CARACTERIZACIÓN Y DETERMINACIÓN DE LA ... INÉS GAJARDO REPETTO Santiago, Chile 2005 A mis amados...

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y

FARMACÉUTICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y

TECNOLOGÍA QUÍMICA

Profesor patrocinante:

Lilian Elizabeth Abugoch James

Departamento de Ciencia de los

Alimentos y Tecnología Química,

Universidad de Chile

Directores de memoria:

Lilian Elizabeth Abugoch James

Departamento de Ciencia de los Alimentos

y Tecnología Química, Universidad de

Chile

María Cristina Añon

Facultad de Ciencias Exactas, Universidad

Nacional de La Plata, Argentina

Eduardo Segundo Castro Montero

Departamento de Ciencia de los Alimentos

y Tecnología Química, Universidad de

Chile

CARACTERIZACIÓN Y DETERMINACIÓN DE LA

ESTABILIDAD DURANTE EL

ALMACENAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS DE

HARINA DE QUINUA ORGÁNICA SIN PULIR Y

PULIDA PROVENIENTE DE LA VI REGIÓN DE

CHILE

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero en Alimentos

PILAR INÉS GAJARDO REPETTO

Santiago, Chile

2005

A mis amados padres

Lina y Rodrigo

Esta memoria fue realizada en el Laboratorio de Procesos

de Alimentos del Departamento de Ciencias y Tecnología

Química, ubicado en la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas de la Universidad de Chile.

El financiamiento para la presente investigación fue

otorgada por el proyecto Fundación para la Innovación

Agraria (FIA) SUB-ES-C2004-1-A-15.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco muy profundamente a todos aquellos que me

apoyaron durante mi carrera y en la realización de mi

tesis:

A mi profesora patrocinante y directora de memoria Lilian

Abugoch por su dedicación, buena voluntad y enseñanzas

que fueron necesarias para el óptimo desarrollo de este

trabajo y por la confianza que siempre me entrego, mil

gracias.

Al profesor Eduardo Castro por intentar siempre hacernos

crecer tanto en lo académico como en lo personal.

A la profesora Lucía Collados por su buena voluntad y por

enseñarme a hacer los geles con tanta disposición y

entrega.

Al profesor Abel Guarda y a la profesora María José

Galotto por facilitar el equipo DSC para la realización de

los análisis.

A Fabiola Barahona por su disposición y ayuda en los

análisis de DSC.

Al profesor Antonio Zanocco por facilitar el

espectrofotómetro del CEPEDEC.

A las personas participantes del proyecto FIA por permitir

que se realice este estudio y a todos los miembros del

Laboratorio de Procesos y de Bioquímica por su

disposición y ayuda.

A los profesores miembros de la comisión evaluadora de

mi tesis por sus valiosos aportes y sugerencias en mi

trabajo.

A todos mis compañeros con los que compartí durante mi

carrera y en especial a mi curso con quienes egrese por el

compañerismo existente y por su amistad.

A mis hermanos Rodrigo y Alejandro y en especial a mis

padres Lina y Rodrigo por los valores que me han

entregado, por el cariño, la unión familiar y por apoyarme

incondicionalmente durante toda mi carrera y mi vida,

muchísimas gracias.

ÍNDICE GENERAL

Página

DEDICATORIA……………………………………………………………………… ii

AGRADECIMIENTOS……………………………………………………………… iv

ÍNDICE GENERAL…………………………………………………………………. v

ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………… viii

ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………. xii

RESUMEN…………………………………………………………………….......... xiii

SUMMARY………………………………………………………………………….. xiv

ABREVIATURAS…………………………………………………………………... xv

I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………… 1

1.1 Antecedentes generales……………………………………………………… 1

1.2 Morfología del grano de quinua……………………………………………… 2

1.3 Propiedades de la quinua……………………………………………………. 3

1.4 La saponina……………………………………………………………………. 4

1.5 Producción orgánica………………………………………………………….. 5

1.6 Industria………………………………………………………………………… 5

1.7 Mercado nacional e internacional…………………………………………… 6

1.8 Proteínas……………………..………………………………………………… 7

1.9 Propiedades funcionales de las proteínas…………………………………. 9

II. HIPÓTESIS……………………………………………………………………… 10

III. OBJETIVOS……………………………………………………………………. 11

3.1 Objetivo general……………………………………………………………….. 11

3.2 Objetivos específicos…………………………………………………………. 11

IV. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………. 12

4.1 Materiales….…………………………………………………………………… 12

4.1.1 Materia prima……………………………………………………………. 12

4.1.2 Reactivos químicos…………………………………………………….. 12

4.1.3 Insumos y utensilios……………………………………………………. 13

4.1.4 Equipos e instrumentos………………………………………………… 14

4.2 Métodos………………………………………………………………………… 15

4.2.1 Obtención de las harinas de quinua………………………………….. 15

4.2.2 Análisis efectuados a las harinas de quinua………………….……… 16

4.2.2.1 Contenido de proteínas totales………………………………. 16

4.2.2.2 Perfil de aminoácidos…………………………………….……. 16

4.2.2.3 Caracterización de los perfiles de polipéptidos de las proteínas 17

4.2.2.4 Actividad de agua………………………………………….…… 18

4.2.2.5 Caracterización térmica de las proteínas……………………. 18

4.2.2.6 Actividad proteolítica.……………………………………..…… 18

4.2.2.7 Propiedades funcionales de hidratación……………….……. 19

4.2.2.7.1 Capacidad de retención de agua………………….. 19

4.2.2.7.2 Solubilidad…………………………………………… 19

4.2.2.8 Espectroscopia UV..…………………………………………… 20

4.2.2.9 Fluorescencia…………………………………………………… 20

4.2.3 Análisis estadístico………………………………………………..…….. 20

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES…………………………………………….. 21

5.1 Contenido de proteínas totales……………………………………………….. 21

5.2 Perfil de aminoácidos…………………………………………….……………. 22

5.3 Caracterización de los perfiles de polipéptidos de las proteínas…………. 24

5.3.1 Electroforesis nativa (PAGE-nativa)……..…………………………… 24

5.3.2 Electroforesis desnaturalizante (PAGE-SDS)……….………………. 25

5.4 Actividad de agua………………………………………………………………. 30

5.5 Caracterización térmica de las proteínas……………………………………. 32

5.6 Actividad proteolítica……….…………………………………….……………. 34

5.7 Propiedades funcionales de hidratación………………………..……………. 35

5.7.1 Capacidad de retención de agua…….….……………..…………….. 35

5.7.2 Solubilidad……………………..………….…………………………….. 37

5.8 Espectroscopia UV……………………………………………….……………. 39

5.9 Fluorescencia…………….……………………………………….……………. 42

VI. CONCLUSIONES……………………………………………………………… 45

VII. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………….. 47

ANEXOS……………………….……………………………………………..…….. 53

1. Composición del grano de quinua……………………………………..………. 54

2. Determinación del tipo de molino para la molienda de harina de quinua…. 55

3. Fotografías del grano y harina de quinua de las distintas localidades…….. 56

4. Procedimiento para determinar el contenido de proteínas totales…………. 57

5a. Preparación de muestras para PAGE……………………….………………. 58

5b. Procedimiento para PAGE-nativa……….………….……..….……………… 58

5c. Procedimiento para PAGE-SDS….….……………….……..….……………. 59

5d. Cálculo PAGE.…………………………………….…….……….……..….….. 61

6. Procedimiento para determinar actividad proteolítica……...………………. 63

7. Descripción método de Bradford……..……………………………………….. 64

8. Preparación de reactivos……………….……………………………………… 66

9. Fotografías de algunos de los equipos y análisis realizados a la harina de quinua

……………………………………………………………..…………………

68

10. Fundamento de la fluorescencia………………..………………..…………… 71

11. Contenido de aminoácidos en alimentos..…………………………………… 72

12. Contenido de los aminoácidos esenciales en quinua y otros alimentos…. 73

13. Cantidad de harina de quinua que es necesario ingerir diariamente por

kilogramo de peso corporal, para satisfacer los requerimientos de aminoácidos en

adultos ………………..………………..………………………….

74

14. Comparación de bandas entre albúminas, globulinas y proteínas solubles.. 75

15. Tabla resultados actividad de agua de harina de quinua………………….... 76

16. Figuras obtenidas en el equipo de DSC………………………………………. 77

17. Tabla resultados capacidad de retención de agua de harina de quinua….. 87

18. Tabla resultados solubilidad de harina de quinua……………………………. 88

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

FIGURA

1

Fotografía planta de quinua y grano de quinua…………………. 1

FIGURA

2

Semilla de quinua entera y con corte sección media longitudinal 2

FIGURA

3

Sección del endospermo mostrando cuerpos proteicos……….. 3

FIGURA

4

Fotografía lavado manual y con agitación de la quinua………… 15

FIGURA

5

PAGE-nativa de extracto soluble de harina de quinua LPP, LPSP y

Pared a todos los tiempos de estudio almacenada a

20ºC………………………………………………………………….

24

FIGURA

6



30ºC…………………………………………………………………

25

FIGURA

7



40ºC…………………………………………………………………..

25

FIGURA

8

PAGE-SDS de extracto soluble de harina de quinua pulida de La

Palmilla almacenada a 30ºC (LPP30)…………………………

26

FIGURA

9

PAGE-SDS de extracto soluble de harina de quinua LPP, LPSP y

Pared a todos los tiempos de estudio almacenada a 20ºC…..

27

FIGURA

10



27

FIGURA

11



27

FIGURA

12

PAGE-SDS con β-mercapto etanol de extracto soluble de harina de

quinua pulida de La Palmilla almacenada a 30ºC

(LPP30)……………………………………………………………..

28

FIGURA

13


quinua LPP, LPSP y Pared a todos los tiempos de estudio

almacenada a 20ºC………………………………………..

28

FIGURA

14



almacenada a 30ºC……………………………………….

29

FIGURA

15



almacenada a 40ºC……………………………………….

29

FIGURA

16

Actividad de agua harina de quinua LPP a 20º, 30º y 40ºC……. 30

FIGURA

17

Actividad de agua harina de quinua LPSP a 20º, 30º y 40ºC..... 31

FIGURA

18

Actividad de agua harina de quinua Pared a 20º, 30º y 40ºC…. 31

FIGURA

19

DSC harina de quinua LPP en el tiempo inicial y LPP30 en el

tiempo final…………………………………………………………..

33

FIGURA

20

Capacidad de retención de agua de extracto soluble de harina de

quinua LPP almacenada a 20º, 30º y 40ºC………………….

35

FIGURA

21


quinua LPSP almacenada a 20º, 30º y 40ºC………………...

36

FIGURA

22


quinua Pared almacenada a 20º, 30º y 40ºC………………..

36

FIGURA

23

Solubilidad extracto soluble de harina de quinua LPP almacenada a

20º, 30º y 40ºC…………………………………….

37

FIGURA

24

Solubilidad de extracto soluble de harina de quinua LPSP

almacenada a 20º, 30º y 40ºC……………………………………

38

FIGURA

25

Solubilidad de extracto soluble de harina de quinua Pared

almacenada a 20º, 30º y 40ºC……………………………………

38

FIGURA

26

Espectroscopia UV de extracto soluble de harina de quinua

almacenada a 20ºC (LPP20)………………………………………

39

FIGURA

27


almacenada a 30ºC (LPP30)………………………………………

39

FIGURA

28


almacenada a 40ºC (LPP40)……………………………………..

40

FIGURA

29


almacenada a 20ºC (LPSP20)……………………………………

40

FIGURA

30


almacenada a 30ºC (LPSP30)…………………………………….

40

FIGURA

31


almacenada a 40ºC (LPSP40)……………………………………

40

FIGURA

32


almacenada a 20ºC (Pared20)……………………………………

40

FIGURA

33



40

FIGURA

34



41

FIGURA

35

Fluorescencia de extracto soluble de harina de quinua almacenada a

20ºC (LPP20)…………………………………….…

42

FIGURA

36


30ºC (LPP30)………………………………………

42

FIGURA

37


40ºC (LPP40)………………………………………

42

FIGURA Fluorescencia de extracto soluble de harina de quinua almacenada a

38 20ºC (LPSP20)……………………….…………… 42

FIGURA

39


30ºC (LPSP30)……………………….……………

43

FIGURA

40


40ºC (LPSP40)……………………….……………

43

FIGURA

41


20ºC (Pared20)……………………….……………

43

FIGURA

42


30ºC (Pared30)……………………….……………

43

FIGURA

43


40ºC (Pared40)……………………….……………

43

FIGURA

44

Comparación entre bandas electroforéticas de harina de quinua

molida en distintos molinos…………………………………………

55

FIGURA

45

Estándares PAGE-SDS de extracto soluble de harina de quinua

pulida de La Palmilla almacenada a 30ºC (LPP30)…….

62

FIGURA

46

Principio de la fluorescencia ……………………………………… 71

FIGURA

47

Contenido de aminoácidos esenciales en quinua y otros

alimentos…………………………………………………………….

73

FIGURA

48

Comparación de bandas entre albúminas, globulinas y proteínas

solubles…………………………………………………..

75

FIGURA

49

DSC en el tiempo inicial, harina de quinua pulida proveniente de La

Palmilla……………………………………………………….

77

FIGURA

50

DSC en el tiempo inicial, harina de quinua sin pulir proveniente de

Paredones……………………………………………………….

78

FIGURA

51

DSC en el tiempo final, harina de quinua pulida proveniente de La

Palmilla almacenada a 20ºC…….…………………………….

79

FIGURA

52



80

FIGURA

53



81

FIGURA

54

DSC en el tiempo final, harina de quinua sin pulir proveniente de La

Palmilla almacenada a 20ºC…….…………………………

82

FIGURA

55


Palmilla almacenada a 30ºC……………………………….

83

FIGURA

56


Palmilla almacenada a 40ºC…….…………………………

84

FIGURA

57

DSC en el tiempo final, harina de quinua sin pulir proveniente de

Paredones almacenada a 30ºC…….………………………..

85

FIGURA

58

DSC en el tiempo final, harina de quinua sin pulir proveniente de

Paredones almacenada a 40ºC…….…………………………

86

ÍNDICE DE TABLAS

Página

TABLA 1 Contenido proteico de diferentes

alimentos………………………..

9

TABLA 2 Contenido proteico en harina de

quinua……..…………………….

21

TABLA 3 Contenido de aminoácidos en harina de

quinua…………………..

23

TABLA 4 Temperatura de desnaturalización en harina de quinua………… 33

TABLA 5 Actividad proteolítica en harina de

quinua………………………….

34

TABLA 6 Composición del grano de

quinua…………………………………..

54

TABLA 7 Peso molecular de los

estándares………………………………….

61

TABLA 8 Peso molecular de la proteína de harina de

quinua…..…………..

62

TABLA 9 Contenido de aminoácidos en

alimentos…………………………..

72

TABLA 10 Cantidad de harina de quinua que es necesario ingerir

diariamente por kilogramo de peso corporal, para satisfacer los

requerimientos de aminoácidos en

adultos…………………………

74

TABLA 11 Actividad de agua de harina de 76

quinua……………………..………

TABLA 12 Capacidad de retención de agua de harina de quinua…..………. 87

TABLA 13 Solubilidad harina de quinua en buffer B

…..………………………

88

RESUMEN

La quinua es un cereal con excepcionales cualidades

nutritivas y especialmente proteicas, es por ello la

importancia del estudio realizado, donde se trabajó con

quinua de distintas localidades de la VI región de Chile,

para obtener harina de este grano y luego realizar un

estudio de las propiedades químicas, bioquímicas y

funcionales, evaluando su comportamiento y estabilidad

en el tiempo, durante el almacenamiento en papel Kraft

doble a tres temperaturas distintas: 20°, 30° y 40°C. Se

determinó la cantidad de proteínas totales obteniéndose

entre 11% y 14% de proteínas, no encontrándose

diferencias significativas entre la harina pulida y sin pulir.

Se obtuvo la cantidad de aminoácidos presentes en cada

harina, encontrándose que la quinua contiene todos los

aminoácidos, esenciales y no esenciales. Se evaluó la

actividad de agua, que fue del orden de 0,51, valor que le

confiere estabilidad a la harina desde el punto de vista

microbiológico, durante el almacenamiento hubo una

disminución de aw, lo que es más favorable para su

estabilidad. El estudio de PAGE señaló que la quinua está

compuesta por polipéptidos semejantes al tipo globulinas,

cuyo perfil no se ve afectado por el tipo de harina, ni con

la temperatura, ni tiempo de almacenamiento. La

caracterización térmica señaló la presencia de dos

endotermas: una en la zona de los almidones a 64,6°C y

otra semejante a las endotermas de proteínas vegetales

globulares, con una temperatura de desnaturalización de

99,2°C. El estudio de la actividad proteolítica total fue

bajo y muy variable durante todo el tiempo de

almacenamiento, por lo tanto no existe deterioro en la

harina. Las propiedades funcionales de hidratación:

capacidad de retención de agua y solubilidad, señalan que

esta harina, o eventualmente aislados proteicos de quinua,

podrían ser incluidos en nuevos alimentos como sopas con

alto valor nutritivo pero de corta duración, ya que al tercer

mes ocurre una disminución de estas propiedades, lo que

se comprobó con espectroscopia UV, debido a la

disminución de la concentración proteica extraída. Por

último, se obtuvo los espectros de fluorescencia, para

determinar si durante el almacenamiento de las harinas el

triptófano sufría modificaciones de estructuras, arrojando

resultados estables para las tres temperaturas de estudio.

Se concluye que la harina de quinua de las diferentes

localidades de la VI Región, desde el punto de vista

proteico, se mantiene estable durante 7 meses de estudio

en un envase de papel Kraft doble.

SUMMARY

Characterization and determination of the stability during

the storage of organic flour proteins of quinoa without

polishing and polished originating of the VI region of

Chile

Quinoa is a cereal with exceptional nutritious qualities and

specially protein, is the importance of this study in which,

quinoa was used in different localities of VI region of

Chile, from the flour obtained of this grain and it is was

used to perform a chemical, biochemical and functional

properties study, evaluating its behavior and stability

through out the time, when it is stored in paper double

Kraft at three different temperatures: 20°, 30° and 40°C. It

was determined the amount of total proteins obtaining

among 11% and 14% of proteins, not finding significant

differences between the polished and without polishing

flour. It was obtained the amino acids quantity in each

flour, finding out that quinoa contains all the amino acids,

essential and non essential. The water activity was tested,

it was around the order of 0.51, value that confers stability

to the flour from microbiological point of view, during the

storage was a decrease of aw, which is more favorable for

its stability. The PAGE study indicated that quinoa is

composed by polypeptides similar to the type globulins,

whose profile is not affected by the type of flour, neither

with the temperature, nor time of storage. The thermal

characterization indicated the presence of two endotherms:

one in the zone of starches at 64.6°C and another similar

to endotherms of globular vegetal proteins, with a

temperature of denaturation of 99.2°C. The total the

proteolytic activity study was low and very variable

throughout the time of storage, therefore it doesn’t exist

deterioration in the flour. The functional properties of

hidratation: water holding capacity and solubility, were

studied indicating that this flour, or even quinoa isolated

protein, could be included in new foods like soups with a

high nutritious value but with a short lasting, due to the

third month occurs a decrease in these properties, which

was proven with an UV spectroscopy, because of a

decrease of the extracted protein concentration. Finally, it

was obtained the fluorescence, to determine if during the

storage of flours the tryptophan underwent with structures

modifications, it showed stable results for the three

temperatures analyzed. In conclusions, flour of quinoa

from different localities at VI Region, from the protein

point of view, it maintains stays stable during 7 months of

study in a package of paper double Kraft.

ABREVIATURAS

A: absorbancia

A/BA: acrilamida – bis-acrilamida

AOAC: Association of Official Analytical Chemists

aw: actividad de agua

BSA: seroalbúmina de bovino

DSC: differential scanning calorimetry (calorimetría diferencial de barrido)

g: gramo

HPLC: cromatografía líquida de alta resolución

HRE: humedad relativa en equilibrio

kDa: kilo Dalton

LPP: harina de quinua pulida proveniente de La Palmilla (comuna de

Pichilemu)

LPP20: harina de quinua pulida de La Palmilla almacenada a 20ºC



LPSP: harina de quinua sin pulir proveniente de La Palmilla (comuna de

Pichilemu)

LPSP20: harina de quinua sin pulir de La Palmilla almacenada a 20ºC



Pared: harina de quinua sin pulir proveniente de La Valdivia (comuna de

Paredones)

Pared20: harina de quinua sin pulir de Paredones almacenada a 20ºC



Tiempo 0: septiembre 2004 (tiempo inicial)

Tiempo 1: octubre 2004

Tiempo 2: noviembre 2004

Tiempo 3: diciembre 2004

Tiempo 4: enero 2005

Tiempo 5: marzo 2005 (tiempo final)

M: molar

mg: miligramos

min.: minuto

ml: mililitros

MM: masa molecular

mm: milímetro

mM: milimolar

N: normalidad

nm: nanómetro

ºC: grados Celsius

p/p: peso/peso

PAGE-nativa: electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones nativas

PAGE-SDS: electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS en

condiciones desnaturantes

PSA: persulfato de amonio

Rf: movilidad relativa

SDS: dodecil sulfato de sodio

TCA: ácido tricloroacético

TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethiletilendiamina

UV: ultravioleta

V: volumen

WHC: water holding capacity (capacidad de retención de agua)

µ: micro

I. INTRODUCCIÓN

Antecedentes generales

La quinua (Chenopodium quinoa Willd) es un producto originario de las regiones

andinas, desde la época de los Incas, hace por lo menos 3000 años. Las especies nativas

y las formas cultivadas de quinua se hallan distribuidas en los Andes desde Venezuela

hasta Chile incluyendo el norte argentino, en diferentes rangos altitudinales. A Chile

llegó por el norte, como parte de los constantes encuentros e intercambios entre pueblos

originarios del altiplano (Fontúrbel, 2003; Sepúlveda y col., 2004).

Figura 1: Fotografía planta de quinua (izquierda) y grano de quinua (derecha).

Su cultivo es posible desde el nivel del mar hasta los 4000 metros de altura. Su

adaptación climática es alta, incluso en ambientes desfavorables, desde climas cálidos

(35ºC) hasta climas fríos (-8ºC), con precipitaciones que oscilan desde los 250 mm

hasta los 2000 mm al año, en suelos francos, arenosos, arcillosos, con pH alcalinos (9)

hasta suelos ácidos (4,5). Su amplia variabilidad fenotípica y genética, le otorga una

mayor capacidad de sobrevivencia a la especie frente a las drásticas adversidades

climáticas donde pueda ser cultivada, otorgándole una mayor seguridad al momento de

la cosecha. Existen 3000 variedades conservadas de quinua, mostrando variabilidad en

el color de la semilla, planta, tallos, tipos de inflorescencia, contenido de saponina,

proteína, betacianinas, contenido de oxalatos de calcio, adaptación a diferentes

condiciones agroecológicas, etc. (Sepúlveda y col., 2004).

Las variedades de quinua chilena presentan escasa información sobre las características

y potencialidades del grano. Estas variedades poseen una gran diversidad de genotipos,

sin embargo, se estima que se ha producido una desaparición importante de genotipos

durante los últimos 50 años. Descriptores de interés para la caracterización de las

variedades son el color de la panoja y del grano, días de siembra y cosecha, tamaño del

grano, densidad de la panoja, valor nutritivo y aptitud de usos (Sepúlveda y col., 2004).

La siembra de la quinua en la VI región se realiza entre la última quincena de

septiembre y la primera de octubre y la cosecha desde fines de febrero hasta fines de

marzo, dependiendo de la precocidad varietal y fecha de siembra, debe cosecharse

cuando el grano esté duro y la planta marchita (Sepúlveda y col., 2004).

Morfología del grano de quinua

El pericarpio está pegado a la semilla, presenta alvéolos que en algunas variedades se

puede separar fácilmente. Pegada al pericarpio se encuentra la saponina, que le

transfiere el sabor amargo a la quinua (Tapia y col., 1979).

La semilla esta envuelta por el epispermo en forma de una membrana delgada (Tapia y

col., 1979). La proteína se encuentra principalmente en el embrión y en el endospermo

de la semilla de quinua (Prego y col., 1998).

El embrión está formado por un eje radícula hipocotiledónea (H) y dos cotiledones (C)

y constituye la mayor parte de la semilla que envuelve al perisperma como un anillo. El

perisperma es almidonoso y normalmente de color blanco (Tapia y col., 1979).

Figura 2: Semilla de quinua entera (izquierda) y con corte sección media longitudinal

(derecha).

Fuente: Tapia y col., 1979; Prego y col., 1998.

La figura 3 muestra una sección del endospermo donde se visualizan las proteínas de

reserva (globulinas) en el interior de los cuerpos proteicos (PB) en un micro diagrama

(Cheftel y col. 1989; Prego y col., 1998).

Figura 3: Sección del endospermo mostrando cuerpos proteicos (PB).

Fuente: Prego y col., 1998.

Propiedades de la quinua

La quinua constituye un producto de excepcionales cualidades nutritivas (ver anexo 1),

que posee importancia internacional por ser alta en proteínas al compararlo con el resto

de los cereales, pero el verdadero valor de la quinua está en la calidad de sus proteínas,

es decir, en la combinación de una mayor proporción de aminoácidos esenciales para la

alimentación humana, que le otorgan un alto valor biológico (Tapia y col., 1979;

Zamudio, 2003).

Además la quinua posee alto contenido de vitaminas, especialmente C, E y del complejo

B. También es rica en minerales como el hierro, fósforo, potasio y calcio (Albarran,

1993).

En relación al contenido total de lípidos es superior al de los cereales, representando

aproximadamente del 5% al 9% de su peso, de esto, contiene alrededor de un 4% de

ácidos grasos, sobresaliendo algunos esenciales como el linoleico y linolénico, los que

comprenden del 55% al 63% del total de los lípidos de la quinua (Albarran, 1993).

El almidón es el mayor constituyente de este grano, con aproximadamente un 51% a

60% del peso de la semilla. Se localiza en las células del perisperma, que son de forma

alargada bien definida (Albarran, 1993).

La quinua contiene fitoestrógenos, sustancias con efectos parecidos a los estrógenos, y

por ende constituyen una forma de tratamiento hormonal natural de los síntomas

menopáusicos (síndrome climatérico) y alteraciones en el ciclo menstrual, además

previenen enfermedades como la osteoporosis, cáncer (de mama, colon, endometrio y

próstata) y enfermedades cardiovasculares (Zamudio, 2003). Tiene actividad

antimicrobiana, anticarcinogenética y antiinflamatoria. Como uso medicinal, a las hojas,

tallos y granos de la quinua, se les atribuyen propiedades cicatrizantes, desinflamantes y

analgésicas contra el dolor de muelas, desinfectantes de las vías urinarias, se utiliza

también en fracturas, en hemorragias internas y como repelente de insectos (CIED,

2004).

Las múltiples características de la quinua hacen de éste cereal un alimento natural que

ayuda al desarrollo y crecimiento del organismo, es fácil de digerir, no contiene

colesterol (y por ende no forma grasas en el organismo), forma una dieta completa y

balanceada, y tiene un valor calórico mayor que otros cereales, lo que la caracteriza

como un alimento apropiado para zonas y épocas frías (Fontúrbel, 2003; Zamudio,

2003).

La saponina

Uno de los aspectos que atenta contra la reincorporación masiva de la quinua es la

presencia de la saponina en los granos, la que da un sabor amargo al cereal por lo que

requiere un procesamiento previo para su consumo. La eliminación de esta sustancia

jabonosa se puede realizar en forma manual (lavando el grano con agua y frotándolo

hasta que no salga espuma) o mecanizado (usando una peladora que pasa el grano por

paletas friccionándolo contra una malla trenzada) (Sepúlveda y col., 2004).

La desaponificadora de quinua quita la cáscara del grano aprovechando este

componente para la industria cosmetológica y además, dada sus propiedades, puede ser

empleada como ingrediente para la fabricación de cervezas y detergentes, como

componente para la fabricación de extinguidores de incendios, en la industria

fotográfica y en la industria farmacéutica (en la fabricación de hormonas sintéticas)

(Fontúrbel, 2003; Sepúlveda y col., 2004).

Por otra parte, la saponina le brinda una protección natural a la semilla que recubre al

grano por completo, evitando de esta forma el ataque de polillas, gorgojos y otras plagas

de almacén y, en el ámbito alimenticio, experiencias desarrolladas en el Perú indican

que el consumo de quinua con residuos de saponina contribuiría a impedir la

acumulación de colesterol en el cuerpo, por lo que habría una menor incidencia de

problemas cardiacos (Sepúlveda y col., 2004; Jara, 2004).

Producción orgánica

La agricultura orgánica es una forma sostenible de producción, promueve e incrementa

la biodiversidad, los ciclos biológicos y la actividad biológica del suelo. Está basada en

el uso mínimo de insumos externos y en métodos que reestablecen, mantienen, e

incrementan la armonía ecológica. No utiliza plaguicidas, herbicidas ni fertilizantes

químicos sintéticos, y en su lugar, se basa en desarrollar un suelo saludable, fértil y con

rotaciones de cultivo apropiadas. De esta forma el predio se mantiene balanceado

biológicamente con una gran variedad de insectos benéficos y otros organismos para

actuar como predadores naturales para plagas de cultivo y un suelo lleno de

microorganismos y lombrices para mantener su vitalidad. Si se requieren medidas de

control directas para prevenir daños serios a los cultivos, existen diversos agentes de

fuentes naturales y pueden utilizarse agentes de biocontrol (Koechlin y col., 2000).

El cultivo orgánico de la quinua ofrece granos de alta calidad, es decir, con cualidades

nutricionales, de sanidad (sin plaguicidas ni elementos nocivos), de apariencia física y

sabor que hacen que la quinua sea apreciada comercialmente (Proyecto Sica, 2001).

Se le incorpora al suelo materia orgánica y mineral para que los microorganismos allí

presentes asimilen los nutrientes y de esta manera puedan ser absorbidos por las raíces

de la quinua, para propiciar su desarrollo y fructificación (Proyecto Sica, 2001).

Industria

Las amplias posibilidades de preparación de la quinua, permite ser usada en la industria

alimenticia en expandidos, extruídos, concentrados proteicos, suplementos alimenticios,

almidones, colorantes vegetales, leche, laminados, perlados, germinados, formulaciones

de alimentos para bebes, hojas liofilizadas, fideos, harinas precocidas de colores

naturales y variados, etc. Estos amplios usos transforman a la quinua en un producto

fácilmente adaptable a los gustos y exigencias del consumidor (Ogungbenle, 2003;

Prego y col., 1998; Sepúlveda y col., 2004).

La capacidad que poseen los ácidos fuertes para hidrolizar las proteínas,

transformándolas en aminoácidos y péptidos hidrosolubles de cadena corta, es

aprovechada en la industria alimenticia para la preparación de hidrolizados de proteína a

partir de materia vegetal. En este proceso se hidrolizan proteínas de varias fuentes

vegetales mediante el agregado de ácido clorídrico concentrado, por lo general en

equipos de revestimiento de vidrio, y el producto es luego neutralizado mediante el

agregado de álcali. La mezcla resultante de péptidos y aminoácidos es luego

concentrada y comercializada en esta forma como hidrolizado de proteína. Estos

productos se utilizan ampliamente en sopas y otros preparados alimenticios de

naturaleza similar (Braverman y Berk, 1980).

El concentrado de proteína puede ser usado como ingrediente en la industria alimenticia

y así incrementar la calidad de éstos (Aluko y Monu, 2003).

Por otra parte, la agroindustria transforma este grano preferentemente en hojuelas y en

harina (CIED, 2004). Según el Reglamento Sanitario de los Alimentos en el artículo

número 348 dice “El producto pulverulento proveniente de la molienda de otros granos

(distinto al de trigo), será designado con la palabra harina, seguida de un calificativo que

indique la o las especies de grano de la que provenga” (González, 2000), por lo tanto,

se obtiene harina de quinua, un producto libre de gluten para ser consumida hasta por

personas celiacas (alérgicas al gluten), que es utilizada además para enriquecer harinas

en la elaboración de galletas, barritas, pasteles, batidos, spaghetti, etc. aportando un alto

valor nutritivo, así se consigue elaborar alimentos altamente energéticos, naturales y sin

colesterol. Es considerada por la FAO y la OMS como un alimento único por su

altísimo valor nutricional, mantiene sus cualidades nutritivas incluso en procesos

industriales y es capaz de sustituir notablemente a las proteínas de origen animal.

Por otra parte, la digestión y absorción de la proteína de los granos enteros es muy

difícil para los niños menores de dos años, incluso cuando han sido sometidos a la

cocción, sin embargo se ha visto que la digestibilidad mejora notablemente con su

ingestión en forma de harinas, en papillas o bebidas (FAO, 1992).

Por último, se encontró que como subproducto del cultivo de la quinua, esta el forraje

para el ganado y la leña (Diario Pyme, 2003).

Mercado nacional e internacional

El consumo de quinua en Chile es bajo, comparado con otros alimentos ricos en

carbohidratos como: trigo, arroz y maíz. Esto se debe a que no se conocen las ventajas

nutritivas de la quinua y a que existe una oferta irregular del producto (Sepúlveda y col.,

2004). En el ámbito comercial, es posible encontrar algunos restaurantes naturistas con

platos elaborados a partir de quinua, y en la sección de productos naturales de

supermercados y tiendas naturistas hay, quinua, harina y productos elaborados a partir

de ella con marcas como “Irupana Andean”, “La fuente natural”, “Nutrisa” y “Ecovida”.

Por otro lado, en Chile existe un mercado creciente del cereal en vías de un amplio

mercado exportable. Es así como en julio del 2002, se realizó la primera exportación de

quinua a Estados Unidos, ese mismo año, la empresa ofreció el volumen productivo de

febrero del año 2003 a supermercadistas de Canadá, Australia, Inglaterra, España,

México y Japón, y desde comienzos de abril del año pasado, la misma Cooperativa de

Producción Agrícola Las Nieves, de la Sexta Región, suscribió un acuerdo comercial y

de marketing con la Sociedad Francesa ABCD, mediante el cual se efectúa una serie de

acciones y estrategias destinadas a introducir el uso de quinua chilena en el mercado del

Viejo Continente. El acuerdo permite adquirir los medios comerciales y de marketing

para llegar directamente a los consumidores europeos y específicamente a los franceses,

junto con potenciar los envíos no tradicionales (Diario Pyme, 2003).

El europeo es un mercado muy interesado en nuevos sabores y texturas, de las cuales

Chile posee toda una gama de productos con una fuerte connotación cultural y

tradicional, es por ello que, el presente estudio sobre la quinua, reviste gran importancia

para la investigación científica, puesto que los resultados permiten profundizar el

conocimiento en los diferentes aspectos de este cereal y así conquistar áreas potenciales

de exportación y mejoras en la comercialización, industrialización y producción

agrícola de la zona central de Chile.

Proteínas

Son sustancias orgánicas cuyo nombre proviene del griego que significa “lo más

importante”. Se componen de carbono, hidrógeno, oxigeno, nitrógeno y a menudo

azufre y fósforo, la presencia de nitrógeno imparte muchas de las propiedades

específicas de las proteínas. Se componen básicamente de 20 aminoácidos y se dividen

en simples (aquellas que solo producen aminoácidos por hidrólisis) y conjugadas (las

que contienen otros grupos no proteicos como azucares, lípidos, ácido fosfórico, ácidos

nucleicos y otros). Los aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos (-CO-

NH-), es decir, el grupo carboxilo de un aminoácido forma un enlace con el grupo

amino de un segundo aminoácido con eliminación de H2O, formándose así una amida

del segundo ácido (Braverman y Berk, 1980).

Las proteínas puras generalmente carecen de color, sabor y olor, cuando los alimentos

ricos en proteínas sufren descomposición, las características organolépticas cambian

debido a impurezas o a grupos prostéticos que contienen nitrógeno y/o azufre

(Braverman y Berk, 1980).

Como es sabido, las proteínas ingeridas con los alimentos se desdoblan, por la

digestión, en sus aminoácidos integrantes, los que son aprovechados por el organismo

después de la absorción, para construir sus proteínas. Una proteína ideal suministraría al

organismo, todos los aminoácidos en las proporciones más adecuadas para sus

necesidades, de manera que podría ser utilizada con muy pocas pérdidas. Es por ello que

es más importante el suministro de los aminoácidos en cantidades y proporciones

requeridas, que el aumento total de las proteínas ingeridas (Schmidt-Hebbel, 1981).

La distribución de las proteínas entre los diversos tejidos que constituyen el grano no es

uniforme, las concentraciones mayores se encuentran en las capas más externas del

endospermo, en la aleurona y en el germen. Tampoco se distribuyen uniformemente los

diferentes tipos de proteínas, las prolaminas y las glutelinas se encuentran localizadas

principalmente en el endospermo; las albúminas y globulinas están en las cubiertas

exteriores y en el germen (Primo, 1979).

A las proteínas de origen vegetal se las halla en gran concentración en los cotiledones

de las semillas (Braverman y Berk, 1980). Están compuestas principalmente por

albúminas (metabolismo) y globulinas (de reserva). Las proteínas globulares adsorben

agua y aumentan de tamaño considerablemente, el sitio principal de adsorción es la

unión peptídica (Braverman y Berk, 1980).

Por último, en la tabla 1 (izquierda) se observa la cantidad proteica de distintos

alimentos, con el fin de visualizar una comparación entre ellos y en la tabla 1 (derecha)

se presentan los valores de literatura del porcentaje proteico de distintos cereales. Se

observa que la quinua es un grano que presenta casi el doble de la cantidad de proteínas

que el resto de los cereales y valores muy similares al amaranto (Schmidt Hebbel y col.,

1992; Arellano y col., 1990).

TABLA 1: Tabla comparativa de contenido proteico de diferentes alimentos:

alimento proteína Carne de vacuno 21,2 %

Poroto 20,6 % Pescado congrio dorado 16,5 %

Huevo 13,5 % Pan Marraqueta 6,4 %

Leche pasteurizada de vaca 3,2 % Tomate 0,8 %

Cereal ProteínaAmaranto 15,5 %

Quinua 13,0 % Cebada 10,6 % Avena 9,6 % Trigo 9,3 % Sorgo 9,3 % Arroz 6,4 %

Fuente: Tabla de Composición Química de Alimentos Chilenos y Revista Chilena de

Nutrición.

Propiedades funcionales de las proteínas

Las propiedades funcionales son todas aquellas propiedades no nutricionales que son

capaces de impartir una característica específica deseable a un alimento, influyendo, ya

sea en el carácter sensorial, como también en el comportamiento físico de los alimentos

durante su preparación, transformación o almacenamiento (Cheftel y col., 1989).

Las propiedades funcionales de las proteínas alimenticias, pueden clasificarse en tres

grupos principales: (Cheftel y col., 1989).

• Propiedades de hidratación: dependiente de las interacciones proteína-agua, incluye

propiedades tales como la absorción y la retención de agua, hinchado, adhesión,

dispersibilidad, solubilidad y viscosidad.

• Propiedades texturales: dependientes de las interacciones proteína-proteína:

interviene en fenómenos tales como la precipitación, gelificación y formación de

otras estructuras diferentes.

• Propiedades superficiales: están relacionadas con la formación de emulsiones y

espumas.

Para conocer las propiedades funcionales de un alimento, es necesario realizar una

evaluación experimental mediante medidas de las propiedades fisicoquímicas en el

alimento (Cheftel y col., 1989).

II. HIPÓTESIS

La caracterización de las proteínas de harina de quinua orgánica permitirá formular

opciones de uso, procesamiento y comercialización del cereal, dado que sus propiedades

químicas, bioquímicas y funcionales no se verán afectadas significativamente a la

temperatura más baja estudiada durante su almacenamiento en un tiempo de siete

meses.

III. OBJETIVOS

Objetivo general

Caracterizar y estudiar la estabilidad de las proteínas en dos harinas de quinua

(provenientes de granos pulidos y sin pulir), durante el almacenamiento a tres

temperaturas diferentes.

Objetivos específicos

• Obtener las harinas de quinua.

• Caracterizar, a tiempo inicial y final, el contenido de proteína total de las harinas de

quinua y realizar un perfil de aminoácidos al comienzo del estudio.

• Almacenar las harinas a tres temperaturas distintas: 20º, 30º y 40°C para estudiar la

estabilidad de las propiedades químicas, bioquímicas y funcionales durante siete

meses, realizando mensualmente los análisis mencionados en los puntos siguientes.

• Caracterizar los perfiles de polipéptidos de las proteínas.

• Determinar la actividad de agua de cada harina.

• Caracterizar térmicamente las proteínas.

• Determinar la actividad proteolítica total de las harinas de quinua.

• Caracterizar propiedades funcionales de hidratación de las harinas de quinua:

capacidad de retención de agua y solubilidad.

• Determinar espectros en proteínas solubles en UV y fluorescencia.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Materia prima:

Quinua orgánica sin pulir proveniente de la localidad de Lo Valdivia comuna de

Paredones y quinua orgánica pulida y sin pulir proveniente de la localidad de La

Palmilla comuna de Pichilemu, ambas localidades ubicadas en la VI región de Chile. La

quinua fue proporcionada por el Sr. Ricardo Valdebenito González de la Cooperativa

Las Nieves ubicada en Paredones y por el Sr. Pablo Rafael Jara Valdivia procesador de

la zona de Pichilemu.

Reactivos químicos:

• Acetato de sodio (CH3COONa) Panreac. Barcelona, Spain

• Acetonitrilo (CH3CN) Panreac. Barcelona, Spain

• Ácido acético glacial (CH3COOH) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Ácido bórico (H3BO3) Panreac. Barcelona, Spain

• Ácido clorídrico (HCl) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Ácido orto-fosfórico (H3PO4) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Ácido sulfúrico (H2SO4) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Ácido tricloroacético (TCA) (CCl3COOH) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Acrilamida (C3H5NO) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Alcohol etílico (Etanol) (C2H6O) p.a. Winkler. México

• Azul brillante de coomasie G-250 (C47H50N3NaO7S2) Baker. USA

• Azul de bromofenol (C19H10Br4O5S) Sigma. USA

• Bis-acrilamida (C7H10N2O2) Sigma. USA

• β-mercapto etanol (C2H6OS) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Butanol (C4H10O) p.a. Mallinckrodt. Montreal, New York

• Cloruro de sodio (NaCl) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Coomassie blue R (C45H44N3O7S2Na) Sigma. USA

• Dietil etoximetilenmalonato. Fluka. Buchs, Switzerland

• Dodecil sulfato de sodio (SDS) (C12H25NaO4S) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Estándar para electroforesis Bio-Rad Kaleidoscope Prestained Standards Catalog

161-0324, control 99237

• Estándar: seroalbúmina de bovino (BSA). Sigma. USA

• Fosfato de potasio dihidrógeno (KH2PO4) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4*H2O) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Glicerol (C3H8O3) Sigma. USA

• Glicina (C2H5NO2) Sigma. USA

• Hidróxido de sodio (NaOH) W & Z

• Indicador fenoftaleina (C20H14O4) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Indicador rojo de metilo (C15H15N3O2) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Metanol (CH3OH) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Persulfato de amonio (PSA) ((NH4)2S2O8) Sigma. USA

• Sacarosa (C12H22O11) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Sodio fosfato bibásico anhidro (Na2HPO4) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4*5H2O) p.a. Merck. Darmstadt, Germany

• Sulfato de potasio (K2SO4) p.a. Purom

• TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethiletilendiamina) Sigma. USA

• Tris (C4H11NO3) p.a. J.T.Baker. USA

Insumos y utensilios:

Agua destilada, bandejas de acero galvanizado de 30 mallas de 44 cm x 24 cm, caja

Coleman, cápsulas para medir humedad, cubeta para electroforesis o cubeta de corrida,

cubetas de cuarzo y de plástico, espátula pequeña, gradillas, guantes, hielo, manga de

polietileno, material de vidrio de laboratorio, micropipetas, papel absorbente, papel

Kraft doble, papel Whatman nº1, parafilm, pinzas, plumavit, potes de plástico, soporte

para electroforesis, tubos Ependorf, tubos Kjeldahl, utensilios de cocina, vidrios para

polimerización y peineta (plástico dentado).

Equipos e instrumentos:

• Agitador eléctrico vortex Thermolyne, type 37600 Mixer, model n°M37610-26,

serie n°871570819103

• Agitador Heavy Duty KitchenAid Inc. St. Joseph, model K5SS, Michigan USA

• Balanza analítica Precisa 125 A Swiss Quality

• Balanza granataria AND, model EK 120-A

• Baño termorregulado con agitador Haake D1 Fisons, type 001-3603, n°891655,

made in Germany

• Calorímetro diferencial de barrido (DSC) Mettler Toledo 822e

• Cámara de refrigeración FrioLux

• Campana de extracción

• Centrifuga Beckman Microfuge, model 11 n°343121, serie 748, made in USA

• Desecador

• Digestor Büchi 426 n°1270878, type B-426RC, made in Switzerland

• Espectrofotómetro de fluorescencia Perkin Elmer, model LS50B, serie n°32938 n°

L225-0105

• Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 11 n°BC11230V, serie NR30031

• Espectrofotómetro UNICAM UV/Vis, type UV3-200, nºUV3022809, made in

England

• Estufa Heraeus Instruments D-63450 Hanau, type UT 6200, made in Germany

• Estufa Heraeus, type KB 600

• Estufa Heraeus, type TU 60/60, n°2760-02

• Freezer Medical Freezer Sanyo, model MDF-U332, n°606033941, made in Japan

• Molino de impacto Retsch Muhle GmbH West-Germany, type SR-2 n°73454

• Novasina Thermoconstanter

• Peachímetro Microprocesador pH 537 WTW, made in Germany

• Refrigerador Mademsa

• Sistema HPLC Merck Hitachi bomba ternaria L6200 con inyector Rheodyne 7725i;

loop de 20 µl, Detector espectrofotométrico UV-Visible modelo 484 a 280 nm,

Integrador D-2500; Columna Nova Pack RP18 (30 cm x 4 µm de diámetro interno)

Waters

• Termómetro

• Unidad destiladora Büchi 323 n°1258804, type B-323, made in Switzerland

Métodos

Obtención de las harinas de quinua:

Se lavó el grano mediante frotación para sacar la saponina; para ello se colocó

aproximadamente 1500 g de quinua, previamente mojada, en un agitador mecánico a

baja potencia (figura 4 derecha), para sacar la espuma que se va soltando al agitar

(saponina), se enjuagó con agua fría (Ogungbenle, 2003). Intercalando con esto, se

realizó un lavado manual (con frotación), para así disminuir el tiempo de agitación

(figura 4 izquierda). La necesidad de remover rápidamente el contenido de saponina es a

fin de minimizar el riesgo de que se difunda en el endospermo (Tapia y col., 1979). Este

procedimiento se realizó hasta que la quinua ya no suelte espuma, lo cual indica que

está libre de saponina, (en el caso de la quinua pulida el procedimiento demoró una hora

y en el caso de la quinua sin pulir cuatro horas).

Figura 4: Fotografía lavado manual (izquierda) y con agitación (derecha) de la quinua.

Luego de lavar, se secó el grano en estufa a 50°C hasta un 15% de humedad,

removiendo de vez en cuando el grano de las bandejas para homogenizar el secado

(Pearson, 1976).

Para verificar que se llegó a la humedad deseada, se sacó una muestra de 5 g y se colocó

en una cápsula de aluminio en estufa a 156°C durante 15 minutos y luego en el

desecador durante 15 minutos, por determinación gravimétrica de la diferencia de peso

se obtuvo el porcentaje de humedad de la quinua (Pearson, 1976).

Posteriormente se realizó la molienda mediante un método estándar, moliendo el grano

de quinua con el molino de impacto del laboratorio de Operaciones Unitarias de la

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile (anexo 2).

Se obtuvieron tres muestras de harinas: pulida y sin pulir proveniente de La Palmilla

(Pichilemu) y sin pulir proveniente de Lo Valdivia (Paredones) (anexo 3). Cada muestra

se almacenó en papel Kraft doble y se dispusieron en estufas a tres temperaturas

distintas: 20º, 30º y 40ºC, con lo que se tuvieron nueve muestras para analizar por mes.

Cada análisis se realizó en duplicado.

Análisis efectuados a las harinas de quinua:

4.2.2.1 Contenido de proteínas totales:

Se determinó mediante el método AOAC (1984). La medición se efectuó al comienzo y

al final del estudio. El método empleado fue el de Kjeldahl, que es el método oficial

más ampliamente usado para la determinación del contenido de proteínas en los

alimentos, la razón se debe a su grado de precisión y reproducibilidad.

Consiste en la destrucción de la materia orgánica por ácido sulfúrico concentrado, el

cual se reduce en parte a SO2, el que a su vez reduce el nitrógeno de la materia orgánica

a NH4 y que luego en presencia de H2SO4 forma sulfato de amonio. El NH3 se libera

con NaOH y al destilarlo se recibe sobre ácido sulfúrico 0,1 N. Finalmente, el ácido

excedente se valora con NaOH 0,1 N, por diferencia se cuantifican los mili-equivalentes

de NH3 y se calcula la masa de nitrógeno. Se usó el factor de conversión 5,77 (Schmidt-

Hebbel, 1981), (ver descripción del método en anexo 4 y fotos anexo 9).

4.2.2.2 Perfil de aminoácidos:

La medición se realizó solo una vez, al comienzo del estudio, mediante el método de

HPLC en el Laboratorio de Química de Alimentos y Materias Grasas de la Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es la técnica de separación de

sustancias más ampliamente utilizada. Las razones de su aplicación son su sensibilidad,

su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la

separación de especies no volátiles o termolábiles y su gran uso a sustancias de interés

en la industria como las proteínas. Se utilizó un equipo HPLC Merck Hitachi bomba

ternaria L6200 con inyector Rheodyne 7725i; loop de 20 µl, Detector

espectrofotométrico UV-Visible modelo 484 a 280 nm, Integrador D-2500; Columna

Nova Pack RP18 (30 cm x 4 µm de diámetro interno) Waters. La muestra se hidrolizó a

110ºC con HCl 6 N por 24 horas. Los aminoácidos se derivaron con dietil

etoximetilenmalonato a 50ºC por 50 minutos y se inyectaron en el cromatografo HPLC.

La resolución de los derivados de aminoácidos se logró usando un sistema de gradiente

binario a temperatura ambiente empleando como fase móvil tampón acetato de sodio 25

mM pH = 6,0 y acetonitrilo (Alaiz y col., 1992).

4.2.2.3 Caracterización de los perfiles de polipéptidos de las proteínas:

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es un método analítico, que se basa

en la separación de moléculas al aplicar un campo eléctrico a una solución (Albarran,

1993), las moléculas de soluto con carga neta positiva se desplazan hacia el cátodo y las

moléculas con carga neta negativa se desplazan hacia el ánodo (Mathews y col., 2002).

Se realizó de acuerdo al método descrito por Laemmli (1970), el que describe la técnica

PAGE que se efectúa en función del estado de las proteínas (nativo o desnaturalizado) a

lo largo del proceso electroforético (Genovese y Lajolo, 2000).

El gel se preparó polimerizando acrilamida y bisacrilamida en presencia del catalizador

PSA. Se incluyó también TEMED para iniciar y controlar la polimerización. Se dejó

polimerizar la mezcla entre dos vidrios colocando agua con butanol encima del gel para

asegurar la obtención de una superficie plana y además para excluir el oxígeno que

inhibe la polimerización. El tamaño del poro del gel puede variarse de acuerdo a la

concentración del monómero en solución (Plummer, 1981), (ver fotos anexo 9).

Electroforesis nativa (PAGE-nativa): Se sometió a las proteínas a migración en un

campo eléctrico. En esta situación las proteínas migran en función de su carga, de su

tamaño y de su forma (ver anexo 5b).

Electroforesis desnaturalizante (PAGE-SDS): Es la más común, las proteínas se

sometieron a migración en un campo eléctrico en presencia de un detergente aniónico,

asegurando la completa desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). En

esta situación la migración es proporcional al tamaño molecular pero no a su carga. Se

realizó PAGE-SDS con y sin el agente reductor β-mercapto etanol (ver anexo 5c).

4.2.2.4 Actividad de agua:

Se realizó usando el equipo Novasina Thermoconstanter, el que permitió una medición

eléctrica de actividad de agua usando un sensor de litio, higrómetro de conductividad

que transmite la señal eléctrica traduciéndose en un valor de actividad de agua. El valor

se registró a temperatura constante (25°C) leyendo en forma directa el dato entregado

por el equipo en el momento en que arrojó un valor constante de actividad de agua.

Considerando que el equipo es un instrumento especializado, su precisión y exactitud

para estas mediciones es buena y no hay errores humanos (Pollio y col., 1986), (ver

fotos anexo 9).

4.2.2.5 Caracterización térmica de las proteínas:

Se preparó cada muestra justo antes de ponerla en el equipo, pesando en balanza

analítica aproximadamente 30 mg de harina en parafilm y se agregó buffer B (anexo 8)

a una concentración de 20%. Luego se tomó aproximadamente 15 mg de esta mezcla y

se colocó en una cápsula previamente pesada y tarada con tapa. Se selló y colocó la

muestra en el equipo de calorimetría diferencial de barrido (DSC), esperando a que el

calorímetro llegue a la fase de enfriamiento, a temperatura ambiente (Sadqi, 2000). Se

trabajó desde 15ºC a 120ºC con un flujo de calor de 10ºC/minuto (USM, 1997). La

cápsula de referencia contenía la harina de quinua con la proteína previamente

desnaturalizada, (ver fotos anexo 9).

4.2.2.6 Actividad proteolítica:

El método diseñado se basó en emplear un buffer con un pH igual al de la harina de

quinua (5,92) (anexo 8) en el cual se incubaron las diferentes muestras a 37°C.

A tiempo inicial se incubaron las muestras en el baño termorregulado a 0, 30, 60, 90 y

120 minutos para así establecer si existe o no diferencia según el tiempo de incubación

en el baño. Así se determinó que los siguientes análisis solo deben realizarse a 0 y 90

minutos debido a que no hay diferencia en los valores entregados por el

espectrofotómetro en cuanto al tiempo de incubación. Los péptidos presentes en el

sobrenadante se determinaron de acuerdo al método descrito por Bradford (1976), (ver

método en anexo 6 y fotos anexo 9), (Castellani, 2001), (Molina y Wagner, 2002).

4.2.2.7 Propiedades funcionales de hidratación:

4.2.2.7.1 Capacidad de retención de agua:

Se preparó una solución de harina de quinua al 1% p/v en agua destilada, pesando

previamente el tubo Ependorf donde se preparó la muestra. Se agitó por 1 hora a

intervalos de 15 minutos y posteriormente se centrifugó a 10.000 rpm por 30 minutos a

15ºC. Finalmente se invirtieron los tubos con el precipitado obtenido dejando reposar en

papel absorbente por 10 minutos. La cantidad de proteína que puede solubilizarse en las

condiciones de ensayo se determinó mediante la siguiente ecuación:

WHC = (m2 - (m1 - m3))/ m1 d

Donde:

WHC: capacidad de retención de agua expresada en ml de agua/ g de muestra

m1: masa de muestra pesada en gramos

m2: masa del precipitado obtenido en gramos

m3: masa de la proteína soluble en gramos

d: densidad del agua a 25°C

4.2.2.7.2 Solubilidad:

Se prepararon dispersiones proteicas al 1% p/v en buffer B (anexo 8), pesando en

balanza analítica alrededor de 10 mg de harina de quinua en tubos Ependorf. Las

muestras se sometieron cada 15 minutos a agitación intensa y breve en vortex, durante 1

hora a temperatura ambiente en un agitador eléctrico. Seguidamente los tubos se

centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos a 15°C (Scilingo y col., 2002). La

proteína que queda en el sobrenadante se cuantificó mediante el método descrito por

Bradford (1976) (ver fotos anexo 9).

4.2.2.8 Espectroscopia UV:

Se utilizó un espectrofotómetro, instrumento que permite medir la intensidad de luz

transmitida (Rendina, 1974), en el que una cubeta con una solución proteica (se usó el

mismo sobrenadante obtenido en solubilidad), se colocó en un haz de radiación

monocromática de intensidad Io. La intensidad del haz emergente disminuyó hasta un

valor I porque la disolución absorbió parte de la radiación (Mathews y col., 2002), pues

cada sustancia absorbe energía radiante de una u otra longitud de onda y deja pasar otras

(Rendina, 1974). Se midió la absorción entre 250 nm – 350 nm y con ello se obtuvieron

los espectros correspondientes para determinar si existe cambio durante el tiempo de

almacenamiento y entre las distintas harinas estudiadas. Dado que esta región del

espectro es fácil de estudiar, la absorción a 280 nm se utiliza de modo sistemático para

medir las concentraciones proteicas (Mathews y col., 2002), (ver fotos anexo 9).

4.2.2.9 Fluorescencia:

Este método se efectuó para realizar una comparación entre harinas en el transcurso del

tiempo visualizando si existen o no cambios en la conformación proteica (Mathews y

col., 2002). Se usó el mismo sobrenadante obtenido en solubilidad, pero en este caso se

midió en el espectrofotómetro de fluorescencia con una excitación de 270 nm para

obtener el espectro de emisión en el rango de 310 a 500 nm a una velocidad de barrido

de 300 nm/min y con ello se obtuvieron las curvas de fluorescencia (ver fotos anexo 9 y

fundamento del método en anexo 10).

Análisis estadístico:

Los resultados obtenidos fueron evaluados estadísticamente usando la media aritmética

y la desviación estándar. Además se realizó un análisis de varianza multifactorial con un

nivel de confianza del 95% para ver si existen diferencias significativas entre los

tiempos, temperaturas y tipos de harinas estudiadas. Para ello se utilizó el programa

StatGraphics Plus 4.0 con el que se realizó un ANOVA según Tukey de (P<0,05)

usando como variable dependiente el análisis que corresponda y como variable

independiente el tiempo, harina y temperatura.

V. RESULTADOS Y

DISCUSIONES

5.1 Contenido de proteínas totales

Este análisis se realizó al inicio y al final del estudio, para determinar y controlar la

cantidad total de proteínas existente.

La tabla 2 exhibe los resultados obtenidos de la cantidad de proteína total de las

distintas harinas, estos resultados muestran la escasa variación existente entre la harina

pulida y sin pulir proveniente de La Palmilla y una diferencia estadísticamente

significativa al comparar con la harina proveniente de Paredones. Entre las temperaturas

estudiadas (20ºC y 40ºC) no se encontró diferencias estadísticamente significativas.

TABLA 2: Contenido proteico en harina de quinua:

Harina % Proteína % Humedad

Tiempo inicial

La Palmilla pulida B α 14,21a ± 0,056 11,6 %

La Palmilla sin pulir B α 13,82a ± 0,028 11,1 %

Paredones sin pulir A α 11,57a ± 0,297 12,3 %

Tiempo final

La Palmilla pulida B 20°C α 14,14a ± 1,107 8,2 %

La Palmilla pulida B 40°C α 13,71a ± 0,102 7,1 %

La Palmilla sin pulir B 20°C α 12,34a ± 1,322 8,5 %

La Palmilla sin pulir B 40°C α 13,67a ± 0,661 7,2 %

Paredones sin pulir A 20°C α 10,33a ± 0,508 8,8 %

Paredones sin pulir A 40°C α 11,37a ± 0,051 7,0 %

a: Igual letra indica que no hay diferencias significativas entre tiempos de estudio

(P<0,05).

A, B: Letras distintas indican diferencias significativas entre harinas (P<0,05).

α: Igual letra indica que no hay diferencias significativas entre temperaturas (P<0,05).

Al comparar los valores con otros estudios realizados para medir el contenido proteico

de la quinua, se tiene: 13% (Schmidt y col., 1992); 13,81% (Tapia y col., 1979); 13,5%

(Ogungbenle, 2003); 13,7% (Chauhan, 1992); 13,4-18,5% (Pino, 1998); 11-13% (en

quinua Chilena), 12-14% (en quinua peruana) (Cárcamo, 1960), entonces, se observa

que la cantidad de proteína encontrada para la harina de quinua esta dentro de lo

esperado. La cantidad de proteína varía de acuerdo a la localidad en que se desarrolla el

cultivo, fecha en que se realiza la siembra y variedad del grano (Pino, 1998).

Además, estudios demuestran que el porcentaje de proteína en la semilla aumenta al

existir una menor cantidad de almidón, el que es acumulado según la fecha en que se

siembre el grano debido a factores climáticos, y además se sabe que, al aumentar la

temperatura ambiental en los cultivos disminuye la tasa de síntesis proteica (Pino,

1998).

5.2 Perfil de aminoácidos

En el Laboratorio de Química de Alimentos y Materias Grasas de la Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile, se determinó la

cantidad de algunos de los aminoácidos presentes en la harina de quinua.

Al realizar una comparación entre harinas (ver tabla 3), se visualiza que los valores de

aminoácidos entre ellas son similares, siendo en casi todos los casos algo superior el

contenido de aminoácidos en la harina LPP. Al comparar con bibliografía también se

obtienen valores similares (ver anexo 11), teniendo claro que los datos difieren según la

variedad de quinua de la cual se trate y según la cantidad total de proteína calculada

(Tapia y col., 1979).

Al realizar una comparación con otros cereales (ver anexo 11 y 12) se encuentra que la

harina de quinua es altamente superior en lisina (aminoácido principal en legumbres)

(Chauhan, 1992), importante en el desarrollo de las células vegetales y en el

crecimiento, se asocia al desarrollo de la inteligencia, memoria y aprendizaje. La lisina

es uno de los aminoácidos más escasos en los alimentos de origen vegetal y la quinua

duplica el contenido al compararlo con otros cereales. Esta sirve de base para considerar

la suplementación de las harinas de trigo con quinua (Tapia y col., 1979). También la

quinua es rica en metionina (aminoácido principal en cereales) (Chauhan, 1992) fuente

principal de azufre y necesaria para el metabolismo de la insulina. Además es alta en

arginina y ácido glutámico y tiene niveles adecuados de histidina, isoleusina, valina y

treonina (Drzewiecki, 2003; Rapid Comunication, 1996; Valenzuela, 1997). La quinua

ofrece mayor cantidad de aminoácidos esenciales (treonina, metionina, lisina) que los

cereales más importantes del mundo (Chauhan, 1992; Tapia y col., 1979), supera la

cantidad de aminoácidos de la leche, e incluso en algunos casos, como arginina,

treonina y glicina, llega a competir con las cantidades de aminoácidos de las legumbres

y carne (Olivares y col., 1993; Tapia y col., 1979) y en cuanto a la arginina duplica el

contenido de los cereales. La calidad de los aminoácidos de la harina de quinua es tan

alta que es posible usarla para mejorar el valor nutritivo de algunos alimentos (Chauhan,

1992; Wahli, 1990).

TABLA 3: Contenido de aminoácidos en harina de quinua (g/100g de producto):

Aminoácido Paredones sin pulir La Palmilla

pulida

La Palmilla sin

pulir

Ac. Aspártico 0,9 1,1 0,8

Ac. Glutámico 1,9 2,2 1,5

Serina 0,5 0,6 0,5

Histidina 0,3 0,4 0,2

Glicina 0,9 0,8 0,6

Treonina 0,6 0,7 0,5

Arginina 1,2 1,3 0,8

Alanina 0,6 0,6 0,4

Tirosina 0,4 0,5 0,3

Valina 0,7 0,7 0,5

Metionina 0,3 0,3 0,2

Cistina 0,1 0,1 0,1

Isoleucina 0,6 0,5 0,4

Leucina 0,9 0,9 0,7

Fenilalanina 0,6 0,6 0,4

Lisina 0,6 0,8 0,6

Fuente: Laboratorio de Química de Alimentos y Materias Grasas.

Por otra parte, la calidad de una proteína depende de la concentración de aminoácidos

esenciales y de la digestibilidad de una proteína (Tapia y col., 1979), particularmente la

proteína de quinua es altamente digestible (Drzewiecki, 2003; Tapia y col., 1979) y

además por su alto contenido de aminoácidos basta una pequeña cantidad

(aproximadamente 100 g/día) para suplir las necesidades diarias recomendadas (ver

anexo 13).

5.3 Caracterización de los perfiles de polipéptidos de

las proteínas

5.3.1 Electroforesis nativa (PAGE-nativa):

Se efectuaron perfiles proteicos para las muestras de harinas, observándose a las

distintas temperaturas y tiempos de estudio el mismo tipo de bandas. A continuación, en

las figuras 5, 6 y 7, se visualizan los geles de las distintas harinas a todos los tiempos de

estudio. En ellos se aprecia que en todos los carriles se observa una banda en la misma

zona, lo que indica la existencia de un solo grupo de proteínas de masas moleculares

similares. No hay bandas inferiores que indiquen degradación de las proteínas ni

tampoco se visualizan bandas superiores que indiquen agregación proteica.

Figura 5: PAGE-nativa de extracto soluble de harina de quinua LPP, LPSP y Pared a

todos los tiempos de estudio almacenada a 20ºC





5.3.2 Electroforesis desnaturalizante (PAGE-SDS):

A continuación, desde la figura 8 a la 15, se muestran los geles realizados para las

harinas a las distintas temperaturas y tiempos de estudio, en cada gel se observa de

izquierda a derecha el estándar de peso molecular y luego los carriles correspondientes a

las muestras a los distintos tiempos. Se muestra primero uno de los geles (figuras 8 y

12) para visualizar los pesos moleculares de cada banda y luego, en las figuras 9, 10, 11

y 13, 14, 15, los geles a las distintas temperaturas y tiempos estudiados para visualizar

la similitud entre las bandas lo que indica estabilidad proteica entre harinas, tiempos y

temperaturas estudiadas.

Sin β-mercapto etanol: En la figura 8 se observan los perfiles proteicos obtenidos para

la harina de quinua LPP30. En todas las muestras se obtuvo el mismo tipo de bandas

(ubicadas en la misma zona), para las distintas temperaturas y tiempos estudiados.

Mientras más intensa es la banda mayor es la cantidad de proteínas de esa masa

molecular presente en la harina. Las masas moleculares de las principales bandas,

fueron similares entre las harinas a las diferentes temperaturas y tiempos de

almacenamiento, se aprecia que existen bandas tanto de alta como de baja masa

molecular.

Figura 8: PAGE-SDS de extracto soluble de harina de quinua pulida de La Palmilla

almacenada a 30ºC (LPP30)

Al analizar las figuras 9, 10 y 11 se aprecia la semejanza entre los perfiles proteicos

desnaturantes para las distintas harinas a las tres temperaturas estudiadas, con excepción

de la intensidad de la banda, especialmente entre geles, de los polipéptidos en los

diferentes carriles, lo que puede deberse a la concentración de la proteína agregada.

Figura 9: PAGE-SDS de extracto soluble de harina de quinua LPP, LPSP y Pared a






Con β-mercapto etanol: En la figura 12 se observan las bandas proteicas para la harina

de quinua LPP30. Se calcularon las masas moleculares de las principales bandas siendo

estas similares entre tiempos y temperaturas estudiadas.

Figura 12: PAGE-SDS con β-mercapto etanol de extracto soluble de harina de quinua

pulida de La Palmilla almacenada a 30ºC (LPP30)

Al igual que en PAGE-SDS sin β-mercapto etanol, en las figuras 13, 14 y 15 se aprecia

la semejanza entre los perfiles proteicos desnaturantes para las distintas harinas a las

temperaturas estudiadas.


LPP, LPSP y Pared a todos los tiempos de estudio almacenada a 20ºC





Al realizar los geles en condiciones reductoras, se aprecia que éstos son distintos a los

sin el agente reductor, esto indica la existencia de grupos disulfuro en la cadena

polipeptídica, puesto que al agregar β-mercapto etanol estos puentes que ayudan a

estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria de la proteína intra e intermolecular se

rompen y es por ello que el perfil electroforético cambia, esto se nota en el cambio de

las masas moleculares, por ejemplo, en el gel sin β-mercapto etanol (figura 8) la banda

más intensa, con masa molecular 61,92 kDa desaparece en el gel con β-mercapto etanol

(figura 12) y aparecen nuevas bandas que no se hallaban en la figura 8, esto es debido a

que la proteína con masa molecular 61,92 kDa se rompe formando nuevas cadenas de

masas moleculares menores.

Las bandas encontradas podrían corresponder a globulinas, debido a que fueron

extraídas con buffer B, buen solvente para este tipo de proteínas (Scilingo y col., 2002)

presentes en la quinua (Tapia y col., 1979), pero no es posible identificar que las bandas

corresponden a esas proteínas, para poder afirmar ello se requieren estudios donde se

usen anticuerpos.

Para una mayor diferenciación de las proteínas más importantes presentes en la quinua

como son las globulinas y albúminas, se podría realizar un extracto proteico de ellas,

con el buffer adecuado, y hacer un perfil electroforético. Un estudio realizado con

extractos de globulinas y albúminas (Albarran, 1993), demostró que las bandas

presentes están situadas en todo el carril en posiciones similares (ver anexo 14), por lo

tanto, los diversos tipos de globulinas y de albúminas tienen semejantes masas

moleculares, no siendo posible su identificación si se hiciesen corren ambos extractos

en un mismo carril.

Los análisis realizados tienen importancia en el ámbito industrial para saber si existe o

no degradación de las proteínas con el tiempo y la temperatura y además son

importantes puesto que, al conocer las masas moleculares proteicas, es posible dar a los

alimentos diversas propiedades funcionales.

5.4 Actividad de agua

Se determinó la actividad de agua en la harina de quinua, cuyos valores, en función del

tiempo, se grafican en las siguientes figuras:

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3 4 5

Tiempo (mes)

aw

LPP20LPP30LPP40

Figura 16: Actividad de agua harina de quinua LPP a 20º, 30º y 40ºC

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3 4 5

Tiempo (mes)

aw

LPSP20LPSP30LPSP40

Figura 17: Actividad de agua harina de quinua LPSP a 20º, 30º y 40ºC

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3 4 5

Tiempo (mes)

aw

Pared20Pared30Pared40

Figura 18: Actividad de agua harina de quinua Pared a 20º, 30º y 40ºC

Los resultados obtenidos se muestran en las figuras 16, 17 y 18, donde se visualiza que,

en general, la actividad de agua disminuye al pasar el tiempo de estudio y al aumentar la

temperatura de almacenamiento, lo cual es lo que se esperaría al tener las harinas

sometidas a calor, debido a la disminución de la humedad. La actividad de agua está

relacionada con la humedad relativa en equilibrio (HRE), la que se refiere estrictamente

a la atmósfera en equilibrio con una solución o alimento y constituye una expresión para

medir el agua disponible. La HRE, como la actividad de agua, es la relación entre la

presión de vapor del alimento y la del agua pura, pero en este caso, expresada en

porcentaje.

A medida que la harina se seca, la presión de vapor del agua del alimento disminuye y

la actividad de agua desciende a partir de un valor máximo de 1 para el agua pura. Esta

disminución es beneficiosa en cuanto al contenido de microorganismos, puesto que

permite retardar el deterioro microbiológico (Braverman y Berk, 1980), los

microorganismos no se multiplican por debajo de una actividad de agua de 0,60 ya que

las moléculas de agua presentan una movilidad restringida. Además, la actividad de

agua da cuenta del agua disponible para que ocurran las reacciones metabólicas, por lo

tanto, al disminuir los valores, ocurrirán menos reacciones que deterioren la harina de

quinua.

La excepción del descenso en la actividad de agua solo ocurrió en los últimos dos

meses, en los cuales tendió a estabilizarse a valores cercanos a 0,3 donde la harina es

más estable.

Según el análisis estadístico, no hay diferencias significativas entre las distintas harinas.

En cuanto a la temperatura, la harina almacenada a 20ºC difiere de las almacenadas a

30ºC y 40ºC no habiendo diferencias significativas entre estas dos temperaturas más

altas de almacenamiento con un nivel del 95% de confianza. En los tiempos estudiados

(ver tabla anexo 15) son similares los tiempos 1 y 2 y el 3 y 4 ambos difieren del tiempo

inicial y del último tiempo de estudio.

5.5 Caracterización térmica de las proteínas

La calorimetría diferencial de barrido (DSC) es una técnica empleada para estudiar los

cambios conformacionales de plegamiento-desplegamiento de la proteína cuando se

calienta, es decir, se registra en forma continua el incremento de temperatura debido a

un calor suministrado, esto es lo que se llama capacidad calorífica. Así se obtiene un

termograma caracterizado por un pick de absorción de calor correspondiente a un

proceso endotérmico, que se debe a la absorción de calor asociado con la

desnaturalización de la proteína inducida por la temperatura (Sadqi, 2000).

Los resultados que entregó el DSC son endotermas (ver anexo 16) que permitieron

conocer la temperatura de desnaturalización (Td), donde se observa que todas las Td

encontradas presentaron aproximadamente los mismos valores (ver tabla 4), nótese que

para la harina de quinua LPP la Td fue de 98,9ºC en el primer tiempo de estudio y de

98,8ºC para el último tiempo en la harina almacenada a 30ºC, es decir, la variación fue

prácticamente nula.

TABLA 4: Temperatura de desnaturalización en harina de quinua:

Tiempo inicial Tiempo final

LPP Pared LPP30 LPSP30

Td 98,9ºC 99,2ºC 98,8ºC 99,7ºC

Ahora, al visualizar los resultados en forma gráfica (figura 19), se observan dos curvas:

la superior correspondiente al primer tiempo de estudio y la inferior realizada al final

del estudio (después de 7 meses).

En cada curva se visualizan dos transiciones endotérmicas: la primera corresponde a los

almidones y la segunda a las proteínas, ya que las proteínas sufren alteraciones al

aplicar una temperatura entre 70 a 80ºC (Braverman y Berk, 1980). Así, es posible

distinguir en el primer tiempo de estudio el pick correspondiente a las proteínas, sin

embargo este pick tiende a desaparecer en el último tiempo estudiado. Esto es debido a

que ocurre una desnaturalización térmica, detectada por el pick que se ve disminuido en

el último tiempo de estudio (después de 7 meses), es decir, hay un posible rompimiento

intramolecular de puentes de hidrógeno o ruptura de enlaces polares en la fracción

insoluble de la proteína. La desnaturalización de las proteínas puede contribuir tanto a la

textura como al sabor de muchos alimentos (Braverman y Berk, 1980).

Figura 19: DSC harina de quinua LPP en el tiempo inicial (tiempo 0) (curva superior) y

LPP30 en el tiempo final (tiempo 5) (curva inferior).

5.6 Actividad proteolítica

TABLA 5: Actividad proteolítica en harina de quinua (%):

Temperatura 20ºC

Harina Paredones La Palmilla pulida La Palmilla sin pulir

Tiempo

0 31,4 ± 44,4 51,2 ± 0,7 95,6 ± 135,2

1 25,1 ± 23,8 91,8 ± 11,6 48,7 ± 3,4

2 22,6 ± 6,2 161,0 ± 222,4 52,6 ± 17,0

3 0 19,3 ± 5,5 7,8 ± 11,0

4 6,0 ± 8,5 55,0 ± 10,4 17,3 ± 3,7

Temperatura 30ºC


Tiempo

0 31,4 ± 44,4 51,2 ± 0,7 95,6 ± 135,2

1 78,8 ± 111,5 72,3 ± 13,4 39,3 ± 11,6

2 55,9 ± 13,6 44,4 ± 2,4 25,2 ± 7,6

3 68,0 ± 14,8 20,7 ± 1,0 45,9 ± 38,2

4 8,1 ± 1,1 25,3 ± 2,1 0

Temperatura 40ºC


Tiempo

0 31,4 ± 44,4 51,2 ± 0,7 95,6 ± 135,2

1 55,2 ± 22,3 94,4 ± 13,2 42,5 ± 29,7

2 28,6 ± 14,2 49,2 ± 48,6 11,3 ± 8,4

3 54,6 ± 42,8 37,1 ± 3,2 20,5 ± 4,4

4 5,8 ± 4,1 52,2 ± 16,0 13,8 ± 17,3

Los análisis son con el fin de determinar si hay actividad proteolítica. Esto podría ser

afectado tanto por la temperatura como por la humedad, al romperse las proteínas y

liberar enzimas, pero los resultados no muestran una correlación reproducible ya que los

valores no aumentaron ni disminuyeron constantemente ni con el tiempo, ni con la

temperatura de almacenamiento, ni con el tipo de harina.

Los análisis indican que existe presencia de actividad proteolítica, pero ella es baja y

dispersa, los valores son diversos y no siguen una tendencia clara. Hay estudios de

actividad proteolítica en los que se han detectado valores muy superiores a los

encontrados en el presente estudio (en soya hasta 500% de actividad). La existencia de

valores bajos de actividad proteolítica indica que no existe deterioro en la harina. Esto

se corrobora con las electroforesis realizadas, donde no hay aparición ni desaparición de

bandas (Molina y Wagner, 2002)

5.7 Propiedades funcionales de hidratación

5.7.1 Capacidad de retención de agua:

En los gráficos siguientes se muestra la capacidad de retención de agua de las diversas

harinas en el transcurso del estudio.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4

Tiempo (mes)

WHC

LPP20LPP30LPP40

Figura 20: Capacidad de retención de agua de extracto soluble de harina de quinua LPP

almacenada a 20º, 30º y 40ºC

En la figura 20 se observa una disminución en la capacidad de retención de agua con el

tiempo en la harina LPP, los valores bajan desde 4,53 ± 0,21 hasta 2,26 ± 0,17; 2,71 ±

0,01 y 2,92 ± 0,29 para la harina almacenada a 20ºC, 30ºC y 40ºC respectivamente (ver

tabla anexo 17).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 1 2 3 4

Tiempo (mes)W

HC

LPSP20LPSP30LPSP40

Figura 21: Capacidad de retención de agua de extracto soluble de harina de quinua

LPSP almacenada a 20º, 30º y 40ºC

Para la harina LPSP se observa que los valores bajan, con excepción de la temperatura a

30ºC cuyo valor es de 3,54 ± 0,55 al tiempo 3 de estudio, pero el aumento que sufre es

pequeño (ver tabla anexo 17). Los valores de capacidad de retención de agua bajan

desde 4,19 ± 0,02 hasta 2,72 ± 0,82 ; 2,88 ± 0,87 y 2,90 ± 0,50 para la harina

almacenada a 20ºC, 30ºC y 40ºC respectivamente.

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4

Tiempo (mes)

WHC


Figura 22: Capacidad de retención de agua de extracto soluble de harina de quinua

Pared almacenada a 20º, 30º y 40ºC

Por último, en la harina proveniente de Paredones también se aprecia un descenso en la

capacidad de retención de agua, cuyos valores van desde 5,19 ± 1,68 hasta 2,36 ± 0,05 ;

3,03 ± 0,40 y 3,31 ± 0,72 para las harinas almacenadas a 20ºC, 30ºC y 40ºC

respectivamente. En este caso se registran aumentos en la capacidad de retención de

agua al tiempo 2 y 3 en la harina a 20ºC y en el tiempo 3 en la harina a 30ºC y a 40ºC.

De los resultados obtenidos, se puede observar que las harinas son capaces de retener

entre 2,3 a 5,1 ml de agua/g de harina, en todos los estudios realizados existe una

disminución de la capacidad de retención de agua con el tiempo en las tres harinas,

especialmente al compararlos con la muestra inicial. Este descenso en la capacidad de

retención de agua, puede deberse a algún grado de desnaturalización de las proteínas en

la harina de quinua durante el almacenamiento, y por efecto de la temperatura, es

probable que los grupos que interaccionan con el agua queden menos expuestos para

interaccionar con ella (Pennacchiotti, 1998).

El análisis estadístico indica que entre la harina LPSP y LPP no hay diferencias

significativas y lo mismo ocurre entre esta última y la de Paredones. En cuanto a la

temperatura, las dos más altas temperaturas de almacenamiento no mostraron

diferencias estadísticamente significativas.

5.7.2 Solubilidad:

Los análisis fueron efectuados a la harina de quinua disuelta en buffer B, esto es debido

a la presencia de globulinas en la quinua, que según estudios (Scilingo y col.; 2002) han

resultado ser más solubles en este buffer. Los resultados encontrados se muestran en las

figuras 23, 24 y 25, donde se aprecia la variación de la solubilidad (%) con el tiempo

transcurrido, para las distintas temperaturas de almacenamiento.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 1 2 3 4 5

Tiempo (mes)

solu

bilid

ad (%

)

LPP20LPP30LPP40

Figura 23: Solubilidad extracto soluble de harina de quinua LPP almacenada a 20º, 30º

y 40ºC

La figura 23 muestra la solubilidad que presenta la harina LPP donde se aprecia que en

los tres primeros tiempos de estudio los valores son cercanos a 14% y en los tres

últimos tiempos la solubilidad disminuye a valores cercanos al 8% (ver anexo 18).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 1 2 3 4 5

Tiempo (mes)

solu

bilid

ad (%

)

LPSP20LPSP30LPSP40

Figura 24: Solubilidad de extracto soluble de harina de quinua LPSP almacenada a 20º,

30º y 40ºC

Al analizar la harina sin pulir, en la figura 24, se aprecia el mismo caso para las dos

temperaturas más altas en estudio (30ºC y 40ºC), en cambio para la harina almacenada a

20ºC el descenso en la solubilidad de la harina con el tiempo es mas leve. Para las tres

temperaturas estudiadas se encuentra un aumento de la solubilidad en el primer y

segundo tiempo de estudio al compararlo con el tiempo inicial.

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 2 3 4 5

Tiempo (mes)

solu

bilid

ad (%

)


Figura 25: Solubilidad de extracto soluble de harina de quinua Pared almacenada a 20º,

30º y 40ºC

Por último, para la harina de Paredones la solubilidad comienza con 9,41 ± 0,80 % y

desciende hasta valores cercanos al 6%, pero en este caso en el tiempo 1 y 2 los valores

aumentan a 11% aproximadamente y en el caso de la harina almacenada a 40ºC el

descenso en la solubilidad es algo mas leve, ya que en el tiempo 3 de estudio presenta

un valor de 10,15 ± 0,42 %

Según el análisis estadístico realizado, las harinas de La Palmilla son similares entre si y

difieren de Paredones. En cuanto a la temperatura se encontró sin diferencias

significativas las dos temperaturas más extremas, 20º y 40ºC. Por último, el análisis de

los tiempos (ver tabla anexo 18) indica que entre el tiempo 1 y 2 no hay diferencias

significativas ni tampoco entre el tiempo 3 con el 4, el resto de los tiempos presenta

diferencias significativas en solubilidad.

En resumen, al analizar los tres gráficos anteriores se observa que a tiempos 1 y 2

aumenta la solubilidad y en los siguientes tiempos la curva muestra un descenso. La

disminución de la solubilidad podría ser debido a la aparición en la superficie de la

molécula de grupos hidrófobos causado por la desnaturalización de las proteínas

globulares en el tiempo, lo que conduce a un desplegamiento de la cadena polipeptídica,

hay interacciones proteína-proteína lo que impide una mayor solubilización (Arrese y

col., 1991; Cheftel y col., 1989; Pennacchiotti, 1998).

5.8 Espectroscopia UV

A continuación se muestran los gráficos absorbancia en función de la longitud de onda

(nm) obtenidos de la espectroscopia UV para las distintas harinas. Se graficó el

promedio de cada ensayo y su duplicado para cada harina en todos los tiempos de

estudio.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 270 290 310 330 350

Longitud de Onda (nm)

Abs

orba

ncia

Tiempo 0Tiempo 1Tiempo 2Tiempo 3Tiempo 4Tiempo 5

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 270 290 310 330 350


Abs

orba

ncia


Figura 26: Espectroscopia UV Figura 27: Espectroscopia UV

de extracto soluble de harina de quinua de extracto soluble de harina de quinua

almacenada a 20ºC (LPP20) almacenada a 30ºC (LPP30)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 270 290 310 330 350


Abs

orba

ncia


0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 270 290 310 330 350


Abs

orba

ncia




almacenada a 40ºC (LPP40) almacenada a 20ºC (LPSP20)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 270 290 310 330 350


Abs

orba

ncia


0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 270 290 310 330 350


Abs

orba

ncia




almacenada a 30ºC (LPSP30) almacenada a 40ºC (LPSP40)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 270 290 310 330 350


Abs

orba

ncia


0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 270 290 310 330 350


Abs

orba

ncia




almacenada a 20ºC (Pared20) almacenada a 30ºC (Pared30)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

250 270 290 310 330 350


Abs

orba

ncia


Figura 34: Espectroscopia UV

de extracto soluble de harina de quinua

almacenada a 40ºC (Pared40)

Como se visualiza en los gráficos anteriores, las curvas para las distintas harinas, a las

diversas temperaturas de estudio, tienen la misma forma. La absorción ocurre debido a

que las transiciones de energía elevada entre estados electrónicos de una molécula

conducen a la absorción en la región ultravioleta del espectro, donde las proteínas

absorben intensamente (Mathews y col., 2002).

En cuanto a los tiempos, se puede ver que la curva en el tiempo inicial se encuentra

sobre las demás y la curva en el último tiempo de estudio es la que está más abajo, esto

quiere decir que la absorbancia a toda longitud de onda disminuye al pasar el tiempo,

debido a que las harinas presentan una pequeña disminución en cuanto al porcentaje

proteico extraído. Los pick encontrados podrían ser de globulinas que son proteínas

presentes en la quinua (Tapia y col., 1979) solubles en buffer B (Scilingo y col., 2002) y

cuya absorción se encuentra en el rango de 260 a 282 nm, según estudios realizados en

guisantes (Chavan y col., 2001). Los pick que presentan los gráficos en el margen de

270 – 290 nm, son debido a la absorción de las cadenas laterales aromáticas de

fenilalanina, tirosina y triptofano (Mathews y col., 2002).

En estudios realizados en aislados proteicos de amaranto se visualiza el mismo tipo de

curvas, pero con una absorbancia mayor (Avanza y Añón, 1998), esto es debido a que el

amaranto tiene mayor cantidad de proteínas que la quinua, y mayor aun si es aislado,

entonces la solución proteica va a absorber más energía por lo cual la absorbancia es

mayor (Mathews y col., 2002).

5.9 Fluorescencia

El estudio de la fluorescencia permite detectar concentraciones mucho mas bajas al

compararlo con el UV, los detectores de fluorescencia son más sensibles y específicos

que todos los detectores ópticos (Aubourg, 2005).

Los siguientes gráficos intensidad de fluorescencia en función de la longitud de onda

(nm) son los resultados de los análisis de fluorescencia por tipo de harina a través del

tiempo. Se graficó el promedio de cada ensayo y su duplicado para las distintas harinas.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

300 350 400 450 500 550


Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia

Tiempo 0Tiempo 1Tiempo 2Tiempo 3Tiempo 4

0

100

200

300

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500

600

700

800

300 350 400 450 500 550


Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia


Figura 35: Fluorescencia Figura 36: Fluorescencia


almacenada a 20ºC (LPP20) almacenada a 30ºC (LPP30)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

300 350 400 450 500 550


Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia


0

100

200

300

400

500

600

700

800

300 350 400 450 500 550


Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia




almacenada a 40ºC (LPP40) almacenada a 20ºC (LPSP20)

0

100

200

300

400

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600

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300 350 400 450 500 550


Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia


0

100

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300

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700

800

300 350 400 450 500 550


Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia




almacenada a 30ºC (LPSP30) almacenada a 40ºC (LPSP40)

0

100

200

300

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500

600

300 350 400 450 500 550


Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia


0

100

200

300

400

500

600

700

800

300 350 400 450 500 550


Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia




almacenada a 20ºC (Pared20) almacenada a 30ºC (Pared30)

0

100

200

300

400

500

600

300 350 400 450 500 550


Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia


Figura 43: Fluorescencia

de extracto soluble de harina de quinua

almacenada a 40ºC (Pared40)

En las figuras anteriores (figuras 35 a 43), se observa el mismo tipo de curva para las

distintas harinas, temperaturas y tiempos de estudio, es decir, en todas ellas el pick

máximo aparece a similar longitud de onda. Lo anterior indica que la estructura de las

proteínas de harina de quinua permanecería estable en el tiempo y que la accesibilidad

del triptófano al solvente polar es constante (Aubourg, 2005; Khatib y col., 2005;

Mathews y col., 2002).

Ahora bien, se observa que hay una leve diferencia en la intensidad de fluorescencia con

el tiempo de estudio, lo cual es atribuible al cambio en la polaridad de la proteína la que

cambia la emisión de aminoácidos aromáticos (Aubourg, 2005; Khatib y col., 2005)

como el triptófano, la tirosina y la fenilalanina, aminoácidos presentes en la quinua y

únicos, entre todos los aminoácidos, que poseen una fluorescencia natural medible

(Cheftel y col., 1989; Mathews y col., 2002), siendo el principal, la fluorescencia del

triptófano, debido a que persiste aunque el aminoácido forme parte de la estructura

proteica (Cheftel y col., 1989).

VI. CONCLUSIONES

• Los parámetros estudiados en las harinas de quinua orgánica presentaron un

comportamiento similar para las tres harinas estudiadas.

• La harina de quinua permanece estable, desde el punto de vista proteico, almacenada

en papel Kraft doble sometida a temperaturas entre 20ºC y 40ºC.

• La quinua tiene un alto contenido de proteínas y además es una excelente fuente de

aminoácidos por la amplia variedad existente de ellos, ya que contiene todos los

aminoácidos, tanto esenciales como no esenciales.

• La actividad de agua presentó valores bajos, lo que previene el desarrollo de

microorganismos que resulten nocivos para el ser humano.

• Los análisis de PAGE señalaron que la quinua está compuesta por proteínas

semejantes al tipo globulinas, ampliamente difundidas en los vegetales. Los perfiles

electroforéticos, tanto en condiciones nativas como desnaturalizantes de extractos

solubles, demostraron que no hay variación en los perfiles de los polipéptidos

proteicos, con un almacenamiento de la harina entre 20º y 40ºC en todo el tiempo de

estudio (7 meses).

• Las endotermas obtenidas por calorimetría diferencial de barrido, mostraron que la

temperatura de desnaturalización de las proteínas no cambia, pero si se observó una

disminución del área bajo la curva de la endoterma, lo que estaría mostrando un

cierto grado de desnaturalización de las proteínas en la harina debida al calor.

• La actividad proteolítica encontrada fue baja por lo que no se esperarían grandes

cambios en las propiedades funcionales de las proteínas en la harina de quinua.

• Las propiedades funcionales de hidratación, no se ven afectadas en gran medida

durante los tres primeros tiempos de estudio, por lo que las proteínas de quinua

podrían ser usadas como ingredientes alimentarios en diferentes alimentos como

sopas y bebidas. En los últimos tiempos de estudio hay una disminución tanto de la

capacidad de retención de agua como de solubilidad, debido a la aparición de grupos

hidrófobos causado por la desnaturalización de las proteínas en el tiempo.

• La espectroscopia UV demostró, que con el tiempo y la temperatura de

almacenamiento, existió una pequeña disminución en cuanto a la cantidad de

proteína extraída.

• El análisis de espectroscopia de fluorescencia, en extractos proteicos solubles de las

distintas harinas, no mostró cambios significativos en las condiciones estudiadas,

demostrando estabilidad de la estructura proteica en el tiempo a temperaturas de

almacenamiento de la harina entre 20º y 40ºC

• Hay que tener siempre presente que en todos los intentos de industrialización de la

quinua habrá que tomar en cuenta el factor económico y además será decisiva la

calidad del producto al paladar del consumidor, es decir, sólo un preparado

completamente limpio y libre de saponinas (que dan un sabor amargo) podrá tener

éxito comercial.

• La quinua es un cereal de gran importancia nutricional y las potencialidades para su

producción y comercialización son muy grandes. El redescubrimiento de este tipo de

alimentos olvidados podría contribuir a paliar el hambre y la desnutrición en las

zonas más desfavorecidas del planeta y eliminar la dependencia excesiva de la

humanidad a unos pocos cultivos, mejorando la disponibilidad de alimentos más

sanos y seguros.

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abril 2004]

ANEXOS

ANEXO 1

TABLA 6: Composición del grano de quinua:

Composición Quinua

Calorías (Kcal) 331

Humedad (%) 9,8

Proteínas (%) 13

Lípidos (%) 7,4

ENN (por diferencia) (%) 64,1

Fibra cruda (%) 2,7

Cenizas (%) 3,0

Calcio (mg/100g) 94

Fósforo (mg/100g) 140

Hierro (mg/100g) 16,8

Tiamina (mg/100g) 0,30

Riboflavina (mg/100g) 0,59

Niacina (mg/100g) 1,4

Ácido ascórbico (mg/100g) 1,3

Fuente: Schmidt Hebbel, H.; Pennacchiotti, I.; Masson, L. y Mella, M.A. (1992) “Tabla

de Composición Química de Alimentos Chilenos”, 8ª ed. Santiago, Chile. Universidad

de Chile. Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química. Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacéuticas.

ANEXO 2

Determinación del tipo de molino para la molienda de

harina de quinua

Se realizó un gel, el que se cargó con volúmenes iguales de extracto, donde las muestras

fueron harinas de quinua molidas en distintos molinos.

Se aprecia la semejanza entre las bandas, tanto de los perfiles proteicos desnaturantes

sin el agente reductor β-mercapto etanol (figura izquierda) como de las bandas de gel

con β-mercapto etanol (figura derecha), a excepción de la intensidad de las bandas, lo

cual indica que el tipo de molienda sí influye en la cantidad de proteínas solubles

extraídas, habiendo sido extraídas de la misma forma.

Figura 44: Comparación entre bandas electroforéticas de harina de quinua molida en

distintos molinos.

El tipo de molienda más adecuado sería donde las bandas son más intensas, con el fin de

distinguir de mejor forma las proteínas presentes. Entonces se podría usar tanto el

molino martillo (4) como el molino mixto martillo/cuchilla (5), por lo que, para realizar

la molienda de la harina de quinua orgánica, se decidió el uso de éste último debido al

mallaje más fino logrado (60 mallas), más semejante a algunas harinas comerciales

encontradas y por la obtención de una banda visiblemente adecuada de distinguir. Se

eligió entonces el molino mixto martillo/cuchilla o molino de impacto (5).

ANEXO 3

Fotografías del grano y harina de quinua de las distintas

localidades

ANEXO 4

Procedimiento para determinar el contenido de proteínas

totales

• Pesar 1 g de muestra.

• Colocar en un tubo Kjeldahl la muestra junto con 12,6 g de mezcla catalizadora (ver

preparación de reactivos en anexo 8).

• Bajo campana de extracción agregar 20 ml de H2SO4 concentrado.

• Calentar en el equipo de digestión dejando reaccionar por 6 horas o hasta que

desaparezca el color negro.

• Una vez obtenido un líquido claro, dejar enfriar hasta que no salgan vapores

blancos, si quedan residuos negros en las paredes, desprender esto agregando agua

destilada y volver al equipo digestor hasta obtener el líquido claro, el tubo debe

quedar con aproximadamente ⅓ de su volumen lo que se completa con agua

destilada.

• Hacer andar el equipo destilador Büchi solo con agua con el fin de limpiarlo, esto se

hace al comienzo, entre las muestras y al final de la destilación.

• Conectar el tubo Kjeldahl en el equipo destilador Büchi y abrir todo el vacío.

• Programar el equipo con 0 ml agua, 90 ml NaOH 30 %, delay 5 seg, destilar por 8

minutos.

• Recolectar los vapores de NH3 a la salida del destilador con un matraz de 500 ml

que contenga 50 ml de H2SO4 0,1 N y 4 gotas de indicador rojo de metilo.

• Valorar el exceso de ácido con NaOH 0,1 N (viraje rosa-amarillo débil).

• Determinar los mg de nitrógeno reaccionantes y luego el porcentaje de proteína.

mg N = (V1 x N1 – V2 x N2) x 14

mg N = (50 x 0,1 – V2 x 0,1) x 14

N1, V1: normalidad y volumen inicial (50 ml) de H2SO4

N2, V2: normalidad y volumen gastado de NaOH

% proteína de harina de quinua = mg N x 5,77

Donde 5,77 corresponde al contenido promedio (17,33%) de nitrógeno en 100 g de

proteína = 100/17,33

ANEXO 5

A) Preparación de las muestras para PAGE:

• Pesar 20 mg de harina de quinua en un tubo Ependorf.

• Agregar 200 µl de solución nativa, solución desnaturante o solución desnaturante

con β-mercapto etanol, (dependiendo si es nativa o desnaturante la electroforesis

que se hará), (ver preparación de reactivos en anexo 8).

• Agitar con agitador eléctrico por 15 minutos a intervalos de 5 minutos.

• Centrifugar durante 15 minutos a 10.000 rpm a temperatura ambiente.

• Recolectar el sobrenadante y vaciarlo en otro tubo Ependorf.

• Almacenar las muestras en refrigerador.

• Cuando se deseen ocupar, calentar las muestras durante 1 minuto en agua hirviendo

(esto se hace solo con las muestras desnaturantes), insertando los tubos en plumavit

para que floten.

B) Procedimiento para PAGE-nativa:

• Lavar los vidrios para electroforesis con alcohol y secarlos con papel absorbente.

Ponerlos en el soporte.

• En una fuente con hielo, colocar 2 matraces: uno con agua destilada y el otro vacío

(donde se preparará la muestra).

• Usando guantes, preparar el gel nativo 6 % (según la siguiente tabla). Agitar antes

de agregar el PSA, luego agitar y agregar el TEMED, volver a agitar.

Gel nativo al 6% de 1 mm

2 geles

Agua destilada 11250 µl

A/BA 2250 µl

Buffer pH 8,8 4500 µl

PSA 10% 105 µl

TEMED 9 µl

• Con micropipeta llenar los vidrios con esta preparación hasta que rebalse (colocar

papel absorbente debajo del soporte).

• Usando guantes colocar el peine, debe rebalsar. Fijarse que no queden burbujas bajo

la peineta, si es así golpear el vidrio para que salgan.

• Llevar a estufa a 37ºC por 30 minutos o hasta gelificar.

• Sacar los vidrios del soporte (Nota: Si se desean guardar los geles, almacenarlos en

buffer de corrida).

• Colocarlos en la cubeta de corrida con el lado más bajo del vidrio hacia adentro.

• Colocar el buffer de corrida en la cubeta de corrida, poniendo el buffer entre los dos

vidrios dejando que rebalse hasta ⅓ del volumen de la cubeta de corrida.

• Cargar con micropipeta: en el primer bolsillo 4 µl de estándar y en los siguientes

bolsillos 4 µl de cada muestra de harina de quinua.

• Tapar la cubeta de corrida y conectar al equipo.

• Encender el equipo haciéndolo funcionar a 200 volts por aproximadamente 40

minutos, o hasta que la muestra haya avanzado al fondo del vidrio.

• Apagar el equipo y sacar los vidrios de la cubeta de corrida.

• Separar los vidrios, cuidando que no se rompa el gel, lavarlo con agua destilada para

separarlo completamente del vidrio.

• Con extremo cuidado, colocar el gel estirado en un pote de plástico que contenga

solución colorante.

• Dejar reposar durante aproximadamente 1 hora.

• Colocar en solución decolorante, hasta que la parte del gel que no contiene bandas

este completamente clara.

• Finalmente, para almacenar el gel, ponerlo entre dos plásticos con algo de solución

decolorante y sellarlo con doble sello.

C) Procedimiento para PAGE-SDS:

• Lavar los vidrios para electroforesis con alcohol y secarlos con papel absorbente.

Ponerlos en el soporte.

• En una fuente con hielo, colocar 2 matraces: uno con agua destilada y el otro vacío

(donde se preparará la muestra).

• Usando guantes, preparar el gel separador 12 % según la siguiente tabla. Agitar

antes de agregar el PSA, luego agitar y agregar el TEMED, volver a agitar.

Gel separador desnaturante al 12% de 0,75 mm

1 gel 2 geles 3 geles 4 geles 5 geles 6 geles

Agua destilada 1273 µl 2546 µl 3819 µl 5092 µl 6365 µl 7638 µl

A/BA 1603 µl 3206 µl 4809 µl 6412 µl 8015 µl 9618 µl

Buffer pH 8,8 1040 µl 2080 µl 3120 µl 4160 µl 5200 µl 6240 µl

SDS 10% 40 µl 80 µl 120 µl 160 µl 200 µl 240 µl

PSA 10% 40 µl 80 µl 120 µl 160 µl 200 µl 240 µl

TEMED 4 µl 8 µl 12 µl 16 µl 20 µl 24 µl

• Con micropipeta llenar los vidrios con 3500 µl de solución gel separador.

• Agregar lentamente agua saturada con butanol, con pipeta volumétrica o gotario,

hasta que rebalse (colocar papel absorbente debajo del soporte).

• Llevar a estufa a 37ºC por 15 a 20 minutos o hasta que gelifique.

• Botar el agua saturada con butanol lavando con agua destilada.

• Secar entre los vidrios con papel Kraft.

• Usando guantes, hacer el gel concentrador 5% según la siguiente tabla:

Gel concentrador desnaturante al 5% de 0,75 mm

1 gel 2 geles 3 geles 4 geles 5 geles 6 geles

Agua destilada 1050 µl 2100 µl 3150 µl 4200 µl 5250 µl 6300 µl

A/BA 250 µl 500 µl 750 µl 1000 µl 1250 µl 1500 µl

Buffer pH 6,8 190 µl 380 µl 570 µl 760 µl 950 µl 1140 µl

SDS 10% 15 µl 30 µl 45 µl 60 µl 75 µl 90 µl

PSA 10% 15 µl 30 µl 45 µl 60 µl 75 µl 90 µl

TEMED 1,5 µl 3 µl 4,5 µl 6 µl 7,5 µl 9 µl

• Poner papel absorbente debajo del soporte y agregar la solución del gel concentrador

con micropipeta hasta que rebalse.

• Usando guantes colocar el peine, debe rebalsar. Fijarse que no queden burbujas bajo

la peineta, si es así golpear el vidrio para que salgan.

• Llevar a estufa a 37ºC por 35 minutos o hasta gelificar.

• Sacar los vidrios del soporte y continuar de igual forma que para PAGE-nativa.

D) Cálculo PAGE:

Se midió la distancia al frente de corrida y la de migración de cada una de las bandas.

La movilidad relativa de cada banda (Rf) se calculó dividiendo la distancia de

migración de la banda por la distancia total del colorante de corrida.

Distancia total recorrida en el gel desnaturante LPP30: 5 cm.

Figura 8: PAGE-SDS de extracto soluble de harina de quinua pulida de La Palmilla

almacenada a 30ºC (LPP30)

TABLA 7: Peso molecular de los estándares:

Distancia estándar (cm) Rf Peso molecular (kDa) Log PM Estándar

0,3 0,06 202 0,3 Miosina

0,6 0,12 133 0,6 Beta Galactosidasa

1,2 0,24 71 1,2 BSA

2,3 0,46 41,8 2,3 Anhidrasa Carbónica

3

0,60

30,6

3

Inhibidor de Tripsina

de soya

4,4 0,88 6,9 4,4 Aprotinina

y = -1,6408x + 2,3497R2 = 0,9747

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

RF

Log

PM estándarLinear (estándar)

Figura 45: Estándares PAGE-SDS de extracto soluble de harina de quinua pulida de La

Palmilla almacenada a 30ºC (LPP30)

Con Rf y log PM de los estándares se obtiene una curva, cuya ecuación de la recta sirve

para calcular el peso molecular las bandas visualizadas, que corresponden a algunas de

las diferentes proteínas presentes en la harina de quinua.

TABLA 8: Peso molecular de la proteína de harina de quinua:

Distancia proteínas de harina de quinua (cm) Rf Log PM Peso molecular (kDa)

0,2 0,04 2,28 192,34

1,3 0,26 1,92 83,77

1,7 0,34 1,79 61,92

2,1 0,42 1,66 45,77

2,3 0,46 1,59 39,35

2,5 0,50 1,53 33,83

2,6 0,52 1,50 31,37

2,7 0,54 1,46 29,08

2,9 0,58 1,40 25,01

3,1 0,62 1,33 21,50

3,9 0,78 1,07 11,75

4,0 0,80 1,04 10,89

4,3 0,86 0,94 8,68

4,7 0,94 0,81 6,42

ANEXO 6

Procedimiento para determinar actividad proteolítica

• Determinar el pH de la harina, para ello colocar 5 g de harina de quinua + 23 g de

agua destilada fría y hervida en un vaso precipitado. Leer pH con peachímetro.

Harina de quinua pH = 5,92

• En tubos Ependorf, pesar aproximadamente 10 mg de harina de quinua.

• Preparar un baño termorregulado a 37ºC.

• Preparar una fuente con hielo.

• Agregar buffer pH 5,92 a la muestra a tiempo cero, dejando una solución al 1%, y

agitar.

• Agregar 100 µl de TCA al 5 % (para detener la reacción) al tubo Ependorf de la

muestra a tiempo cero y agitar.

• Colocar en hielo la muestra a tiempo cero.

• Agregar buffer pH 5,92 al resto de los tubos Ependorf, según la cantidad que

corresponda a cada tubo dejando una solución al 1% y agitar.

• Colocar cada tubo en el baño termorregulado, insertados en plumavit para que

floten.

• Después de 90 minutos agregar 100 µl de TCA (para detener la reacción) al resto de

los tubos, agitar y colocar en hielo.

• Centrifugar a 10.000 rpm por 15 minutos a 15ºC

• Separar el sobrenadante.

• Los péptidos solubles presentes en el sobrenadante se determinan de acuerdo al

método descrito por Bradford (ver anexo 7), agregando buffer de pH 5,92 para diluir

la muestra.

• El cálculo se realiza con la siguiente fórmula: (Molina y Wagner, 2002)

%∆STCA = 100[(STCA)t – (STCA)0]/STCA)0

Donde:

%∆STCA = porcentaje de incremento en la solubilidad

(STCA)t = solubilidad al tiempo t de hidrólisis

(STCA)0 = solubilidad a tiempo inicial

ANEXO 7

Descripción método de Bradford

Preparación del estándar de proteína:

• Pesar en balanza analítica 10 mg exactos de seroalbúmina de bovino (BSA),

completar con 990 µl de agua destilada, disolver suavemente. Una vez disuelto,

diluir en tubos Ependorf esta solución concentrada de 10 mg/ml de BSA tomando

100 µl de esta solución y completando a 1 ml con 900 µl de agua destilada, agitar

con vortex, etiquetar y congelar hasta el momento de ser utilizado.

• Cada vez que se vaya a hacer una curva de calibración, comprobar la concentración

del estándar leyendo a 280 nm, usando como blanco agua destilada. El valor

obtenido en el espectrofotómetro se divide por 0,63 y este resultado da la

concentración exacta del patrón en mg/ml

Curva de Calibración:

• Agregar en tubos Ependorf las siguientes cantidades de estándar de BSA ± 1 mg/ml,

agitar después de agregar el agua destilada y dejar reposar 5 minutos, después de

agregar el reactivo de Bradford:

Nº tubo Estándar BSA (µl) Agua destilada (µl) Reactivo de Bradford (µl)

1 0 50 1500

2 10 40 1500

3 20 30 1500

4 30 20 1500

5 40 10 1500

• Reposar 10 minutos y leer en el espectrofotómetro a 595 nm, de menor a mayor

concentración.

Medición de proteínas en las muestras: Los péptidos presentes en el sobrenadante de las muestras, se determinan de acuerdo al

método descrito por Bradford, la sensibilidad de este método oscila de 1 a 40 µg de

proteínas, por lo que hay que estimar el porcentaje de proteínas aproximado que se

espera en la muestra para caer en el rango de la curva.

El método a seguir es el siguiente:

• Tomar entre muestra y solvente 50 µl, agregando en tubos Ependorf el solvente que

corresponda según el análisis a efectuar (agua destilada, buffer B, buffer pH 5,92).

Agitar después de agregar el solvente, dejar reposar 5 minutos y después agregar

1500 µl de reactivo de Bradford.

• Dejar reposar 10 minutos y leer las muestras en el espectrofotómetro a una longitud

de onda de 595 nm

• Dibujar la curva de calibración: cantidad de BSA (eje de las abscisas) contra

absorbancia obtenida a una longitud de onda de 595 nm (eje de las ordenadas).

• La absorbancia resultante de las muestras, se interpola a la curva de calibración y se

extrapola de esta al eje de las X, para conocer la cantidad de proteína contenida en la

muestra. La curva de calibración debe hacerse en paralelo con la medición de la

muestra.

ANEXO 8

Preparación de reactivos

Mezcla catalizadora: Pesar 24 g de K2SO4 y 1,88 g de CuSO4*5H2O, mezclar en un

mortero y almacenar etiquetado.

Reactivo de Bradford: Disolver 100 mg de azul brillante de Coomasie G-250 en 50 ml

de etanol al 95%. Agregar 100 ml de ácido fosfórico al 85% (p/v), diluir a un volumen

final de 1 litro. Agitar al menos 2 horas tapado y cubierto de la luz. Filtrar con papel

Whatman nº1 usando plegado múltiple. Almacenar en frasco ámbar protegido de la

oscuridad.

Buffer pH 5,92: Mezclar 912,4 ml de KH2PO4 0,1 M y 87,6 ml de NaOH 0,1 M y

almacenar etiquetado.

Buffer B (pH 8,5): Mezclar Na2HPO4 33,3 mM con NaH2PO4*H2O 1,7 mM. Para esto

pesar 4,73 g de Na2HPO4 y 0,23 g de NaH2PO4*H2O completar a 1 litro y almacenar

etiquetado.

Buffer A (pH 7,5): Mezclar Na2HPO4 32,5 mM con NaH2PO4*H2O 2,6 mM y llevar a

pH 7,5 Para esto pesar 4,61 g de Na2HPO4 y 0,36 g de NaH2PO4*H2O y ajustar con

NaCl 0,4 M (23,38 g), completar a 1 litro y almacenar etiquetado.

Buffer de electrodo pH 8,3 (o buffer de corrida): Disolver 3 g de Tris, 14,4 g de glicina

y 1 g de SDS en 1 litro de agua destilada. Almacenar en frío.

Buffer de concentración pH 6,8: Disolver 6 g de Tris y 0,4 g de SDS en 40 ml de agua

destilada. Ajustar con HCl 4N y completar el volumen a 100 ml. Almacenar en frío.

Buffer del gel de separación pH 8,8: Disolver 36,4 g de Tris y 0,8 g de SDS en 80 ml de

agua destilada. Ajustar el pH con HCl 4N y completar el volumen a 200 ml.

Acrilamida/bis-acrilamida: Disolver 30 g de acrilamida y 0,8 g de bis-acrilamida en 100

ml de agua destilada. Almacenar en frasco oscuro a 4ºC. Usar guantes y mascarilla para

la preparación.

Solución de persulfato de amonio (PSA): Disolver 100 mg de PSA en 1 ml de agua

destilada y congelar. Permanece estable por 4 años.

Solución colorante: Disolver 1,25 g de Coomassie Blue R en 227 ml de metanol y 46 ml

de ácido acético glacial. Completar con agua destilada a 500 ml.

Solución decolorante: Mezclar 70 ml de ácido acético glacial, 300 ml de etanol y

completar el volumen a 1 litro con agua destilada.

Solución desnaturante con β-mercapto etanol: 2,5 ml de buffer pH 6,8 ; 1,2 g de SDS ;

4 ml de glicerol; 2 ml de β-mercapto etanol; punta de espátula de azul de bromofenol

completar a 10 ml.

Solución desnaturante: 2,5 ml de buffer pH 6,8 ; 1 g de SDS ; 0,4 g de sacarosa ; punta

de espátula de azul de bromofenol, completar a 10 ml.

Solución nativa: 4 ml de buffer pH 6,8 nativo; 4 ml de glicerol; punta de espátula de

azul de bromofenol, completar a 10 ml.

ANEXO 9

Fotografías de algunos de los equipos y análisis realizados

a la harina de quinua

Digestor Büchi Unidad destiladora Büchi

Equipo electroforesis Cubeta de corrida electroforesis

Novasina Thermoconstanter Cápsula Novasina Thermoconstanter

Equipo DSC Celda equipo DSC

Equipo espectro UV Celda equipo espectro UV

Equipo espectroscopia de fluorescencia Celda equipo de fluorescencia

Agitación con vortex Muestras en centrífuga Beckman

Tubos para curva de calibración Bradford Molino de impacto Retsch Muhle

Cooperativa Las Nieves – Paredones Quinua Cooperativa Las Nieves Paredones

ANEXO 10

Fundamento de la fluorescencia

En la mayoría de los casos, las moléculas que pasan a un estado electrónico excitado por

la absorción de energía radiante, vuelven al estado basal por una transferencia sin

radiación de la energía de excitación a las moléculas circundantes. En pocas palabras, la

energía vuelve a aparecer como calor. Pero en ocasiones, (ver figura 46) una molécula

perderá solo parte de su energía de excitación por transferencia (flecha amarilla) y

volverá a radiar la parte más grande (flecha verde). Con ello, surge el denominado

fenómeno de fluorescencia. Dado que, el cuanto de energía remitida como fluorescencia

siempre es de menor energía que el cuanto que se absorbió inicialmente (flecha

naranja), la longitud de onda de la luz fluorescente será más larga que la longitud de

onda de la luz de excitación (Mathews y col., 2002).

Además, la excitación de la fluorescencia por luz polarizada en el plano, proporciona un

modo de estudiar la dinámica de la estructura proteica. Si los residuos excitados pueden

moverse o rotar de modo apreciable antes de que se remita la luz fluorescente, la

fluorescencia se despolarizará en alguna cantidad. La medida de cuantía de esta

despolarización proporciona una medida de la movilidad rotacional del grupo a la

molécula (Mathews y col., 2002).

Figura 46: Principio de la fluorescencia.

ANEXO 11

TABLA 9: Contenido de aminoácidos en alimentos,

valores expresados como g/100g de producto:

Aminoácido Quinua Harina

quinua

Harina

trigo

Arroz Avena Maíz Cebada Poroto Carne Leche

Ac. Aspártico 0,875 0,82 0,491 0,808 1,075 0,596 0,666 2,648 1,590 0,264

Ac. Glutámico 1,428 1,39 4,171 1,622 2,919 1,800 2,771 3,271 2,703 0,764

Serina 0,444 0,31 0,562 0,427 0,656 0,473 0,476 1,228 0,713 0,199

Histidina 0,288 0,29 0,248 0,197 0,292 0,258 0,248 0,627 0,603 0,092

Glicina 0,624 0,53 0,424 0,393 0,656 0,351 0,453 0,839 0,860 0,068

Treonina 0,420 0,29 0,321 0,307 0,462 0,342 0,389 0,872 0,812 0,153

Arginina 0,841 0,76 0,422 0,65 0,876 0,398 0,555 1,257 1,118 0,113

Alanina 0,564 0,41 0,367 0,474 0,633 0,716 0,464 0,927 1,033 0,119

Tirosina 0,336 0,28 0,277 0,275 0,459 0,363 0,365 0,559 0,637 0,163

Valina 0,540 0,50 0,493 0,433 0,711 0,461 0,592 1,016 0,886 0,199

Metionina 0,240 0,15 0,174 0,183 0,234 0,182 0,196 0,234 0,478 0,086

Cistina --- 0,02 0,304 0,084 0,372 0,147 0,267 0,188 0,226 0,028

Isoleucina 0,432 0,43 0,435 0,3 0,526 0,350 0,421 0,927 0,852 0,162

Leucina 0,720 0,64 0,840 0,648 1,012 1,190 0,784 1,685 1,435 0,328

Fenilalanina 0,492 0,39 0,581 0,406 0,698 0,464 0,603 1,154 0,778 0,185

Lisina 0,672 0,53 0,248 0,299 0,517 0,254 0,406 1,593 1,573 0,268

Triptofano --- 0,09 0,128 --- --- 0,067 --- --- --- ---

Prolina 0,372 0,35 1,387 0,369 0,723 0,85 1,282 0,789 0,668 0,314

Fuente: FAO (1970) “Contenido en aminoácidos de los alimentos y datos biológicos

sobre las proteínas” Roma, Italia. Organización de las Naciones Unidas para la

agricultura y la alimentación. Colección alimentación y nutrición.

Fuente contenido de aminoácidos de harina de quinua: Tapia, M.; Gandarillas, H.;

Alandia, S.; Cardozo, A.; Mujica, A.; Ortiz, R.; Otazu, V.; Rea, J.; Salas, B. y Sanabria,

E. (1979) “La Quinua y la Kañiwa: Cultivos Andinos” Bogotá, Colombia. Editorial

IICA.

ANEXO 12

Contenido de aminoácidos esenciales en quinua y otros

alimentos

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

Treonina

Valina

Metion

ina

Isoleuc

ina

Leuc

ina

Fenila

lanina

Lisina

Harina Quinua LPPHarina TrigoArrozAvenaMaizCebadaPorotoCarneLeche

Figura 47: Contenido de aminoácidos esenciales en quinua y otros alimentos

Fuente: FAO (1970) “Contenido en aminoácidos de los alimentos y datos biológicos

sobre las proteínas” Roma, Italia. Organización de las Naciones Unidas para la

agricultura y la alimentación. Colección alimentación y nutrición.

ANEXO 13

TABLA 10: Cantidad de harina de quinua que es

necesario ingerir diariamente por kilogramo de peso

corporal, para satisfacer los requerimientos de

aminoácidos en adultos:

Aminoácidos Necesidades de

aminoácidos en

adultos (mg/kg/día)

(*)

Contenido de

aminoácidos LPP

(mg/g)

Cantidad de LPP

requerida para

satisfacer

requerimientos

(g/kg/día)

Fenilalanina +

tirosina

14 11 1,3

Isoleusina 10 5 2,0

Leucina 14 9 1,6

Lisina 12 8 1,5

Metionina + cistina 13 15 0,9

Treonina 7 7 1,0

Valina 10 7 1,4

(*) Fuente necesidades de aminoácidos en adultos (mg/kg/día): Olivares, S.; Andade,

M. y Zacarias, I. (1993) "Necesidades nutricionales y calidad de la dieta. Manual de

autoinstrucción" 1ª ed. INTA, Universidad de Chile. Santiago, Chile. Impreso en Sopmc

Chile.

ANEXO 14

Comparación de bandas entre albúminas, globulinas y

proteínas solubles

Figura 48: Comparación de bandas entre albúminas, globulinas y proteínas solubles

Fuente: Albarran, Rubén (1993) “Estudio de algunos componentes químicos, caracteres

morfoanatómicos y patrones proteicos en semillas de dos ecotipos de quínoa

(Chenopodium quínoa Willd)”. Tesis (Ingeniero Agrónomo). Chillan, Chile.

Universidad de Concepción, Facultad de Agronomía, Departamento de Producción

Vegetal.

Proteínas de quinua separadas en un gel de poliacrilamida discontinuo con SDS de 1

mm. Banda 1, 2 y 3: muestras de harina de quinua proveniente de Pichamán. Banda 4, 5

y 6: muestras de harina de quinua proveniente de Iquique. Banda 1 y 4: albúminas

anteriormente extraídas en 4 ml de agua destilada por 30 minutos a 4ºC. Banda 2 y 5:

globulinas anteriormente extraídas en 4 ml de tampón 0,125 M Tris/0,019 M de ácido

bórico, pH 8,9 por 1 hora a 4ºC. Banda 3 y 6: proteínas solubles anteriormente extraídas

en 4 ml de tampón 0,125 M Tris/0,019 M de ácido bórico, pH 8,9; 4% de SDS, 5% de

ME por 1 hora a 4ºC. Electroforesis: gel acumulador al 6% PAA en 0,75 M Tris/0,72 M

HCl pH 6,8; gel separador al 10% PAA en 2,25 M Tris/0,4M HCl pH 8,8, tampón de

corrida 0,025 M Tris/0,192M glicina, 0,1% SDS, pH 8,3, 300 V y 54 mA, por 2,5 horas.

ANEXO 15

Tabla resultados actividad de agua harina de quinua

En la siguiente tabla se visualiza la actividad de agua de las harinas a los distintos

tiempos de estudio, con su correspondiente desviación estándar entre duplicados.

TABLA 11: Actividad de agua harina de quinua:

Temperatura 20ºC β Harina Paredones A LPP A LPSP A Tiempo

0 0,518d ± 0,003 0,488d ± 0,005 0,522d ± 0,007 1 0,396c ± 0,022 0,460c ± 0,076 0,339c ± 0,006 2 0,329c ± 0,001 0,418c ± 0,025 0,461c ± 0,004 3 0,228a ± 0,016 0,340a ± 0,035 0,277a ± 0,021 4 0,242a ± 0,001 0,253a ± 0,006 0,247a ± 0,001 5 0,317b ± 0,002 0,390b ± 0 0,357b ± 0,066

Temperatura 30ºC α Harina Paredones A LPP A LPSP A Tiempo

0 0,518d ± 0,003 0,488d ± 0,005 0,522d ± 0,007 1 0,385c ± 0,002 0,374c ± 0,009 0,367c ± 0,006 2 0,342c ± 0,034 0,457c ± 0,029 0,358c ± 0,011 3 0,204a ± 0,005 0,244a ± 0,004 0,219a ± 0,001 4 0,247a ± 0,001 0,247a ± 0,001 0,259a ± 0,011 5 0,315b ± 0,005 0,263b ± 0,002 0,310b ± 0,001

Temperatura 40ºC α Harina Paredones A LPP A LPSP A Tiempo

0 0,518d ± 0,003 0,488d ± 0,005 0,522d ± 0,007 1 0,395c ± 0,001 0,362c ± 0,033 0,451c ± 0,054 2 0,382c ± 0,096 0,456c ± 0,002 0,370c ± 0,009 3 0,193a ± 0,005 0,268a ± 0,003 0,204a ± 0,023 4 0,249a ± 0,002 0,236a ± 0,007 0,246a ± 0,016 5 0,309b ± 0,001 0,261b ± 0,083 0,332b ± 0,013

a, b, c, d: Letras distintas indican diferencias significativas entre tiempos de estudio

(P<0,05).

A: Igual letra indica que no existe diferencia significativa entre harinas (P<0,05).

α, β: Letras distintas indican diferencias significativas entre temperaturas (P<0,05).

ANEXO 16

Figuras obtenidas en el equipo de DSC

A) Resultados obtenidos al comienzo del estudio:

Muestra: Lo Palmilla PulidaPeso muestra húmeda: 16.34 mgPeso muestra seca: 3.59 mgRango de temperatura: 15°C a 120°CFlujo de calor: 10°C/minMedio Buffer B Concentración al 20%

Integral -21.23 mJ normalized -5.91 Jg^-1Onset 56.67 °CPeak Height 0.33 mWPeak 65.67 °CExtrapol. Peak 65.72 °CEndset 72.97 °CPeak Width 9.51 °CLeft Limit 49.98 °CRight Limit 78.17 °CLeft bl Limit 49.98 °CRight bl Limit 78.17 °CHeating Rate 10.00 °Cmin^-1Baseline Type line Result Mode Sample TempLeft Area 55.82 %Right Area 44.18 %

Integral -7.89 mJ normalized -2.20 Jg^-1Onset 90.88 °CPeak Height 83.71e-03 mWPeak 98.85 °CExtrapol. Peak 98.96 °CEndset 104.22 °CPeak Width 12.48 °CLeft Limit 78.59 °CRight Limit 114.83 °CLeft bl Limit 78.59 °CRight bl Limit 114.83 °CHeating Rate 10.00 °Cmin^-1Baseline Type line Result Mode Sample TempLeft Area 59.02 %Right Area 40.98 %

mW0.2

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

^exo Lo Palmil la Pulida Seca 22.09.2004 12:50:41

Universidad de Santiago de Chile: Lab. Prop. Fisicas SystemeRTAMETTLER TOLEDO S

Figura 49: DSC en el tiempo inicial, harina de quinua pulida proveniente de La Palmilla

Muestra: Paredones sin pulirPeso muestra húmeda: 15.86 mgPeso muestra seca: 3.25 mgRango de temperatura: 15°C a 120°CFlujo de calor: 10°C/minMedio Buffer B Concentración al 20%

Integral -7.57 mJ normalized -2.33 Jg^-1Onset 86.20 °CPeak Height 68.30e-03 mWPeak 99.20 °CExtrapol. Peak 106.29 °CEndset 112.82 °CPeak Width 19.90 °CLeft Limit 84.79 °CRight Limit 112.82 °CLeft bl Limit 84.79 °CRight bl Limit 112.82 °CHeating Rate 10.00 °Cmin^-1Baseline Type line Result Mode Sample TempLeft Area 41.86 %Right Area 58.14 %


mW0.5

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

^exo Paredones sin Puli r Seco 22.09.2004 13:12:39


Figura 50: DSC en el tiempo inicial, harina de quinua sin pulir proveniente de

Paredones

B) Resultados obtenidos al finalizar el estudio, en este

caso aumenta el número de curvas puesto que cada harina

fue almacenada a tres temperaturas: 20, 30 y 40°C

Muestra: Lo Palmilla Pulida 20°CPeso Muestra: 26,0 mgRango de Temperatura: 15°C a 120°CFlujo de Calor: 10°C/minMedio: Buffer BConcentración al 20%


LPSP40, 07.04.2005 16:37:03LPSP40, 26.0000 mg

mW2

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

^exo Lo Palmilla Pulida 20 07.04.2005 17:22:52


Figura 51: DSC en el tiempo final, harina de quinua pulida proveniente de La Palmilla

almacenada a 20ºC

Muestra: Lo Palmilla Pulida 30Peso Muestra: 20,8 mgRango de Temperatura: 15°C a 120°CFlujo de Calor: 10°C/minMedio: Buffer BConcentración al 20%

Integral -0.34 mJ normalized -16.88e-03 Jg^-1Onset 96.80 °CPeak Height 19.43e-03 mWPeak 98.84 °CExtrapol. Peak 98.91 °CEndset 101.87 °CPeak Width 2.89 °CLeft Limit 96.75 °CRight Limit 102.38 °CLeft bl Limit 96.75 °CRight bl Limit 102.38 °CHeating Rate 10.00 °Cmin^-1Baseline Type line Result Mode Sample TempLeft Area 38.36 %Right Area 61.64 %



LPP30, 07.04.2005 17:32:32LPP30, 20.0000 mg

mW0.2

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10




almacenada a 30ºC


Muestra: Lo Palmilla Pulida 40°CPeso Muestra: 20,3 mgRango de Temperatura: 15°C a 120°CFlujo de Calor: 10°C/minMedio: Buffer BConcentración al 20%

LPP40, 07.04.2005 16:14:01LPP40, 20.0000 mg

mW0.2

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10




almacenada a 40ºC

Muestra: Lo Palmilla Sin Pulir 20Peso Muestra: 14,8 mgRango de Temperatura: 15°C a 120°CFlujo de Calor: 10°C/minMedio: Buffer BConcentración al 20%


LPSP20, 07.04.2005 17:13:05LPSP20, 14.0000 mg

mW2

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

^exo Lo Palmil la Sin Puli r 20 07.04.2005 17:46:15


Figura 54: DSC en el tiempo final, harina de quinua sin pulir proveniente de La Palmilla

almacenada a 20ºC

In teg ral -0 .50 mJ nor malized -2 1.2 2e- 03 Jg - 1On set 81. 68 °CPe ak Height 14. 15e -03 mWPe ak 84. 87 °CEx tra pol. Pe ak 84. 73 °CEn dse t 89. 41 °CPe ak Width 6.7 2 ° CLe ft Limit 81. 68 °CRi ght Limit 90. 37 °CLe ft bl Limi t 81. 68 °CRi ght bl Lim it 90. 37 °CHe ati ng Rate 10. 00 °Cmin - 1Ba sel ine Typ e lin e Re sul t Mode Sam ple TempLe ft Area 37. 74 %Ri ght Area 62. 26 %



LPS/30, 08.04.2005 11:18:50LPS/30, 23.6000 mg

mW0.5

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

^exo LPS 30 08.04.2005 11:45:49



almacenada a 30ºC

Muestra: Lo Palmilla Sin Pulir 40°CPeso Muestra: 26,0 mgRango de Temperatura: 15°C a 120°CFlujo de Calor: 10°C/minConcentración al 20%


LPSP40, 07.04.2005 16:37:03LPSP40, 26.0000 mg

mW2

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

^exo Lo Palmil la Sin Puli r 40 07.04.2005 17:33:28



almacenada a 40ºC

Muestra: Paredones 30Peso Muestra: 23,6 mgRango de Temperatura: 15°C a 120°CFlujo de Calor: 10°C/minMedio: Buffer BConcentración al 20%

Integral -0.22 mJ normalized -9.35e-03 Jg -1Onset 79.35 °CPeak Height 14.52e-03 mWPeak 82.11 °CExtrapol. Peak 82.02 °CEndset 83.84 °CPeak Width 2.34 °CLeft Limit 78.51 °CRight Limit 84.13 °CLeft bl Limit 78.51 °CRight bl Limit 84.13 °CHeating Rate 10.00 °Cmin^-1Baseline Type line Result Mode Sample TempLeft Area 62.95 %Right Area 37.05 %


Pared30, 07.04.2005 17:49:23Pared30, 23.0000 mg

mW1

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

^exo Paredones 30 07.04.2005 17:54:42


Figura 57: DSC en el tiempo final, harina de quinua sin pulir proveniente de Paredones

almacenada a 30ºC

Muestra: Paredones 40°CPeso Muestra: 28,6 mgRango de Temperatura: 15°C a 120°CFlujo de Calor: 10°C/minMedio: Buffer BConcentración al 20%


Pared40, 07.04.2005 16:56:48Pared40, 28.0000 mg

mW2

min

°C20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

^exo Paredones 40 07.04.2005 17:38:33


Figura 58: DSC en el tiempo final, harina de quinua sin pulir proveniente de Paredones

almacenada a 40ºC

ANEXO 17

Tabla resultados capacidad de retención de agua harina de

quinua

En la siguiente tabla se visualiza la capacidad de retención de agua de las harinas a los

distintos tiempos de estudio, con su correspondiente desviación estándar entre

duplicados.

TABLA 12: Capacidad de retención de agua de harina de quinua (ml de agua/g de

harina):

Temperatura 20ºC α Harina Paredones B LPP A, B LPSP A Tiempo

0 5,19c ± 1,68 4,53c ± 0,21 4,19c ± 0,02 1 3,02b ± 0,33 3,46b ± 0,30 3,23b ± 0,40 2 2,81b ± 0,04 3,40b ± 0,17 3,13b ± 0,16 3 3,60b ± 1,65 2,82b ± 0,52 2,72b ± 0,003 4 2,36a ± 0,05 2,26a ± 0,17 2,72a ± 0,82

Temperatura 30ºC β Harina Paredones B LPP A, B LPSP A Tiempo


Temperatura 40ºC β Harina Paredones B LPP A, B LPSP A Tiempo


a, b, c: Letras distintas indican diferencias significativas entre tiempos de estudio

(P<0,05).



ANEXO 18

Tabla resultados solubilidad de harina de quinua

En la siguiente tabla se visualiza la solubilidad de las harinas a los distintos tiempos de

estudio, con su correspondiente desviación estándar entre duplicados.

TABLA 13: Solubilidad harina de quinua en buffer B (%):

Temperatura 20ºC β Harina Paredones A LPP B LPSP B Tiempo

0 9,41c ± 0,80 13,32c ± 1,36 11,67c ± 0,40 1 11,38d ± 0,17 14,78d ± 0,13 16,24d ± 0,38 2 11,06d ± 0,27 14,91d ± 1,12 14,93d ± 0,37 3 5,58b ± 0,38 8,11b ± 0,81 11,49b ± 0,48 4 6,86b ± 0,97 8,85b ± 0,64 9,49b ± 0,76 5 6,61a ± 0,10 7,10a ± 0,12 8,65a ± 0,30

Temperatura 30ºC α Harina Paredones A LPP B LPSP B Tiempo


Temperatura 40ºC β Harina Paredones A LPP B LPSP B Tiempo


a, b, c, d: Letras distintas indican diferencias significativas entre tiempos de estudio

(P<0,05).



CARACTERIZACIÓN Y DETERMINACIÓN DE LA ... INÉS GAJARDO REPETTO Santiago, Chile 2005 A mis amados...

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