmaciones handemostrado que en algunos embrionesla fragmentación puede considerarsecomo un episodio temporal que puede reducirse o incluso desaparecer al cabode algunas divisiones celulares.También se ha constatado que losembriones mitóticamente inactivos nose fragmentan por lo que el proceso defragmentación se relaciona únicamentecon las células en división (Alikani,2007).

Los fragmentos son de origencitoplasmático y están delimitados pormembrana citoplasmática lisa en la queprácticamente no se observanmicrovilli. Tampoco se observan unionesque los conecten entre sí ni con losblastómeros. Según su tamaño puedenllegarse a confundir con un blastómeroo con los corpúsculos polares aunque sedistinguen de ellos por ser anucleados ypor presentar formas variadas. Por logeneral, los fragmentos no presentanningún tipo de material nuclear en suinterior y el citoplasma contiene losmismos orgánulos citoplasmáticos queel de los blastómeros aunque la

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distribución suele ser distinta. Losorgánulos se concentran endeterminadas zonas de los fragmentosdejando regiones sin orgánulos que seobservan como regiones más claras queen ocasiones pueden tener forma deanillo y abarcar toda la regiónperiférica del fragmento, similar alanillo acitoplasmático que se observaen los blastómeros en procesosdegenerativos (Veeck, 1999), oincluso ocupar prácticamente todo elfragmento (fragmentos de aspectovacío). La electrodensidad de losfragmentos suele ser variablepudiéndose encontrar en un mismoembrión, fragmentos más oscuros queotros que en cortes semifinos seobservan con diferente grado detinción (Fig. 9).

EMBRIONES MULTINUCLEADOS

A pesar de que algunos autores habíansugerido que la multinucleación podríaser un fenómeno temporal y reversiblede la división celular (Staessen and VanSteirteghem, 1998), la presencia demultinucleación se correlacionadirectamente con un incremento en latasa de aneuploidias y mosaicismo(Sathananthan et al., 1999; Hardarsonet al., 2001) por lo que los embrionesque la presentan se consideran de malpronóstico y existe consenso enconsiderarlos como no transferibles porlo que deberían excluirse para latransferencia uterina a menos que noexista ningún otro embrión de mejorpronóstico (Gil et al., 2007)

En muchas ocasiones la multinucleaciónse presenta asociada a otros fenómenos

anómalos como la polispermia (VanBlerkom et al., 1984) fruto de unasegregación anómala (Kola andTrounson, 1989, Sathananthan et al.,1999), el cese del desarrolloembrionario o la fragmentacióncitoplasmática (Van Royen et al.,2003). También puede detectarse enembriones sin ningún otro signo deanormalidad morfológica (Fig. 10).

Distintos estudios han reportado unaincidencia variable de blastómerosmultinucleados de hasta el 74% enembriones de D+2/D+3 procedentes decigotos 2PN+2CP (Gil et al., 2007).

Mayoritariamente, la multinucleaciónse considera fruto de la ausencia dedivisión citoplasmática (citocinesis)tras una replicación mitótica delmaterial nuclear, división nuclear(cariocinesis) o fragmentación delnúcleo (Lopata et al., 1983, Hardyet al.,1993). Según Tesarik et al.,(1987), este fenómeno se produce por una migración deficiente de los cromosomas durante la anafasemitótica que comportaría laaparición de grupos aislados decromosomas que posteriormentequedarían individualmente envueltospor membrana nuclear formandodistintos núcleos o micronúcleos. Lapresencia de blastómeros multinucleadospuede tener distintos orígenes siendolos más probables los defectosen el citoesqueleto o en la placametafásica del ovocito o blastómero ylas anomalías en el centrosomaespermático. Se han relacionado con elfenómeno de la multinucleación: lascondiciones no adecuadas de cultivo

embrionario como por ejemplo cambiosen la temperatura (Winston et al.,1991), determinados medios de cultivo(Pickering et al., 1995) o incluso losfármacos empleados en la estimulacióndel ciclo ovulatorio (De Vincentiis etal., 2005).

Existen distintos patrones demultinucleación que tienen en cuenta elnúmero de células afectadas, el número denúcleos que se observan y el día dedesarrollo en el que se detecta laanomalía. Según el patrón demultinucleación, el pronóstico delembrión será distinto. Meriano et al(2004) distingue dos fenotiposembrionarios distintos según presentenblastómeros binucleados o multinucleadosy encuentra mayor tasa de embarazotransfiriendo embriones con blastómerosbinucleados (48%) en comparación con losmultinucleados (15.4%).

La observación de la división temprana (EC) en la tarde del D+1permite detectar los primerosblastómeros multinucleados. Kligman ycolaboradores (1996) describen que el70% de las células con multinucleaciónen D+2/D+3 presentan tres o másnúcleos mientras que en estadios másavanzados (D+4) suelen serbinucleadas. Dichos autores postulanque la multinucleación en D+2/D+3produce mayoritariamente embrionescromosómicamente anormales mientrasque si se observa en D+4 o estadiosposteriores, la mayoría de losembriones serán cromosómicamentenormales.

También se han descrito embrionesmultinucleados en los primeros estadios de desarrollo embrionario queposteriormente son mononucleados(Gil et al., 2007) y distintos autores hanreportado el nacimiento de niños sanosa partir de la transferencia deembriones multinucleados (Balakierand Cadesky, 1997; Jackson et al.,1998; Pelinck et al., 1998). Laexplicación a este fenómeno dereparación o corrección de lamultinucleación también es muyvariada e incluye distintas hipótesiscomo la recuperación en divisionesposteriores de la citocinesis, la fusiónposterior de los núcleos derivadosinicialmente de un mismo núcleo

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Figura 10.- Corte semifino de un embriónmultinucleado en estado de cuatro célulasprocedente de un cigoto 2PN+2CP. En la imagen seobservan tres blastómeros, uno de ellos con dosnúcleos.

Figura 9.- Corte semifino de un embriónfragmentado en el que se observa una distribuciónvariable de los orgánulos y diferente grado detinción entre los fragmentos.




(Kligman et al., 1996) y la relegación altrofectodermo de las célulascromosómicamente anormales (Mottlaet al., 1995).

El volumen de los blastómerosmultinucleados es significativamentemayor que el de sus blastómeroshermanos. Los análisis morfométricosdemuestran que los blastómerosmononucleados de embrionesmultinucleados son menores que losmononucleados de embriones normales(Hnida and Ziebe, 2007).

Los núcleos de las células multinucleadassuelen ser de menor tamaño que los de lascélulas mononucleadas (Lopata et al.,1983) aunque frecuentemente seobservan núcleos de distinto tamaño enun mismo blastómero. Los núcleos suelenser redondos aunque a veces pueden serovales e incluso lobulados. La membrananuclear presenta múltiples poros y lapresencia de pequeños cuerpos ovalesentre las dos capas de la membrana que enocasiones son de mayor tamaño y menorelectrodensidad que los observados en lospronúcleos. Una característica particularde los blastómeros multinucleados es laausencia de polarización de las estructurasnucleares. A diferencia de la polarizaciónobservada en las estructuras nucleares delos pronúcleos de los cigotos hacia la zonade convergencia de estos, las estructurasnucleares de los distintos núcleos de unmismo blastómero no presentan estatendencia a polarizarse de formaconvergente (Fig. 11) (Boada, 1992).

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Figura 11.- Imagen ultraestructural en la que seobserva la distribución no polarizada de lasestructuras intranucleares en los núcleos de unblastómero multinucleado (6.000X).




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