CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS AISLAMIENTOS DE ... · ... Innovación y Creación de la ......
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1. Información general
Título del proyecto: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS AISLAMIENTOS DE Streptococcus agalactiae PROVENIENTES DE LECHERÍAS DEL DEPARTAMENTO DE CALDAS Nombre de la convocatoria en la cual presenta el proyecto: “Convocatoria general para la financiación de proyectos de Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2013” Nombre de los Grupos de Investigación: (registre la información de los grupos que participan) Biología de la Producción Pecuaria Grupo de investigación CERES Nombre del Grupo: Biología de la producción pecuaria Facultad/Instituto/Departamento: Ciencias agropecuarias/Instituto de Biotecnología/ Producción agropecuaria
Clasificación _ reconocido COLCIENCIAS
Tipo de proyecto de I&D: Investigación Básica1: Investigación Aplicable2: Aplicación en curso3: Creación: Innovación Tecnológica4:
Tipo de innovación: Innovación tecnológica de producto Innovación tecnológica de proceso Innovación organizacional Área Estrátegica del Plan de Desarrollo Biotecnología
Artes, Cultura y Humanidades Problemática Social
Salud
Ambiental
No corresponde a ninguna de las áreas estratégicas
INTEGRANTES DEL EQUIPO DE INVESTIGACIÓN (indicar cuál es el investigador responsable con un asterisco)
NOMBRE/TIPO DE VINCULACIÓN EN LA UNIVERSIDAD DE CALDAS
DEPARTAMENTO o PROGRAMA
ÁREA DE CONOCIMIENTO (según anexo 1)
Sandra Bibiana Aguilar Marín*/Docente de planta
Departamento de Producción Agropecuaria
Agronomía, veterinaria y afines
Departamento de Producción Agronomía, veterinaria y
Alejandro Ceballos Márquez/ Docente de planta
Agropecuaria afines
Claudia Gisela Cobo Ángel/Joven investigadora/ Estudiante
Departamento de producción agropecuaria
Agronomía, veterinaria y afines
Estudiante de postgrado Departamento de Producción Agropecuaria
Agronomía, veterinaria y afines
Marcos Muñoz Domon/Externo
Universidad de Concepción (Chile)
Agronomía, veterinaria y afines
Juan Carlos Rodríguez-Lecompte/Externo University of Prince Edward Island
Agronomía, veterinaria y afines
Lugar de Ejecución del Proyecto: Ciudad: Manizales. Departamento: Caldas Presupuesto Valor total del proyecto: $ 124,142,000 Fuentes de financiación: Universidad de Caldas, Universidad de Concepción (Chile), Universidad de la Isla del Principe Eduardo.
Valor solicitado en metálico a la VIP en esta convocatoria: $ 39,800,000
Duración total (meses): 18
2. Resumen ejecutivo
El S. agalactiae es una bacteria Gram positiva, aerobia, clasificada en el grupo B de
Lancefield (GBS), que ocasiona problemas serios en la producción lechera y en la salud
humana. En vacas, esta bacteria es responsable de mastitis clínicas y subclínicas
crónicas que causan altas pérdidas económicas; en cambio en humanos, este patógeno
es responsable de la enfermedad conocida como “sepsis neonatal”, además puede causar
meningitis, abscesos, infecciones urinarias y artritis, causando mortalidades del 15%.
Sin embargo a pesar de la importancia de este patógeno en la medicina humana y
veterinaria, muchos aspectos de la epidemiología de este microorganismo son aún
inciertos, como el interrogante de si existe transmisión interespecies (humanos y
bovinos) y cuál de las especies actúa como reservorio para la otra. El objetivo del
presente proyecto consiste en Caracterizar molecularmente los aislamientos de S.
agalactiae en leche de ganaderías lecheras del departamento de Caldas mediante MLST,
lo que permitirá estandarizar y validar la técnica para la genotipificación de aislamientos
de S. agalactiae en el laboratorio de calidad de leche de la Universidad de Caldas; así
como establecer el origen intrapredial de las cepas de S. agalactiae aisladas en lecherías
de Caldas; determinar las eventuales diferencias genotípicas en las cepas de S.
agalactiae aisladas con patrones positivos de mujeres; establecer la asociación entre el
recuento de células somáticas y los eventuales genotipos de S. agalactiae aislados de las
vacas provenientes de las lecherías seleccionadas para el estudio, y evaluar la asociación
entre la presencia de las diferentes cepas de S. agalactiae con los diferentes factores de
riesgo para la infección por este patógeno. Para esto, se utilizarán 150 aislados de S.
agalactiae, provenientes de 50 vacas de fincas previamente diagnosticadas con esta
bacteria, y se cultivará la leche de estos animales para aislar el patógeno. Estos asilados
serán sometidos a la prueba de MLST, la cual se hará mediante PCR múltiple con siete
genes Housekeeping y posteriormente se realizará secuenciación en Cornell Uneversity.
El patrón positivo humano, será obtenido por un centro médico de la ciudad quien
enviará el aislado al laboratorio de calidad de leche de la Universidad de Caldas para
someterlo al MLST. De otra parte, se medirá en leche el recuento de células somáticas y
se realizará una encuesta de factores de riesgo en cada finca seleccionada para el
estudio. Los datos serán analizados mediante un modelo de regresión múltiple, fijando
como significativo un valor de p<0,05. Los resultados de esta investigación aportarán al
conocimiento de la epidemiología molecular del S. agalactiae, permitirá identificar las
cepas prevalentes de este microorganismo en algunas lecherías de Caldas, así como el
origen de las mismas (bovino o humano), los factores de riesgo y la relación entre las
diferentes cepas con el recuento de células somáticas. Lo que se traducirá en mejor
calidad de leche, mejor productividad y competitividad del sector lácteo de la región,
disminuyendo el riesgo potencial para la salud pública.
Conformación y trayectoria del equipo de investigadores
Sandra Bibiana Aguilar Marín: M.Sc., en Biotecnología Vegetal de la Universidad
Tecnológica de Pereira, 2006. Desde su vinculación a la Facultad de Ciencias
Agropecuarias en el 2009, ha liderado y ejecutado proyectos de investigación enfocados
al desarrollo de protocolos de micropropagación y embriogénesis somática en varias
especies vegetales. En el área de Biología molecular, ha realizado estudios de diversidad
genética en plantas de Rubus spp. (moras), Cacao spp. (cacao) y Tomate cherry, y ha
desarrollado métodos de diagnóstico viral en Solanum tuberosum (papa) y Fasciola
hepática a partir de técnicas moleculares y serológicas, así como de sexaje molecular en
Psitácidos. Los resultados de estas investigaciones han sido publicados en revistas
internacionales homologadas y nacionales indexadas en Colciencias.
Publicaciones:
Sandra Bibiana Aguilar Marín, German Ariel Lopez Gartner, Fredy Arvey Rivera Paez,
“Caracterización molecular de clones de Theobroma cacao L., por medio de marcadores
moleculares Microsatélites.” Revista Luna Azul ISSN: 0122-5391 ed: v.32 fasc. P.52 –
60 ,2011.
Sandra Bibiana Aguilar Marín, Marta Leonor Marulanda, Ana Maria Lopez, “Genetic
diversity of wild and cultivated Rubus species in Colombia using AFLP and SSR
markers”. Crop Breeding And Applied Biotechnology ISSN: 1518-7853 ed: v.7 fasc.
P.242 – 252 ,2007.
Sandra Bibiana Aguilar Marín, “Caracterización molecular de Rubus spp., en el Eje
Cafetero. Colombia.”. Actualidades Biológicas. ISSN: 0304-3584. ed: Universidad De
Antioquia. V. 29 fasc.1 p.111 – 111, 2007.
Alejandro Ceballos Márquez: M.V.Z. Universidad de Caldas; Magister en salud
animal de la Universidad Austral de Chile; PhD en Atlantic Veterinary College;
Postdoctorado en Cornell Uneversity. Ha participado en diversos proyectos de
investigación y extensión relacionados con la mastitis y la calidad de la leche. Además
ha liderado el montaje del laboratorio de calidad de leche de la Universidad de Caldas.
Publicaciones:
Ceballos Márquez, A.; Kruze, J. Barkema, H.; Dohoo, I.; Sanchez, J. Uribe, D.;
Wichtel, J.J.; Wittwer, F. “Barium selenite supplementation and its effect on
intramammary infection in pasture-based dairy cows”. Journal Of Dairy Science ISSN:
0022-0302. V.93. p.1468-1477, 2010.
Ceballos Márquez, A.; Barkema, H.; Stryhn, H.; Dohoo, I.; Keefe, G.; Wichtel, J.J.
“Milk Selenium Concentration and its Association with Udder Health in Atlantic
Canadian Dairy Herds”. Journal Of Dairy Science ISSN: 0022-0302. V.93. p.4700-
4709, 2010.
Ceballos Márquez, A.; Barkema, H.; Stryhn, H.; Wichtel, J.J. Neumann, J.; Mella, A.
Kruze, J.; Espindola, S.; Wittwer, F. “The effect of selenium supplementation before
calving on early-lactation udder health in pastured dairy heifers”. Journal Of Dairy
Science ISSN: 0022-0302 v.93 p.4602-4612, 2010.
En Libro: Ceballos Márquez, A.; López benavides, M.; Rauch, B.J.; Schukken, Y.H.
“Efficacy of Teat Dips Based on Naturally Occurring New Intramammary Infections
and Somatic Cell Count” Udder Health And Communication. ISBN: 9789086861859.
P.337-342, 2011.
En Libro: Gutiérrez Solano, C.; Ceballos Márquez, A.; Schukken, Y.H. “Bilingual
Trainings for Milkers in New York State: A Success for Quality Milk” Udder Health
And Communication. ISBN: 9789086861859. P.191-196, 2011.
Claudia Gisela Cobo Ángel M. V.Z. Magíster en ciencias veterinarias, con énfasis en
salud pública y epidemiología, actualmente se desempeña como joven investigadora e
innovadora de Colciencias en el grupo de investigación en biología de la producción
pecuaria.
Publicaciones:
Romero Peñuela, M.; González Gordon, L.M.; Cobo Ángel, C.G. “evaluación del
bienestar animal por medio de indicadores conductuales durante el sacrificio de
bovinos”. Revista Luna Azul issn: 1909-2474 centro editorial universidad de caldas
V.35 p.48 – 59, 2012.
Cobo Ángel, C.G. “Indicadores conductuales de bienestar animal durante el
presacrificio bovino”. Veterinaria Y Zootecnia ISSN: 2011-5415 Centro Editorial
Universidad De Caldas, V.6 fasc.2 p.112 – 124, 2012.
Cobo Ángel, C.G.; Romero Peñuela, M. “importancia de la interacción hombre-animal
durante el presacrificio bovino: revisión”. Biosalud: Revista De Ciencias Básicas ISSN:
1657-9550 Centro Editorial De La Universidad De Caldas v.11 fasc.2 p.79 – 91, 2012.
Juan Carlos Rodríguez-Lecompte: MVZ de la Universidad de Caldas; magíster en
microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana; PhD virología molecular,
University Of Prince Edward Island. Postdoctorado McMaster University. Actualmente
trabaja en proyectos relacionados con la respuesta inmune de la glándula mamaria.
Publicaciones:
Rey MR, Undi M, Rodríguez-Lecompte J.C, Joseph T, Morrison J, Yitbarek A,
Wittenberg KM, Tremblay R, and Ominski KH. 2013. A study of the effectiveness of a
needle-free injection device compared with a needle and syringe used to vaccinate
calves against bovine viral diarrhea and infectious bovine rhinotracheitis viruses. The
Veterinary Journal, on line Sep.4/2013 (In press). 2013.
Rodríguez-Lecompte J.C, Romero-Perez G.A, Ramírez-Yañez G, Ask K, and Gauldie
J. Adenoviral-mediated gene transfer into bone marrow: an effective surgical technique
in rat. European Surgical Research. 50 (2-4):282-291. 2013.
A Yitbarek, J C Rodríguez-Lecompte, H M Echeverry, P Munyaka, N Barjesteh, S
Sharif, G Camelo-Jaimes. Performance, histomorphology, and Toll-like receptor,
chemokine, and cytokine profile locally and systemically in broiler chickens fed diets
supplemented with yeast-derived macromolecules. Poultry Science. 92(9): 2299-310.
2013.
Marcos Muñoz Domon: Médico Veterinario, PHD en Animal Science (Cornell
University, USA, 2008. Es responsable de la docencia en Producción de Leche y
Tecnología y Calidad de Leche para estudiantes de pregrado de la carrera de Medicina
Veterinaria. Participa también en la docencia de postgrado en los programas de
Magíster en Ciencias Veterinarias mención Inocuidad de Alimentos y en el Programa de
Doctorado en Ciencias Veterinarias. Ha participado en investigaciones relacionadas con
la epidemiología molecular de varios patógenos mamarios.
Publicaciones:
R. N. Zadoks, H. M. Griffiths, M. A. Munoz, C. Ahlstrom, G. J. Bennett, E. Thomas,
and Y. H. Schukken. 2011. Sources of Klebsiella and Raoultella species on dairy farms:
Be careful where you walk. J. Dairy Sci. 92: 1045-1051.
Munoz, M. A., G. Bennett, C. Ahlstrom, H. Griffiths, Y. H. Schukken, and R. N.
Zadoks. 2008. Cleanliness scores as indicator of Klebsiella exposure in dairy cows. J.
Dairy Sci. 91: 3908-3916.
Dopfer, D., W. Buist, Y. Soyer, M. A. Munoz, R. N. Zadoks, L. Geue, and B. Engel.
2008. Assessing genetic heterogeneity within bacterial species isolated from
gastrointestinal and environmental samples: how many isolates does it take? Appl.
Environ. Microbiol. 74: 3490-3496.
Munoz, M. A., F. L. Welcome, Y. H. Schukken, and R. N. Zadoks. 2007. Molecular
epidemiology of two Klebsiella pneumoniae mastitis outbreaks on a dairy farm in New
York State. J. Clin. Microbiol. 45:3964-3971.
4. Descripción del proyecto
4.1 Planteamiento de la pregunta o problema de investigación y su justificación
La mastitis bovina constituye una de las enfermedades que afecta la calidad y la
cantidad de leche alrededor del mundo (Ceballos-Márquez et al., 2010). Esta
enfermedad es causante de pérdidas económicas significativas, debido a la disminución
en la producción, los descartes de leche, las asesorías y los tratamientos veterinarios, los
descartes tempranos de las vacas y el aumento del recuento de células somáticas (RCS)
(Keefe, 1997). Se ha señalado que el costo de un caso de mastitis varía entre 164€ y
235€ por vaca al año (Huijps et al., 2008; Huijps et al., 2009). Así mismo, la mastitis
clínica y subclínica, producen cambios composicionales en la leche que se traducen en
un menor valor nutricional, dificultad en el procesamiento, menor vida útil y cambios en
el sabor (Keefe, 1997).
Actualmente, el S. agalactiae, constituye uno de los patógenos de mayor prevalencia en
los tanques de enfriamiento lechero de Colombia. Estudios previos han reportado que
más del 40% de los tanques evaluados en el país son positivos para la presencia de esta
bacteria (Keefe et al., 2010; Calderón et al., 2011). Sin embargo la elevada prevalencia
de S. agalactiae no solo acarrea problemas en la industria lechera, sino que también
afecta la salud pública desde varios aspectos, ya que este agente es la principal causa de
severas infecciones y muertes neonatales debido a la enfermedad conocida como “sepsis
neonatal” (Spratt, 2011). De igual manera, este patógeno afecta a las personas adultas
con enfermedades tales como meningitis, septicemia, abscesos subcutáneos e
infecciones del tracto urinario y artritis (Chaiwarith et al., 2011), llegando a causar tasas
de mortalidad aproximadas del 15% en países desarrollados (Lamberten et al., 2004;
Phares et al., 2005; Pereira et al., 2010).
Pese a los riesgos en la salud pública que puede acarrear el consumo de leche cruda, en
Colombia el 51% de la leche se comercializa de esta manera en mercados informales
(Conpes, 3576). Previas investigaciones han reportado prevalencias de S. agalactiae
entre el 20 y el 50% en tanques de enfriamiento lechero. Sin embargo, no se ha
establecido la tipificación de estos aislamientos, la fuente del patógeno, los factores de
riesgo para su presencia, la trasmisión o el reservorio principal de este patógeno en las
producciones lecheras (Keefe et al., 2010b). Esto es debido a que el estudio de la
epidemiología molecular de este patógeno ha estado ligado primordialmente a la
medicina humana, más que a la medicina veterinaria (Zadoks et al., 2011). Sin embargo,
uno de los mayores interrogantes en la epidemiología molecular de S. agalactiae, es
determinar si la transmisión interespecies ocurre (i.e. entre humanos y bovinos) y cuál
de estas especies actúa como reservorio (Manning et al., 2009; Zadoks et al., 2011).
Recientemente nuevos interrogantes han surgido respecto al fenómeno observado en
países como Dinamarca, donde la infección por S. agalactiae, se ha convertido en una
enfermedad re-emergente (Zadoks et al., 2011 ). En la década de los 80 y los 90 se había
logrado reducir la prevalencia de este patógeno hasta el 2%, gracias a esfuerzos
sistemáticos de control (Andersen et al., 2003). Pero desde el año 2000, la prevalencia
ha venido incrementándose progresivamente, hasta el punto que en el 2009 se reportó
que el 28% de los hatos eran positivos para esta bacteria, incluyendo su positividad para
cepas de origen humano (Katholm et al., 2009). Sin embargo, es desconocido el cómo y
el por qué emergió este patógeno con una prevalencia tan alta, lo cual puede
relacionarse con cambios en la virulencia o adaptabilidad, lo que requiere mayor
investigación (Zadoks et al., 2011).
Por lo anterior, la clasificación y caracterización molecular del S. agalactiae aislado de
muestras de leche cruda, ayudaría a ampliar el conocimiento acerca de aspectos
importantes en la biología, virulencia, epidemiología y transmisión de este
microorganismo. Así mismo, brindará información acerca de cuáles factores de riesgo
se encuentran asociados con la positividad a las diferentes cepas de S. agalactiae en los
tanques lecheros, contribuyendo a establecer planes de prevención y control para este
patógeno, lo que sin duda impactará en la salud pública, en la rentabilidad y
competitividad del sector lácteo regional y colombiano.
4.2 Marco Teórico
El S. agalactiae es un coco Gram positivo aerobio, encapsulado, β-hemolítico,
clasificado dentro del grupo B de Lancefield (Lancefield, 1934). Este microorganismo
es intramamario obligado, ya que generalmente no sobrevive por largos períodos fuera
de la glándula mamaria, tiene la habilidad de adherirse al epitelio de la glándula
mamaria y de adaptarse al microambiente específico de la ubre para reproducirse en la
misma (Keefe, 1997).
El S. agalactiae es responsable en bovinos, de mastitis subclínicas crónicas y altamente
contagiosas, que difícilmente pueden curarse en forma espontánea, con aumentos
moderados en el conteo de células somáticas. Debido a que este patógeno ocasiona
mastitis subclínicas, los animales pueden pasar largos períodos de tiempo sin ser
diagnosticados, actuando como reservorio de la infección, ya que no son sometidos a
tratamiento, segregación o sacrificio. El principal método de transmisión de esta
bacteria es por contacto entre cuartos susceptibles y cuartos contaminados, por medio de
equipos o las manos del operario; por lo tanto el ordeño es el momento de mayor riesgo
para adquirir la infección (Keefe, 2012).
Por otro lado, el S. agalactiae adquiere un nivel de importancia en salud pública, ya que
coloniza fácilmente la región anorrectal y el tracto genitourinario de las mujeres, con
mayor frecuencia en aquéllas gestantes. El neonato se infecta con este patógeno al pasar
por el canal del parto, por infección intrauterina o por adquisición nosocomial postparto,
adquiriendo la enfermedad conocida como septicemia neonatal (Montibello et al.,
2011). En mujeres, este patógeno puede causar abscesos y mastitis durante la lactancia,
lo cual es un factor de riesgo para la presentación de este patógeno en la infancia del
lactante (Dinger et al., 2002). En adultos, la infección por S. agalactiae suele
presentarse de manera asintomática. Sin embargo, puede generar infecciones en el tracto
genitourinario y tejidos blandos enfermedades severas como neumonía, bacteriemia,
artritis y meningitis (Delannoy et al., 2013).
Diversos estudios han sugerido que es probable que exista una transmisión interespecie
de S. agalactiae, ya que se ha encontrado este microorganismo de origen humano
adherido a las células epiteliales de la glándula mamaria del bovino causando la
infección (Martínez et al., 2000; Bohnsack et al., 2004; Reyes et al., 2013 proyecto
Juan). Así mismo, se ha considerado la hipótesis que indica que las cepas humanas
evolucionaron de cepas bovinas, debido a que estas cepas se encuentran conectadas por
medio de dos variantes de un único locus (Bisharat et al., 2004).
A pesar de la similitud entre las cepas humanas y bovinas, estudios recientes han
identificado que estas cepas pertenecen a dos subtipos diferentes, sugiriendo que la cepa
humana no es una variante de la bovina, sino que son poblaciones diferentes (Brochet et
al., 2006). Pese a lo anterior, la cepa más frecuente en los humanos sigue siendo
encontrada en bovinos, perros, cocodrilos y mamíferos acuáticos (Zadoks y Shukken,
2006). Otros reportes han sugerido que sí es posible la transmisión interespecies, pero
esta es de rara ocurrencia (Sukhnanand et al., 2005; Reyes et al., 2013).
A finales del año 2006, se publicó la secuenciación completa del genoma de una de las
cepas del S. agalactiae de origen bovino (ST67), lo cual permitió compararlo con
genomas de cepas de origen humano, revelándose ocho nuevas islas genómicas que
probablemente fueron adquiridas por transmisión horizontal de genes (Richards et al.,
2011). Entre estas islas genómicas se incluyen los operones de lactosa y fructosa para
las cepas bovinas y humanas respectivamente, los cuales determinan las diferencias en
el uso de la lactosa, azúcar que es metabolizada por las cepas de origen bovino
(Richards et al., 2011). No obstante, Sorensen y colaboradores (2010) reportaron que el
13% de los aislamientos de S. agalactiae de origen humano fermentaba lactosa. Este
hallazgo hizo retomar la discusión acerca del vínculo de las cepas humanas y bovinas.
Es evidente, que existen vacíos en el conocimiento epidemiológico del S. agalatiae.
Estos interrogantes asociados a la epidemiología de las cepas de un mismo
microorganismo, están siendo abordados por la epidemiología molecular. La cual es una
rama de la epidemiología que estudia la distribución y los determinantes de salud y de
enfermedad a través del uso de técnicas moleculares (Riley, 2004). No obstante, el
objetivo de la epidemiología molecular no sólo es clasificar los organismos por su
taxonomía o sus grupos filogenéticos, sino que además identifica las fuentes, las
relaciones biológicas, las rutas de transmisión, los genes responsables de la virulencia,
resistencia y los antígenos de importancia para el desarrollo de vacunas de los
organismos patógenos (Zadoks y Shukken, 2006).
Para el estudio de la epidemiología molecular del S. agalactiae, numerosos métodos
moleculares han sido utilizados, incluyendo métodos comparativos como la
electroforesis en campo pulsado (PFGE), el cual es adecuado para realizar
investigaciones de brotes de la enfermedad (Wang et al., 2010). Sin embargo, cuando se
trata de análisis genéticos de poblaciones altamente estandarizadas, como es el caso del
S. agalactiae, es preferible utilizar técnicas tipo librería como el caso del Multi-locus
Sequence Typing (MLST) (Jolley et al., 2005), este es un método preciso basado en la
secuenciación de una serie de genes altamente conservados o “housekeeping”, que
codifican para funciones esenciales de la célula. EL ADN de estos genes es tan
conservado, que un cambioen el mismo, pondría en riesgo la sobrevivencia de la célula
bacteriana. La identificación de las cepas por medio de este método, incluye en algunos
casos, la identificación adicional de genes de virulencia, de resistencia, del metabolismo
o de respuesta al estrés
El MLST, tiene un alto poder discriminatorio, permitiendo identificar las diferencias
genotípicas entre aislados, con el fin de diferenciar las cepas del mismo patógeno
(Zadoks y Shukken, 2006), las bases de datos resultantes de la tipificación de las cepas
en diferentes lugares del mundo se encuentran en línea (www.mlst.net), permitiendo
estudiar la evolución de las cepas y monitorear su estado en diferentes aislados de una
misma bacteria (Alcaine et al., 2005).
El estudio de la epidemiología molecular de S. agalctiae, incluyendo su evolución y la
diferenciación de las cepas aisladas, tiene importancia para esclarecer cuáles son los
reservorios, los métodos de transmisión y de virulencia. Con lo cual se puede prevenir y
controlar los brotes de las enfermedades asociadas a este patógeno tanto en humanos
como en bovinos (Hillerton, 2004; Zadoks y Shukken, 2006). Este estudio también
permitiría desarrollar pruebas piloto que permitan conocer mejor los mecanismos de
transmisión del patógeno tanto intra como interespecies y daría pie para el desarrollo de
investigaciones posteriores que permitan involucrar no solamente hembras bovinas sino
que adicionalmente identificar mujeres gestantes que puedan potencialmente poner en
riesgo la salud del bebé.
4.3 Objetivos
Objetivo general
Caracterizar molecularmente los aislamientos de S. agalactiae en leche de ganaderías
lecheras del departamento de Caldas, seleccionadas sobre la base de su positividad a la
bacteria y al RCS.
Objetivos específicos
• Estandarizar y validar la técnica de MLST para la genotipificación de
aislamientos de S. agalactiae de origen bovino en lecherías de Caldas.
• Establecer el origen intrapredial de las cepas de S. agalactiae aisladas en
lecherías de Caldas seleccionadas sobre la base de su RCS y positividad a la
bacteria
• Determinar las eventuales diferencias genotípicas en las cepas de S. agalactiae
de origen bovino con patrones positivos obtenidos de pruebas de tamizaje en
mujeres embarazadas.
• Establecer la asociación entre el recuento de células somáticas y los eventuales
genotipos de S. agalactiae aislados de las vacas provenientes de las lecherías
seleccionadas para el estudio.
• Evaluar la asociación entre la presencia de las diferentes cepas de S. agalactiae
con los diferentes factores de riesgo para la infección por este patógeno.
4.4 Metodología propuesta
El presente trabajo corresponde a un estudio observacional de tipo transversal, que será
llevado a cabo en lecherías ubicadas en el departamento de Caldas, las cuales serán
seleccionadas de acuerdo al historial de mastitis causadas por S. agalactiae y al recuento
de células somáticas en el tanque.
Tamaño muestral
Según la sugerencia hecha por Dopfer et al (2008), el tamaño de la muestra para análisis
moleculares puede fluctuar entre dos y 20 aislados de cada bacteria para asegurar con un
95% de certeza que es posible establecer la heterogeneidad entre los aislados. No
obstante, estos mismos autores indican que el número de aislados analizados puede
variar por conveniencia o por el presupuesto del estudio. Por lo anterior, en esta
investigación se consideraran 150 aislados obtenidos de 50 vacas de las lecherías
seleccionadas.
Aislamiento del S. agalactiae en leche
En las fincas seleccionadas se tomarán dos muestras de leche de 30 mL de cada animal,
en frascos estériles. La punta de cada pezón será limpiada y desinfectada mediante la
aplicación de una gasa con alcohol. Las muestras serán transportadas al laboratorio de
calidad de leche de la Universidad de Caldas bajo condiciones de refrigeración.
Posteriormente, se cultivarán las muestras directamente en agar sangre con esculina
mediante un esparcidor T y se incubarán 24 horas a 35°C. Las cepas serán identificadas
con base a su morfología y hemólisis. Las colonias sospechosas de Streptococcus
agalactiae, serán confirmadas fenotípicamente mediante una reacción de CAMP.
(Hogan et al., 1999; Keefe et al., 2010).
Multilocus sequence typing (MLST)
Extracción de ADN, verificación de la calidad y concentración
La extracción de ADN de las cepas positivas de S. agalactiae obtenidas de los tanques
de leche y posteriormente cultivadas, se realizará mediante el kit de extracción DNA
Bacterial UltraClean® de Mobio, USA; según las recomendaciones del fabricante. La
calidad del ADN se verificará en geles de agarosa teñidos con bromuro de ethidio y
visualizados mediante luz ultravioleta. Para la verificación de la relación del radio a una
absorbancia entre 260/280 nm, las muestras se leerán en un nanodrop (Termo Fisher,
USA).
Amplificación y purificación de los productos
Las reacciones de amplificación se realizarán mediante PCR multiplex con los siete
genes Housekeeping, tal cual como se plantea para la técnica MLST según Sukhnanand
et al (2005); las secuencias de estos genes, citados en la Tabla 1, han sido tomados del
sitio web para el MLST: http://pubmlst.org/sagalactiae/. La purificación de los
amplicones se llevará a cabo según las recomendaciones del BioResource Center en la
Universidad de Cornell, Estados Unidos, en donde serán finalmente secuenciadas.
Tabla 1. Iniciadores para GBS MLST, Jolley et al., 2004
Locus Forward (5' to 3') Reverse (5' to 3') Amplicon size (bp) adhP amplification GTTGGTCATGGTGAAGCACT ACTGTACCTCCAGCACGAAC 672
Sequencing GGTGTGTGCCATACTGATTT ACAGCAGTCACAACCACTCC 498 pheS amplification GATTAAGGAGTAGTGGCACG TTGAGATCGCCCATTGAAAT 723
Sequencing ATATCAACTCAAGAAAAGCT TGATGGAATTGATGGCTATG 501 atr amplification CGATTCTCTCAGCTTTGTTA AAGAAATCTCTTGTGCGGAT 627
Sequencing ATGGTTGAGCCAATTATTTC CCTTGCTCAACAATAATGCC 501 glnA amplification CCGGCTACAGATGAACAATT CTGATAATTGCCATTCCACG 589
Sequencing AATAAAGCAATGTTTGATGG GCATTGTTCCCTTCATTATC 498 sdhA amplification AGAGCAAGCTAATAGCCAAC ATATCAGCAGCAACAAGTGC 646
Sequencing AACATAGCAGAGCTCATGAT GGGACTTCAACTAAACCTGC 519 glcK amplification CTCGGAGGAACGACCATTAA CTTGTAACAGTATCACCGTT 607
Sequencing GGTATCTTGACGCTTGAGGG ATCGCTGCTTTAATGGCAGA 459 tkt amplification CCAGGCTTTGATTTAGTTGA AATAGCTTGTTGGCTTGAAA 859
Sequencing ACACTTCATGGTGATGGTTG TGACCTAGGTCATGAGCTTT 480 Análisis del MLST
Análisis de las secuencias de ADN
La alineación de las secuencias de los siete genes Housekeeping, se realizará usando el
Clustal W algorithm en MegAlign (DNAStar). Los datos serán usados por eBURST
(http:// eburst.mlst.net/)
Análisis de los datos arrojados por MLST
El software TOPAL, se usará para hallar evidencias de eventos de recombinación
intragénica. El árbol filogenético se obtendrá mediante el método de Neighbor-joining a
través de los programas SEQBOOT, DNAPARS, CONSENSE y DRAWTREE de
PHYLIP, mediante el Mega software; empleado para organizar las relaciones más
cercanas de los tipos alélicos de los siete genes Hosekeeping al interior del grupo. Para
determinar el poder de discriminación del método de subtipificación empleado, se
calculará el índice de discriminación de Simpson`s (SID). Para comparar las
distribuciones de frecuencia de cada uno de las agrupaciones en los siete genes
Housekeeping para cepas humanas y bovinas, se realizará una prueba de independencia
X2, usando el programa estadístico SAS; SAS Institute, Cary, N.C.
Aislamiento de la cepa de origen humano
Se contactarán hospitales, centros médicos y laboratorios del eje cafetero que realicen
citologías vaginales con el objetivo de que informen al laboratorio de calidad de leche
de la Universidad de Caldas acerca de los aislamientos de S. agalactie. La cepa
encontrada será conservada en microviales con glicerol y enviada al laboratorio con el
fin de ser confirmada molecularmente, mediante MLST.
Recuento de células somáticas (RCS)
A una de las muestras de leche se le adicionará dicromato de potasio para conservar las
propiedades de la leche. El RCS, se realizará utilizando la técnica de la citometría de
flujo en disco con coloración del ADN de los leucocitos en la muestra de leche,
realizado por un contador de células portátil y automatizado (DCC DeLaval®. DeLaval,
Tumba, Suecia).
Evaluación de los factores de riesgo
En las lecherías del estudio se aplicará una encuesta diseñada para colectar información
con respecto a los procedimientos y rutina de ordeño, bioseguridad en el rebaño,
tratamiento de mastitis, manejo y funcionamiento del equipo de ordeño e higiene
general de las vacas y los pezones.
Análisis estadístico
Se realizarán bases de datos en el programa EpiData Entry, Versión 3.1 (EpiData
Association, Odense, Dinamarca), las cuales serán exportadas al programa STATA
Versión 12.1 (StataCorp. College Station, TX, Estados Unidos). La asociación entre las
variables será evaluada inicialmente mediante regresión lineal o regresión logística
según corresponda. Aquellas variables asociadas (P≤0,15) serán incluidas
posteriormente en un modelo mutivariado removiendo aquellas no significativas
mediante eliminación de paso atrás (backward elimination), fijando como significante
un valor P<0,05. El ajuste de los modelos estadísticos será evaluado mediante la prueba
de Hosmer y Lemeshow (Dohoo et al., 2009; Elmoslemany et al., 2009a).
4.5 Resultados esperados
Generación de conocimiento
Los resultados de esta investigación aportarán al conocimiento de la epidemiología
molecular del S. agalactiae, permitirá identificar las cepas prevalentes de este
microorganismo en algunas lecherías de Manizales, así como el origen de las mismas
(bovino o humano). Así mismo, este estudio permitirá comparar las diferencias en las
cepas aisladas en lecherías y será la base para estudios posteriores involucrando
aislamientos de origen humano, lo que permitirá establecer en un futuro las diferencias
genotípicas existentes.
Adicionalmente, la presente investigación identificará cuáles son los factores de riesgo
existentes en las lecherías del triángulo del café para la presentación de las diferentes
cepas de S. agalactiae en el tanque de leche y se establecerá cuáles de ellas ocasionan
mayores recuentos de células somáticas en el tanque de leche.
Fortalecimiento de la comunidad científica
La ejecución de este proyecto permitirá estandarizar y validar la técnica de MLST para
la caracterización molecular del S. agalactiae en el laboratorio de calidad de leche de la
Universidad de Caldas, el cual será pionero en esta técnica, ya que no está siendo
realizada en ningún laboratorio del país.
De otra parte, este proyecto fortalecerá los vínculos internacionales de la Universidad de
Caldas, debido a que este estudio se realizará en cooperación con la Universidad Isla
Príncipe Eduardo (Canadá) y la Universidad de Concepción (Chile). Así mismo, se
formará un estudiante de doctorado y se capacitarán dos integrantes del grupo de
investigación en biología de la producción pecuaria y ASPA en el diagnóstico
molecular de S. agalactiae.
Apropiación social/pública del conocimiento
Los resultados de esta investigación serán divulgados a la comunidad científica
mediante la publicación de un artículo en revista de alto impacto (A1) y mediante la
participación en un evento científico en el área.
Adicionalmente, se divulgarán los resultados en las centrales lecheras más importantes
de la región, así como con la comunidad médica.
4.6 Impactos esperados a partir del uso de los resultados
La estandarización de la técnica de MLST para identificar las cepas del S. agalactiae,
fortalecerá la capacidad técnica y diagnóstica del laboratorio de calidad de leche de la
Universidad de Caldas, el cual se convertirá en un laboratorio de referencia en el país.
Además se podrá prestar el servicio de diagnóstico molecular de este patógeno a
investigadores y profesionales de las ciencias de la salud y de la medicina veterinaria.
De otra parte, el reconocimiento del origen de las cepas de S. agalactiae encontradas en
las lecherías de la región, ayudará a establecer planes de prevención y control más
específicos de este microorganismo, debido a que se podrá establecer la fuente, y así
intervenir en su ciclo epidemiológico. Lo que se traducirá en mejor calidad de leche,
mejor productividad y competitividad del sector lácteo de la región, disminuyendo el
riesgo potencial para la salud pública.
La integración con centrales lecheras del país e investigadores reconocidos
internacionalmente en el área, fortalecerá la relación entre la academia y la industria, lo
cual permitirá la divulgación de resultados para los productores y la oportunidad de
implementar técnicas que permitan producir leche con mayor inocuidad y calidad de la
mano de los avances científicos realizados en las condiciones reales de los productores.
De igual manera, este proyecto será clave para investigaciones futuras en el área y
referente para el uso de técnicas diagnósticas moleculares para S. agalactiae.
4.7 Cronograma de actividades:
ACTIVIDADES MESES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Revisión de literatura
Entrenamiento en técnicas de laboratorio
Prueba piloto
Toma de muestras de leche
Análisis de laboratorio de las muestras
Elaboración de bases de datos
Análisis de la información
Elaboración de informes
Elaboración de artículos científicos
5. Compromisos
Los investigadores del presente proyecto se comprometen con una publicación científica
en una revista indexada u homologada por Colciencias en categoría A1.
6. Bibliografía
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PRESUPUESTO TOTAL *
RUBROS
FUENTES
TOTAL UNIVERSIDAD DE
CALDAS FINANCIACIÓN
EXTERNA RECURRENTE
[1] Solicitado a
V.I.P RECURRENTE RECURSOS FRESCOS
1. SERVICIOS PERSONALES 33,417,000 0 45,000,000 4,900,000 83,317,000 1.1. Investigadores 33,417,000 0 45,000,000 4,900,000 83,317,000 1.2. Auxiliares 0 0 0 0 0 2. GASTOS GENERALES 0 39,800,000 0 0 39,800,000 2.1. Servicios técnicos 0 21,000,000 0 0 21,000,000 2.1.2. Pruebas técnicas 0 21,000,000 0 0 21,000,000 2.2. Materiales e insumos 0 13,800,000 0 0 13,800,000 2.2.1. De campo 0 1,000,000 0 0 1,000,000 2.2.2. De oficina (papel, tinta, fotocopias) 0 300,000 0 0 300,000
2.2.3. De laboratorio 0 12,500,000 0 0 12,500,000 2.3. Apoyo económico para gastos de viaje 0 5,000,000 0 0 5,000,000
2.3.1. Tiquetes aéreos 0 2,000,000 0 0 2,000,000 2.3.3. Gastos de viaje (gasolina y peajes) 0 700,000 0 0 700,000
2.3.4. Auxilio para viaje 0 300,000 0 0 300,000 2.3.5. Apoyo económico para alojamiento y alimentación [2] 0 2,000,000 0 0 2,000,000
SUB-TOTAL 33,417,000 39,800,000 45,000,000 4,900,000 123,117,000 ADMINISTRACIÓN, 20% 0 0 0 1,025,000 1,025,000 TOTAL 33,417,000 39,800,000 45,000,000 5,925,000 124,142,000 PORCENTAJE DE FUENTES 26.9% 32.1% 36.2% 4.8% 100.0%