Tesi Doctoral

Caracteritzaci de la resposta immune induda per RUTI en el

tractament de la infecci tuberculosa latent experimental

Evelyn Guirado CceresDirector de Tesi: Dr. Pere-Joan Cardona i Iglesias

Departament de Gentica i Microbiologia, UAB 2008

Caracteritzaci de la resposta immune

induda per RUTI en el tractament de la

infecci tuberculosa latent experimental

Evelyn Guirado Cceres

Universitat Autnoma de Barcelona Departament de Gentica i de Microbiologia

Unitat docent Germans Trias i Pujol Caracteritzaci de la resposta immune

induda per RUTI en el tractament de la

infecci tuberculosa latent experimental

Evelyn Guirado Cceres

Memria de tesi presentada per obtenir el grau de

Doctora en Microbiologia per la Universitat

Autnoma de Barcelona, Febrer de 2008.

Director de tesi: Dr. Pere-Joan Cardona i Iglesias

U E

Para Jess.

Por estar ah siempre.

En realidad prefiero la ciencia a la religin. Si me dan a escoger entre Dios y el aire acondicionado,

me quedo con el aire.

Woody Allen

Unitat de Tuberculosi Experimental

El Dr. Pere-Joan Cardona i Iglesias, Investigador Principal de la Unitat

de Tuberculosi Experimental, de la Fundaci Institut dInvestigaci en

Cincies de la Salut Germans Trias i Pujol,

FA CONSTAR:

Que el treball experimental i la redacci de la memria de tesi titulada

CARACTERITZACI DE LA RESPOSTA IMMUNE INDUDA PER

RUTI EN EL TRACTAMENT DE LA INFECCI TUBERCULOSA

LATENT EXPERIMENTAL han estat realitzats per na Evelyn Guirado

Cceres i considera que s apta per al trmit de lectura i defensa

pblica davant dun tribunal, per optar al grau de Doctora en

Microbiologia per la Universitat Autnoma de Barcelona.

I per tal que quedi constncia signa aquest document a Badalona,

de de 2008.

Dr. Pere-Joan Cardona

Investigador Principal

Unitat de Tuberculosi Experimental

U E

Informe sobre la unitat estructural de la memria de tesi i la

idonetat de la seva presentaci com a compendi darticles.

La infecci per Mycobacterium tuberculosis afecta avui dia a un ter de

la humanitat, s a dir a 2.000 milions de persones. Sestima que cada

any apareixen 8 milions de nous casos, i que ms de 2 milions de

persones moren degut a la malaltia.

Ja als anys 60, es va comenar a impulsar el tractament de les

persones infectades en pasos amb el suficient poder econmic, per

intentar reduir aquest reservori, aix com reduir el risc de reinfecci i de

malaltia en ambients amb una baixa incidncia. Lamentablement,

aquesta estratgia ha trobat un gran contratemps: el tractament

establert per a la infecci tuberculosa latent s extremadament llarg, cal

ladministraci disoniazida durant 9 mesos. Aquest fet ha dificultat

moltssim ladherncia al tractament de les persones infectades, donat

que no pateixen cap simptomatologia. Per aquesta ra, el Comit per a

lEradicaci de la Tuberculosi va promulgar lany 1998 la necessitat

dobtenir una vacuna teraputica contra aquesta infecci globalitzada.

En la memria de tesi, que es presenta com a compendi darticles,

queda reflexada la cronologia dels estudis realitzats. Aquesta cronologia

permet entendre com es va portar a terme el desenvolupament dun

projecte de tal magnitud, com pot ser fer una vacuna teraputica contra

la infecci tuberculosa latent.

De fet, amb els tres articles que es presenten, i un quart article pendent

de publicar que quedar annexat, queden perfectament retratades les

quatre etapes claus del nostre projecte, que sengloben dins de la fase

preclnica de la vacuna teraputica contra la infecci tuberculosa latent.

Primer, lestabliment dun model mur de tuberculosi humanitzat que

ens va permetre estudiar la infecci tuberculosa latent, sobretot els

mecanismes relacionats amb la generaci de necrosi

intragranulomatosa, lescenari local durant la fase crnica-latncia de la

infecci. I tamb lestudi de les hiptesis esttica i dinmica en

lorigen de la infecci tuberculosa latent.

Segon, el desenvolupament i la caracteritzaci de la vacuna teraputica

contra la tuberculosi, que vam anomenar RUTI, en el model

experimental mur dinfecci tuberculosa crnica.

Tercer, un estudi sobre la resposta immune humoral obtinguda

mitjanant immunoterpia amb RUTI, respecte del fenomen de

reactivaci que t lloc desprs duna pauta curta de tractament

quimioterpic, en el model mutant de ratol SCID.

I quart, i encara pendent de publicaci, un estudi sobre la

caracteritzaci de la resposta immune cellular obtinguda mitjanant

immunoterpia amb RUTI, en els models experimentals dinfecci

tuberculosa crnica de ratol i conill porqu, desprs duna pauta curta

de tractament quimioterpic.

En aquesta tesi, doncs, queden patents els coneixements adquirits

treballant amb models animals, concretament ratol i conill porqu, pel

que fa al tractament de la infecci tuberculosa latent desprs duna

pauta curta de tractament antibitic, i seguidament la immunoterpia

amb la nostra vacuna.

La positivitat dels resultats ha fet possible portar a terme estudis

complementaris amb models animals ms grans, com sn porcs i

cabres. I finalment, el desenvolupament dun Assaig Clnic Fase I, de la

vacuna teraputica contra la infecci tuberculosa latent RUTI en

humans.

RESUM La infecci tuberculosa latent (ITBL) afecta actualment a un ter de la

humanitat, s a dir, a 2.500 milions de persones. Linters en el seu

estudi i tractament es basa en el fet que en un 10% dels casos tindr

lloc un recreixement bacillar, que donar lloc a una tuberculosi (TB)

activa.

Aquest fet s especialment perills perqu encara es desconeixen els

mecanismes implicats en aquesta reactivaci, o sigui que ens manquen

factors pronstics. I perqu, a ms a ms, el tractament de la ITBL s

extremadament llarg (9 mesos disoniazida), i aix fa que moltes vegades

aquesta mesura teraputica ni es plantegi a nivell de mesura sanitria.

A partir de les observacions obtingudes en lestudi de levoluci de les

lesions en el model de TB experimental en el ratol, es va generar un

model de TB humanitzat que generava necrosi intragranulomatosa

pulmonar (INPG). Inicialment, la INPG soriginava mitjanant la

inoculaci de LPS intranasal, per degut a lelevada taxa de mortalitat

dels animals, el model es va estandarditzar portant a terme la infecci

per aerosol amb soques de M. tuberculosis capaces de desenvolupar

INPG de manera espontnia.

Grcies a aquest model humanitzat es va poder provar un nou rgim

teraputic basat en la hiptesi que la inoculaci, desprs duna pauta

curta de tractament antibitic, amb fragments de M. tuberculosis

cultivats en condicions destrs i detoxificats (vacuna RUTI) seria capa

de controlar la reactivaci bacillar, i ser una eina teraputica efica per

reduir el temps de tractament actual de la ITBL.

En aquest sentit, els estudis inicials mostraven la reactivitat de

diferents subtipus dIgG contra protenes presents en la vacuna, i la

capacitat bactericida de la resposta immune generada, en soques de

ratol resistent (C57BL/6) i susceptible (DBA/2).

Portant a terme estudis ms amplis sobre la resposta immune generada

mitjanant la immunoterpia amb RUTI desprs duna pauta curta de

tractament antibitic, sha volgut avaluar tant el component humoral,

com el cellular.

Realitzant srum-terpia passiva amb anticossos, obtinguts desprs de

portar a terme aquest tractament combinat en ratolins DBA/2, es va

veure que el model de ratol severament immunodeprimit SCID era

capa de controlar la reactivaci bacillar i presentava un nombre

inferior dabscessos pulmonars.

Pel que fa a lavaluaci de la resposta cellular, els resultats obtinguts

mitjanant el mateix esquema de tractament confirmen el que sobserva

en els estudis anteriors.

I finalment, cal destacar una total absncia de toxicitat deguda a la

inoculaci de la vacuna RUTI, ni en el model de ratol, ni en el conill

porqu.

LLISTAT DARTICLES Aquesta memria de tesi es basa en els segents articles:

Guirado E, Gordillo S, Gil O, Daz J, Tapia G, Vilaplana C, Ausina V, Cardona PJ. Intragranulomatous necrosis in pulmonary granulomas is not related to resistance against Mycobacterium tuberculosis infection in experimental murine models induced by aerosol. International Journal of Experimental Pathology 2006;87:139-49

Cardona PJ, Amat I, Gordillo S, Arcos V, Guirado E, Daz J, Vilaplana C, Tapia G, Ausina V. Immunotherapy with fragmented Mycobacterium tuberculosis cells increases the effectiveness of chemotherapy against a chronical infection in a murine model of tuberculosis. Vaccine 2005;23:1393-98

Guirado E, Amat I, Gil O, Daz J, Arcos V, Caceres N, Ausina V, Cardona PJ. Passive serum therapy with polyclonal antibodies against Mycobacterium tuberculosis protects against post-chemotherapy relapse of tuberculosis infection in SCID mice. Microbes and Infection 2006;8:1252-9

LLISTAT DABREVIATURES ADN cid desoxiribonucleic

Ag antigen

APC cllula presentadora dantigen

ARN cid ribonucleic

ARNm cid ribonucleic missatger

BAL rentat broncoalveolar

BCG bacil de Calmette i Gurin

BL bacil latent

CD clster de diferenciaci

CT grup control

DTH resposta immune de tipus hipersensibilitat retardada

EBA activitat bactericida primerenca

FE fase estacionria

FMtbC paret cellular fragmentada de M.tuberculosis

GM-CSF factor estimulador de colnies de granulcits i

macrfags

HS srum hiperimmune

IFN- interfer-gamma

Ig immunoglobulina

IL-12p40 interleuquina 12, subunitat p40

INH isoniazida

iNOS xid ntric sintasa induble

ITBL infecci tuberculosa latent

KO Knock Out

LAM lipoarabinoman

LPS lipopolisacrid

ME macrfag escums

MTBC Mycobacterium tuberculosis complex

MW pes molecular

NAD poder reductor

NK cllules natural killer

NO xid ntric

NOS xid ntric sintasa

OMS Organitzaci Mundial de la Salut

PBMC cllules monoctiques de sang perifrica

PMN cllules polimorfonuclears

PPD derivat protenic purificat

PZA pirazinamida

RANTES citocina regulada, expressada i secretada per cllules

T activades

RIF rifampicina

SIDA sndrome dimmunodeficincia adquirida

TB tuberculosis

TBMR tuberculosis multiresistent

TBR tuberculosis resistent

TDO tractament directament observat

TNF- factor de necrosi tumoral-alfa

UFC unitat formadora de colnia

NDEX

1. INTRODUCCI ................................................................. 1

1.1 La TB: Pinzellades de la seva histria ............................. 2

Lantic Egipte ............................................................ 3

Europa actual: societats prehistriques .................... 4

Lantiguitat clssica .................................................. 4

LAmrica precolombina ............................................ 5

Europa: de lEdat Mitjana al segle XVIII .................... 6

El Romanticisme ....................................................... 7

El bacil de Koch ........................................................ 8

El descens de la TB ................................................... 9

TB: una malaltia reemergent ................................... 12

1.2 La infecci tuberculosa latent ...................................... 13

Models in vitro de latncia ....................................... 14

Models in vivo de latncia ........................................ 16

El model mur humanitzat ..................................... 24

1.3 El projecte RUTI: desenvolupament duna vacuna

teraputica .................................................................. 30

El tractament antibitic de la infecci tuberculosa

latent i la hiptesi dinmica ................................... 30

RUTI: la vacuna teraputica contra la TB latent ...... 37

Efectivitat de RUTI .................................................. 41

2. OBJECTIUS I HIPTESIS ............................................... 47

3. RESULTATS ................................................................... 49

3.1 Estudi sobre la relaci existent entre la necrosi

intragranulomatosa i la resistncia a la infecci

tuberculosa crnica en el model de ratol ..................... 49

3.2 Estudi dels efectes del tractament immunoterpic

amb RUTI sobre la quimioterpia en el model mur

dinfecci tuberculosa crnica ..................................... 59

3.3 Estudi dels efectes de la srum-terpia passiva amb

anticossos policlonals en el model experimental

de ratol SCID ............................................................. 65

4. DISCUSSI I PERSPECTIVES ......................................... 73

4.1 El model mur humanitzat ....................................... 76

4.2 La vacuna teraputica RUTI ....................................... 81

4.3 La resposta humoral induda per RUTI ....................... 83

4.4 La resposta cellular induda per RUTI ........................ 86

5. CONCLUSIONS ............................................................... 89

6. BIBLIOGRAFIA .............................................................. 91

7. COMPENDI DARTICLES .............................................. 111

7.1 Intragranulomatous necrosis in pulmonary

granulomas is not related to resistance against

Mycobacterium tuberculosis infection in

experimental murine models induced by aerosol ....... 113

7.2 Immunotherapy with fragmented Mycobacterium

tuberculosis cells increases the effectiveness of

chemotherapy against a chronical infection in

a murine model of tuberculosis ................................ 125

7.3 Passive serum therapy with polyclonal antibodies

against Mycobacterium tuberculosis protects against

post-chemotherapy relapse of tuberculosis infection

in SCID mice ............................................................ 131

8. ANNEX: LLISTAT DALTRES PUBLICACIONS ................ 139

8.1 RUTI induces a strong polyantigenic cellular

immunity and controls pulmonary pathology

and bacillary concentration in murine and

guinea pig experimental models of tuberculosis ....... 141

9. AGRAMENTS .............................................................. 171

1 INTRODUCCI

La tuberculosi (TB) representa ms dun quart de les morts adultes en

el mn que es podrien evitar (1). Segons dades de la Organitzaci

Mundial de la Salut (OMS) sestima que lany 2005 van haver 8.8

milions de nous casos, 7.4 milions daquests a lsia i lfrica sub-

sahariana. I que 1.6 milions de persones van morir de TB, entre elles

195 000 infectats per el virus de la immunodeficincia humana (VIH)

(2). Aix es tradueix en qu cada 3.5 segons una persona sinfecta per

TB i cada 19 segons una persona es mor de TB. A continuaci es

mostra un mapa en el qual es representa la distribuci de la TB a nivell

mundial.

TB: Incidncia estimada, 2005

Figura 1.1 Distribuci de la incidncia mundial de TB corresponent a lany 2005. Adaptat de la publicaci MAP TB notification, incidence and prevalence rates, inclosa al WHO Report2007 http://www.who.int/tb/publications/global_report/2007/download_centre/en/index.html

8.8 MILIONS DINFECTATS 1.6 MILIONS DE MORTS

1

http://www.who.int/tb/publications/global_report/2007/download_centre/en/index.htmlhttp://www.who.int/tb/publications/global_report/2007/download_centre/en/index.html

Introducci

1.1 La TB: pinzellades de la seva histria

Lorigen de Mycobacterium tuberculosis s incert, i al llarg del temps

shan proposat diferents teories per tal dexplicar-lo. La teoria ms

mpliament acceptada proposa que el gnere Mycobacterium derivaria

dun avantpassat com, que sanomena Mycobacterium archaicum, i que

shauria anat ramificant fins a donar lloc a la complexitat despcies

actuals (3).

Proposa que lespcie ancestral hauria viscut en estat lliure, i que della,

fruit de levoluci, haurien sorgit una branca conservadora, que

comprn les actuals espcies lliures, i una branca no conservadora,

amb espcies associades a organismes multicellulars en forma de

parsits patgens. Es diu que lassociaci entre micobacteris i

vertebrats hauria tingut lloc fa uns 300 milions danys, abans dels

vertebrats terrestres. Per tant, proposa una transmissi vertical entre

els vertebrats de llurs parsits.

Dacord amb aquestes afirmacions, avui dia sabem que Mycobacterium

tuberculosis prov duna forma bovina. I que, segurament, levoluci va

tenir lloc a lfrica, relacionat amb la domesticaci dels bvids. I potser

alguna forma africana de Mycobacterium va intervenir en el procs, com

a intermediari.

Finalment, cal destacar que lany 2005 es va publicar un article sobre el

possible origen de Mycobacterium tuberculosis (4). En aquest estudi, els

investigadors, analitzant genticament unes troballes realitzades a la

poblaci de Djibouti (E-frica), van concloure que els membres del

Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), els responsables de la TB,

(M.tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum, M. pinnipedii i M.

caprae), que mostren diferents caracterstiques fenotpiques i que

comprenen un ampli rang dhostes, representen un dels exemples ms

extrems dhomogenetat gentica. I encara ms rellevant, que es tracta

2

Introducci

dun conjunt despcies que pertanyen a la prognie clonal dun sol

ancestre com que va aparixer fa 3 milions danys.

LAntic Egipte

La TB s una malaltia present constantment a la histria de la

humanitat. Es tracta de la malaltia social infecciosa i devoluci crnica

per excellncia

Grcies a les proves realitzades amb cid desoxiribonucleic (ADN) fssil

recollit en excavacions arqueolgiques, sha pogut demostrar que la TB

ja era present en lEgipte de fa ms de 5 500 anys i fins al 500 aC (5).

La literatura assiriobabilnica fa nombroses referncies a la TB, per

cal dir que sha danar amb molta cura a lhora de valorar aquestes

referncies, donat que moltes altres malalties podrien deixar signes a

les restes semblants als que deixaria el pas de la TB. Si b, es fa difcil

afirmar la presncia de la TB grcies als textos, com hem dit, existeixen

altres dues fonts que la confirmen: 1) les representacions artstiques i 2)

les restes humanes, les mmies, a les quals es poden realitzar proves

dADN. La majoria de casos descrits corresponen a TB ssia. I encara

que hom sospita de lexistncia de TB pulmonar, ganglionar i intestinal

a lantic Egipte, no ha estat possible trobar lesions viscerals, donat que

aquestes, sextreien i es guardaven en vasos canopis un cop arribat el

moment de la momificaci.

Europa actual: societats prehistriques

Les primeres troballes europees daten del Neoltic. Grcies a la

paleopatologia el nombre de casos documentats s molt alt. Per

exemple, el cas dunes vrtebres dorsals afectades dun adult jove trobat

a un cementiri proper de Heidelberg, que data del 5 000 aC

aproximadament (6,7), casos despondilitis tuberculosa a Itlia, que

daten del 4 000 aC (8,9), casos trobats a Alemanya i Dinamarca, que

3

Introducci

daten del 2 500-1 500 aC (10). O un cas trobat a Anglaterra i que data

de ledat de Ferro, fa aproximadament 2 200 anys (11).

Lantiguitat clssica

Pel que fa a lextrem orient, la TB es troba present des dels primers

escrits que ens han arribat. El ms antic de tots s el Rig-Veda, 1 500

aC, que anomena Yaksma a la TB i li dedica un himne sencer al seu

guariment.

A la Xina, el primer text amb allusions a la TB s de carcter mdic, i

satribueix a lemperador Shen Nung, al 2 700 aC, es tracta dun recull

de remeis contra la malaltia.

A la Grcia clssica, la TB passa a anomenar-se tisi. El primer

personatge del qual hom pot trobar textos sobre la tisi s Herdot, al

481 aC, que descriu com un general no pot incorporar-se a la guerra

fruit daquesta malaltia. Hipcrates, al seu Tractat sobre les malalties,

llibre I, la colloca a la llista dafectacions que invariablement resulten

mortals. I, posteriorment, fruit del desenvolupament de lObservaci

Clnica per part de la Medicina Hipocrtica, podem veure una discussi

detallada sobre els principals smptomes de la tisi, la seva edat

dincidncia, les variacions estacionals i el seu pronstic, a lobra

Collecci Hipocrtica.

Es fa difcil conixer la incidncia de la TB en aquella poca, per

podem deduir del elevat nombre de descripcions clniques que la TB

pulmonar era una malaltia molt freqent.

Va ser Aristtil, lany 350 aC, el primer en assenyalar la natura

contagiosa de la TB. A aquesta corrent dopini shi van afegir

importants metges de lpoca. Com a tractament dels casos aguts de TB

es prescrivia reps, banys i dieta lquida, mentre que per als casos

crnics es recomanava exercici moderat i dieta de fcil assimilaci.

4

Introducci

LAmrica precolombina

Sha discutit molt sobre si els europeus sn els responsables de la

introducci duna soca molt virulenta de Mycobacterium tuberculosis al

Nou mn, i/o si van ser ells els qui van introduir el microorganisme per

primera vegada.

Actualment, existeixen estudis que confirmen la presncia de TB al

continent americ abans del contacte amb els europeus (12). La

hiptesi ms mpliament acceptada s que la TB hauria arribat a

Amrica fa 10 000-20 000 anys, fruit de les migracions procedents

dsia, a travs del pont de Beringia. I hauria assolit nivells epidmics

lligat al fet sociocultural de canviar el tipus de vida nmada dels petits

grups per lestabliment de comunitats sedentries molt ms poblades

(12,13).

Tot i aix, altres fets socioculturals, la diferent patognia de les soques

europees... van provocar que la poblaci autctona rebs un fort

impacte per la TB durant el descobriment del continent per part dels

europeus.

Europa: de lEdat Mitjana al segle XVIII

Els coneixements sobre la TB van restar inalterats fins al segle XVII. No

s fcil concretar la incidncia que va tenir la malaltia a lEdat Mitjana,

per podem deduir de manera indirecta que va ser important, degut a

lestabliment de la cerimnia del toc reial. Lnica causa possible de la

malaltia era la intervenci divina, segons la creena popular. I donat

que tamb es suposava que els monarques tenien poder guaridor, el

tractament ms desitjat era ser tocat per ells, mentre pronunciaven la

frase El Rei et toca, i Deu et guareix (14).

5

Introducci

Figura 1.2 Gravat on es pot veure a Henri IV de Frana tocant als malalts descrfula, mot referit a diverses formes de TB no pulmonar, sobretot la ganglionar cervical. Gravat de Pierre Firers, extret del treball dAndr de Laurens.

La incidncia de TB va augmentar progressivament durant lEdat

Mitjana i el Renaixement. Desplaant incls a la lepra. I ja al segle XVII

s considerada un greu problema de salut pblica en tots els pasos

occidentals.

La gran epidmia europea, que minv incontablement la poblaci, va

rebre el nom de Pesta Blanca, amb inici al segle XVII i fi al segle XIX

(15). Els valors mxims de mortalitat senregistren entre el 1780 i el

1880, coincidint amb la migraci massiva dels camperols cap a les

ciutats buscant un lloc de treball a les fbriques. Tradut en dades

numriques, per exemple a Espanya les estadstiques oficials parlen de

30 000-75 000 morts anuals per TB.

Per no tot va ser negatiu en aquest perode de la histria. La nova visi

de lanatomia sorgida durant el Renaixement va permetre realitzar

estudis anatmic-patolgics. Silvius (1614-1672), grcies a les

autpsies, va ser capa de relacionar els tubrculs descoberts en el

teixit necrosat amb els smptomes de tisi que havia patit el pacient

(3,14). Richard Morton (1637-1698) va incloure dins del concepte de tisi

lafebliment que pateix lorganisme, tot ben descrit en la seva obra

Phthisiologia (1720), una obra monogrfica sobre la malaltia

tuberculosa que resumeix tots els coneixements sobre TB que existien

fins aquell moment. I Pierre Dessault (1675-1737) va establir que es

tractava duna malaltia infecciosa i que els esputs podrien ser la causa

6

Introducci

del contagi, per es tractava dun punt de vista massa avanat per a la

seva poca, i fou rpidament oblidat.

El Romanticisme

Durant el Romanticisme la TB es va convertir en la malaltia de moda.

Hom percebia la mort com un vehicle per alliberar-se. El sucidi o

labandonament personal fins a contraure la TB i morir eren els

objectius ms desitjats. Laparena ideal era una natura malaltissa, on

hi destacaven la pallidesa, laspecte frgil, lexpressi de sofriment i

una sensibilitat extrema.

La TB sesdev culturalment la malaltia dels privilegiats i es creu que

confereix als malalts un increment de la creativitat. Es relaciona

sobretot amb la classe social amb elevat poder adquisitiu, els joves i les

dones.

Grcies a les estadstiques hom ha pogut comprovar que no es tractava

duna malaltia de rics, ni molt menys. La TB afectava principalment a la

classe treballadora degut a les condicions de vida, dhabitatge, de

treball i dalimentaci (16).

Ja durant el segle XIX, t lloc un canvi dactitud de la societat envers la

TB, i el personatge del malalt adquireix les mateixes connotacions que

t avui dia. El tsic passa de ser un heroi a convertir-se en un marginat

social.

La causa de la tisi encara era desconeguda. La polmica sobre el seu

carcter hereditari o contagis encara romania present a la societat. I a

mitjans del segle XIX el tractament encara era variat i inefica, basat en

sagnies, purgants, emtics i una dieta enfortidora. I va ser durant

aquesta poca, que es va considerar que laire atmosfric tenia qualitats

benefactores, la qual cosa precedeix segurament el culte a laire pur que

va tenir lloc durant lpoca sanatorial.

7

Introducci

El fet ms destacat satribueix al metge militar Jean-Antoine Villemin

(1827-1892), que realitzant experiments sobre la transmissi de la TB,

inoculant conills amb matria tuberculosa i pus de malalts humans i

bvids, va ser capa lany 1865 de demostrar que la TB havia de ser

inclosa dins dels grup de les malalties virulentes. Cal dir per, que la

seva opini no va ser mpliament acceptada, fins que al 1877 Julius

Conheim i Carl Salomonsen van ser capaos de reproduir experiments

semblants.

El bacil de Koch

Heinrich Hermann Robert Koch (1843-1910)

era un metge prussi que ha estat considerat

el fundador de la bacteriologia. Grcies als

estudis que va portar a terme sobre el

carboncle, va ser capa de descobrir-ne lagent

causal, el Bacillus anthracis.

Per no sols aix, grcies aquests estudis

previs tamb havia estat capa de

desenvolupar la tcnica dels cultius purs, Figura 1.3 Foto de Koch considerada com una de les major aportacions

del cientfic alemany a la microbiologia, i desenvolup noves tcniques

de tinci. Tamb cal destacar que grcies al seu treball al pavell de

tsics de lHospital de la Charit de Berln, tenia accs a material

patolgic. I, tot aix, li va proporcionar una base slida per a iniciar

lestudi de lagent causal de la TB el 18 dagost de 1881 (17,18).

Noms 8 mesos ms tard, el 24 de mar de 1882, aplicant els seus

propis postulats, Els postulats de Koch, a aquesta malaltia, havia

estat capa descobrir-ne lagent causal, el Mycobacterium tuberculosis

(19). Va observar i allar el bacil de lesions tuberculoses, el va cultivar in

vitro, el va inocular en animals i va veure que produa la mateixa

malaltia i, finalment, va poder recuperar novament el bacil de les

8

Introducci

lesions. Des daquest moment, el dia 24 de mar sesdev el Dia

Mundial de la Tuberculosi.

El descens de la TB

Grcies a la millora en les condicions de vida, incloses les millores

laborals, la higiene i la nutrici, la incidncia de la TB va comenar a

disminuir. I aquesta s la tendncia que sha mantingut fins a la segona

meitat del segle XX, exceptuant els perodes de catstrofes mundials,

com van ser la Primera i la Segona Guerra Mundial.

Aviat la presncia del bacil tuberculs a lesput va ser considerada com

la prova diagnstica per excellncia. Els descobriment dels raigs X, que

va portar a terme W.C. Rntgen (1845-1925), va permetre lestudi de les

lesions pulmonars i es va implantar arreu rpidament.

Encara no es disposava dun tractament efectiu contra la malaltia, i la

medicaci es basava en cures de reps, combinades amb exercici suau i

aire pur, complementades amb una bona alimentaci. Els sanatoris

eren centres hospitalaris, amb una rigorosa reglamentaci, a vegades

ms estrambtica que teraputica, que tenien una doble missi: allar

els malalts tuberculosos per evitar contagis i curar aquests malalts. El

primer sanatori europeu el va fundar Hermann Brehmer al 1854 (15). I

el primer sanatori americ, en Edward Livingston Trudeau, al 1884

(20). Com a complement de la terpia sanatorial, es va desenvolupar la

collapsoterpia, amb una pea clau, el pneumotrax artificial de

Forlanini (1906), i tamb la toracoplstia.

El 4 dagost de 1890, R. Koch va desvetllar els resultats que havia

obtingut sobre una substncia que podia prevenir el creixement del

bacil tuberculs, la tuberculina (21). Avui dia sabem que el Govern

Prussi va pressionar al cientfic perqu fes pblic el seu descobriment.

I s fruit dun assaig clnic molt poc rigors, on no es van respectar les

indicacions teraputiques den R. Koch i on lestudi estadstic mostra

9

Introducci

mancances importants, que es va condicionar i es condiciona encara

avui dia ls de la immunoterpia contra la TB (19).

Tot i aix, existeixen moltes evidncies [22,23,24,25] que demostren que

ls teraputic de la tuberculina va estar mpliament ests fins a la

segona meitat del segle XX. I, bviament, no existeix cap dubte del

potencial diagnstic de la infecci mitjanant la tuberculina, donat que

s el sistema que encara sempra actualment, substituint la tuberculina

antiga de la prova originria per un derivat protenic purificat (PPD),

que presenta menys reaccions inespecfiques.

Les aproximacions quimioteraputiques van comenar a generalitzar-se

cap al 1920, amb ls de sals dor (sanocrisina). Per no va ser fins a la

meitat de la Segona Guerra Mundial, que es va descobrir el primer

antibitic efica contra Mycobacterium tuberculosis, lestreptomicina, per

Selman Abraham Waksman. Paradoxalment, i per combatre mutacions

resistents a lestreptomicina (26), es van realitzar tractaments

combinats amb isoniazida (INH), que shavia descobert al 1912, per

que havia passat desapercebuda (3). Posteriorment, es van anar

introduint la resta dantibitics, que utilitzem encara per combatre la

TB: cicloserina (1955), kanamicina (1957), rifampicina (RIF) (1965),

etionamida (1966), etambutol (1968) i pirazinamida (PZA) (1970).

Lany 1956 es va portar a terme lestudi de Madrs, amb la finalitat de

valorar la possibilitat deliminar el ingrs hospitalari del malalt, per tal

de rebaixar el cost de les campanyes antituberculoses, sobretot al

Tercer Mn. Aquest experiment va aclarir dos fets del tractament: la

possibilitat que el malalt contagis a les persones del seu entorn, i la

influncia de la dieta en el tractament. Al 1966 va quedar demostrat

que la possibilitat de contagi no era superior si el malalt es quedava a

casa, i que el rgim alimentari no influa en la resposta al tractament.

Aix va fer que molts sanatoris tanquessin, i que es modifiqus

lenfocament teraputic de la malaltia.

10

Introducci

A ms a ms, estudiant el problema de lautoadministraci, al Centre de

Quimioterpia Tuberculosa de Madrs, es va veure que els efectes

secundaris desagradables del tractament feien que el malalt no el

prenguessin. Aquest fet ja shavia vist a altres parts del mn, i la nica

soluci que es veia al problema era que sadministrs el tractament per

part del personal sanitari, una proposta inviable de posar en prctica.

Aquest fet va ser, sens dubte, una visi futurista de la implantaci,

per part de la OMS, de lactual Tractament Directament Observat

(TDO).

Junt amb lesperit de voler guarir la TB, al segle XX tamb hi va haver

lesperit de voler prevenir la malaltia. Encara que cal dir que lobtenci

de la vacuna adequada va ser fruit duna observaci casual. Albert

Calmette (1863-1933) i el seu ajudant Camille Gurin (1872-2961) van

cultivar el bacil de la TB bovina, Mycobacterium bovis, en un medi

glicerinat de patata amb bilis de bou, per afavorir-ne lemulsi, i van

descobrir que els successius cultius provocaven una disminuci

progressiva de la virulncia. Al cap de 231 passades, el bacil atenuat de

Calmette i Gurin, la vacuna BCG, va participar en el primer assaig

clnic (1921-1927), mostrant la seva protecci en nens (14). Tot i la

presncia de diversos estudis amb conclusions contradictries, el fet

que es determins que era inncua i que produa un cert grau

dimmunitat, va fer que el seu s sestengus, un cop registrat el fort

increment de la TB desprs de la Segona Guerra Mundial (27).

Actualment, la BCG s encara la vacuna de referncia utilitzada a nivell

mundial, i es continua administrant en llocs delevada incidncia. Cal

dir per, que ens resulta difcil determinar amb precisi quina pot haver

estat la influncia de la vacunaci massiva amb BCG sobre el descens

de la TB, donat que la seva eficcia s motiu de discussi encara avui

dia.

11

Introducci

TB: una malaltia reemergent

La situaci assolida feia pensar que el problema de la TB es podria

resoldre durant les properes dcades als pasos desenvolupats, i poc

desprs a la resta del mn. Es confiava plenament en la vacunaci

massiva i en la quimioterpia, i shavia comenat a treballar en

tractaments que actuessin contra la infecci tuberculosa latent (ITBL).

Per laparici de lepidmia de la Sndrome dImmunodeficincia

Humana Adquirida (SIDA), a principis dels anys 80, va fer que la

regressi de la TB saturs. El VIH no ha fet altra cosa que augmentar

les probabilitats demmalaltir en el cas dindividus amb ITBL i de morir

en el cas dels malalts. I el problema encara sha fet ms complicat amb

laparici de soques de M.tuberculosis resistents (TBR) i multiresistents

(TBMR) als frmacs emprats (28).

Fruit duns programes de control de TB inadequats, les xifres

dincidncia, prevalena i mortalitat assolides van obligar a la OMS,

lany 1993, a declarar la TB com una emergncia de salut pblica.

La OMS va comenar a promoure el TDO lany 1991 (29,30), i ja al 1994

va produir un marc per al control efica de la TB (31), on feia una

descripci de lestratgia TDO. Aquest marc fou revisat i ampliat lany

2002 (32), per promoure una expansi geogrfica del camp dactuaci i

per incloure-hi la problemtica de les TBR i TBMR.

Molt breument, els principis bsics del TDO sn:

- Intervenci organitzada i sostinguda per part dels governs

- Identificaci rpida dels casos

- Quimioterpia efica i fcil, administrada de manera directa i sota

supervisi

- Maneig eficient dels frmacs

- Sistema de comunicaci i registre de dades

12

Introducci

Lobjectiu general de la OMS s eradicar la TB lany 2050. Amb aquesta

finalitat lany 2006 es va formular The Global Plan to Stop TB (2006-

2015) (33); amb els objectius concrets de millorar i reforar els sistemes

sanitaris, augmentar els recursos humans, incloure aspectes

relacionats amb el control del VIH i les soques resistents i

multiresistents als plans dactuaci; promoure noves proves

diagnstiques, aix com promoure la investigaci i el desenvolupament

de nous frmacs i noves vacunes. Els resultats publicats a linforme

anual de lany 2007 (2) mostren que anem assolint objectius. Tot i ser

aix, la victria final contra la TB encara ens queda lluny.

1.2 La infecci tuberculosa latent (ITBL)

La infecci per M.tuberculosis afecta avui dia a un ter de la humanitat,

s a dir, a 2 500 000 000 de persones. Linters en lestudi de la ITBL i

el seu tractament es basa en el fet que, en un 10% dels casos tindr lloc

un recreixement bacillar donant lloc a una TB (34).

Podem dir que sestableix la infecci quan M.tuberculosis t la capacitat

de crixer al interior dels macrfags alveolars. Avui dia, aquest fet el

podem demostrar a travs de la inoculaci intradrmica de PPD, tamb

anomenada prova de Mantoux, i la posterior avaluaci de la resposta

immune dhipersensibilitat retardada (DTH) que genera (34). O

visualitzant la presncia de cllules T efectores productores dIFN- en

cultius de cllules monoctiques de sang perifrica (PBMCs), desprs

dun estmul curt amb antgens especfics, (35) mitjanant la tcnica

dELISPOT. O b, detectant la producci dIFN- en el sobrenedant

daquests mateixos cultius, mitjanant la tcnica dELISA.

Un cop comprovada la infecci, cal realitzar una radiografia de trax,

per tal de visualitzar lesions pulmonars. Si es detecten lesions actives o

13

Introducci

de nova generaci, es diagnostica una TB (34). Si pel contrari, no es

troben lesions, estem davant duna ITBL.

Laparici del bacil latent (BL) ha estat un punt clau de la infecci per

M.tuberculosis. Segurament, aquest ha estat un dels aspectes que ms

ha motivat als cientfics estudiosos de la TB, fins al punt que la infecci

per M.tuberculosis ha passat a dir-se infecci tuberculosa latent.

Duna banda, sabem que qualsevol gnere bacteri presenta formes de

resistncia o formes metablicament enlentides que fan front a lestrs

ambiental, a la manca de nutrients, mitjanant un canvi metablic que

condueix a la inducci de la Fase Estacionria (FE) (36). I en totes

aquestes bactries sha pogut demostrar que, aquest estat els confereix

una major capacitat de resistncia (37).

I, daltra banda, es pot destacar que mitjanant estudis de genmica i

protemica sha demostrat que els micobacteris no difereixen gaire de la

resta de microorganismes (38).

Per qu tanta importncia, doncs, per respondre a la pregunta : Qu s

el BL ? Doncs, la soluci la trobem en qu cal conixer molt b aquest

bacil per poder demostrar la validesa dun nou tractament contra la

ITBL.

Models in vitro de latncia

Sens cap dubte, linters sobre els BL va comenar lany 1948, quan els

investigadors van adonar-se que les recaigudes de la malaltia, que

tenien lloc mesos o anys desprs del tractament, no es podien justificar

per ladquisici de resistncies als antibitics utilitzats, donat que es

feien servir pautes farmacolgiques mltiples (39).

A finals de la dcada dels anys 70, amb la introducci de la rifampicina

i determinats estudis per explicar per qu amb laddici daquest frmac

14

Introducci

al tractament es podien esterilitzar les lesions ms rpidament,

Mitchinson i Dickinson van predir lexistncia duna poblaci bacillar

que no presentava activitat metablica o que la tenia molt reduda. (40).

De fet, els seus estudis sn la base per a les teories sobre les poblacions

bacillars en les lesions de TB, fonamentades en la velocitat de

proliferaci dels microorganismes (41,42) Aquests descobriments van

donar sentit a les observacions clssiques sobre la capacitat de

persistncia de M.tuberculosis en cultius antics (43) i es corresponen

amb les reactivacions que poden tenir lloc a la ITBL (44,45).

Totes aquestes observacions van donar lloc a lorigen del mecanisme de

ressuscitar, que recentment sha vist afermat per la troballa de

protenes per ressuscitar, capaces dinduir el recreixement de BL que

es trobaven en condicions de FE durant molt de temps, al llarg del qual

la seva viabilitat no shavia pogut demostrar per altres mtodes (46).

Per, aquest mecanisme difcilment pot explicar com els BL de lesions

tuberculoses antigues poden recrixer i generar una TB activa, si tenim

en compte que les protenes per ressuscitar les generen bacils en

creixement actiu.

Per demostrar la capacitat dels bacils per adaptar-se a condicions de

microaerobiosi i danaerobiosi, Wayne i Lin (47,48) van portar a terme

experiments amb medis artificials. Van demostrar que, induint

progressivament una baixa pressi doxigen, M.tuberculosis canviava el

seu metabolisme a travs de lestimulaci dalguns enzims. Aquest canvi

metablic va rebre el nom del shunt del glioxilat (49), i es va veure que

tenia dos finalitats, obtenir poder reductor (NAD) per poder portar a

terme una respiraci de tipus fermentaci anaerbica i obtenir energia a

partir de compostos lipdics (50).

Aquest estudi es pot criticar per la relativa importncia que t la baixa

pressi doxigen perqu M.tuberculosis proliferi als teixits de lhostatger.

15

Introducci

De fet, les condicions microaerfiles generades artificialment sn les que

ja existeixen als macrfags de forma fisiolgica (51).

Tamb s criticable perqu, els resultats de cultius en anaerobiosi, per

contra, demostren que els bacils no sobreviurien ms enll dalguns

mesos. De fet, lanaerobiosi podria donar-se en el cas de grans lesions

presents en TB actives, o incls en aquelles fibrosades a mig cam de

ser calcificades, per, fins a la data, aquest ambient mai sha trobat en

la ITBL. Com a molt, sha pogut demostrat un ambient de

microaerobiosi, que daltra banda s habitual en la majoria de teixits

cellulars.

I finalment, tamb sha pogut veure creixement bacillar exponencial en

experiments portats a terme amb ratolins Knock Out (KO) per citocines

bsiques en la resposta immune, com IFN- o TNF-, o de cllules T

CD4, que presentaven grans lesions necrtiques, definides com lesions

amb baixa concentraci doxigen (52,53).

Models in vivo de latncia

Podem afirmar que, la major part de la informaci disponible sobre

lorigen dels BL prov dels estudis portats a terme amb models

experimentals dinfecci tuberculosa. Aix ha estat possible grcies al

parallelisme existent entre fase crnica i ITBL.

Els estudis clssics den Wallace (54) van demostrar en el model mur

que els bacils de pulmons infectats en fase crnica eren molt ms

resistents a lestrs per calor que quan aquests mateixos bacils eren

allats en fase aguda. Ja que els bacils allats de cultius en FE tamb

eren ms resistents a aquest estrs que els bacils procedents de fase en

creixement exponencial (FIG 1.4A), es va concloure que la resistncia a

lestrs per part del bacil en fase crnica tenia el seu fonament en el

metabolisme enlentit que presentava com a conseqncia de trobar-se

en FE.

16

Introducci

Aquesta teoria ha estat confirmada recentment per altres autors (55),

mitjanant la comparaci entre la concentraci de bacils viables i lADN

cromosmic, un parmetre que reflexa tant els bacteris viables com els

bacteris morts. Durant la infecci crnica, els recomptes de UFC es

mostren estables, i podem tenir dos possibles situacions per explicar

aquest fet. Que tingui lloc un equilibri esttic, on la replicaci s

mnima o nulla i per tant, veiem una petita diferncia en levoluci i la

quantitat dambds parmetres, bacils viables i ADN cromosmic (FIG

1.4B). O b, que tingui lloc un equilibri dinmic, on lelevada taxa de

replicaci queda compensada amb una elevada mortalitat, fruit de la

resposta immune adquirida, i a on podrem veure nombres constants de

bacils viables per quantitats creixents dADN cromosmic, donat que

aquest pateix un procs dacumulaci. Doncs b, aquests autors

demostren que lacumulaci dADN cromosmic s mnima durant la

fase crnica. I aquesta dada reflexa que els bacils en fase crnica es

troben predominantment en FE, com va predir en Wallace al 1961.

Figura 1.4 Parallelisme existent entre fase crnica i ITBL. (A) Experiments clssics den Wallace. (B) Demostraci de lequilibri esttic en fase crnica. Adaptat de la publicaci Cardona. Inflammation & Allergy-Drug targets 2007;6:27-39 (56)

Per tant, es pot concloure que els BL sn la poblaci bacillar capa de

sobreviure a la immunitat especfica de lhoste i de persistir durant la

fase crnica de la infecci, i es troben predominantment en FE.

17

Introducci

La TB presenta unes caracterstiques fonamentals, com sn la

presncia, a les lesions, de diferents poblacions bacterianes segons la

seva fase metablica, distribudes en diferents nnxols ecolgics, bacils

intra i extracellulars, amb diferents concentracions de pH, pressi

doxigen, i molts altres parmetres, que fan massa complicada la tasca

de modelitzar-ho tot in vitro. Per aquest motiu, els models experimentals

animals han estat tan importants en lestudi de la TB. Sobretot, el

model mur de TB, que ha estat clau en lestudi de la patognia de la

malaltia, aix com en lestudi del seu tractament.

Des de fa molts anys, el coneixement sobre la histopatologia de la TB

humana es basa en els estudis portats a terme per Lurie (57,58,59,60)

amb dues soques de conills, sensible i resistent, i que van ser

posteriorment completats i interpretats per Dannenberg

(61,62,63,64,65,66). Daquests experiments es dedueix que el model de

TB desenvolupat en la soca resistent de conills de Lurie s el que ms

mimetitza levoluci de la TB en lsser hum immunocompetent.

Aquests animals sn capaos de desenvolupar una resposta immune

molt important, amb la presncia de lesions cavitades, i devitar la

disseminaci de noves lesions.

Els conills porquins sn molt ms susceptibles a M.tuberculosis si els

comparem amb els conills i els ratolins. Els conills porquins

requereixen dun incul aproximadament 100 vegades menor que el

conill i el ratol, i la infecci progressa cap a la mort en tots els casos.

Cal destacar que, en aquests animals t lloc una forta disseminaci

hematgena, i que desenvolupen lesions necrtiques i cavitades (67). La

presncia de DTH en aquests animals s molt important i t una

durada molt llarga en el temps. De fet, aquesta va ser la reacci

inicialment descrita per Koch (68). Sestimula a dosis molt baixes de

PPD, i s extraordinriament similar a la reacci produda en humans,

tant macro com microscpicament. Per aix es tracta dun bon model

per estandarditzar les tuberculines.

18

Introducci

Si comparem el model de conill porqu amb el model mur, podem

afirmar que es tracta danimals amb molta ms capacitat per respondre

contra M.tuberculosis, capaos dexercir un millor control sobre la

concentraci bacillar. Histopatolgicament, mostren granulomes ms

ben definits i estructurats, amb una capa gruixuda de fibrosi a

lexterior, necrosi intragranulomatosa, i no es detecten gaire bacils, sols

en la perifria del granuloma i dins dels macrfags escumosos. I aquest

fet sexplica molt fcilment: tenen un volum 50 vegades major que els

ratolins. El fet de tenir un volum superior, si assumim que el tamany de

les cllules del sistema immune s similar en tots els mamfers, fa que

puguin desenvolupar una resposta immune molt ms intensa, generant

teixit necrtic (teoria dels volums)[69]. Actualment, en el cribatge de

vacunes profilctiques, sutilitza aquest model per avaluar la toxicitat,

monitoritzant la prdua de pes al llarg del temps.

La utilitzaci del model mur de TB, en lactualitat, supera molt als

models anteriorment descrits. Lgicament, una de les raons de pes ha

estat el preu, i laltre ra ha estat el manteniment dels animals. Tamb

cal destacar que la immunologia del ratol es coneix millor que la dels

altres models citats. I que existeix un major ventall de reactius per

poder estudiar la resposta immune en aquest model.

El model experimental de Cornell (70,71) es va convertir en la primera

prova experimental de lexistncia de BL. Aquest model es va fer servir

durant molt de temps i, encara avui dia hi ha cientfics que el fan servir.

Es basa en la inoculaci endovenosa a ratolins duna elevada

concentraci de M.tuberculosis, aproximadament 105 UFCs. Es deixa

que la infecci es desenvolupi durant dos setmanes; pulmons i melsa

arriben a assolir concentracions bacillars de 107 UFCs. Desprs es

realitza un tractament antibitic amb INH 25mg/Kg i PZA 1g/Kg. I es

pot comprovar que a les 12 setmanes els rgans sn aparentment

estrils, donat que no sobserva cap bacteri cultivable. Quan es tracten

els animals amb cortisona, durant quatre setmanes, a partir del segon o

19

Introducci

del tercer mes posterior a la finalitzaci del tractament antibitic, es pot

observar la reactivaci de la infecci en el 100% dels casos. Es postula,

doncs, que durant aquest temps que els teixits semblen estrils, els

bacils es trobarien en fase latent.

El model mur ha estat presentat com el paradigma de lhoste capa de

posar en marxa una resposta immune efica contra M.tuberculosis,

donat que exerceix un control sobre la infecci sense provocar necrosi

als teixits infectats, s a dir, sense gaire toxicitat per a les cllules.

Grcies als avenos tcnics en immunologia i biologia molecular shan

pogut conixer millor els mecanismes implicats en la resposta immune

del model mur. Existeixen estudis (72,73,74) que demostren la

presncia duna resposta immune de tipus cellular on intervenen

limfcits T CD4 del subtipus Th1, capaos de secretar IFN-, que junt

amb el TNF- present, provoquen un efecte bactericida contra

M.tuberculosis. Sembla que, en aquest fet, podrien intervenir radicals

doxigen i de nitrogen, aix com la disminuci del pH a linterior del

fagosoma (75,76).

Tamb sha pogut demostrar, grcies a aquest model, la participaci de

les cllules T del tipus per regular lestructura del granuloma (77), la

presncia de cllules natural killer (NK) a linici de la resposta immune

inespecfica (78,79), aix com una poblaci de limfcits de memria

capaos de proliferar davant duna reinfecci (80,81). La relaci entre la

inducci de la DTH i les cllules T CD4 productores de IFN- s

controvertida. Per un cant sha observat una poblaci de cllules T

CD4 responsables de portar a terme la DTH diferenciada de la poblaci

de limfcits T CD4 que sintetitzen IFN- (82). Per un altre, sha

demostrat que ambdues poblacions es sobreposaven (83). I un fet

observat, molt important, s que la poblaci de limfcits T CD4

responsables de la resposta immune protectora sestimulava amb la

20

Introducci

presentaci dantgens secretats per M.tuberculosis al interior del

fagosoma.

La nostra experincia amb el model mur dinfecci per aerosol de baixa

dosi (84) ens va portar a formular una hiptesi ben diferent de la

establerta i a introduir dubtes sobre leficincia de la resposta

immunitria del ratol contra el micobacteri (85). Als nostres estudis

sobre levoluci de la histopatologia (FIG 1.5), vam poder observar

lesions primries, poques, representades per acmuls de neutrfils,

macrfags i limfcits, que amb el temps sacabaven limitant per un

anell limfoctic. Posteriorment en el temps, apareixien lesions

secundries, moltes, formades per un petit nombre inicial de macrfags

que eren rpidament envoltats per limfcits. Aix sexplica perqu quan

es desenvolupen aquestes lesions, l'hoste ja disposa duna resposta

immune adquirida important.

Malgrat que inicialment no es va tractar dun fet que ens crids

latenci, donat que sn cllules que es troben presents en lesions

pulmonars de diverses etiologies, el fet ms important de les nostres

observacions ha estat descobrir lenorme importncia que tenen els

macrfags escumosos (ME).

Amb el temps, tant les lesions primries com les secundries,

apareixien envoltades duna corona de ME, que ocupaven lespai

intraalveolar. Es tracta de macrfags que netegen les lesions de

detritus cellulars. Molts daquests macrfags estarien activats

directament per limfcits o b per la ingesta de detritus que contenen

restes de paret cellular bacteriana. Aix sha pogut comprovar grcies a

lexpressi de la xid Ntric Sintasa (NOS). Vam poder observar que els

ME podien portar algun bacil al seu interior, i si sobservava la

presncia de molts bacils en linterior de ME, aquests es trobaven fora

dels granulomes, i amb aspecte fora deteriorat.

21

Introducci

Pensem que lhostatger podria ser enganyat pel bacteri, donat que

davant de la situaci destrs es tornaria invisible per a les cllules de

la resposta immune, probablement disminuint el seu metabolisme i

entrant en una fase de latncia, de manera que no hi hauria creixement

bacillar. Cal tenir en compte que la resposta immune es dirigeix contra

pptids que sintetitzen els bacils en creixement, i per tant, els BL

passarien desapercebuts.

O b, una altra explicaci possible, que no excloent, seria que el nivell

dactivaci daquests ME no els permetria portar a terme la destrucci

dels bacils, donat que sintetitzen xid Ntric (NO), que pot provocar

immunosupressi local. Quan aquestes cllules es trobaven plenes de

cossos lipdics i no podien fagocitar res ms, es dirigien cap als espais

alveolars, per ser conduts cap als espais bronquials superiors

mitjanant lepiteli ciliar (86). Els bacils que carreguen al seu interior

podien, doncs, iniciar una fase de creixement exponencial en zones del

parnquima pulmonar lliures de la pressi immune. I, daquesta

manera, aquestes cllules serien capaces de generar noves lesions

secundries constantment, mitjanant la disseminaci.

Aquestes cllules serien doncs, el factor clau per a lescapament dels

bacils cap a fora del granuloma. Aquesta hiptesi tamb ens ajuda a

explicar per qu sobserven nivells constants de citocines claus per a la

resposta immune, com IFN- o TNF-, al teixit dels animals infectats i,

tot i aix, no saconsegueix esterilitzar-los. I aquesta tamb podria ser la

ra per la qual els ratolins moren per la quasi total ocupaci del

parnquima pulmonar (87,88,89).

22

Introducci

Figura 1.5 Evoluci dels granulomes pulmonars en el model mur de TB. (A) infecci inicial dels macrfags alveolars; (B) formaci dun pregranuloma i disseminaci pulmonar; (C) aparici de la resposta immune adquirida, es crea un anell de limfcits; (D) aparici dels ME, ms externament, amb algun bacil al seu interior (rodejat dun cercle vermell); (E) aquesta bacils poden reactivar, destruint el ME i, generant granulomes secundaris, que sacabaran transformant en terciaris. Adaptat de la publicaci Cardona. Inflammation & Allergy-Drug targets 2007;6:27-39 (56)

Tot i que el model mur dinfecci crnica s el ms emprat en

lactualitat, molt possiblement la seva utilitat no sempre es porti a

terme de la manera ms adient. Cal destacar que alguns dels

investigadors que treballen amb models murins de TB, sovint semblen

oblidar la histria natural daquesta malaltia. I, o b per comoditat, o b

per economitzar els estudis, i sovint amb plantejaments experimentals

erronis, porten a terme la infecci dels animals mitjanant inoculaci

endovenosa delevades concentracions de M.tuberculosis, en comptes de

portar a terme la infecci per aerosol. bviament, quan sinocula una

elevada concentraci bacillar en la melsa, es genera de manera quasi

immediata una immunitat especfica contra M.tuberculosis, i aix sobt

una poblaci a nivell pulmonar molt ms minsa que la induda per

aerosol. Podem dir, que es tracta dun model molt menys agressiu

(88,89). I sols seria adient per a determinats tipus destudis.

23

Introducci

El model mur humanitzat

Una de les caracterstiques ms importants de la infecci per

M.tuberculosis en els humans, s el fet dinduir necrosi

intragranulomatosa (90). Altres micobacteris, com per exemple M.

avium, no ho poden fer (91).

Que al model clssic de ratol no es geners aquesta necrosi (92), ens va

semblar, si ms no, inoport, per tal que implicava dos fets importants.

Primer, feia disminuir molt la capacitat dextrapolar les observacions

realitzades en aquest model, a lhum. I segon, provocava que al model

no exists una poblaci bacillar extracellular, necessria per valorar

lefecte de nous antibitics i noves vacunes teraputiques.

Sabem que la concentraci bacillar que sassoleix en la fase dinfecci

s similar a la que es detecta en humans, en conills i conills porquins,

on si que es produeix la necrosi intragranulomatosa (58,78,93). Per

aquesta ra, pensem que lnica explicaci possible per aquesta manca

de necrosi s que el ratol sigui un hoste menys sensible (o el que seria

el mateix, ms tolerant) als antgens de M.tuberculosis i que, per tant,

necessiti duna concentraci bacillar superior perqu sindueixi. Dues

dades que afermen aquesta teoria sn que, shan aconseguit

concentracions bacillars elevadssimes en ratolins KO per IFN- (52), on

es pot observar necrosi intragranulomatosa; i que per aconseguir una

resposta DTH mitjanant tuberculina PPD RT-23 en ratol ens calen

50g, al conill porqu 5 g i en el hum en tenim prou amb 0,04g

(83,94,95).

Amb lobjectiu de mimetitzar al mxim les condicions presents en la TB

humana, el nostre grup va desenvolupar el model mur de TB

humanitzat (96).

24

Introducci

Abans de poder induir necrosi intragranulomatosa en el model havem

de saber quina era la causa daquesta necrosi, com podem induir la

seva aparici. En aquest sentit, cal dir que lestudi bibliogrfic ens va

ajudar molt. Lorigen de la necrosi shavia relacionat des de linici de les

investigacions sobre TB amb el fenomen de Koch (97).

Buscant un mtode teraputic contra la TB, Robert Koch va veure que

quan infectava un conill porqu intradrmicament, als 10-14 dies podia

veure un petit ndul amb ulceraci al lloc dinoculaci, junt amb la

disseminaci cap als ganglis limftics propers i cap a diferents rgans,

provocant la mort de lanimal en pocs mesos. Per tamb va veure que

si reinfectava aquest animal, la reacci immune que es produa era ben

diferent. A les 24-48 hores, observava una escara que es resolia sense

problemes, els ganglis no es veien afectats i no hi havia disseminaci

sistmica. Utilitzant cultius estrils filtrats i concentrats per evaporaci

va crear la tuberculina antiga. Posteriorment, Von Pirquet va

extrapolar que la reacci a la tuberculina implicava un contacte previ de

la persona amb M.tuberculosis (98), i va introduir el mtode diagnstic

que, sense gaires modificacions, encara fem servir avui dia.

La Reacci de Koch es va definir com una resposta immune

dhipersensibilitat retardada (99). Grcies al seu estudi, es va veure que

les cllules presentadores dantgens locals (APCs), macrfags o

cllules dendrtiques, eren capaces de captar i de processar els

antgens inoculats, i els presentaven als limfcits Th1 especfics,

provocant lalliberament de quimiocines, amb la finalitat de fomentar el

reclutament de ms macrfags i de cllules polimorfonuclears (PMNs).

Tamb es secretava IL-3 i factor estimulador de colnies de granulcits i

de moncits (GM-CSF), provocant 3 efectes claus. Produir lestimulaci

de la producci de moncits en la medulla ssia, activar als macrfags i

el seu alliberament de factors inflamatoris, com lIFN-, i promoure

lexpressi de molcules dadhesi a vasos sanguinis locals, com el

25

Introducci

TNF-. Entre les 48 i les 72 hores segents, shavia provocat una forta

acumulaci local de cllules, sobretot macrfags i limfcits al hum o

macrfags, limfcits i neutrfils al ratol, i una induraci local deguda

de ledema produt per lextravasaci de fluids dels vasos sanguinis cap

al teixit (100).

Dannerberg (63,64), amb la seva interpretaci i aprofundiment en els

estudis de Lurie (60), va explicar com tenia lloc levoluci de la TB en

lsser hum i va relacionar laparici de necrosi amb la DTH. Ell (64)

considerava que, tant la DTH com la immunitat cellular sn

mecanismes que sassocien a la resposta immune adquirida, que t com

a objectiu controlar el creixement bacillar. I aix ho faria, o b generant

necrosi per evitar el creixement bacillar a linterior del macrfags

infectats no activats, mitjanant la DTH, o b activant els macrfags

grcies als limfcits especfics (64), mitjanant la immunitat cellular.

Per un altre cant, hi ha almenys un estudi que fa dubtar sobre la

relaci necrosi-DTH. Lucas i Nelson (101), en els seus estudis sobre la

patognia de la TB en pacients infectats pel VIH, van enunciar que els

pacients anrgics eren els que desenvolupaven major necrosi als seus

teixits.

Aquesta va ser la teoria sostinguda durant molt de temps, per els

mecanismes exactes mitjanant els quals la DTH generava la necrosi

intragranulomatosa no shavien aconseguit esclarir.

Llavors, Rook i Al Attiyah (102) van establir una possible relaci entre la

necrosi i la reacci dSchwartzman. Aquesta reacci havia estat

enunciada als anys 30 (103), i descriu un fenomen de reactivitat local

en la pell, provocat per la inoculaci intradrmica prvia duna

endotoxina (injecci preparadora), i duna injecci endovenosa a les 18-

24 hores de la mateixa endotoxina (injecci provocadora) (103).

26

Introducci

Aproximadament a les 4 hores es desenvolupa una necrosi hemorrgica

en el punt de lincul inicial. Si les dos injeccions dendotoxina es fan

endovenoses, t lloc una reacci generalitzada, sovint acompanyada de

coagulaci intravascular disseminada. La reacci depn de les cllules

polimorfonuclears i de la coagulaci dels vasos sanguinis.

En aquest sentit, Rook i Al Attiyah (102) van pensar que els granulomes

tuberculosos actuarien com a zona preparada, i lalliberament de TNF-

, per part dels macrfags locals en resposta al creixement bacteri,

seria la provocaci necessria per al desenvolupament de la necrosi

intragranulomatosa.

Grcies a tota la informaci disponible, el nostre grup va decidir

dissenyar experiments per aconseguir un model mur de TB

humanitzat. Segons les nostres observacions prvies, ens vam deixar

influenciar per les teories de Rook i Al Attiyah (102), i vam considerar

que els granulomes eren un teixit preparat. Aix doncs, ens calia

trobar una injecci provocadora. Vam portar a terme la inoculaci

local de lipopolisacrid (LPS) dEscherichia coli O111:B4, en el pulm,

per via intranasal, 3 setmanes desprs de la infecci per aerosol. I vam

aconseguir induir necrosi als granulomes primaris als 10 dies. Aix com

una disminuci de les UFCs a les 24h, que es resolia als 10 dies, i un

augment del nombre de lesions secundries. A les 9 setmanes post-

infecci podem observar una necrosi intragranulomatosa ben

estructurada, bsicament eosinoflica i de consistncia caseosa.

Mentre que al model mur clssic, la infecci es produa habitualment

per via endovenosa, i es comenava el tractament antibitic a les 3

setmanes, quan encara no hi havia poblaci bacillar latent, molt

possiblement perqu encara no hi ha una resposta immune adquirida,

al nostre model humanitzat, la infecci es produa per aerosol de

baixa dosi (entre 10-50 bacils als pulmons), amb un incul de 25 g de

27

Introducci

LPS al dia 20, intranasalment, per a generar la reacci dSchwartzman

i, per tant, la necrosi intragranulomatosa. Posteriorment, portvem a

terme un procs de reactivaci bacillar mitjanant ladministraci

diria dhidrocortisona, de la setmana 9 a la 18, basat en les teories de

Rook, que relacionen un increment del cortisol amb la reactivaci

endgena que t lloc en els humans. A la setmana 18, amb uns

granulomes ben estructurats, amb un centre necrtic, un exterior

densament fibrosat i una concentraci de UFCs elevada, inicivem el

tractament antibitic.

Amb aquest model vam aconseguir dos fites molt importants. La

primera, demostrar que la presncia de necrosi intragranulomatosa

podria estar lligada a la reacci dSchwartzman (103). I la segona,

daquesta manera aconseguem imitar millor que amb cap altre model

existent les alteracions que sofreix lhum (96).

La nostra hiptesi s que lincrement agut i massiu de LPS

saconseguiria just abans de lentrada en escena de la resposta immune

adquirida, quan la concentraci de M.tuberculosis augmenta de manera

exponencial (60,63,64). En aquest cas la font de LPS, o en aquest cas de

la toxina necessria, serien el lipoarabinoman (LAM) i el cord factor,

entre daltres, presents abundantment en la paret cellular

micobacteriana (104). Laugment de lendotoxina provocaria lactivaci

dels macrfags, que secretarien molt TNF-, provocant la necrosi pel

propi alliberament de proteases, junt amb la necrosi produda per els

PMNs acumulats, i junt amb la coagulaci de vasos sanguinis locals,

que podrien produir uns petits fenmens disqumia local, amb la

producci danxia (103,105).

Per, amb aquest model vam observar una elevada taxa de mortalitat,

aproximadament del 20% dels ratolins. Vam associar aquesta mortalitat

a la inoculaci de LPS, hipotetitzant que el LPS no es distribua

28

Introducci

homogniament mitjanant la inoculaci intranasal, i que, en alguns

casos, podia produir pneumnia massiva, provocant la mort de lanimal.

Per aquesta ra, el nostre segent objectiu va ser estandarditzar

ladministraci de LPS mitjanant aerosol, per aconseguir distribuir

mpliament la mateixa dosi de LPS al llarg de tot el parnquima

pulmonar (106).

Amb aquest model vam portar a terme un treball comparatiu sobre

lefecte que produen diferents soques de M.tuberculosis, lH37Rv, CL-

511 i alguns allats clnics (UTE0335R, UTE0423R, UTE0705R i

UTE0824R), respecte dos soques de ratol, C57BL/6 (resistent) i DBA/2

(sensible). Grcies a aquest treball, vam poder observar que

determinades soques de M.tuberculosis, postulem que degut a la seva

virulncia, eren capaces dinduir necrosi intragranulomatosa de manera

espontnia en el model mur, sobretot en la soca de ratolins resistent

(107), sense la necessitat dintroduir cap altre endotoxina, com el LPS.

Amb un treball final sobre la relaci entre la necrosi

intragranulomatosa i la resistncia-susceptibilitat, segons la dotaci H-

2, de diferents soques de ratol a la infecci tuberculosa, el nostre model

mur humanitzat de TB va quedar estandarditzat (108). La figura

segent mostra levoluci dels parmetres ms importants del model.

29

Introducci

Figura 1.6 Cintiques tpiques del model experimental mur. Les lnies continua i discontinua mostren el mxim i el mnim dels bacils en creixement actiu. Les lnies puntejades representen un cicle en levoluci de la fase crnica. En les fases log i estacionaria es mostren macrfags infectats, amb creixement bacillar al seu interior i en procs de necrosi, respectivament. Adaptat de la publicaci Cardona. Inflammation & Allergy-Drug targets 2007;6:27-39 (56) i de la publicaci Cardona. Tuberculosis 2006;86:273-89 (69)

1.3 El projecte RUTI: desenvolupament duna vacuna

teraputica

El plantejament de RUTI va sorgir com a resposta a les preguntes

plantejades respecte a la fisiopatologia de la ITBL.

El tractament antibitic en la ITBL i la hiptesi dinmica

Grcies als estudis realitzats hem pogut oferir una visi ms racional

dels mecanismes implicats en la ITBL, la hiptesi dinmica, en

contraposici a la hiptesi esttica, que ha estat la base clssica per

explicar laparici de la ITBL (56).

Des dels treballs realitzats per Comstock (109) el tractament establert

per a la ITBL s ladministraci dINH durant 9 mesos (34). Per si fem

30

Introducci

un estudi de lEBA (early bactericidal activity) en pacients amb TB

pulmonar podem veure que lefecte mxim del frmac t lloc a les 48

hores de tractament, amb una reducci de 0,7Log10 de la crrega

bacteriana (110). s ms, podem dir que lefecte mxim bactericida de

la INH t lloc durant els primers 15 dies de tractament. Per aquesta ra,

hom es qestiona perqu calen 9 mesos de tractament.

La hiptesi dinmica s lnica capa dargumentar la necessitat

daquest tractament antibitic per evitar que es generi una TB a partir

duna ITBL. La hiptesi esttica defensa 3 premisses per raonar la ITBL:

- desprs de la infecci i disseminaci inicial dels bacils, es formen

uns granulomes estancs, que sn capaos de contenir la infecci

mitjanant la formaci duna banda fibrosa exterior. Tot plegat

crea un ambient danaerobiosi (48)

- aquests granulomes resten inalterats durant anys (90,111)

- el bacil latent, que ha quedat tancat dins del granuloma durant

anys, i que haur estat capa de resistir lambient anaerbic

(112), pot reactivar el seu creixement en presncia dun factor de

ressuscitaci (111)

La hiptesi dinmica t en compte els aspectes fisiolgics de lhoste,

com el temps de vida mitjana que tenen les cllules i la regeneraci dels

teixits danyats, i explica que el bacil genera la ITBL degut a 3

particularitats:

- una velocitat de creixement extremadament lenta

- la capacitat que t M.tuberculosis de generar necrosi

intragranulomatosa

- la seva paret cellular

No implica lexistncia danaerobiosi. Suposant que nhi hagus, sha

pogut demostrar en models in vitro que els bacils no sobreviuen ms

31

Introducci

enll duns mesos. I en tercer lloc, per generar aquesta anaerobiosi

caldria un consum doxigen constant per mantenir-la, com passa per

exemple als budells, fet que no succeeix precisament en lesions on hi

ha BL (113).

Tampoc implica laparici en escena de cap factor mgic que, si b s

cert que shan descobert algunes protenes amb la capacitat dinduir

reactivaci en bacils latents, la seva procedncia sempre s deguda a

bacils en creixement actiu (46), que no es troben en aquest tipus de

lesions.

En el context de la hiptesi dinmica, quan M.tuberculosis entra a

lespai alveolar, t la necessitat de ser fagocitat per un macrfag, donat

que lambient que el rodeja es troba ple de surfactant i enzims que van

erosionant la seva paret cellular (114). Un cop dins de la cllula, un

percentatge de bacteris poden multiplicar-se i sobreviure. Evitant la

uni fago-lisosmica, poden iniciar una fase de creixement (Log) i

destruir el macrfag (115). Novament al medi extracellular, ara encara

ms agressiu degut a lelevada mort cellular (surfactant, enzims

bactericides, radicals lliures doxigen, radicals lliures de nitrogen, pH

cid (116)...), els bacils entren en FE fins a ser fagocitats per un altre

macrfag. Fruit del creixement bacillar i del reclam de nous macrfags

atrets cap al procs inflamatori, el cicle es va reproduint. Daquesta

manera es generen bacils en creixement actiu i bacils en FE, que

sacumulen al teixit necrtic.

Un cop apareix la resposta immune adquirida, capa datacar als bacils

en creixement actiu (117), el creixement bacillar queda aturat i els

macrfags comencen a ser activats. s en aquest punt que entren en

escena els ME. Aquests macrfags sn els mateixos que tenem abans

en la lesi, per en ser activats, ja no sn destruts pel creixement

bacillar i poden fagocitar ms quantitat de teixit necrtic, restes

cellulars, acumulant gran quantitat de cossos lipdics al seu

32

Introducci

citoplasma. Quan un ME fagocita un bacil, junt amb el teixit necrtic, el

bacil no es multiplica, per el macrfag tampoc s capa dexecutar la

seva destrucci (107). Segurament la seva crrega lipdica els dificulta

la uni fago-lisosoma (118), o b no porten a terme una bona

presentaci dantigen als limfcits (119), o b amb la secreci de NO

generen un ambient dimmunosupressi al seu voltant (120).

Aquests ME acaben formant la capa ms externa del granuloma i,

viatjant cap a les vies respiratries superiors amb la finalitat de ser

expulsats o deglutits. O b el ME fagocita el bacil que es troba entre els

detritus cellulars sense adonar-se, o b la resposta immune sap que

aquests bacils hi sn presents per prefereix centrar el seu efecte en els

bacils en creixement actiu, perqu els considera ms perillosos.

La qesti s qu els bacils han estat capaos dadaptar-se a aquesta

situaci i de persistir en el temps.

(B) es mostra el final del recreixement constant grcies a la quimioterpia, i leliminaci peridica dels bacils latents del teixit necrtic. El nombre dels bacils localitzats dins dels macrfags es mostra en vermell, mentre que els del teixit necrtic es mostren en gris. Adaptat de la publicaci Cardona. Tuberculosis 2006;86:273-89 (69)

Figura 1.7 Aproximaci matemtica del model dinmic de latncia. Durant la fase aguda els bacils arriben al seu valor mxim dUFCs desprs de 20 dies de creixement. Quan sestableix la immunitat el 99% de la crrega bacteriana es destruda. (A) Aquesta reacci crea un 0,1% de bacils latents al teixit necrtic. L1% restant recreixen durant 20 dies, fins a ser destruts novament, es repeteix el mateix esquema. Aquesta dinmica continua fins a establir-se un equilibri, que t el llindar a 2Log10 en humans. El nombre de bacils en el teixit necrtic disminueix, mentre que el percentatge de patir la malaltia va disminuint amb el temps, 0,74% el primer i segon any, 0,31% entre el tercer i el cinqu...

33

Introducci

El procs de drenatge dels bacils es troba molt relacionat amb un

mecanisme fisiopatolgic clau per, que no ha estat gaire relacionat

amb la fisiopatologia de la TB, la generaci daerosols. La formaci

daquests aerosols t lloc a les vies respiratries superiors amb la

finalitat dacondicionar laire entrant, afegint calor i humitat (121). I per

a la formaci daquests aerosols cal fluid alveolar, que en el cas duna

ITBL, pot contenir aquests bacils que havien de ser drenats. I els

aerosols, un cop units a laire inspirat, tenen com a dest tornar a

lespai alveolar.

A. Inspiraci

B. Espiraci

Figura 1.8 Dinmica dels aerosols. Les figures mostren la relaci entre la

capa mucosa que cont el surfactant, la generaci daerosols i el drenatge bacillar. Un cop el bacil es troba a lespai alveolar, ser drenat cap a les vies respiratries superiors amb la mucositat, per a ser expulsat o deglutit. La inspiraci daire fred i sec provoca la formaci daerosols des de la capa mucosa cap al lumen de larbre bronquial, donant una possibilitat a la reinfecci endgena. Durant lespiraci el refredament de laire condensa

Doncs, b, la cintica daquests aerosols, junt amb la capacitat de

resistncia a lestrs que presenten els bacils latents, pot explicar que la

ITBL podria ser fruit duna reinfecci endgena, o duna disseminaci i

reactivaci constants. I amb aquesta hiptesi dinmica s sexplica que

el tractament dINH durant 6-9 mesos sigui efica. Mentre que la

34

Introducci

hiptesi esttica, que postula que durant la disseminaci inicial es

generen petits granulomes en la part apical dels pulmons, que contenen

bacils latents, que tenen la capacitat de reactivar molts anys desprs,

fruit dun factor per ressuscitar, el tractament actual seria inefica.

Segons aquesta hiptesi, ladministraci dINH shauria destablir

durant tota la vida, o una gran part daquesta (122).

Figura 1.9 Esquema dels volums pulmonars i de la cintica que tindria lloc segons la hiptesi dinmica. Es pot observar com t lloc una constant reinfecci endgena fruit dels bacils drenats per els ME. Segons aquesta hiptesi la TB activa seria la conseqncia duna reinfecci que ha tingut lloc a lpex pulmonar, degut a les condicions favorables que es donen en aquesta zona per al creixement bacillar. Adaptat de la publicaci Cardona. Keystone Symposia 2007

La hiptesi dinmica no contradiu el fet que als lbuls pulmonars

superiors lelevada concentraci doxigen faci que siguin una zona on el

bacil pugui crixer ms rpid, i amb tanta intensitat que pugui arribar a

generar cavitats (123,124), sols postula que el creixement bacillar s

fruit duna reinfecci endgena constant.

Aix doncs, grcies a la hiptesi dinmica sexplica que amb el

tractament dINH de 6-9mesos, lhoste pugui portar a terme el drenatge

dels bacils en FE, evitant que puguin reactivar el seu creixement.

Duna banda, el tractament quimioterpic presenta avantatges per

lhoste, com poden ser reduir la resposta inflamatria (125), permetre

lestabilitzaci de la poblaci bacillar cap a un mnim inactiu, reduir

lacmul de ME al voltant del granuloma i el possible creixement dels

35

Introducci

bacils al seu interior, aix com la font dimmunosupressi local que

suposen, i tamb disminuir les possibilitats de generar una resposta de

tipus Koch txica.

B A

Figura 1.10 Aspecte dels granulomes en fase crnica de la infecci, setmana 6, en el model de TB experimental en ratolins (A) i un cop sha finalitzat el tractament antibitic (B). Es pot observar la desaparici de la capa de macrfags escumosos, responsables de la immunosupressi local. Adaptat PJCardona; Tuberculosis 2006;86:273-89 (69)

Per daltra banda, tamb crea immunodepressi per s mateix. Com els

bacils no es multipliquen, no reestimulen la resposta immune, no

sarriba al llindar mnim necessari per a la formaci de noves cllules

efectores i, la resposta immune acaba cedint (125). Degut a la manca de

resposta inflamatria i immunitat local, els bacils en FE poden iniciar

una nova fase de creixement. I s per aquesta ra, que les pautes de

tractaments quimioterpiques curtes no funcionen.

Per, aquest panorama podria canviar substancialment si es realitzs

un tractament immunoterpic desprs del perode curt de

quimioterpia que evits, per un costat, la reactivaci bacillar dels BLs

i, per laltre, la inducci duna immunodepressi local especfica.

36

Introducci

RUTI: La vacuna teraputica contra la TB latent

El disseny de RUTI respon a 5 qestions:

1) RUTI es va dissenyar per a ser utilitzada desprs duna pauta curta

de tractament quimioterpic, per reomplir aquest espai buit de

resposta inflamatria i dimmunitat local que es genera un cop sacaba

el tractament antibitic.

Portant a terme investigacions prvies, amb el model experimental

mur, el nostre grup havia vist que desprs duna pauta curta de

tractament antibitic, tenia lloc una reactivaci del creixement bacillar

que no es seguia per una resposta immune immediatament. Aquesta

reactivaci podia arribar incls als 4Log10 de crrega bacillar i, la

resposta immune podia aparixer amb un retard de 2 mesos respecte el

moment de la reactivaci (126).

Segurament, aquest fet es troba relacionat amb el fenomen de

tolerncia que presenta el model experimental dinfecci tuberculosa

crnica en ratol (96), comparat amb daltres hostatgers que tenen un

volum corporal superior, com els humans.

Doncs, b, la finalitat de la vacuna teraputica RUTI seria fer un

boosting, una reestimulaci, a la resposta immune, per tal d accelerar

la seva actuaci.

37

Introducci

Figura 1.11 Estudi dels mecanismes de la ITBL. (A) Es pot observar que la inoculaci de RUTI (en fletxes blaves) aconsegueix augmentar la resposta immune, resumit segons la producci dIFN- (en vermell) desprs del tractament antibitic (franja taronja), impedint la reactivaci bacillar. (B), Es pot observar com el fet dadministrar una pauta curta de tractament antibitic permet que la resposta immune decreixi i tingui lloc la reactivaci bacillar. Adaptat del dossier de premsa: El desenvolupament de la vacuna antituberculosa RUTI 2007

2) RUTI tamb es va voler dissenyar per mostrar a la resposta

immune antgens propis dels bacils latents.

Realitzant lestudi de levoluci dels granulomes, ens vam adonar de

lescapament dels bacils latents de les lesions. Els bacils latents sn

invisibles per a la resposta immune, fruit de la transformaci que

pateixen (cllules amb una taxa de creixement molt baixa, amb un

temps de divisi llargussim, amb menys ADN i ARN i pocs nucletids

per cllula, amb substancials canvis en la seva paret cellular, que

impliquen un engruiximent, un augment en la presncia de lantigen de

16KDa...), en resposta a lestrs que es genera en contra dells. A partir

daquest fet, que la resposta immune es focalitzi sols en els bacils en

creixement actiu (127), va sorgir la idea dimmunitzar amb fragments de

bacils cultivats en condicions destrs.

38

Introducci

3) RUTI s una vacuna feta amb bacils que han crescut sota

condicions destrs. Els cultius de Mycobacterium tuberculosis H37Rv es

porten a terme en medi slid, en agar Middlebrook 7H11, a 37C.

Daquesta manera, el cultiu pateix una davallada progressiva de la

pressi parcial doxigen i del pH (128,129).

En resum, els bacils que sutilitzen per fer RUTI es troben sotmesos a

les condicions fisiolgiques que trobem en els granulomes dels hostes

amb una immunitat activa, s a dir, baixa concentraci doxigen degut a

lestructura fibrtica del granuloma i baix pH dins del fagolisosoma dels

macrfags activats.

4) RUTI es presenta com a fragments de bacils liposomats per

optimitzar el procs de presentaci dantigen (130).

Portant a terme estudis amb microscpia electrnica de transmissi,

vam podem veure que RUTI es composava duna barreja de liposomes

unilamelars i multilamelars. I, portant a terme estudis amb un

analitzador de mides de partcules per difracci lser, vam poder veure

que les partcules tenien un dimetre mig de 100nm, i que el 99,9%

delles el tenien inferior a 1m.

5) Daltra banda, se sap que els components de la paret cellular

micobacteriana tenen propietats adjuvants (131), per tant, no cal afegir

res ms per a induir una resposta immunolgica capa de reconixer els

bacils latents. Una part bsica del procs de producci de RUTI s la

detoxificaci dels fragments de paret cellular obtinguts que han de ser

liposomats.

En estudis previs amb models experimentals de ratolins, portant a

terme la recerca dun model humanitzat, vam poder relacionar la

39

Introducci

presncia de necrosi intragranulomatosa amb la reacci dSchwartzman

(una resposta Koch-like). El fenomen de Koch (102) satribueix

clssicament a ladministraci de vacunes teraputiques en pacients

infectats, on la presncia dendotoxines, com poden ser glicolpids

localitzats en la part ms externa de la paret cellular (96), poden

provocar reaccions immunes inespecfiques.

Per eliminar el risc potencial de desenvolupar un fenomen de Koch

vam decidir treure totes les molcules endotxiques (132,133)

contingudes als fragments utilitzant el detergent suau Trit X-114

(134).

El canvi substancial en la pauta de tractament seria el segent:

1 mes dINH + 2 dosis de RUTI 9 mesos dINH

2 x

Figura 1.12 Modificaci en la pauta de tractament antibitic per tractar la ITBL

En la nostra o