Cardellá Hernandez · Modificación del ADN (posterminación) 453 Replicación en eucariontes 453...

Cardellá - Hernandez r.

Prólogo a bioquímica es una ciencia que se ha desarrollado con un ritmo muy acelerado en el presente siglo. Los logros alcanzados en los últimos años TJ en el conocimiento de esta ciencia iian influido decisivaniente en el

progreso de numerosas ramas científicas afines, en particular en las hiomédicas. Muchos hallazgos de la bioquímica han incidido directa o indirectamente en la teoría y la práctica médica; por ello resulta imprescindible el dominio de los aspectos fundamentales de esta disciplina por parte de médicos, estomatólogos, licenciados en enfermería, y en general por todo el personal profesional relacionado con la asistencia, docencia e investigación en el campo de las ciencias médi- cas.

El texto fue elaborado teniendo en cuenta los intereses de las diferentes especialidades de las ciencias médicas. De igual modo, éste puede ser de utilidad a estudiantes de cualquier otra carrera biológica. En el Tomo IV se tratan, además, algunos aspectos especializados de la bioqiiímica de interés clínico actiial, lo que permite a estudiantes de años superiores y graduados de las diferentes ramas de las ciencias médicas complementar y aplicar conocimientos adquiridos al cursar las ciencias básicas.

Nuestros propósitos son contribuir a mejorar la comprensión de la disciplina Bioqiiímica y destacar su importancia en la formación de profesionales de las especialidades médicas. Corresponde principalmente a nuestros estudiantes eva- luar en qué medida ello se ha logrado.

Las autores

CONTENIDO

CApfiULo 20. Membranas biol6gieas 373 Componentes moleculares de las membranas 373

Lípidos de membrana 373 Proteínas de membrana 375 Glúcidos de membrana 376

Modelo del mosaico fluido 376 Membrana plasmática 378

Funciones de la membrana plasmática 381 Transportedesustancias através de las membranas 381

Difusión y ósmosis 381 Transporte mediante proteínas 382

Potencial de membrana en reposo 385 Diferenciación de la membrana plasmática 385 Resumen 386 Ejercicios 386

CAPf'm.0 21. Organelm membranosus in-ulares 389 Tipos de organelos membranosos internos 389 Estmctura general de las endomembranas 390 Funciones generales de los organelos membranosos 390 Relaciones entre los organelos membranosos 391

Retículo endoplasmático 391 Aparato de Golgi 394 Lisosomas 395 Peroxisomas 397

Relaciones del sistema de endomembranas 398 Resumen 398 Ejercicios 400

CAP~TULO 22. Citoesqueleto 401 Citoplasma soluble 401 Microfilamentos 402

Principales funciones de los microfilamentos 404 Microtúbulos 405

Principales funciones de los microtúbulos 406 Filamentos intermedios 406 Inclusiones citoplasmáticas 407

Glóbulos de grasa 407 Gránulos de glucógeno 408

Resumen 409 Ejercicios 410

C~pfrvLo 23. Núdeo celular 411 Componentes estructurales del núcleo 411

Envoltura nuclear 412 Nucléolo 415 Nucleoplasma 415

Par cromatina-cromosoma 416 Cromatina 416 Cromosomas 416

Cariotipo humano normal 417 Mitosis 419 Resumen 420 Ejercicios 421

CmíTin.0 24. Flujo celular de información 427 Información molecular 427 Formas de la información niolecnlar 428 Transferencia de información 429 Ciclo celular 429 Actividad biosintética durante el ciclo celular 431 Regulación del ciclo celular 434 Resumen 437 Ejercicios 437

CAPíTin.0 25. Replicación de los ADN 439 Historia del problema 439 Aspectos generales 441 Requerimientos de la replicación 442 Etapas de la replicación 444 Replicación en procariontes 444

Replicación en E. coli 444 Origen de la replicación 445 Eventos previos a la iniciaciÓn(preiniciacióo) 445 Iniciación 447 Elongación 449 Terminación 452 Modificación del ADN (posterminación) 453

Replicación en eucariontes 453 Complejidad del proceso 453 Replicación en eucariontes pluricelolares 455

Fidelidad del proceso 456 Inhibidores de la replicación 457 A manera de conclusiones 458 Resumen 459 Ejercicios 460

CAPíTUL0 26.Op@zación del genoma eucarionte 461 Genes y cromosomas 461 Genes y ADN 465 Estructura del gen 466 Familias génicas 468 Genoma humano 47 1 Resumen 472 E,jercicios 473

CAPfTUL0 27. Transcripción del ADN 475 Aspectos generales 475 Etapas de la transcripción 476

Eventos previos a la iniciación (preiniciación) 477 Iniciación 479 Elongación 480

Terminación 480 Eventos posterminación 483

Transcripción en eucariontes 485 Síntesis y maduración de los ARNr 486 Síntesis y maduración de los ARNt 487 Unidades de transcripción 487 Síntesis y maduración de los ARNm 490

Inhibidores de la transcripción 493 Resumen 494 Ejercicios 495

CmíTin.0 28. Código gen6üco 497 - - Primeros pasos 497 Descifrado del código 498 Codones de terminación 501 Codon de iniciación 502 Universalidad del código 503 Estructura del código 503 Descodificación 505 Resumen 506 Ejercicios 507

CAPíTUL0 29. Ribosomas 509 Primeros indicios 510 Composición molecular 510 Estructura tridimensional512 1,ocalización de los componentes 512 Dominios funcionales 515 Riogénesis de los ribosomas 516 Ribosomas eucariontes 517 Polirribosomas 518 Resumen 518 Ejercicios 519

CAPíTULo 30. 'ihducción 521 Primeros aportes 521 Características generales 522 Eventos previos a la iniciación 522 Iniciación 525

Formación del complejo de preiniciación 525 Incorporación del fmet-ARNt, 526 Incorporación del ARNm 526 Formación del complejo de iniciación 70s 526

Elongación 527 Incorporación del aminoacil-ARNt 527 Formación del enlace peptídico 529 Translocación 529

Terminación 530 Traducción en eucariontes 530 Posterminación 532 Distribución de proteínas 533 Consideraciones energéticas 534 Inhibidores de la traducción 535 Resumen 536 Ejercicios 536

c m 0 31. Reeombinari6n genética 537 Historia del problema 537 Tipos de recombinación genética 538 Modelo de Holliday 539 Comprobación del modelo 541 Formación del intermediario de Holliday 542 Enzimología de la recombinación 542 Significado biológico de la recombinación 545 Resumen 546 Ejercicios 546

CAPfirrr.0 32. Mutadones 549 Definiciones y nomenclatura 549

Concepto de mutación 549 Tipos de mutaciones 550 Mutaciones génicas 550

Mutagénesis 551 Mutágenos análogos de bases 551 Mutágenos químicos 552 Sustancias intercalantes 553 Radiaciones 553

Consecuencias de las mutaciones 553 Mutaciones mayores 555 Supresión 556 Mutaciones en humanos 557 Resumen 558 Ejercicios 559

CAPínno 33. Comervaei6n de la informaci6n genetiea 561 Modificación-restricción 561 Daños al ADN 564

Bases mal apareadas 564 Bases perdidas 564 Alteraciones de bases 564 Rotura de una hebra 564 Rotura en las 2 hebras 565 Enlaces entrecruzados 565

Sistema de reparación 566 Fotorreactivación 566 Reparación por escisión 566

Reparación por recombinación 567 Sistemas SOS 569

Reparación de otros daños 569 Alteraciones de la reparación 569 Resumen 571 Ejercicios 571

CAPfiur,~ 34. Regulaci6n de la expresi6n genetiea 573 Aspectos generales 573 Regulación transcripcional 574 Inducción enzimática 574

Mecanismo de atenuación 581 .- Eficiencia del promotor 582

Regulación postranscripcional 582 Regulación en encariontes 583

Regulación pretranscripcional 584 Regulación transcripcional 585 Regulación postranscripcional 585

Resumen 586 Ejercicios 587

CAPfiULo 35. k o l o g l a del ADN reeombiinante 589 Procedimiento general 589 Obtención de genes específicos 591 Recombinación in vitro 591 Vectores 593 Identificación del gen recombinado 595 Pmblem en la producción de pmteínas eucariontes 596 Expresión de genes clonados 596 Experiencia típica 596 Empleo diagnóstico 598 Perspectivas 599 Resumen 600 Ejercicios 601

Introducción a la sección

omo fue considerado en el capítulo 4, la célula es la forma fundan~ental de r; .: organización de la materia viva; de aquíse deduce que la comprensión del \ -/ funcionamiento celular constituye un elemento fundamental para el conoci-

miento de los fenómenos biológicos en su conjunto.

La primeraaproximación del hombre al estudio de la célula se produjo a través desu morfología, auxiliado en sus inicios por instrumentos ópticos de amplificación de imágenes. Desde los primeros momentos se hizo evidente que las células eran estructuras complejas con elevado nivel de organización interna.

El desarrollo de los estudios bioquímicos, que demostraron la posibilidad de analizar algunas funciones celulares en preparados libres de células -especialmente algunas actividades enzimáticas-, abrió un período importante de adquisición de nuevos conocimientos acerca del funcionamiento de estas células. Se descubrieron las vías y ciclos metabólicos y avanzó de manera extraordinaria el conocimiento sobre la estructnra y función de las enzimas, así como su función reguladora en el metabolismo.

En una etapa pareció que el conocimiento bastante completo de la función celular estaba relativamente cerca y que consistiría en identificar todas y cada una de las enzimas celulares, así como las reacciones que ellas catalizaban; de este modo, una imagen reduccionista de la célula, como un pequeño saco donde las enzimas llevaban a cabo su función, cobró algún valor ein el pensamiento de los bioquímicos. Pronto esta

imagen afrontó dificultades al ponerse en evidencia que muchas funciones metahólicas requerían, no solo los catalizadores enzimáticos correspondientes, sino de determinadas estructuras con un elevado grado de organización; tal fue el caso de la síntesis de proteínas en relación con los rihosomas o de la respiración celular con las mitocondrias.

De manera simultánea el desarrollo de los métodos de estudio de la morfología celular- especialmente la microscopia electrónica- fue revelando la extraordinaria complejidad de la citoarquitectura, a ello se unió el cúmulo de información obtenida mediante métodos como la histoqnímica y la inmunohistoquímica, los cuales permitieron hacer un análisis que integraba la estructura y la función de diversos componentes.

Hoy resulta evidente que si queremos comprender adecuadamente a la célula,la visión del pequeOo saco repleto de enzimas tiene que ser desplazada por la de un complejo estmctural y funcional, donde tan importantes son las características cinéticas de una enzima como su ubicación intracelular y sus atributos topológicos.

De este modo se justifica plenamente la inclusión de esta sección "componentes celulares" en un texto de bioquímica; desde luego, el lector deberá tener presente que el contenido es eminentemente funcional y los detalles morfológicos son considerados en la medida quecontribuyen a este objetivo. El estudio cada vez más complejo sobre la morfología celular sigue siendo objeto de estudio primordial en disciplinas de carácter morfológico como la Histología. Sin dudas nos vamos acercando a una sínte- sis de conocimientos que muchos reconocen como una disciplina independiente, la Biología Molecular, en nuestro caso se considera como una parte de la propia Bioquímica.

El enfoque eminentemente funcional nos ha decidido tratar los aspectos estmcturales de algunos componentes celulares (mitocondrias y ribosomas) en capítulos de otras secciones donde se estudian sus funciones.

En esta sección se tratan aspectos estructurales y funcionales de los componentes celulares,cnáies son lamembranaplasmática y losorganelosmembi.anau>sinhamlulares, el núcleo celular y el citoesqueleto.

En este texto podrá comprobarse cómo estos conocimientos son retomados necesariamente para lograr mejor comprensión del funcionamiento y regulación del metabolismo celular, cobrando fuerza una concepción de la relación estmctnra-función a todos los niveles de organización de la materia viva.

Sin embargo, debe quedar claro que una célula es un objeto muy complejo, con un elevadísimo grado de organización cuya comprensión requiere aún de intensas investigaciones.

Las membranas biológicas son organizaciones supramacromoleculares flexibles y fluidas que delimitan las células del medio circundante (membrana plasmática), o constituyen el sistema de endomembranas característico de las células eucariotas y que condiciona la compartimentación de éstas; además, las membranas delimitan a muchos organelos citoplasmáticos.

Aunque la composición molecular de las membranas biológicas varia según el tipo de célula del cual forme parte, e incluso de su localización intracelular, todas ellas presentan un conjunto decaracteristicas comunes tantoen relación con su composición molecular y su organización estructural general como con sus funciones básicas.

En este capítulo se estudiarán estas caracteristicas comunes a todas las membranas biológicas y además, se tratarán las especificidades estructurales generales de la membrana plasmática, haciendo énfasis en algunas de sus funciones, particularmente las relacionadas con el paso de sustancias a través de ella.

Componentes moleculares de les membranas

Las distintas membranas biológicas están constituidas fundamentalmente por Lípidos y proteínas, poseen además, glúcidos en pequeñas cantidades. Los Lípidos y las proteínas son los componentes fundamentales que se encuentran en proporciones variables según el tipo de membrana; en las membranas mielínicas los Iípidos constituyen cerca de1 80 % de su masa y las proteínas alrededor de1 20 %,en tanto que en lamembranainternade las mitocondrias la proporción de ambos constituyentes es inversa,-20 % de Iípidos y 80 % de proteínas. Entre estos límites existe una gama de proporciones diversas de dichos componentes; analizaremos algunos aspectos particulares de cada uno de los componentes moleculares de las membranas.

Lípidm de membrana

Losopid~s<lwxenwnbranfonnandopartedelasmembrana~presentanlapropiedad deser aníipátieascomo se mrdará, éstase deuna pomón polar y otra apolar (capítulo 13). Dichos Iípidos de membranas son fdátidos de glicerina y esñngolípidos; los triacilglicéridos se encuenhan en cantidades ínfimas. Algunos tipos de membrana poseen colesterol y éstem de colesterol.

La característica anfipática de los principales Iípidos de las membranas condiciona la organización estructural deéstos en forma de micela o bicapa (Fig. 20.1),en la cual los grupos polares se disponen hacia el exterior de ésta e interactúan con el medio acuoso a través de puentes de hidrógeno y de interacciones electrostáticas. Las cadenas apolares, a su vez, se dirigen hacia el interior, entreellas se establecen atracciones por uniones bidmfóbicas y por fuerzas de Van der Waals.

Fie. 20.1. Reuresentación esriaeial de un seemento de bieaiia liuídica. En negro. átomos de carbono;

En la Fig. 20.2 puede apreciarse la forma en que el colesterol se relaciona con los fosfolípidos; como se ha dicho, la bicapa, estructura fundamental de las membranas, es fluida; ello depende de su composición. La longitud de lacadena y el grado de insatu- ración de los ácidos grasos, -que constituyen los fosfátidos de glicerina y esfingolípidosinfluyen deformadeterminante en esta propiedad; de esta manera los ácidos grasos de cadena corta y los insaturados limitan el "empaquetaniiento" de las cadenas hidrófobas y por tanto contribuyen a la fluidez. La presencia de colesterol en la membrana eierce efectos sobre su fluidez. "

La bicapa lipídica es asimétrica, ya que la disposición de sus componentes difiere en cada una de las capas. La mayoría de las moléculas de fosfatidil serina y fosfatidil etanolamina se encuentran en la capa interna, en tanto que, en la externa predominan las defosfatidil colina y esfingomielina; el difosfatidil glicerol se encuentra sólo en la membrana interna de la mitocondria y en algunas membranas bacterianas. El inositol en el fosfatidilinositol, así como el 4,s-difosfoinositol fosfoglicérido (PIP,) forman parte también de la membrana plasmática y en el caso del PiP2es fuente de 2 segundos mensajeros.

Los plasmalógenos forman parte también de algunas membranas como el tejido nervioso y el corazón. Como veremos más adelante,algunos glúcidos se unen a Iípidos formando los glucolípidos.

El espesor de la bicapa lipídica mide aproximadamente entre 6 y 9 nm para la mayoría de lasmembranas; esta bicapase comporta como una barrera permeablepara las sustancias lipídicas, e impermeables a los iones y compuestos polares con la excepción del agua (Fig. 20.3).

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Wl -?"he ap apgmdns e1 ua o lo!lai -u! la ua uppe>!qn ns un% '( p ) seqqj!~ad o semsuuixa 6 (2 d q 'e) sa@Pa>u! a semsryu! las uapand seuequiaui m1 ap seu!aiold se1 'VOZ %

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Fig. 20.5. Disposición en la membrana plasmática de la gliroforina, proteína intrínseca de las glóbulos rojos humanos. (Tomado de Bioquímica. L. Stryer. Segunda edición, 1982).

Las proteínas periféricas se disponen en lasuperficie interna o externa de la bicapa y se unen, por interacciones débiles de tipo electrostático, a la cabeza polar de los Iípidos de la membrana, por lo cual son fácilmente separadas con el uso de soluciones salinas. Estas proteínas son solubles en solventes polares. Entre las proteínas periféri- cas hay algunas con actividad enzimática.

Las porciones de las proteínas de membrana que se incluyen en la bicapa lipídica poseen elevado contenido de aminoácidos apolares, con predominio de la estrnctura en hélice u ó de conformadón P; como fue estudiado en el capitulo 12, la estructura en hélice u de las proteínas minimiza el carácter hidrofnico.de1 enlace pepiídico.

Glúeidos de membrana

En todas las células eucariotas se encuentra una cantidad de glúcidos, formando partede las membranas, particularmente de la plasmáiica. Los glúudosse hallanunidos de forma covalente a Iípidos o proteínas para formar glicolípidos o glicoproteínas, respectivamente. La fracción glucídica constituye entre 2 y 10 %;desde el punto de vista estructural son oligosacáridos, que en su mayoríaestán unidos a proteínas y en menor cantidad a los Iípidos. Los oligosacáridos de las membranas están dispuestos hacia la cara no citoplasmática (Fig. 20.6), éstos cumplen las funciones siguientes:

1. Contribuyen a la orientación de las proteínas en la membrana. 2. Participan en la interacción entre membranas de células distintas. 3. Tienen una función fundamental en las propiedades inmunológicas

de las membranas.

Los azricares que se encuentran formando parte de estos glicolípidos y glicoproteínas son: glucosa, galactosa, manosa, fucosa, N acetil galactosamina y el ácido siálico. La asimetría se mantiene debido a que el paso espontáneo de moléculas de una capa a la otra es casi nulo.

Modelo del mosaico fluido

El modelo de membrana del mosaico fluido fue propuesto por Singer y Nicolson en 1972, éste es capaz de explicar numerosas propiedades físicas, químicas y biológicas

Fig. 20.6. Reprcsentacih de la capa lipidies externa de una rnemhrana plasrnátira Iiipotétiea. Les oligosaeáridos integrantes de los gangliósidos están constituidos por diversos monosacá- ridos indicadas con Ictras. ('romado de Moleeular Biulog? af thc crll. R. Albci-ts et al., 1983).

de las membranas; se acepta universalmente como la organización estructural más probable de los componentes de las membranas biológicas.

El modelo se propuso sobre la hase del estudio de la composición química y propiedades físicas de las membranas biológicas, así como de resultados experimentales en los cuales se comparó el comportamiento de membranas sintéticas preparada5 en el laboratorio, a partir de una mezcla de fosfolípidos y algunas proteínas, con el comportamiento de las memhranas naturales.

En la figura 20.7 puede apreciarse una representación esquemática del modelo. Se considera que las proteínas forman un mosaico dentro de la hicapa lipídica, que constituye la estructura básica; además, las proteinas experimentan movimientos laterales. En estemodelo puede observarse la disposición de los glúcidos en la cara no citoplasmática; las proteínas periféricas se localizan hacia ambos lados, y el conjunto adopta una estructura tridimensional compacta y flexible.

,N Bicapa lipídica

. '

Fig. 20.7. Modelo del mosaico fluida. (Tomado de Bioquímies. L. Strper. Segunda edición, 1982).

El grado de fluidez de una membrana influye en sus funciones, si aumenta su fluidez seincrementa su permeabilidad al agua y a otras moléculas e iones, en tanto

1. Los Iípidos y proteínas organizados en forma de mosaico. 2. Las membranas son estructuras fluidas donde los Lípidos y proteinas pueden efec-

tuar movimientos de traslación dentro de la misma capa. 3. A s h e t i a en la disposición de los Iípidos, las proteínas y especialmente las glúcidos.

Membrana plasmática

La membrana plasmática se organiza como una doble capa continua, delgada, de 4 a 5 nni de espesor. En algunas células, por fuera de la membrana, existe una cubierta celular que la cubre y protege. La membrana plasmática individualiza a la célula y permite que ésta se relxione con el medio; su desarrollo constituyó un evento cruiial en el proceso de evolucibn de la materia viva (capítulo 3).

La membrana plasinática está constituida deforma siniilar a la descrita para las membranas hinlúgicas, por lo cual aquí trataremos sólo las particularidades más relevantes.

En un niisiii~~ tipo de nieinbrana plasmáticase han podido aislar e identificar unas 100 proteínas diferentes, y teniendo en cuenta los distintos tipos de membranas plasmá- ticas estudiadas se Iia determinado la presencia de numerosas enzimas, algunas de e llas exhiben una Ion~alizaciún bistica especifica, como las disacaridasas -localizadas en las n~icrovellosidades dc la niucosa intestinal-, en tanto otras presentan una ubicación más universal -iVl'l'asa dependiente de Na' y K'.

Las proteínas transportadorai, la$ que forniancanales y los receptoresdemembrana tienen una especial relevancia, ya que desempeña una función vital en el intercambio de sustancia, energía e inti)rniaciún de la célula con su entorno (Fig. 20.8). Las proteína? de membrana pueden presentar adeniás funciún estructiiral,constituir antígenos o alguna otra funcibn especifica.

Ligando

l

Pro 1 l l ~ e c e i t o r de

teína Proteína Bomba membrana canales transpoitadora

Fig. 20.8. 'Tipos de proteínas de menihranas. Ohs6rvesc Wmu todas rllas son proteínac integrales.

La membrana plasmática del eritrocito (figura 20.9) ha sido muy estudiada dehido a la relativa facilidad de su aislamiento y purificación, contiene 52 90 de proteínas, 40 % de lípidos y 8 % de glúcidos en forma de oligosacáridos. La distribucibn de las proteínas en la bicapa es también asimétric-, las periféricaq queson más solubles se encuentran en la cara citoplasmática, las externas están más asociadas a los lípidos. Las glicoproteínas se disponen en la cara externa o lnminal. En el capítulo 63 el lector puede ampliar detalles al respecto.

Las proteínas transportadoras son proteínas integrales de membrana, tienen especificidad y se unen a la sustancia que se debe transportar. Los canales o poros son proteínas intrínsecas que crean un ambiente "acuoso" en su interior debido a la conformación adoptada por sus niveles terciarios y cuaternarios, lo que permite la difusión de sustancias en ambos sentidos a través de la muiihrana; las sustancias se mueven a favor del gradiente. Aunque estas proteínas canales muestran cierta especificidad, nose unen a lasustancia quese debe trausportar y laselectividad parece más biénestar relacionada al tamaíio y carga eléctrica de la sustancia transportada. El flujo a través del canal secontrola por la regulación de su apertura y cierre.

Las proteínas receptoras son proteínas transmembrauales cuya funciún especializada es constituir un eslabún fundamental en la comunicaciún intercelnlar,

Banda 111 '1; -. -gH~exiracelular Espacio -. - l l. ~. , . . Bicapa - lipídica
... . r, *Y . i .< .., < <

Citoplasma

HOOC

Fig. 20.9. Disposiri6n de la banda 111 y de la glicoforina (GP) en la mcnilirn- na del critracito.

NHZ (Tomado de Moleeular Bh>logy of thc cell. R. Alhcrts el al., 1983).

ellas captan alguna? señales quíniicas del exterior y trasmiten una información Iiacia el interior de la célula. No todos los receptores son proteinas de membrana, pues en algunoscasosla proteína receptora se encuentra localizadaen el interior de la célula y no forma parfe de la nienilnma plasniática. Se hace referencia súlo a los receptores de membrana. Estos de acuerdo con sus respuestas ante las señales pueden:

1. Regular el paso de determinadas sustancias o iones a través de canales. 2. Modificar la actividad de algunas enzimas. 3. Provocar cambios de conformación y fiinción de determinadas proteinas. 4. Facilitar procesos de endocitosis. 5. Inducir la transcripciún de algún segmento del ADN.

La estructura de los receptores es muy variada, pueden estar formados por una cadena polipeptídica o cnnstituir oligómerus más o menos complejos. En muchos casos se pueden distinguir 3 dominios: uno extracelular, glicosilado, relacionado cnn el reconocimiento molerular de la señal quíniica; otro que atraviesa la membrana, y un tercero, intracclular relacionado con la trasinisii,n de la información (Fig. 20.10).

Bicapa lipídica

Fk. 20.10. Estriirtiira dc un receptor de nirriitiran~. (a) I>ifcrentes dominios: DE dominio cxtraiclular Por donde Sr unic el lizande, 1Yl' diiniinio transineniliranal y DC dominio citoplasmático por dondc se expresa o lrasmitc la respuesla a la scñel. (1,) Al unirse el ligando sc produce una transi<información que provoca la aclivaciím dcl centro catalítico inactivo (CCl) y se conviene en centro cairlílico activo (CCA), lo que pcrmile que ocurra la reacción cniiniútica.

Fig. 20.11. Mierofotngrafia electr6nicii dc la superficie de un linfocito. La lineión específica permite ver la cubierta celular o gliioeálix. (Tomado de Mulerular Biology of tlie ccll. B. Alherts el al., 1983).

El reconocimiento y unión de la señal al dominio externo de la proteína receptora provoca un cambio conformacional en ésta, el que se trasmite al dominio intracelular y desencadena el tipo de respuesta correspondiente. En el capítulo 59, en ocasión del estudio de la comunicación celular, el lector podrá ampliar este aspecto.

Las membranas plasmátieas de células animales poseen colesterol en cantidades elevadas, hasta una relación de 1:l con los fosfolípidos. De igual forma el contenido de oligosacáridos es relativamente elevado, al compararlo con el de otro tipo de membranas como se puede comprobar en la tabla 20.1.

nbla 20.1. Con~posiCiÓn aproximada de IIpidos en distintas membranas celulares

Tipo de lipido MFH MPE MIE MlT RE

Colaterol 17 23 22 3 6

Glicolipidos 7 3 28 hz hz

1.0s \dores se dan en por cientos del peso total de lipidos. Leyendas: MPH: membrana plasmátiea hepática. MPE: membrana plasmática del eritrocito. MIE: niieliim 5117: mitocandria. RE: rrtiriilo cn<loplásniiro. trr: trazas.

Los glúcidos presentes en la membrana parecen tener importancia en las interacciones de las células, específicamente en el reconocimiento entre ellas.

A la zona externa de la membrana plasmática, abundante en glúcidos, se le conoce con el nombre de glicocalix (Fig. 20.11). Con frecuencia se adsorben glicoproteínas y proteoglicanos, secretados por la propia célula, a esta cara externa de la membrana plasmática.

La cubierta celular está formada por polisacáridos. En las células vegetales la pared celular está constituida por celulosa y pectina. En algunas célnlas animales está presente una capa de heteropolisacárido que rodea a la membrana y forma la cubierta externa; ésta, aunque no tiene función relacionadacon la permeabilidad de lamembrana, puede sin embargo, actuar como filtro, por ejemplo, el ácido hialurónico presente en el tejido conectivo puede, en cierta medida, modificar la velocidad de difusión a través de la membrana.

Funcione8 de la membrana piasm4tica

Las membranas plasmáticas presentan un conjunto de funciones como:

1. Delimitan la célula y la interrelacionan con otras. 2. Presentan permeabilidad selectiva, permiten el paso libre de algunas sustancias e

impiden el de otras según el tamaño y solubilidad de éstas. 3. Participan en los mecanismos mediante los cuales la célula secreta y expulsa

sustancias al exterior. 4. Contribuyen al mantenimiento del balance hidromiueral de las células. 5. Trasmiten ondas excitatorias a las células vecinasen respuesta de algunas señales. 6. Reciben señales del medio a través de las proteínas receptoras de membranas. 7. Participan en el transporte selectivo de sustancias entre la célula y el medio. 8. Incorporan grandes moléculas mediante el mecanismo de fagocitosis. 9. Confieren especificidad antigénica a la célula.

Transporte de sustancias a través de las membranas

Por su naturaleza apolar la bicapa lipídica de la membrana plasmática actúa como barrera impermeable para los iones y las moléculas polares con la excepción del agua. El transporte de moléculas pequeñas a través de la bicapa lipídica se realiza mediante proteínas transmembranales especializadas; estas moléculas transportadoras son muy específicas y cada una acepta una determinada molécula o un grupo de ellas muy relacionadas. El paso de moléculasmayores, como las macromoléculas, a través de las membranas se produce por los mecanismos de endo y exocitosis, que serán estudiados en el capítulo 21. Algunas moléculas apolares sí son capaces de atravesar libremente la bicapa lipídica, ello depende de su solubilidad y tamaño. (Fig. 20.12).

Existen mecanismos diferentes relacionados con el transporte de sustancias a través de las membranas: en algunos casos el paso se produce sin la intervención de transportador alguno ( difusión simple y ósmosis ), en otros, el paso ocurre con la participación de alguna proteína transportadora (transporte pasivo y activo ) o que delimita un espacio por donde pasa la sustancia ( poros o canales ); y en otra$ ocasiones el paso ocurre por movimientos de la membrana que incluye a la sustancia que se debe transportar (endocitosis o exocitosis).

En el primer caso se trata de moléculas para las cuales la membrana plasmática es permeable, lo que le permite difundir, esto dependerá únicamente de la diferencia de concentración de dicho soluto fuera y dentro de la célula, o sea, de su gradiente de concentración. La velocidad de difusión en este caso es directamente proporcional a la diferencia de concentración del soluto.

Este tipo de transporte se realiza a favor del gradiente y no requiere de energía ni de transportador, aunque en algunos casos, participan al y n a s proteínas que forman canales y permiten el paso de determinadas sustancias mediante el mecanismo de

- F; apolares

Moléculas H20

Moléculas glucosa polares mayores sacarosaE&

Bicapa lipídica

Fig. 20.12. Pcrrnealiilidatl selcitiv" de la hieapa lipídiea.

1 1 canal

Bicapa

Fig. 20.13. Mecanismo de difusi6n simple. Éste ocurre a ti-a& dc la bicapa lipídira ti cn alguna caros, a tra- vés dc proteíiias que funcionan cm10 canales. (Tomado de Mi>lecula~. Biolegy of thc cell. 1%. Alberts et al.. 19113).

Fig. 20.14. s) Des disi>liieiirnes dc ceiicen- traciancs d i f ~ r ~ n t c s dcl niisnio soluto, sepanidas por una " I C ~ I -

hrana simipcrnieal>le qw pcrmilf cl pasa dcl disolvente pcro ni, del snlutii. E l disulventc pasara del ienipartinicnlii de menor eoiircri- tracióii IC,) al de i i i q i i i . cnnien- trariiin IC,) hasta que se igualen las conccntrecion~s en ambos la- dui, h) ta eoluiiinn del líquido sube en C. y hoja en C,. A la presión que se ilrlw ejercrr en C' para evitar el ascenso dc la rolumma dc liquido sc denomina preiiiin osniótira.

difusión simple (Fig. 20.13). Al igualarse las concentraciones de la sustancia transportada, fuera y dentro de la célula el flujo neto se hace cero.

La ósmosis es un caso particular de la difusión simple, pues lo que atraviesa la membrana es el líquido. Si en ambos lados de una membrana semipermeable existen 2 soluciones con concentraciones diferentes de un soluto que no puede atravesarla, se produce el paso del solvente acuoso desde el ladodonde seencuentra la solución más diluida hacia la más concentrada, hasta que ambas concentraciones se igualen. Se conoce como presión osmótica a la fuena que hay que ejercer en el lado de la solución máq concentrada ( C, en la figura 20.14) para impedir el paso del agua desde el lado de la solución más diluida (C, en la figura).

Membrana semipermeable

Transporte mediante pmteúias

Poros o canales

El transporte con la participación de proteúia puede ser por poros o canales y en este caso el mecanismo es similar alde difusiónsimple, comose ha señalado. Los canales y los poros son proteínas transniembranales que delimitan espacios a través de los cuales se realiza el paso de algunas sustancias; los poros son menos selectivos y dejan espacios mayores, un ejemplo lo constiiuyen los p o m de la membrana nuclear. Los canales poseen mayor selectividad en cuanto a la sustancia que los atraviesa, esta selectividad parece estar relacionadacon su tamaño y carga, pues no presentan sitios de unión paraellas. A diferencia de los poros, que siempre se mantienen abiertos, la apertura y cierre de los canales están regulados por determinados ligandos u otras señales, un ejemplo 10 constituyen los canales del Na'.

En el transporte pasivo participan proteínas transmembranales conocidas como permeasas o "translocasas" ,este tipo de transporte se realiza también a favor del gradiente y se lellama pasivo porque no requiere deenergía.

Las proteínas transportadoras reconocen a la o las sustancias específicas transportadas por ellas; tienen un wmportamiento similara las enzimas en cuanto a su capacidad para saturarse, así como para experimentar inhibición de tipo competitiva. La diferencia fundamental con las enzimas es que no transforman su ligando.

Cuando la proteína transportadora es capaz de transportar sólo una molécula, se dice que el proceso es uniporte; cuando el paso de una determinada sustancia depende del trasporte simultáneo de otra, el proceso se denomina cotransporte. Éste se designa como simporte si el paso de ambas sustancias se produce en el mismo sentido, en caso contrario se conoce como antiporte.

En la figura 20.15 se observa la forma de actuar de una proteína transportadora en el caso de uniporte, ésta presenta 2 conformaciones; también se aprecia como el paso de una a otra resulta esencial para la realización de su función. En la figura 20.16 se puede apreciar la diferencia que existe en el comportamiento en la velocidad de transporte en el caso de la difusión simple y la facilitada (transporte pasivo).

Bicapa lipídica

n Gradiente de concentración

, Proteína

transportadora

.....--a!: 3 _--- -

.e ,,-- ' /, Difusión facilitada

/ i

Km Concentración de la molécula transportada

Las proteínas que intervienen en el transporte activo se conocen con el nombre de bombas y son proteínas transmembranales. La concentración de iones y otros solutos en el interior y exterior de las células es diferente (tabla 20.2); esta diferencia es esencial en el mantenimiento de un potencial energético,debido a la existencia de un

Fig. 20.35. Mecanismo de transporte pasivo. El cirmhio de conformacibn resulta esencial para la función de la proteína transportadora. (Tomado de Molecular Uiology of the cdl. U. Alberts et al., 1983).

Fig. 20.16. Cinética del transporte en el caso de la difusión simple p la difusión facilitada. Obsérvese que el comportamiento cinético cn el segun-

, da caso resulta similar al de las enzimas.

componentes cePulares y anetica molecdar 383

gradiente deconcentración y a la diferencia de cargas eléctricas, lo que condiciona el potencial electroquímico, este último está ligado a procesos fundamentales como la generación del impulso nervioso, la contracción muscular y la síntesis de ATP. El mantenimiento de la concentración iónica diferente dentro y fuera de la célula se garantiza por la existencia del transporte activo.

Tabla20.2 Concentración iónica (ml3q.C') dentro y fuera dela rnenibrana celular, en mamíferas

Componente Concentración intracelular Concentración extracelular

Cations

Nn*

K*

Mg2* ea:* H+

Aniones

L1-

Nota: Tanihién mnstituycn animes numerosas los ácidos nucleicos y otras sustancias

El transporte activo se realiza en contra del gradiente de concentración, por lo cual requiere de energía, un ejemplo típico y muy estudiado lo constituye la enzima adenosín hifcsfatasa dependiente de Na' y K* (ATPasa N¿*-Kidependiente), esta enzima constituye una bombaque utilizala energía de hidrólisis del ATPpara extraer 3 iones Na'hacia el espacio extracelular e incorporar 2 iones K' hacia el interior de la misma célula (Fig. 20.17). Puede comprobarse cómo se le une un grupo fosfato del ATP, lo cual condiciona el cambio conformacional que le permite realizar so función.

La bomba de Na+-K'contribuye a regular el volumen celular, ya que coopera para mantener la concentración de solutos dentro y fuera de la célula donde las macromoléculas y otros compuestos cumplen funciones importantes.

2

Fig. 20.17. La honiha de Na+-K* reqiiierr energía en furnia de ATP para su acción. La proteína se fosforila y experimenta una traaisri,i>forniaeión, la cual resulta necesaria para realizar su función. Al deefusfurilarse la I>ainl>ii recupera su conformaeiún inicial. (Tomado de Maleeular Bielogy of the r d . R. i\lbcrts et al., 1983).

384

Potencial de membrana en reposo

La diferencia del contenido iónico dentro y fuera de las céliilas condiciona una diferencia de potencial eléctrico, donde el interior de la célula es más negativo que el exterior; esta diferenciase debe en gran medida al funciouamiento de las bombas,en especial a la ATPasa Na--K' dependiente, ya que provoca en so acción un deshalance instantáneo de cargas por la salidade 3 iones de sodio y la entrada de 2 de potasio. A esta diferencia contribuye, adeinás, la presencia de proteínas aniúnicas de forma predominante en el interior de la célula.

Ladiferencia de potencial entre el exterior y el interior de lai ctlulas oscilade -20 a -200 mv y el valor en muchos tejidos, como el riervioso, es de -70 mv.

Si por alguna causa, como pudiera ser la entrada de iones de sodio al interior de la célula, la diferencia de potencial se hace menor, se produciría una despolarizaciúii. Por el contrario,si la entrada de ionescloruro (CI-) ola salida de K+ provoca unincremento de la diferencia de potencial con respecto al wlor de reposo, en ese caso se produce una hiperpolarización. Estos cambios de los valores de potencial en las células excitables están relacioiiados con la trasniisión del impulso nervioso (rapitulo 64) y otros procesos fisiológicos.

Diferenciación de la membrana plasmátiea

La membrana plasinática de algunas células experimentan diferenciaciones relacionadas con su especialización, ello permite que cumplan mejor su función; de esia manera se puede encontrar la structura en forma de reborde "en cepi1lo"presente en los túbulos renales; o las diferenciaciones que hacen posible la unión o adherencia con otras células como los desmosomas o nexus, o la disposición característica de la membrana plasmática de las células de la mucosa intestinal; en este último caso se compmeba la presencia de abundantes proyecciones finas del citoplasma cubiertas p>r la membrana plasmática denominadas microvellosidad6 (Fig. 22.18), que aumentan

viy. 21J.18. En la niiri-ofotoprafia puede ohserrarse el rihorde e n cepillo d e la inuiess intest inal . l.% m i r r o i e l l o ~ i d . d e s i n e r r r n r n t m iiotahleiiicnle la superficie de ah- c o r e i h ('l'omado de Histalogia. D. Frrrer. Cuarta edición, 19751.

considerablemente la superficie de absorción efectiva, aspecto fundamental en la función de dichas células.

Resumen

Las membranas biol6giras son organizaaones supramacromoleeulares flexibles y fluidas, formadas fundamentalmente por Iípidos y proteínas en proporciones variables según el tipo de célula y la loeaüzaaón intracelular de la membrana

Además de üpidos y proteínas, las membranas animales suelen tener determinados tipos de glúudos en su composición, los üpidos presentes en estas estructuras se caracterizan por ser anfiphtieos y se organizan formando bicapas que conforman la estructura básica de las membranas.

Las proteínas pueden ser exúhecas o intrínsecas de acuerdo con su ubicación en las superñcies o en el interior de la bicapa, respectivamente. Las intrínsecas son más abundantes y entre ellas se encuentran numerosas enzimas, las proteínas transportadoras y los receptores de membranas.

Los gbícidos se encuenban unidos a proteínas o Iípidos formando glicoproteínas o glicolípidos, se loealizan hacia la cara externa o luminal de las membranas y contribuyen a la orientación de las proteínas.

La membrana plasm6tica está formada por una doble capa continua y delgada, que delimita a la célula y permite que ésta se relacione con el medio; por fuera de la membrana plasmhtica existe una cubierta celular que la cubre y protege. Las funciones de esta membrana son variadas, pero el paso selectivo de sustancias es una de las funaones más importantes.

La bicapa Lipídica resulta permeable a las moléculas apolares, e impermeable a los iones y moléculas polares con la excepaón del agua. La incorporación de maeromoléculas a través de las membranas se produce por el mecanismo de endocitosis que ser4 objeto de estudio en el capitulo 21.

Los mecanismos de transporte de sustancia a través de la membrana son de 3 tipos: difusión simple, transporte pasivo y transporte activo. En el primer caso no se requiere de transportador ni de energía y el paso del soluto se realiza a favor del gradiente. El transporte pasivo se realiza tambihn a favor del gradiente de concen- tración, pero se requiere la presencia de una proteína transportadora aunque no se precisa de energía. El transporte activo requiere la participación de algunas pro- t e h conocidas como bombas, que funcionan con consumo de energía; el paso de sustancia en este caso se reaiiza en contra del gradiente de concentración, un ejemplo típico de esíe tipo de transportador lo constituye la ATPasa Na'-K+ dependiente.

Las membranas plasm5ticas experimentan diferenciaciones relacionadas con la especialización celular, que le permiten a la célula realizar de manera más eficiente su función.

Ejercicios

1. ;Por qué las menibranas biológicas constihiyen estruciuras supraii~acromoleculares? 2. Enumere los componentes fundan~eiitales de las membranas biológicas y explique

las proporciones en que ellos sc encuentran. 3. ;Cuál es la propiedad común que tienen los lípidos presentes en las membranas

biológicas y diga por qué esta propiedad es fundamental para constituir la estructura básica de las membrana?

4. Enumere los distintos tipos de Iípidos y explique cómo se disponen en las membranas.

5. Cite losdistintos tipos de proteínas presentes en las membranas biológicas y explique las diferencias entre ellas.

6. Mencione las distintas funciones que cumplen las proteínas en la membrana plasmática.

7. Explique la importancia del carácter informacional en la realización de las funciones de las proteínas de membrana.

8. Expliquela disposición de los glúcidos en la membrana plasmática. 9. Cite las funcionesde la membrana plasmática.

10. Establezca una comparación entre la difusión simple y el transporte pasivo en relación con requerimientos energéticos, necesidad de proteína transportadora y dirección del flujo de sustancia.

11. Establezca una comparación entre el transporte activo y pasivo. Refiérase a los 3 aspectos indicados en el ejercicio numero 10.

Entre las caracterktim que distinguen a una célula eucariota típica, junto con la presencia de un núcleo bien delimitado, se encuentra el hecho de que estas células poseen, además de la membrana plasmálica, un complejo sistema de membranas internas denominados sistema de endomembranas

Este complejo sistema parece ser imprescindible para el mantenimiento de la actividad vital de las células que tienen un volumen relativamente grande. El sistema de endomembranas está ausente en las pequeñas células procanatas.

La extensión del sistema de endomembranas se deduce cuando se conoce que, en las células eucariotas típicas, estas endomembranas representan del 95 al 98 % de todaslas membranas celulares,de modo que la membrana plasmática que rodea a la célula sólo es una pequeña fracción del total de ellas.

Las endomembranas no son homogéneas, presentan un definido grado de diferenciación y especialización que conduce a la formación de organelos subcelulares distinguiblesdesde los puntos devista estmctural y funcional, por lo que resulta muy válido estudiar estos componentes celulares bajo la denominación de organelos membranosos internos (Fig.21.1).

Tipos de organelos membranm internos

Los organelos membranosos internos de las células eucariotas son: retículo endoplasmático, aparato de Golgi, lisosomas, peroxisomas, mitocondrias, membrana nucleary cloroplastos.

El retículo endoplasmático constituye la mayor fracción del sistema de endomembranas, representa del 50 al 70 % de las membranas internas, posee 2 variedades: el retículo endoplasmático liso y el retículo endoplasmático rugoso.

El aparato de Golgi representa entre 5 y 10 % del total de las endomembranas, mientras que los lisosomas y peroxisomas representan menos del 1 %.

Estos 4 organelos membranosos se estudian detalladamente en este capítulo, las mitocondrias y la membrana nuclear se tratarán en otros capítulos las primeras se estudiarán en la respiración celular (sección VI) y la segunda cuando se estudie el núcleo celular (capítulo 23).

Los cloroplastos son organelos membranosos típicos de las células vegetales (capitulo 45).

Fig. 21.1. Imagen de una célula eucariontf vista por medio del rniiroarapio electrónico. Ohsérvesc la prcsen- ria en el interior celular de numerosas estruettiras de aspecto mernbranoao.

(Tomado de Priniipes de Biochimie. AL. Lehninger, 1985).

Retículo endoplasmáti rugoso

Lisosoma

Peroxisoma

Aparato de Golgi

Nucléolo

Mitocoodrias

Núcleo


Estructura general de las endomembranas

Si bien la composición exacta de cada una de las membranas que integran los organelos membranosos intracelulares difiere de uno a otro, todos ellos presentan una estructura general común que responde al modelo de mosaico fluido. Esto significa que las membranas intracelulares presentan una doble capa de lípidos donde se encuentran diferentes proteínas; estos constituyentes se mantienen unidos mediante interacciones débiles. Las diferencias de composición se refieren al tipo y proporción de los diferentes lípidos de la bicapa y a las proteínas que están asociadas.

Los organelos membranosos internos de la célula se distinguen además por la forma de organizarse en el espacio intracelular.

Algunosorganelos membranosos,como las mitocondrias,presentanen su estructnra una doble membrana pero la mayoría posee una sola. Todas estas diferencias de los organelos membranosos se relacionan con la función que desempeñan en el metahlismo celular.

Funciones generaies de los organelos membranosos

Cada organelo membranoso realiza funciones propias, que en conjunto posibilitan funciones como:

1. Compartimentación. El sistema de endomembranas divide el espacio celular en compartimientos, a su vez mantiene separadas diferentes sustancias que participan en el metabolismo, como las enzimas, los sustratos y los cofactores; esto hace que cada organelo membranoso constituya un reducto metabólico casi independiente del resto de la célula, lo que posibilita que en una célula puedan ocurrir, de manera

simultánea, procesos metabólicos incompatibles de producirse en un mismo comparümiento.

2. Establecimiento de gradientes de concentración. El carácter semipermeable de las membranas biológicas posibilita que a través de ellas se establezcan gradientes de concentración de diferentes sustancias, estos gradientes de concentración representan determinada energía potencial que puede manifestarse durante varias funciones celulares.

3. Disponibilidad de áreas de superficie. Muchas funciones celulares sólo pueden realizarse en las membranas o a través de ellas. Los organelos membranosos pro- veen extensas superficies donde se producen diferentes reacciones metabólicas, y a través deestas áreasseUeva a cabo el intercambio de sustancia entre compartimientos.

4. Incremento de las velocidades de los procesos metabólicos. En relación con los 2 aspectos anteriores se encuentra la función general de las endomembranas de acelerar la velocidad con que pueden ocurrir, en el interior de las células, determinados procesos dependientes de la difusión de sustancias. La compartimentación reduce los espacios intracelulares, donde los sustratos deben difundir para interaccionar con las enzimas que los transforman; por otra parte, muchos sustratos difunden en las 2 dimensiones determinadas por las membranas, lo cual incrementa demanera extraordinaria la velocidad para tener acceso a los sitios activos de enzimas localizadas en la propia membrana.

5. Generación de nuevas membranas. Hasta donde se conoce, las membranas biológi- cas sólo se forman por crecimiento de membranas preexistentes. El sistema de endomembranas provee un soporte que posibilita el crecimiento de las propias membranas, lo cual resulta imprescindible para el ciecimiento y la multiplicación celulares.

Relaciones entre los organelos membranosos

La diferenciación de los organelos membranosos y su delin~itación de compartimentos celulares separados, no implican que los organelos son totalmente independientes. Los organelos membranosos establecen importantes relaciones estructurales y funcionales entre sí; éstas son un área de intensa investigación en la actualidad.

El retículo endoplasmático es el organelo membranoso más abundante en la mayoría de las células eucariotm, gran parte del interior celular se encuentra ocupado por el conjunto de membranas que componen este organelo.

En las secciones celulares preparadas para obtener imágenes de microscopia electrónica, el retículo endoplasmático aparece como un conjunto de espacios muy aplanados rodeados por una membrana; se considera que este organelo es un enorme saco membranoso único, muy replegado y comprimido, conectado también por una serie de finos tubos (fig. 21.2).

El espacio encerrado dentro del retículo endoplasmático constituye un compartimento intracelular independiente y suele denominarse lumen o espacio cisternal. La separación entre las membranas del retículo endoplasmático es de 20 a 30 nm, éste también presenta continuidad con la membrana nuclear externa Y en él se distinguen 2 porciones diferentes, tanto desde los puntos de vista estructural como funcional (fig. 21.3).

El retículo endoplasmático rugoso se caracteriza por presentar gran cantidad de nbosomas unidos a la cara externa desus membranas, que le da el aspecto que origina

Fig. 21.2. Esquema del retículo endoplasmático. Nótese que se distinguen porciones con aspecto de sacos aplanadas, micntras en otras nonás existen tubos inembranosos finos qrre iirterco- neitan los anteriores. (Tomado de Moleeular Biology of the cell. B. Alberts et al., 198.1).

RE rugoso RE liso

IFig. 21.3. Imagen al niicn,sropiii rleelróni- co dc una seceiijn de célula. donde se obserraii porciones del retí- culo endoplasniático: reticulo endoplasmYieo liso (RE lisni y re- tículo endoplasniátiw rugoso (RE rugoso). Puede iipreciarsc el asper- to diferente de anihas porciones del retículu. (Tomado de Molerular Biulogy of thc ccll. B. Alherts et al., 1983).

Fig. 21.4. Relículo endopla~máticu rugoso (RE rugosa) en un corte de célula observado al microscopio electró- nico. Las membranas del retículo endoplasmático rugoso forman cisternas con aspecto de sacos ma) aplanados y apiladus. (Tomado de Molecula~. Biology uf the cell. B. Alberts et al., 1983).

su denominación; su organización es en forma de sacos aplanados y apilados llamados cisternas (fig. 21.4).

El retículo endoplasmático rugoso está presente en todas las células nucleadas, pero es mucho más abundante en células secretoras que sintetizan proteínas las que luego son exportadas al exterior de la célula.

El retículo endoplasmáticolisoes continuación del mgoso y representa porciones del retículo endoplasmático desprovistas de ribosomas; se organiza en forma de finos tubos interconectados con las cisternas del retículo endoplasmático rugoso; además es muy abundante en las células que sintetizan Iípidos de forma activa, aunque en general representa sólo una pequeña fracción del retículo endoplasmático (Fig. 21.3).

El término "microsoma", que aparece con frecuencia en textos de bioqnímica, se utiliza para denominar pequeñas vesículas que se originan por fragmentación y sellaje del retículo endoplasmático, al someter las células bajo técnicas de homogeneización. Según la porción del retículo endoplasmático donde se originan, se formarán microsomas rugosos o lisos que pueden ser separados mediante centrifugación; aunque estos microsomas no conservan toda la estructura del retículo endoplasmático, han resultado muy útiles en el estudio de algunas características de este organelo membranoso.

La función del retículo endoplasmático rugoso es fundamentalmente la síntesis de proteinas -en especial glicoproteíuas. Las prnteinas se sintetizan en los ribosomas que tapizan la superficie externa del retículo endoplasmático rugoso; hoy se sabe que estos ribosomas unidos a este retículo son idénticos a los que se encuentran libres en la célula.

En la actualidad seconsidera qnela mayoría o todas las proteínas sintetizada en el retículo endoplasmático rugoso comienzan su síntesis en los ribosomas libres pero, una vez formado el péptido señal (capítulo 46), una "partícula reconocedora de señal" se unea éstee impide la continuación de la síntesis. Esta partícula interviene también en el reconocimiento de receptores específicos en la superficie externa del retículo endoplasmático rugoso. Una vez unido el ribosoma a la membrana, la unión se estahiliza y la síntesis proteínica continúa.

Esta síntesis de proteínas se produce de modo que la cadena polipeptídica en crecimiento surge hacia el espacio del lumen o bien queda incorporada a la membrana (incorporación cotraduccional) (Fig. 21.5).

Además del proceso biosintético descrito,se sabe que algunas proteínas sintetizadas en los ribosomas libres pueden ser incorporadas a las membranas del retículo endoplasmático rugoso y a otros organelos membranosos (incorporación postraduccional); para estos casos hay evidencias muy claras de que existen secuencias señales específicas y de que, al menos en algunos de ellos, el proceso requiere el consumo de energía.

Se plantea que posiblemente todas las proteínas sintetizadas en el retículo endoplasmático rugoso experimentan un proceso de glicosilación; no existe acuerdo de que este proceso de glicosilación se inicie en el retículo endoplasmático mgoso o sea privativo del aparato de Golgi.

Se ha postulado que la glicosilación de las proteínas sintetizadas en el retículo endoplasmático rugoso puede ocurrir simultánea al crecimiento de la cadena poli-

Eliminación del péptido señal Cadena poli&ptidica terminada con péptido señal eliminado

Fig. 21.5. Síntesis de proteínas en el retícu- lo endoplacmático nigoso. La sin- tesiseomienzaen ribosomas libres, pero una vez formado el péptido señal el complejo se une a la superficie externa del retículo endoplasmático, y la unión se estabiliza por proteínas específicas, postcriormcnte la síntesis de pro- teínas continúa. (Tomado de Molecular Biology of the rcll. B. Alberts et al., 19113).

Componentes celulares y Oui&ica mkcular 393

procesamiento de glicosilaciones -sobre todo en residuos de serina y treonina-, modificación de los oligosacáridos unidos a radicales de asparagina, proteólisis parcial, sulfatación y adición de ácidos grasos. Todos estos cambios son cataii7ados por enzimas localizadas en el sistema de cisternas del Golgi.

Las biomoléculas que maduran en el aparato de Golgi emergen a través de su región trans -aunque también de algunas cisternas intermedia$- en forma de vesículas que siguen diferentes destinos dentro de la célula (fig. 21.7).

.. Membrana plasmática basal

El aparato de Golgi tiene uiia participación destacada en la preparacibn y concentración de proteínas que son secretadas por la célula; de hecho el aparato de Golgi está muy desarrollado en las células que realizan esta función secretora.

Los productos de secreción uiia vez maduros y concentrados seseparan del aparato de Golgi en forma de yesictila\. donde ruele ocurrir una concentración ulterior. Las vesículas de secrecibii se adoiaii a la iiirinhrana plasmática y se fusionan con ésta y vierten su contenido al exterior de la celula, en un proceso denominado exocitosis, que se produce ante estímulos específicos.

Los lisosomas son yesículas 'meinbranosas de tamaño y forma diversos, cuya heterogeneidad obedece a las distintas etapas evolutivas de su ciclo funcional; constituyen orgaiielos que están implicados en la degradación de diferentes biomoiéculas, por lo cual se les compara con un aparato digestivo intracelular. Esta

Fig. 21.7. I'roceso dc maduración de biumoll iulas en el aparato de Golgi. Las hiomelbcuias ingresan al aparato de Golgi por su región iis y se van trasladando hacia la región trans, en c u y trinsita ru- frcn modifieaeionrs de distinto tipo. Las Ihiamoléeulas maduras emergen en forma de vesículas que siguen diferentes destinos en la célula. (Tomado de Molecular Biologs of the ecll. B. Alherts et al., 1983).

-

Componentes celulares y Genética molec~phr 395

Fig. 21.8. Aspecto de los lisosomas primarios y secundarios en una imagen de microseopia electrónica. Lisosoma primario (LP) y lisosoma secundario (LS). (Tomado de Molccular Biologv of the eell. B. Alberts et al., 1983).

función típica de los lisosomas se realiza gracias a las enzimas hidrolítieas que suman varias decenas de diferentes hidrolasas, capaces de actuar sobre los distintos sustratos.

Las enzimas lisosomales se sintetizan en el retículo endoplasmático, de donde pasan al aparato de Golgi. Las enzimas lisosomales se caracterizan por ser glicoproteinas y poseen un pH óptimo en la región ácida. El lisosoma, como organelo independiente, se origina por evaginaciones del aparato de Golgi en forma de pequeñas vesículas de 0 5 pm de diámetro, que se denominan lisosomasprimarios (fig. 21.8).

La membrana de los lisosomas posee una bomba de protones (H') dependiente de ATP, que mantiene el interior de este organelo en un valor de pH cercano a 5,0, en correspondenciacon el valor ópthode pH para la acción de las hidrofasas que contiene. Las caraeterísücw de permeabilidad de esta membrana son tales que, mienhas mantienen separadas sus potentes hidrolasas del resto de la célula, permiten la salida de los productos de degradación de las biomoléculas que son digeridas.

Los mecanismos, mediante los cuales las enzimas lisosomales son dirigidas hacia la formación de este organelo, no están del todo aclarados, pero se les ha atribuido un elevado significado a la presencia en las enzimas lisosomales de un oligosacárido que contiene manos 6 fosfato,lo cual se considera un marcador específico de estas enzimas y que pudiera participar en interacciones con receptores vinculados a su transporte intracelular.

Los üsosomas participan en el recambio normal de los componentes celulares y en la digestión de materiales provenientes del exterior celular; también intervienen en la remodelación de tejidos durante la embriogénesis y el desarrollo, e incluso en mecanismos emergentes de supervivencia celular ante un inadecuado suministro de nuhientes.

En su funcionamiento los lisosomas primarios dan origen a diversos tipos de lisosomas secundarios de variada morfología, cuya nomenclatura diverge de un autor a otro. Resulta de interés referirse a 2 tipos de lisosomas secundarios, ya que sus denominaciones se basan en el origen del material en proceso de digestión localizado en su interior, los autofagosomas (lisosoma secundario autofágico) y los heterofagosomas(lisosoma secundario heterofágico).

Los heterofagosomas son vesículas digestivas que se forman por la fusión de lisosomas primarios con vesículas heterofágicas, constituidas por invaginaciones de la membrana plasmática que incluyen en su interior material proveniente del exterior celular (fagocitocis y pinocitocis).

La fagocitocis y la pinocitocis son 2 variantes de un proceso general denominado endocitocis; como su nombre indica, la endocitocis consiste en la incorporación al interior celular de material proveniente del exterior. En el caso de la fagocitocis el material incorporado es relativamente voluminoso (virus, bacterias, fragmentos de otras células y complejos supramacromoleculares), mientras que la pinocitd se refiere a la incorporación de moléculas o pequeñas porciones del medio extracelular.

El mecanismo general de la endocitocis consiste en la invaginación de la membrana plasmática, con formación de una vesícula donde queda incluido el material endocitado; por tanto, la membrana que rodea este material tiene su origen en la membrana plasmática. Al menos, en algunos casos el mecanismo de endocitocis se desencadena por la unión del material que será endocitado en los receptores específicos localizados en la propia membrana plasmática.

Los autofagosomas se forman por la fusión de lisosomas primarios con vesículas autofágicas, que contienen en su interior material procedente de la propia célula. El origen y formación de las vesículas autofágicas se desconoce. En la figura 21.9 se representan estos procesos de autofagia y beterofagia. Al lisosoma secundario que contiene en su interior material que noes digerible se te denomina cuerpo residual.

Se ha descrito un numeroso grupo de enfermedades hereditarias debidas a deficiencias de algunas de las enzimas lisosomales; estas enfermedades de "ates0ramiento"con frecuencia afectan el normal desuroUo del sistema nervioso central y de otros órganos. Es común observar en células de pacientes con estas afecciones un gran número de lisosomas distendidos y "abarrotados", con el sustrato no digerido de la enzima que está en déficit (fig. 21.10).


Fagocitosis

Fig. 21.9. Esquema representativo de los evenloa que ocurren durante la autofagia (a) y durante la Iieterofagia (b).Lisosuma primario (LP). Autafagosoma y hcternfago- sonis. En ambas casos, una vez englobado en una vesícula el material a digerir, sc produce la fu- sión ron lisosomas primarios y se inicia la degradación de las biomo- Iéculas secuestradas. (Tomado de Maleeular Biolugy of thc iell. B. Alberts el al., 1983).

Los lisosomas también están implicados en otro tipo de alteraciones, como los procesos iníiamatorios y degenerativos. En otras partes del texto se hará referencia a algunas de estas enfermedades.

Los peroxisomas son pequeños organelos membranosos de forma esférica, que en los cortes estudiados al microscopio electrónico, suelen presentar en su interior zonas de aspecto cristalino (fig. 21.11).

En la mayoría de las células los peroxisomas no rebasan los 025 pm de d i i e t r o , pero en algunas, como las del hígado y el riñón, alcanzan 0,s pm.

Los peroxisomas se originan por vesiculación del retículo endoplasmático que, en ocasiones, se les observa unidos por porciones tubulares. No obstante, la mayoría de las proteínas de los peroxisomas son importadas desde el citoplasma.

Si bien el contenido enzimático de los peroxisomas es variable de un tipo celular a otro, en todos los casos parecen estar presentes enzimas que intervienen en el metabo-

del peróxido de hidrógeno (H,O,). En efecto, la catalaia participa en la oxidación dealgunassnstancias, utilizandod&ectamenteel oxígeno molecular según la reacción:

Fig. 21.10. Imagen de niieruscopin clertró- nira de células provenientes dc uii

paciente afectado con la enfermedad de Ta! -Sacfis. Lisosomas sc- tundarios (1.S): Obsérreiise los lisosonias secundarios dilatados por inateri:il de tipo iipídiro (gangliósidos) no digerido.

(Tomado de Prinripcs de Riocliimie. 1 . . I.dininger, 1982).

Fig. 21.11. Peroxisomas vistos por medio del microscopio electrúnico. Peroxisomas (P) Obsérvense lar zonas centrales de aspecto crirta- lino earaiteristieas de estos nrganelos. (Tomado de hlolecular Biology of the rell. B. Alherts et al.. 19831.

Fig. 21.12. Vesiculas cubiertas ohserradas por medio del microscopio elec- trónica. V&culas cubiertas (VC). Estas estnicturas participan en el "trasiego" de distintos eomponen- tes entre diferentes membranas de las células. La cubierta de aspccto poliédrico está formada fundamentalmente por la proteina clatrina. fTomadu de Molecular Biology Of the eell. B. Alberts ct al., 19831.

Por su parte la peroxidasa tiene a su cargo la descomposición del H,O,, una sustancia potencialmente dañina para la célula:

Los peroxisomas intervienen en procesos de detoxificación, y en algunos tejidos pneden participar en la degradación de ácidos grasos. En las plantas estos organelos cumplen diversas funciones que incluyen procesos metabólicos que permiten a sus células convertir ácidos grasos en glúcidos, lo cual es imposible en las células animales.

Relaciones del sistema de endomembranas

Como se señaló inicialmente el sistema de endomembranas se encuentra relacionado de maneras estructural y funcional; ejemplo de estas relaciones son las que se establecen entre el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi, así como entre los peroxisomas y los lisosomas. Sin embargo, hoy día se atribuye una función vital en las relaciones entre membranas y vesículas membranosas que establecen conexiones no sólo entre los organelos del sistema de endomembranas, sino de éstos con la propia membrana plasmática; estas vesículas constituirían verdaderas unidades para transportar componentes de membranas y proteínas específicas entre las diferentes membranas celulares.

Cuando las vesículas de secreción se fusionan con la membrana plasmática no sólo vierten su secreción al exterior, sino que su membrana se integra a la plasmática. También se ha observado que los componentes de estas vesículasson reciclados, de modo que también se forman vesículas porinvaginación de la membranaplasmática, las cuales se integran de nuevo al sistema de endomembranas; esto explica que no se produce un crecimiento üimitado de la membrana plasmática en las células secretoras, además, tiene un sentido económico dado por la reutilización de algunos componentes de las propias vesículas secretoras. Relaciones similares parecen establecerse entre otros organelos membranosos, aunque el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi se encuentran en el centro de estos vínculos.

Las vesículas transportadoras explican el crecimiento de otras membranas a partir de la incorporación de algunos componentes al retículo endoplasmático. Con frecuencia estas vesículas se observan envueltas por una capa de aspecto poliédrico, a las cualesseles hadenominado vesículas cubiertas, y el componente fundamental de su envoltura es una proteína denominada clatrína (fig. 21.12). Probablemente la formación y separación de la cubierta de clatrina guarde relación con la orientación de estas vesículas hacia diferentes compartimientos celulares.

Además de estas vesículas de transporte, en el interior de las células existe una llamada proteína transferidora de fosfolípidos, que traslada moléculas de este tipo de Iípidos entre diferentes organelos membranosos como pudieran ser el retículo endoplasmático y las mitocondrias. Sin dudas, el conocimiento sobre las complejidades estructural y funcional del sistema de endomembranas se encuentra en su inicio.

Resumen

Las c6lulas eueariotas presentan en su interior un complejo sistema de membranas, las cuales componen un diverso coqjunto de organelos membranmm intraeelulares.

Los organelos membranow intracelularrs son: el reticulo endoplasmático, el aparato de Golgi, los lismmas, los peroxisomas, las mitoeondrias, la membrana nuclear y los elomplastos.

Los cloroplsstos d o se encuentran en células que llevan a cabo el proceso de fotosíntesis, el resto está praente con mayor o menor desarrollo en la mayoría de las células eucariotas.

La estructura general de las endomembranas se corresponde con el modelo de mosaico fluido, cada organelo membranoso se diferencia de los demás por las composiciones tipídica y proteica de m membranas y el modo de organizarse &as.

Las funciones generales que reaüzan los organelos membranasos son las siguientes:

- 2. Establecimiento de gradientes de concentración. 3. Disponibilidad de áreas de superñcie. 4. Incremento de la velocidad de los procesos metabótim. 5. Generación de nuevas membranas.

El retlculo endoplasmático es el organelo membranoso más extenso; sus funciones se relacionan con la síntesis de proteínas que han de ser exportadas al exterior de la célula, la modificación estmctural de estas proteínas y la síntesis de tipidos. En algunas células también realiza funciones de detoxiñcación.

En el retículo eudoplasmáüco se distinguen 2 porciones denominadas reticulos endoplasmaíticos liso y mgoso, cuya diferencia fundamental es la presencia de ribosomas asociados a la superficie externa del segundo.

El aparato de Golgi es un centro procesador y distribuidor de macromoléculas en el interior de las células. Este aparato interviene en la modificación pastradufoón de numerosas proteínas. Estas modificaciones son glimilaciones y modiñcaciones de los oligosacáridos unidos a las proteínas, pmteólisis parcial, sulfatación y adi- ción de dcidos grasos.

El aparato de Golgi adopta una estructura peculiar formada por una serie de sacos aplanados de superf~cie lisa, cuyos coqjuntos se les denomina dictiosomas. Los productos madurados en el aparato de Golgi salen al exterior de las células o son distribuidos a otros compartimientos intracelulam a través de vesículas de transporte.

Los lisosomas constituyen centros de la digestión intracelular de numerosas biomolécuias; ellos se caracterizan por poseer numerosas bidrolasas cuyo pH óp- timo se encuentra en la zona ácida. Se originan en el aparato de Golgi en forma de pequeñas vesículas denominadas tisosomas primarios; estos lisosomas primarios, por fusión con otras membranas, dan lugar a lisosomas secundarios de tipo autofspico o beterofágico según el origen del material que se digiere en su interior. La deficiencia hereditaria de enzimas lisosomales ocasiona diversas enfermedades. Los peroxisomas son pequeños organelos membranosos en forma de vesículas que suelen presentar en su interior un contenido de aspecto cristalino; debido a sus h a s , intervienen en reacciones de oxidación de diferentes sustancias y, en especial, en la descomposición del 50, el cual se forma en estas reacciones y puede

dañino para la célula. Todos los organelos membranosos intracelulam presentan relaciones estnic-

-ales y funcionales entre sí; estas relaciones pueden ser por conünuidad Física de membranas o, lo que es más común, por la comunicación que se establece entre

Componentes celulares y Gedtica molecular 399

ellos y con la membrana p l d i i c a por medio de las vesículas de transporte. 'Igmbién una proteína transferidora de fosfolípidos eontnbuye al intercambio de componentes entre los diferentes organelos membranosos.

Ejercicios

1. Enumere todos los organelos intracelulares que están formados por membranas. 2. ¿Cuál es la estructura general de las membranas que constituyen a los organelos

membranosos intracelulares? ;Cuáles características las distinguen? 3. Explique las funciones generales de los organelos membranosos. 4. ¿Cuáles son las características estructurales y funcionales de las 2 porciones del

retículo endoplasmático? 5. Explique cuáles son los mecanismos que intervienen en la unión de los ribosomas

con el retículo endoplasmático rugoso. 6. ¿Cuál esla participación del retículoendoplasmáticoen la formación de membra-

nas intracelulares? 7. ¿Cuáles son las características estructurales y funcionales del aparato de Golgi? 8. :Mediante cuál mecanismo los productos madurados en el aparato de Golgi alcan-

zan otras localizaciones? 9. ¿Cuáles son las funciones generales de los lisosomas y cómo se asegurael cumpli-

miento de estas funciones? 10. ¿Cuáles son las diferencias entre un lisosoma primario, un autofagosoma y un

heterofaeosoma? - 11. ¿Cuáles son las características estructurales y funcionales de los peroxisomas? 12. ;,Cómo se establecen las relaciones estructurales y funcionales entre los diferentes

organelos membranosos?

El citoplasma se consideraba una fase soluble amorfa, y aunque desde hace un siglo se planteó por algunos investigadores la presencia deesiructuras traveculares en &,estas estrnctnmsediemn por artefactos h&qne,apíohdamente2déca&ah;is,mmediante técnica$ especiales de microscopia electrónica, quedó establecida la existencia de tal esqueleto celular. Entonces hoy, citosol es el término más usado para designar el medio interno acuoso,donde se hallan losorganelos y las moléculas disueltas intracelularmente, lo que equivaldría a la antigua concepción del citoplasma amorfo.

El citoesqneleto es una compleja red de filamentos y microhibulos que atraviesa el citoplasma y determina la forma de cada célula, asícomo su organización estmctural interna. Diversos tipos de movimientos celulares están asociados con esta fina red tridimensional de estructuras proteínicas que conforman el citoesqueleto.

Los principales avances logrados en el conocimiento de esta dinámica estructura subcelular derivan de estudios realizados en músculos y en tejidos, cuyas células presentan cilios o flagelos, los cuales poseen funciones evidentemente asociadas al movimiento mecánico. Los componentes moleculares presentes en estas estructuras, están también en aquéllas que conforman el citoesqueleto de todas las células. Los filamentos y microtúbnlos que participan en los movimientos del músculo y de los cilios presentan propiedades muy semejantes a las observadas en el citoesqneleto, pero difieren en estabilidad. Los movimientos del citoesqueleto son muy Iábiles y cambiantes, mientras que los del músculo y delos cilios son más estables.

En este capítulo trataremos las características de los diferentes componentes del citoesqneleto: los microfilamentos, los filamentos intermedios y los microtúbnlos. Para ello se estudiarán las interacciones que algunas drogas mtablecen con algunos d e sus componentes moleculares, las cuales han servido de insustituible instmmento para conocer su dinámica, y naturalmente se referirán las funciones que se hallan asociadas a estas organizaciones subcelulares.

Por último se tratará de los gránulos bien definidos que permanecen en el interior de algunos tipos de células especializadas y a los cuales se les conoce como inclusiones citoplasmáticas.

Citoplasma soluble

A la luz del microscopio óptico se denominó citoplasma al contenido delimitado Por la membrana plasmática; algunos distinguieron una zona periférica que llamaron

Fig. 22.1. Esquema de la trama del citoesqueleto. Se representan los microfilamentos, los microlúbu. los, la membrana y otras estructu ras del citoplasma.

(Tomado de Prineipes de Biochimie. AL. Ldininger, 1982).

exoplasma o plasmagel y una más fluida en el interior,el endoplasma oplasmasol. No hay dudas de que el endoplasmaes unafaseacuosa,peroeshidios posteriores permitieron descubrir la trama defüamentos y microtúbulos que le proporcionan una armazón, por lo cual pasó a la historia la idea del citoplasma como un contenido amorfo. Ello no niega que, a pesar de la existencia de los organelos y el reconocido citoesqueleto, hay un medio interno representado por el citosol. El término, surgido del fraccionamiento celular por medio dela centrifugación, se aplica a la fracción soluble que se obtiene después de centrifugar un homogeneizado de tejido a elevadísimas velocidades. Este citosol es particularmente abundante en las células poco diferenciadas; en éste se hallan las proteinas y enzimas solubles de la matriz citoplasmática, entre estas últimas se encuentran las de la glucólisis y las encargadas dela activación delos aminoácidos, previo a la biosíntesis de las proteínas. Por supuesto que en esta fase acuosa también se hallan los distintos metaholitos que intervienen en las transformaciones químicas del metabolismo intermediario.

Los microfilamentos son estructuras que resultan de la polimerización de un tipo fundamental de proteína: la actina;existen, por lo menos,6 tipos diferentes deactina en las células delos vertebrados. Estas proteinas homólogas son codificadas por genes diferentes, que determinan cadenas polipeptídicas con secuencias y propiedades muy semejantes. El lector debe remitirse al capítulo 66 para profundizar en los aspectos de estas proteínas descubiertas y estudiadas en detalle en el tejido muscular.

Por debajo de la membrana plasmática hay haces de filamentos que se continúan con una trama similar la cual atraviesa el citoplasma. ~stos'microfilamentos se relacionan durante su recorrido con vesículas del retículo endoplasmático, con microtúbulos y otros organitos (Fig. 22.1).

Estos microfilamentos tienen una existencia muy dinámica, su polimerización y despolimerización permiten los movimientos de los organelos del citoesqueleto. Los microfilamentos de otras células que no sean las musculares son menos fáciles de localizar, tanto por su dinámica como por aparecer de ordinario menos agregados; existen excepciones como el caso de las microvellosidades de las células intestinales donde forman haces compactos (Fig. 22.2).

La actina globular o actina G, que se obtiene de los microfilamentos de las células musculares, tiene un peso molecular de 41 000 D y se asncia a un Caz* y a una molécula de ATP. El calcio contribuye a mantener la estructura globular de la molécula. La función del ATPes curiosa, ya que la polimerización de la actina en la formación de los

F ig . 22.1. Miciofot<igi-af ids de célula5 cp i tc l ln lc \ del icitestina. Las i i i i~

i rovc l lw idader se iihscivaii coniii extei i i ioi iss digi ialer de l a inciii- br;in;i p l i is in i r ica. Ci idi i i n i c io - vcl losidi id contiene aproximada- ~niei i t r 40 iii icrufilametitos. (Tnnindo dz Mol rc i i ln i Biolngy of ihc c z i l B. Alberts ct al.. 1983).

filamentos es un proceso espontáneo, pero resulta acelerado por la hidrólisis de aquél. Los CTP, GTP y TTP pueden sustituir al ATP in virro sin afectar el proceso de polimerización. Los microfilamentos o filamentos de actina, observados al microscopio electrónico, presentan una doble hélice que se forma por la polimerizacióii de moléculas de esta proteína con unas 13.5 moléculas por vuelta (Fig. 22.3).

En estos estudios se Iia puesto de manifiesto que la velocidad de polimerización no es constante. La formación del núcleo de polimerización inicial es muy lenta y 'k

requiere de la participación de otras proteínas. e

En el citoplasma existe una reserva de moléculas de actina libre en equilibrio con -- . la actina polimerizada (actina F) y este equilibrio depende del control de factores ,' 36 n m celulares que permite la coordinación de los movimientos; por ejemplo, uno de estos factores es la proteína profilina, la cual se une a la actina e interfiere con la polimerización; se desconoce a través de qué mecanismos reguladom se debilita esta - 1 asociación.

Cada molécula de profilina se une a una molécula de actina y de este modo interfiere con la polimerización. Hay algunas evidencias aisladas que sugieren la existencia de mecanismos reguladores, los cuales inodulan la interacción actina-profilina, afortunadamente se establece un dispositivo de control capaz de disparar una rápida polimerización.

La mayor parte del conocimiento acerca del equilibrio dinámico entre la , -

polimerización y la despolimerización de la actina, así coiiio de los movimientos en 10s que participan los microfilainentos, proviene de estudios realizados con un tipo de

Fig. 22.3. D i b u j o esqueiu i t ico de u n fi- drogas: las citocalasinas, obtenidas de algunas especies de moho (Fig. 22.4). ~a~iici i to dc iictinii. Se scfialan los

Estas sustancias interactúan con las moléculas de actina por uno de los extreinos 3h nin de loii$tud y las 13,) uiiib

del filamento e impiden su poliinerizacióii. Se ha comprobado que el uso de estas dades de ac l i i i i i que correspon-

drogas inhibe varios movimientos celulares, como la locomoción celular, la Iagocitosis, dcn ii iiiia vuc l t i i de l a disposi- c ión hclicoid;il eii 1 ; ~ \ i icssióii de

la citocinesis y otros. Sin embargo. ellas no interfieren la mitosis ni la contracción iiioiióincroi.

C o m ~ n t e s ~~~~s y -tia mIecPar 403

Fig. 22.4. Estructura química de la ritoealasina B.

Fig. 22.5. Dlbiijo esquemático que representa la pro~resión de un filames- lo por la einéticr polimeriza- ción-despolimcr?zaeiún en extremos apuestos. Los monómeros de artina-G sc representan por un eo- lor diferente. a) A partir de un ins- tante arbitrario O. b) Se comienza a alargar el extremo (+) en la misma medida que ls estructura de- crece por el extremo (-). e) Trans- currido un intervalo determinado se aprecia cn la figura el desplazamiento del filamento.

muscular, en la cual no intervienen la polimerización ni la despolimerización de filamentos Iábiles.

Contrario a la acción de las citocalasinas,existeotro tipo de drogas del grupo de los alcaloides: la faloidina, que estabiliza los filamentos de actina, de manera que impide su desorganización; cuando esta sustancia se le inyecta a los protozoos,como la ameba (la faloidinano atraviesa la membrana), impidelos movimientos ameboides. Parece claro que la dinámica de la formación y desagregación de los microfilamentos es esencial para la consecución de los diferentes movimientos que dependen de estas estructuras

Cabe destacar que tos füamentos de actina son estnicturas que presentan polatidad, es decir, que sus extremos son diferentes, porque ésta es una propiedad que permite explicar cómo ocurren algunos de los movimientos en los que ellos participan.

La afinidad de las moléculas de actina para asociarse es diferenteen cada extremo. La concentración críticade actina übrees aquélla a la cual la velocidad de incorporación es igual a la de disociación del polímero. Parece que la hidrólisis del ATP provoca un cambio conformacional, de manera que la concentración crítica se hace menor en uno de los extremos que en el otro; por tanto, en determinadas concentraciones intermedias, el tilamento se puede mantener en un estado estacionario, según el hecho de que las moléculas se separan predominantemente de un extremo (-) y se añaden de manera predominante al otro (+). En el estado estacionario la velocidad neta de incorporación al extremo (+) es igual a la de desagregación del extremo (-).La consecuencia deesto (Fig. 22.5) es que la longitud del filamento permanece constante, perose va desplazando en el espacio desde el extremo (-) al (+).

' desplazamiento'

Existen numerosos ejemplos donde la actina se polimeriza rápidamente; en los seres humanos tenemos el caso de las plaquetas; cuando éstas responden ante la lesión de un vaso sanguíneo se desarrollan móltiples prolongaciones finas que intervienen en la formación y contracción del coágulo. Estas proyecciones contienen grandes cantidades de ñiamentos que se han estnicturado a partir del pwlde actina G. Además de la profilina, ya mencionada, que une una buena proporción de la actina despolimerizada, otras proteínas capaces de unirse a la actina se han descrito en la mayoría de las células de vertebrados e invertebrados.

Principales funciones de las microñlamentos

Existen 2 tipos clásicos de movimientos celulares en que estas estructuras constituyen la fuerza motriz: las corrientes citoplasmáticas, conocidas como ciclosis,

y el movimiento ameboide, característico de las amebas y de muchas células libres; juntocon los demáscomponentes del citoesqueleto contribuyen alas transformaciones sol-gel que experimentan las células. Los microfilamentos, mediante los mecanismos de su dinámica que hemos estudiado, participan en las funciones de endocitosis y exocitosis.

Son estructuras tubulares presentes en el citoplasma de las células eucariotas, se distribuyen preferentemente alrededor del núcleo y aparecen en el microscopio electrónico como si sus extremos se fijaran en la membrana o en formaciones cercanas a ella.

Como los microfilamentos, los microtúbulos son muy Iábiles, sobre todo los que forman parte del citoesqueleto, pues los que se hallan en cilios y flagelos son más estables.

Los microtúbulos son el resultado de la polimerización de un tipo fundamental de proteína globular: la tubnlina; esta proteína constituye un dímero formado por 2 monómeros que presentan estructuras primarias muy semejantes y peso molecular de 55 000 cada uno. Se distinguen como alfa-tubulina y beta-tubulina.

Un alcaloide, la colchicina, se une al dímero de tubulina e inbibe su polimerización, mientras que otra droga, el taxol, estabiliza la estructura de los microtúbulos, ya que favorece el proceso inverso.

Colchicina

El corte transversal de un microtúbulo permite observar 13 unidades dispuestas en forma circular alrededor de un ejeimaginario central (Fig. 22.6), cada una de estas unidades corresponde a un componente de los 13 protofilamentos que integran el microtúbulo.

En cada orotofilamento las unidadesde alfav beta tubulinase alternan alo largo - deéste,de modo que cada subunidad queda entre 2 subunidades distintas; además, cuando se estudia la disposición de los protofilamentos a lo largo del microtúbulo, las subunidades alfa y beta se disponen en forma escalonada e integran un retículo regular definido.

En la dinámica de la polimerización-despolimerización de los microtúbulos interviene el GTP. como lo bacía el ATP en los filamentos de actina: ~articiaan 2 moléculasde GTPen la adición de cada dímero, una deetlas está unida reversiblemente Y se bidroliza de manera simultánea con el ensamblaje; la otra molécula de GTP se une de forma irreversible y no es hidrolizada.

Los microtúbulos también presentan polaridad y sus extremos se denotan por (+) Y (-); ellos se van "ensamblando" desde los denominados centros organizadores, los cuales protegen su extremo (-) como si estuviera encapsulado, presumiblemente estableciendo interacciones con proteínas específicas que inhibeo el crecimiento de ese extremo. Este extremo encapsulado se encuentra en la región adyacente al núcleo (centrocelular o citocentro) durante la interfase y la mitosis.

Fig. 22.6. Organiraeióii molecular de los niierotúbulos. a) Dihu,ja esqueniá- tiro de uii mierotúbirlo en vista luiigitudiiial. bl Microfatografía de u n corte transversal dc u n microtúbule.

(Tomado d e Prineipes d e Biochimie. AL. Lehninger, 1982).

A partir de estos sitios precisamente es que se iniciará la organización de los microtúbulos, razón por la que estos centros se denominan centros organizadores, los cuales están relacionados con los centríolos.

De estas interacciones dependerá también la unión de los microtúbulos a los componentes membranales y a algunas proteínas enzimáticas que antes se creían libres en la fracción solubledel citoplasma. Se han descrito 2 tipos principales de proteínas accesorias: las tau y las MAP (microtubules associatedproteins). Las primeras, de peso molecular entre 60 y 70 mil, se enlazan a la tubulina e incrementan la polimenzación. Las MAP de peso molecular entre 200 y 300 mil parecen poseer 2 dominios, uno se enlaza al microtúbulo, mientras que el otro queda libre y puede estar involucrado en la unión a otros componentes celulares: las mejores conocidas son la dineína y lanexina. Para lacomprensión del sentido de algunas de estasinteracciones, es preciso antes esbozar las principales funciones en que intervienen los microhíbulos.

F'rinapales funciones de IOB micmtiíbuios

La adopción de las formas características de algunos tipos celulares, así como de sus prolongaciones tienen que ver con la orientación y distribución delos microhíbulos. Los axones de las células nerviosas son un ejemplo típico de esta función.

Numerosos cambios que tienen lugar en la morfogénesis están relacionados con la fundónmecánica delos microtúbulos. La inducción de la placoda en la diferenciación del cristalino se acompaña de la aparición de numerosos microhíbulos, por citar solo un caso.

Todas las células eucariotas tienen una geometría es~acial distintiva. dada nor la u

posición de sus organelos; esta polaridad celular depende de la integridad de los microtúbulos. Cuando son destruidos, el desplazamiento celular se torna azaroso y pierde su carácter direccional.

No cabe duda que los microhíbulos se pueden constituir en una especie de sistema de transporte interno, lo que permitiría la circulación de macromoléculas, al delimitar

\ canales en el citoolasma. Se conoce que en algunos receptores sensoriales se hallan presentes conjuntos de

microtúbulos, lo cual presume que intervengan de alguna manera en la transducción de diferentes formas de energía en esos neurorreceptores.

En el capítulo 23 se expone la participación en la mitosis de los microtúbulos. Por último, los cilios,flagelos y centríolos son derivados de los microtúbulos. De todo lo dicho, se comprende que los microtúbulos intervienen en muchos

movimientos celulares guiando algunas corrientes citoplasmáticas, que pueden transportar gránulos de secreción hacia la superficie celular, donde descargan su contenido por exocitosis: movimientos que agrupan en un polo de la célula a las proteínas integrales de la membrana plasmática; movimiento de los cromosomas durante la división celular y otros.

Se considera como muy probable la intervención directa de los microtúbulos en la generación de fuerzas en el caso de los movimientos ciliares o flagelares; estos movimientos provocan un desplazamiento del líquido extracelular respecto a las células, si ellas están fijadas, o de la propia célula, si es libre y suficientemente pequeña.

Filamentos intermedias

Si bien los 2 tipos más importantes de componentes del citoesqueleto son los microfilamentos y los microtúbulos, caracterizados por su dinámica labüidad, existe otro tipo de filamento, de diámetro intermedio entre aquéllos y que resulta ser mucho más estable. Esta propiedad sedebe aquesus constiiuyentesmolecularesson proteínas de naturaleza fibrosa y no globular, que los hace muy resistentes a la extracción con

soluciones de variadas concentraciones salinas y con detergentes no iónicos; sin embargo, esta insolubilidad hace posible su observación microscópica mucho más fácil que la de los restantes componentes del citoesqueleto. En la figura 22.7se presentan microfotografías correspondientes a 2 tipos celulares diferentes.

Los filamentos intermedios tienen una disposición que también parece partir del centro de la célula, pero con recorridos menos sinuosos; se hallan relacionados con las zonas de las células que están bajo grandes tensiones.

Varios tipos de proteínas están presentes en los filamentos intermedios, tienen pesos moleculares que varían de 40 000 a 200 000 D y se polimerizan sin dar lugar a estructuras tan regulares como las de los microtúbulos y microfilamentos; el número de estas proteínas fibrosas varía según el tipo de célula y la especie.

Cada ñlamento parece presentar un hímero como unidad de polimerización, aunque ello no está confirmado, y todavía los factores que controlan estas estructuras y sus funciones son objeto de especulación. Lo que sise puede afirmar es que cada tipo de célula presenta filamentos intermedios característicos, que están constituidos por ~roteínas diferentes que se asocian; ejemplo de ello son los filamentos de queratina en las células epiteliales, los de vimentina en los fibroblastos y los neurofilamentos de las neuronas.

precisa mente,^^ diversidad hacemucho másdificil su estudio y el desus proteínas constituyentes. Laasociación de estas proteínasfibrw parece presentar características estructurales semejantes a la de la colágena (capítulo 68).

Deacuerdo con lo expresado se comprende que lapolimerización de los filamentos intermedios, hasta el momento, parece ser un proceso irreversible; de ello no deben deducirse que el número, tamaño y disposición de estas estructuras han de mantenerse constantes a lolargo de toda la vida celular. Se han descubierto enzimas proteolíticas que degradan específicamente un tipo u otro de filamentos intermedios, y se desconoce cómo es regulada la actividad de estas enzimas NI vivo; in vitro, muchas de ellas son activadas por el Caz'; lo cierto es que la única forma conocida en que pueden ser desagregados los filamentos de esta clase es, mediante la hidrólisis de sus proteínas, en péptidos más pequeños.

En tanto no se demuestre lo contrario, la función de los filamentos intermedios parece restringida a soporte mecánicode la estructura celular.

Se denominan inclusiones a las estructuras que existen en el citoplasma, y no son más que verdaderos almacenes de sustancias específicas que se hallan disponibles para ser utilizadas en la célula o por el organismo. Estas sustancias incluyen desde compuestos de reserva energética -como la grasa y el glucógeno- hasta elementos simples -como el hierro y pigmentos como la melanina.

Glóbulos de grasa

Es ta inclusiones se encuentran en las células del tejido adiposo de losmamíferos, son cúmulos de Iípidos del tipo de los triacilgliceroles (capítulo 13). Ellos son una reserva de energía muy eficiente, debido al elevado contenido calórico que posee esta clase de Iípidos; en los adipocitos pueden llegar a ocupar más del 90 % del volumen celular (Fig. 22.8).

No obstante, estas inclusiones aparecen en otras células del organismo, como las musculares y en los hepatocitos; en estos últimos pueden acumularse excesivamente y causar daño hepático bajo determinadas circunstancias, es el denominado hígado graso que en algunos casos puede evolucionar hacia la cirrosis hepática. En la figura 22.9aparece una niicrofotografia electrónica de un adipocito.

Fig. 22.7. MicrofotograBas de filanientos interrncdios. a) Por técnicas de inmuiionuoreseeneia se visualizan filamentos intermedias de vimeiitina. h) Neurafilamentas presentes en un sector de axoplasnia cn el axón gigante de una lombriz marina. ('hmsdo de Molecular Biolagy of the cell. B. Albere et al., 1983).

Fig. 22.8. Mierofotagrafia de un adipocito. Se observa el citoplwma reducido a un fino borde periférico y el núcleo prominente, desplazados por un gran glóhulo de grasa. (Tomado de Bioquímiea. L. Stryer. Segunda edición, 1982).

Fig. 22.9. Mirrofotografia de barrido de un adipoeita. (Tomada de Bioquímiea. L. Stryer. Segunda edición, 1982).

El glucógeno es un polisacárido formado por unidades de glucosa, lo que le permite constitnir, igual que los triacilgliceroles, una reserva energética para la célula o el organismo (capítulo 10). Los gránulos de glucógeno ofrecen un aspecto bien denso en las microfotografias (Fiz. 22.10). - , -

En el gránulo, además se encuentran las enzimas que participan en las síntesis y degradación del polisacárido, y otro conjunto de enzimas que tienen una función reguladora del metabolismo del glucógeno. Tanto el peso molecular del glucógeno, como la proporción en que se hallan las proteínas enzimáticas en el gránulo, son variables, de modo que estas inclusiones poseen diámetros que van desde los 1 000 a los 4 000 nm.

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Monocapa de enzimas específicas que recubren la molécula de glucógeno

Fig. 22.10, Microfotagrafia dc los gránulos de glucógeno. a) Las inclusiones citaplssmátieas, en este casa gránulos de glucógena, sc ubscrvan corno múltiplrs zonas densamente oscurecidas. h) Kepresentacih csqueiiiitira de un gránulo de glucógcno. (Tomado de Molceular Binlogy af the ccll. B. Alherts et al., 1983).

Resumen

La fase soluble que se obtiene como sobrenadante en una centrifugación de muy elevada velocidad se conoce como citosol. Las téenicas avanzadas de micmsmpia electrónica no niegan que el medio interno celular, donde se encuentran los organelos y el citoesqueleto, se halla bañado por una fase acuosa, el citosol. En éste se encuentran disueltos metabolitos, proteínas y enzimas solubles. El dtoesqueleto es una compleja red de ñlamentos y microtúbulos que atraviesan el dto~lasma v determina la forma celular. asícomo la oreanizaa6n del hialonlasma , . - -

Los microñlamentos son el resultado de la polimerización de monómeros de la proteína acüna, una de las 2 proteínas fuodamentales que participan en la propie dad conírácül de Las fibras muxulares. Estos poümeros, en el caso de los ñlamen- tos del citoesqueleto de una célula cualquiera, se agregan y despolimerizan de forma continua, lo cual les confíere una dinámica en su loealizaci6n, iamaiío y estabiüdad, además, les permite intervenir en funciones relacionadas con algunos movimientos celulares.

Eata dinámica y su importancia en algunas propiedades celulares han podido ser estudiadas con la ayuda de drogas que, como la citocalasina, impiden la polimerizaci6n de las moléculas de actina. La profia es una proteína que pareee tener una funci6n parecida en el control fisiol6gico del equilibrio polimerización-despolimerizaci6n de los microfilamentos.

Si se interfiere la mecánica normal de los microñlamentns se impide la loco- moci6n wlular, la f agdh i s , la citocinesis y el desarroiio de las digitaciones que ocurre en la respuesta fiiol6gica de las plaquetas, entre otros procesos.

Los micmtúbulos poseen una dinámica similar, pero están constituidos de otra pmteiaa, la tubuüna

Las 2 estnictur~s citadas presentan polaridad y generalmente en un extremo Predomina la desagregación de los monómeros, y en el opuesto la polimerización, mcterísoca que hace posible la movilidad de ambos.

Los mkmtúbulos del citoesqueleto tienen una dimímica semejante a la de los microñlamentos, pero como los pdúaeros estables de acüna se hallaron en los músculos, existen también micmtúbulos más duraderos y menos cambiantes en los d i o s y melos.

Los mieroffibulos se originan de ordinario en regiones adyacentes al niideo celular, denominadas centros organizadores, éstos están relacionados con los centrfolos.

Las proteínas accesorias establecen nexos entre las moléculas de tubulina y de éstas con otros componentes celulares.

Los microtúbulos son determinantes en la especioadad de la forma de los diferentes tipos de células, intervienen en la morfogénesis, en la formación del huso mitótico, confieren polaridad a las c6lulas que la poseen, parece que desempeñan una función en algunos nenmrreeeptores y, por mipuesto, forman parte importante del sistema eirnilatorio intraeelular.

Por Ultimo, los filamentos intermedios los forman diferentes proteínas en las disüntas células: y son más estables que los mimíüamentos y microhíbulos. Tam- bién se diferencian de aquéJlos en que Las proteínas que los integran son fibmsas en vez de globulares. Su diversidad ha hecho más d i ñ d el estudio y comprensión de sns estnictnras y funciones: en las células epiteüales existen filamentos de queraüna; en los fibmblastos y la mayoría de otras células suele estar presente la vimentina, entre las proteínas componentes de los filamentos intermedios.

Se presume que estos filamentos se destniyan por pmteólisis y se han aislado enzimas especííicas para sns diversas proteúias constituyentes.

Las 3 estructnras esindiadas conforman el citoesqueleto, que como su nombre indica constiíuye el soporte meesnico del coqjunto de la arquitectura celular.

Las inclusiones citoplasmáticas son acumulaciones de sustancias que se alma- cenan durante algún tiempo en la célula Los exponentes más comunes son los glóbulos de grasa y los gránulos de glucógeno, ambos tienen función de reserva energ6tica para la célula o el organismo.

Ejercicios

1. Realice una comparación entre las proteínas que integran los microfilamentos y los microtúhulos.

2. ¿Qué característica especial presentan las proteínas de los filamentos intermedios que no la poseen las de los microfilamentos y microtúbulos?

3. ¿Cuál es el sentido del gran dinamismo que presentan las estructuras poliméricas fundamentales del citoesqueleto?

4. Trate de deslindar las funciones de los microfilamentos, los microtúbulos y los filamentos intermedios que les son propias y las que lesson comunes a los3.

5. La división celular no se afecta por la droga citocalasina, pero sí por la colchicina. ¿Qué conclusión puede usted inferir en cuanto a las estructuras del citoesqueleto que intervienen en la mitosis y las que no lo hacen?

6. De acuerdo con lo estudiado en el capítulo 18 y en éste, jcree usted que los gránulos de glucógeno constituyen sistemas multienzimáticos?

7. ;,Son los glóbulos de grasa inclusiones exclusivas del adipocito?

La diferencia fundamental entre las células procariotas y eucariotas es la presencia en estas últimas de la envoltura nuclear que separa al ADN; también existen diferencias entre los procesos relacionados con el ADN y los procesos que ocurren en el citoplasma. En las células procariotas, la síntesis de ARN (transcripción) y la síntesis de proteína (traducción) se llevan a cabo casi de manera simultánea, sin haberse separados aún los ARNm del ADN. La aparición, durante el proceso evolutivo, de la envol- turanuclear posibilitó la separación entre los procesos de transcripción y traducción, lo que permitió el desarrollo de ambos.

En este capítulo describiremos las diferentes estructuras del núcleo: la envoltura nuclear, el nucléolo, la cromatina-cromosomas y el jugo nuclear, además, haremos referencia a la relación entre estas estructuras y su función.

El estudio del núcleo celular constituye un ejemplo fehaciente del principio de laoiganización de las macromoléculas, ya que podemos observar duranteel desarrouo de la mitosis cómo diferentes estructuras nucleares desaparecen bajo determinados mecanismos de regulación, no del todo conocidos, y vuelven a formarse, entre otras causas, por el mnocimiento molecular entre sus componentes. La propiedad del m n e cimientomolecular ligado a lasdiferentes estruchuas fue tratada en el capítulo 9.

Cuando la célula se encuentra en interfase podemos ver todas las estructuras nucleares: el material genético se encuentra estructurado en forma de cromatina, la envoltura nuclear está presente y podemos observar al menos un nucléolo. Cuando en la célula comienza la división mitótica, ocurren cambios que conducen a la desapari- ción de la envoltura nuclear, a la conversión de la cromatina en cromosomas y a la desaparición del nucléolo. Una vez terminada la separación del material genético en 2 partes iguales, entre lascélulas hijas, se producen loscambios que le devuelven a la célula la estructnra que tenía en la interfase.

Componentes estmcturaies del ~IWX

Podemos dividir al núcleo en los componentes estructurales siguientes (Fig. 23.1):

l. Envoltura nuclear. 2. CromaOna 3. Nucléolo. 4. Nncleoplasma o jugo nuclear.

Fig. 23.1. Componentes del núcleo. a) La membrana nuclear. (b) El nueléolo. (e) La eromatina. (d) El nueleoplasma (a carialinfa). Se observan ambas membranas de la envallura nuclear y los ribosomas unidos a la membrana externa; también se observan (e) Las poros de la membrana.

Envoltura nudear

La envoltura nuclear es lo que fundamentalmente distingue a la célula como organis- moeucarionte, puesto que los pmcariontesnola tienen. La aparición de estecomponente celular introdujo cambios celdares como la separación de la célula en 2 comparíimwntos: el citoplasma y el núcleo. Esto resultó ventajoso al limitar el paso de sustancias entre ambas compartimentos y, por ende, pudiemn evolucionar mecanismos de regulación; así como suceder el paso de sustancia entre ambos espacios celulares. La aparición de la membrana también permitió que evoluaonara la organización estruciwal de los ADN en el núcieo, y quesedes~17ollaran también los mecanismos desíntesis del ADN y ARN, así como las de sus resnectiv~~~ remilaciones.

Fig. 23.2. Disposición de los poros. Tienen una disposición hexagonal y en el micrómetro representada hay 45 poros que ocupan aproximadamente el 10 % de esta brea.

~ ~~ .~~~~ . ~ ~~~~ ~

que unenlos gpaciosintranuclear (nucleoplasma) y ciioPlasnátim m. 23.1). A &delos pom sólo pueden pasardetenninadoscompuestos, tienen paso selectiva

Si observamos una de las 2 cara de la membrana, notamw que los poros presentan una distribucih hexagonal (Fig. 232); éstos constituyen del 10 al 36 % del área total de la membrana, y hay entre 40 y 145 poros por micrómeiro cuadrado.

Poros

P m m

Cada una de las membranas que forman la envoltura nuclear tiene estructura semejantea la membrana descrita en el capítulo 20, sin embargo,cadauna tiene sus particularidades. Delas 2 membranas, la que está en contacto con el citoplasma es una continuación de las membranas del retículo endoplasmático mgoso; sus composiciones lipídica y proteínicason casi las mismas, y contiene las proteínas que intervienen en el reconocimiento de los ribosomas y del péptido señal, por Lo que se observan al microscopio electrónico los ribosomas funcionales adosados a ella.

La membrana interna que está en contacto con el jugo nuclear tiene adosado a su cara nuclear un "emjado" de proteínas, Uamado Iámina nuciear,oiganización pmteínica especial formada por 2 proteínas diferentes (lamininas A y B), que parecen intervenir en los mecanismos de desagregación y reagregación de laenvoltura nuclear durante la mitosis, y que, a su vez, se regulan por modificación covalente (fosfo- nlación-desfosforilación). Por una parte, esta lámina se une a la cara nuclear de la membrana interna de la envoltura nuclear, y por otra parte, se relaciona en algunos puntos con la cromatina, que une a ésta con la membrana (Fig. 23.3).

Membrana interna de la membrana nuclear

- Cromatina

Proteínas de la Iámina nuclear

Fig. 23.3. Proteínas de la lámina nuclear. Una de eUas se ssoeia Íntimamente a la membrana y otra a la emmatina.

Los poros pueden observarse muy bien en una fotograña al microscopio electróni- co; parecen ser canales abiertos queconectan ambos compariimentos, están bordeados por proteínas especiales, tanto por su superficie citoplasmática como nuclear y el propio conducto parece estar ocupado por ellas.

Camplejo del poro nuclear

Ocupando y formando el canal se encuentra el complejo del poro nuclear, que tiene un peso de partícula de 125 megadalton; está formado por aproximadamente 100 polipéptidos diferentes que reciben el nombre de nucleoporinas. Muchas de las nucleoporinas tienen unidas de forma covalente moléculas de N-acetil glucosamina, además, poseen pequeñas secuencias de aminoácidos (degeneradas y repetidas) como fen-X-fen-gli.

Aún no se conocen todos los detalles de la estmctura de este complejo. Dos aros, formados cada uno por 8 subunidades (aproximadamente 20 proteínas porcada una), bordean el poro porcada ladode la envoltura nudear,uno por la cara nuclear y otro por la citoplasmática; lo que queda entre los aros, llamado cintura, se une al espesor de la membrana donde se funden las membranas externa e interna de la envoltura nuclear. Hacia la superficie citoplasmática, y partiendo de cada una de las subunidades, se encuentran fdamentos; a veces estos filamentos son continuación de los filamentos de los POms vecinos. Por la cara nuclear del poro también parten filamentos, pero éstos f~rman como una cesta de baloncesto (Fig. 23.4).

Por el poro pasan moléculas del núcleo hacia el citoplasma, y viceversa. El diáme- tro del poro es de 80 nm, sin el complejo nuclear, y con éste es de 9 nm; sin embargo, Por el poro pasan partículas de más del doble de este diámetro, mediante la difusión

Fig. 23.4. Complejo del poro nuclear. (a) El anillo de la cara citoplasmáüea formada por las S subunidades. (b) la cintura. (e) La envoltura nuclear y el espacio perinuclear. (d) Filamen tos de la cara citop¡asm8tica. (e) Filamentos de la cara nuclear, far- mando una estructura parecida a un cesto. (0 Tapón de proteinas que ocupan el canal.

I Fig 23.5. Mecanismo de transporte a través del iiom nuclear. (a) Se observa el complejo del pom nuclear. (b! Las envoltura y espacia perinuclear (c). El ARN que será transportado se une a Is proteína de transporte (0, que a su vez es reconocida por una secunda ~roteíns de transporte (g). (d) El complejo se une a los filamentos nucleares, se desliza con easto de enereia a través del canal, - y se libera del lado citoplasmático lu-o de desprenderse de los fila- me& del otro lado (0.

Fig. 23.6. Cambios de volumen del núcleo. Se produce a expensas del corrimiento de sus membranas: interna (ami! y extersa (roja).

simple, ejemplo de este paso son las moléculas proteínicas pequeñas: el citocromo c (13 kD) difunde Libremente, la ovalbúmina (43 kD) demora en pasar y la seralbúmina bovina (66 kD) no pasa. Más allá de este tamaño el paso se realiza por transporte activo: requiere energía, depende de señales y tiene saturabilidad. Por este tipo de transporte pueden pasar partículas basta de 25 nm dediámetro.

Las señales dependen de secuencias de aminoácidos que pueden estar repetidas; existen señales para las sustancias que entran, señales diferentes para las que salen y otras para las sustancias que entran y salen rápido. Una señal bien conocida para la salida es la estructura CAP de los ARN transcriptos primarios (capítulo 271, que se une alas proteínas de transporte.

Uno de los mecanismos descritos utiliza al menos 2 proteínas para la salida de algunos ARN, una de ellas se une a proteínas del complejo del poro, la segunda se une a aquélla y al ARN que va a pasar (Fig. 23.5).

Lado nuclear

(b)

Por el poro deben pasar al interior las protehassintetizadas en el citoplasma, que se requieren para la síntesis de los ADN y ARN, y para el resto de los procesos que o e m n en el núcleo; por ejemp10,las bistonas quese requierenal formarsela cromatina, durante la síntesis de ADN, provienen del citoplasma (por cada poro entran 106molé- culas de historias en un minuto).

Además de actuar como paso selectivo de sustancias, otra de las funciones del poro es servir como tampónde volumen, pues por el corrimiento entre las membranas internas externa de la envoltura nuclear, el núcleo puede aumentar o disminuir de

En el nncléolo ocurre la síntesis de los ARNr de 5,s; 18 y 28 S; además se lleva a cabo el "ensamblaje" de éstos con proteínas ribosomales, formando las subunidades de los ribosomas.

Los nucléolos se encuentran localizados en algunas porciones del genoma, los llamados organizadores nucleolares, que contienen la información para la síntesis de los ARNr. Durante la interfase, estas porciones del genoma se encuentran desenrolla- das y localizadas en un sitio del núcleo sobre ellas y de forma ininterrumpida se produce la transcripción de estos genes. Conocemos que los ribosomas de eucanontes poseen diferentes clases de ARN, y que su síntesis trae como resultado, no sólo la transcripción, sino también el procesamiento de los transcriptos primarios que final- mentequedan transformadosen los ARN definitivos (capítulo 32). En esta porción del núcleo, donde se transcribe la información de los transcriptos primarios del ARNr, también ocurre parte de laorganización snpramacromolecnlar de los ribosomas (agregados de ARNr y proteínas de diverso tipo).

Las proteínas que forman parte de los ribosomas se sintetizan en el citoplasma, pero pasan por los poros al núcleo y allí, de acuerdo con un determinado orden, y debido al reconocimiento molecular, se van agregando en partículas cada vez mayores y más complejas para conformar las 2 subunidades ribosomales (capítulo 81).

De tal forma se van conformando los ribosomas en el nucléolo, que si se hiciera un corte del nucléolo se vería como hacia sus porciones centrales se encuentran los transcriptos primarios en proceso de síntesis; a medida que avanzamos hacia la superficie se observan los ARN ribosomales acoplándose con las proteínas ribosomales, y en las capas más externa veremos partículas completas o casi completas (Fig. 23.7). Debido a esta distribución funcional, se pueden distinguir en la estructura de este organelo 2 porciones: una central, fibrilar, donde ocurre la transcripción, directamente en las cadenas del ADN, y otra periférica, granular, donde ocurre el "ensamblaje" de las unidades de nucleoproteínas del ribosoma.

En los núcleos diploides existe el doble de organizadores nucleares que en las células haploides.

Este componente nuclear es una continuación del citoplasma; contiene, como este último. un citoesaneleto -el carioesaneleto- v en los esuacios de la trama se encuentran suluhilizado* t ~ d ~ s 10% componentes requwidns cn la síntesis !. pnwsa- miento de los .ADN, de los ARN y de tudas aquellas reacciones que ocurren en 1.1 núcleo: las enzimas, los snstratos, los cofactores y los productos.

Fig. 23.7. Una sección del nuiléalo. En la porción central se observa la trans- cripción de los transeriptas primarios de los RNA ribosomales (rojos); las ADN en azul. A medida que se avanza al exterior se produce la maduración de aquéllos, y su unión con las proteínas ribosomales (verde). Ya en el borde se observan algunas partículas ribosomales mayores y menores.

Fig. 23.8. La eslructura de la rromatina. Se observan los nucleosomas como cuentas de un collar (aclámero de Iiistonas, enrolladas por el ADN) y separadas par el ADN espaciadar.

Fig. 23.9. Estructura del nueleosoma. (al En el esquema que representa la estmctura dcl nucleosoma, se observan las8 histonas; ésta7 re apre- cian separadas para mostrar la re- lación entre ellas y con el ADN que las rodea. (b) Se observa la relación que mantiene la histana 1 con el nueleasoma.

Par cmmatina-cromosoma

El par cromatina-cromosoma representa las 2 formas de organización del material genético; ambas se caracterizan por la diferente disposición estnictural de La dmxirribo- nucleooroteína en distintas etauas del ciclo celular. La cromatina es la forma de orga- - nización un tanto desenrollada de este tipo de supramacromolécula, se encuentra en el núcleo en interfase y se transcribe deforma continua. El cromosoma es su forma de organización compacta durante la fase de mitosis, y en esta forma de organización no se transcribe. Se describirá primero la estructura de la cromatina, que es la menos compacta.

Cromah

I:n i I iapitulo II,dmdt*se deicrihii, Iaeslrurturadr loa Jcido5 nuileicus,cnnu- cimos de la estructura sivund~riadel .\L).esp~citicanirnte. la del mwJrlod' \\ alson y Crick.

Cuando el núcleo está en interfase, el ADN se encuentra organizado fo,mando complejos supramacromoleculares con proteínas básicas llamadas histonas. Esta es la cromatina, que al observarla al microscopio electrónico parece conformada como un collar, cuyas cuentas se encuentran algo separadas entre sí (Fig. 23.8). Estas cuentas están formadas por los nucleosomas, y las porciones entre las cuentas están formadas por la estructura del ADN de doble banda.

El nucleosoma está formado por el ADN de doble banda, enrollado sobre un octámero de proteínas básicas, lashistonas. Estas proteínas están muy conservadas (casi no hay diferencia entrelas del frijol y las de la vaca), y hay 5 tipos diferentes. Se diferencian, entre otras cosas, en su peso molecular y su contenido de aminoácidos básicos. Además, estas proteínas están muy modificadas, pues presentan metilaciones, fosforilaciones y adenilaciones.

Tipo de histona Peso molecular (kD)

Y % % Y H 4 21 14,s 13,7 15,3 11,3

Relación lidarg 20 1,2 2,s 0,7 0,s

El octámero está formado por (H,),(H,,),(H,),«I,)2, tiene 110 nm de largo por 55 nm de ancho; en el centro del octámero se encuentra el tetrámero (H,),(H,), y a cada lado de éste se encuentran los dímeros (H,JH,,). El ADN se enrolla 1 213 veces sobre el octámero; esta porción enrollada se corresponde con 146 pb (Fig. 23.9a).

La porción de ADN que queda entre 2 nucleosomas adyacentes varía en longitud, puede ser entre 8 y 114 pb (promedio 55 pb); a esta porción del ADN se le llama espaciador. La H, parece quedar unida a los 2 extremos de la porción enrollada del ADN sobre el nucleosoma (el extremo que comienza el enrollamiento y el que lo termina)? la H, queda en el espacio entre ellos (Fig. 23.9b). La H, contribuye al aempaquetamiento, posterior de la cromatina al formarse el solenoide.

La organización de los nucleosomas en la cromatina no es siempre la misma, vana en los genes activos donde se produce el desenrollamiento del ADN.

Durante la replicación deben formarse nucleosomas nuevos mientras se duplica el ADN. Parece que los nucleosomas viejos a veces quedan en una banda, y otras veces en la otra banda; en la formación de los nuevos nucleosomas, además de las histonas y el ADN, intervienen la nucleoplasmina y la topoisomerasa 1 (capítulo 25). La primera es una proteína «chaperona» que pone en contacto al ADN con las histonas, e impide asociaciones erróneas. La topoisomerasa 1 es necesaria para proporcionar el nivel requerido de superenrollado al ADN sobre el octámero.

En la formación del cromosoma, la cadena de nucieosomas se enrolla y forma una f?stNctura en solenoide. En la figura 23.10 se puede observar cómose va compactandn la cromatina hasta la formación del cromosoma. Cada cromosoma está formado por una molécula de ADN, y como ejemplo de este "empaquetamiento" podemos referir-

nos al cromosoma del primer par humano (ver los pares humanos en el cariotipo). Este ADN se compacta unas 7 000 veces, cuando se encuentra desenrollado tiene una longitud de 7J cm y compactado en el cromosoma su largo es de 10 pm.

Cromosomas: Forma y tamGo

Existen métodos que permiten de forma experimental, en el laboratorio, fotogra- fiar todos los cromosomas que pertenecen a una misma célula. Como todas las células de un mismo organismo (en la es~ecie animal o vegetal) tienen igual dotación genética, - se puede tomar para este estudio cualquier célula de cualquie; tejido; este estudio se lleva a cabo en los leucocitos. Una fotografía ampliada de los cromosomas en mitosis nos muestra que todos los cromosomas no son iguales y que difieren en su tamaño y forma

Podemos distinguir en cada cromosoma estructuras características. En la figura 23.11 hemos esquematizado un cromosoma típico, se observa que está formado por 4 brazos (largos o cortos), que se unen al centrómero. A veces los brazos presentan constricciones, y cómo a la constricción que se forma al nivel del centrómero se le Uama primaria, a éstas que se forman en los brazos se les Uaman secundarias. Al peque- ñofragmento de brazo que queda terminal a la constricción secundariase le denomina satélite (Fig. 23.11).

Fig. 23.11. Partes de un cromosoma. Se repraentan 2 cromosomas, en ellos podemos observar las partes que lo forman: (a) Brazos. (b) Centrómero (constricción primaria). (c) Constricción secundaria. (d) Satélite.

Si de la fotomafía ampliada recortamos cada cromosoma y luego los ordenamos según su tamaño,de may& a menor sobre un papel, observaremos que siempre nbten- dremos la misma distribución de los cromosomas paracada especie; a esta distribución característica se le ha llamado cariotipo.

Canotipo humano normal

Cada especie animal posee un número constante de cromosomas: el hombre posee 46 (23 pares incluyendo el sexual), el gato 38, el maíz 20 y la Escherichia colipnsee 1. Para el hombre el cariotipo normal se compone de 7 tipos de cromosomas que difieren por su tamaño y la posición del centrómero, como características más relevantes (Fig. 23.12).

Gmpo A: metacéntricos (1,2 y 3), tienen los brazos del mismo largo. Gmpo B: submetacéntricos (4 y S), sus brazos tienen tamaños diferentes. Grupo C: submetacéntricos (6,7,8,9,10,11,12 y X), iguales al grupo anterior,

pero de menor tamaño. Gmpo D: acrocéntricos con satélite (13,14 y 15), uno de sus pares de brazos

son muy cortos. Gmpo E: metacéntricos y submetacéntricos (16,17 y 181, de menor tamaiío. Gmpo F: metacéntricos (19 y 20), de menor tamaño. Gmpo G: acrocéntricoscon satélites y sin ellos (21,22 y Y),de menor tamaño.

Fig. 23.10. La erornatina al eompaetarse forma los cromosamas. (a) La eromatina se compacta en una figura que recuerda un solenoide. (b) El solenoide parece compac- tarse aún más en lazos muy unidos. (e) Un enrollamiento mayor pudiera formar el cromosoma.

Fig. 23.12. Cariotipo humano normal. Grupo A: Metacéntricos. Grupo B: Submetacéntricos. Grupa C: Submetacéntricos. Grupa D: Aeroeéntrieos con satélite. Gnrpo E: Metacéntricos y submetacéntricos. Grupo F: Metacéntricos. Grupo G: Aeroeéntrieos con satélite y sin él. (Tornado de Molecular Biology of the cell. B. Albe- el al., 1983).

Al estudiar el cariotipo se tienen en cuenta el tipo de cromosoma, su tamaño relativo y la posición del centrómero; se determinan el sexo y las alteraciones que existan en el número y estructura de ellos.

Alteraciones del carioOpo

Los cambios en el número o en la estructura de los cromosomas producen graves enfermedades, cuando falta una copia de los cromosomas no sexuales (autosomas) la consecuencia es letal. Si se tienen 3 copias de un cromosoma la supervivencia es escasa, pero la trisomía del cromosoma 21 es viable, esta anormalidad se conoce como síndrome de Down (antes llamado mongolismo); es el más frecuente de los trastornos cromosómicos del hombre y depende mucho de la edad en que la mujer se embaraza. Enmujeresmenores de 29 añosla posibiüidad de queun hijo padezca esta anormalidad cromosómica es del Y2 000, pero en mujeres mayores de 45 años la frecuencia de tener un hijo con síndrome de Dowu es de 1/50.

En los individuos afectados, la simple observación los descubre, entre otros signos se observa la estatura baja, el perfil facial plano, fisuras palpebrales oblicuas, lengua voluminosa y manos anchas y cortas, El retraso mental generalmente es intenso, pero tienen un carácter tímido y apacible.

Existen otras muchas enfermedades con alteraciones de los cromosomas. En el síndromede Künefelter,el trastorno se presentaen los cmmosomassexuales; el Canotipo anormal es 4na;Y, pero también puede ser 47XXXY ó 47XXXXY. Estos enfermos son estériles y con ligera disminución de la inteligencia.

Mitosis: Se le llama mitosis al proceso medianteel cual se produce la duplicación de las

células eucariotas, este proceso ocurre en la fase M del ciclo celular (capítulo 24). Al llegar a la mitosis los componentes celulares se encuentran duplicados. La mitosis es el proceso de separación de los componentes celulares entre las 2 células hijas.

Por su complejidad y para facilitar su descripción se suele dividir en 4 etapas:

1. Profase. 2. Metafase. 3. Anafase. J. Telofase.

Aiites de la primera etapa, ya han estado ocurriendo cambios en la célula, pues la croiiiatiiia ha comenzado a condensarse y el nucléolo a desaparecer. En el citoesqueleto ocurren eariibios también, pues aunquelos filamentosintermedios noexperimentan cambios, los filamentos de actina, miosina y los microtúbulos se «desensamblan».

1. Profase. Fnnnaci6n del huso d l k o y ia desintegraa6n de la envoltura nuclear. Los 2 centríolos, cuya división ya había comenzado en la fase S, se encuentran en uno de los polos de la célula, ocupando, uno con respecto al otro, una posición perpendicular. Se encuentran rodeados de una zona opaca que se tiñe poco y que a partir de ella se "ensamblan" los microhíbulos,formando los 2 ásteres (áster significa estrella). Los iiiicrotúbulos (capítulo 22) se «ensamblan» o «desensamblan*> por sus extre- nios. pero por uno de esos extremos estos procesos son más rápidos; a este último se le denomina el extremo positivo, y al otro el negativo. En losmicrotúbulos que se forman a partir de los centríolos, los extremos negativos quedan inhibidos y situa- dos en la zona que rodea a los centríolos; el extremo positivoes el másalejado de los centríolos y al crecer va alejando a los centnolos cada vez más hasta colocarlos en extremos opuestos del núcleo; en esta posición, el núcleo se observa rodeado .~ ~ . ,' por los filamentos que quedan tendidos entre ellos como rayos que unen a 2 soles, y en el centro sus extremos positivos se interdigitan (Fig. 23.13). En el núcleo también han ido ocurriendo cambios. La cromatina se ha ido conden- o"

~ ~

~ ~ . . 4 sando y aproximando a la envoltura nuclear y en el centro del núcleo aparece un vacío; la condensación de la cromatina es cada vez mayor y se llega a notar en el

~ - microscopio óptico, que cada uno de ellos está formado por las cromátidas herma- .,-

nas unidas por el centrómero. La lámina nuclear se hiperfosforila y se disgrega. La laminina A se hace soluble, y Fig. 23,13, El huso rodea laB permanece unida a las vesículas quese forman al fragmentarse la envoltura nuclear; esto es probable que las marque, y que sin dudas sea el sitio de reconocimiento cuandoen etapas posteriores de la mitosis se reconstruya la euvoltura nuclear. La desintegración de la membrana marca el final de la profase.

2. Metaiase. La orientación diredonal de los cromosomas en el plano ecuatorial. Una vez «desensamblada» la envoltura nuclear, los microtúbulos polares se introducen en la zona que ocupaba el núcleo, y quedan entre ambos polos inva- diendo esta zona con sus extremos positivos interdigitados (Fig. 23.13). Los cromosomas se mueven durante la metafase hasta que ocupan un plano que queda perpendicular entre los 2 polos, a este plano se le denomina placa ecuatorial. En este movimiento parece intervenir el «ensamblaje» y «desensamblaje» de los mi- crotúbulos, y llegan a ocupar la placa ecuatorial cuando se establece un equilibrio entre el «ensamblaje>* y «desensamblaje» por ambos lados del cromosoma. El "desensamblaje" atrae a los cromosomas hacia los ásteres, pero con mayor iutensi-

Microtúbulos polares

c) ,, .

1 ....,

~icrotúbul& del cioetocoro

Fig. 23.14. Etapa? de la mitosis. (a) Solo se representa a uno de los Cromo- samas. La orientación se logra al contactar los microtúliulos de cada rinetoeuro, a ambos lados del cromosuma, con la zona que rodea a las eentriolos. (b) Separa- ción de las cromútidm. (e) Fuerzas que al parecer producen la separa- ción de las cromátidas. Iro. Una de ellas parece ser la separación de los eentríolas y se observa una menor interdigitación de los mierotúbulos polares. Zdo. La otra pudiera ser el acortamiento de los microtúbulos del einetororo.

Fig. 23.15. La citocincsis. En el ecuador de la célula en división se forma un anillo de aetina que se va eonstriñendo.

dad, mientras más alejados se encuentran de los polos; en cambio es menor cuando están más cercanos. La situación de equilibrio puede durar algún tiempo, y la mitosis por ello puede durar un tiempo mientras queda detenida en esta fase (Fig. 23.14a).

3. Anafe. La separación de las cmmBOdas. La separación de las cromátidas comienza de forma simultánea en todos los cromosomas y continúa con el movimiento de aquéllas hacia los polos (Fig. 23.14b). Aunque el mecanismo es desconocido, una hipótesis que intenta explicar la sepa- ración brusca y simultánea de las cromátidas es la siguiente: por un proceso de regulación desconocido, los centrómeros terminan de duplicarse y como aquéllas permanecían unidos por éstos, al terminar de dividirse en 2 se separan. La migra- ción de cada cromátida a su polo se realiza a una velocidad aproximada de 1 pm por minuto y aparentemente responde a 2 tipos de fuerzas (Fig. 23.14~). Una de estasfuenases ladel continuo «desensamblaje» de los microtúbulos del cinetocoro en la zona que rodea a los ásteres y que provoca el acortamiento de los filamentos, y la aproximación cada vez más de la cromátida a los polos. La otra fuerza, que aleja los polos entre sí y que alarga al huso, depende, parece ser, del deslizamiento entre los extremos de los microhíbulos polares. La disminución de la interdigitación entre ellos disminuye por un movimiento de deslizamiento; en este movimiento parece intervenir una proteína parecida a la dineina de los cilios y flagelos; se ha demostrado que no intervienen la actina y la mimina. En esta fase se observa el progresivo movimiento de los cromosomas hacia los polos de la célula, molimiento en el cuál los centrómeros parecen arrastrar a los cromosomas tras de sí. Los filamentos de los cinetocoros se acortan hasta un quinto de su longitud original.

4. Telofase. Reaparición del núcleo. Al terminar la migración de los cromosomas, desaparecen los microtúbulos; comienza la descondensación de los cromosomas y se adosan a ellos las vesículas de la envoltura nuclear, que casi rodean a cada cromosoma antes de fusionarse entre sí. Las proteínas desfosforiiadas de la lámina nuclear p m n que orientan el «ensamblaje> dela membrana, quizás al poümerizaise ellas. Las proteínas de los poros reaparecen,tennina el «ensamblaje» de la membrana, también finaliza la descondensación de la cromatina y comienza la síntesis de ARN, así como la formación del nucléolo. En esos mismos instantes está ocurriendo la citocinesis, que no es más que la división del propio citoplasma celular que resulta de la formación de las 2 células hijas (Fig. 23.15). Durante la anafaseseforma por debajo de la membrana citoplasmáticaun anillo de fibras de actina y miosina, cuya localización se corresponde con la placa ecuatorial del huso. El mecanismo regulador que controla su formación es desconocido, así como también lo son los cambios que ocurren al nivel de este anillo, el cual con el tiempo se va cerrando cada vez más. En el exterior de la célula se observa la formación de uncanal circular queva profundizándose hasta Uegar a individuali- zar a las 2 células hijas. Debajo de la membrana plasmática, el grosor del anillo no varía a pesar de ser cada vez menor su circunferencia, por lo que se presume que de alguna forma se eliminan moléculas de actina y miosina. Al final desaparecen estas proteínas por completo, y entre ambas células queda un puente formado de membrana plasmática, los filamentos interdigitados muy compactados entre sí y una sustancia muy condensada; después las células se separan. Como los organelos de la célula se encontraban en cantidad suficiente y distribuidos por todo el citoplasma, al producirse la citocinesis quedan repartidos entre las 2 células hijas.

El núcleo, orgaaelo propio de los orgauismos eucariontes, está formado por una membrana o envoltura nuclear, la uomaOna, al menas un nucléolo y el jugo nuclear o nucieoplasma

La envoltura nuclear está constihiida por 2 membranas con un espacio intermembranoso entre eUas y la atraviesan poros, a iravés de los cnaies se ponen en comunicación el nueleoplasma con el citoplasma, pero por los cuáles s610 pasan algunas sustancias @aso selectivo). La membrana externa nuclear se parece mucho al r e t i d o endoplasmático rugoso, y de hecho, es una conünuación de ésie. Por el contrario, la membrana interna nuclear no contiene ribwmas en su superficie y además, se relaciona por su parte más interna con una orgadzaci6n especial protefniea: la Iámina nuclear, formada por 3 proteínas. Esta estnidura es importante, pues regula la desagregación y la agregación de la envoltura nuclear duran- telamitosis.

El nucléolo es el sitio de formación de los ARN ribosomales, pero además allí se aensamblanm &cm con las proteínas ribosomales, sintetizadas en el citoplasma, y se forman Las 2 subunidades del ribosoma que luego salen por los poros hacia dicho espacio celular.

La cmmatina es la forma de organización del material genético durante la interfase; en esta fase del ciclo celular se Ueva a cabo, de forma intensa, la síntesis de ARNm y del propio ADN; estos procesos se fadlitan, ya que la cromatina está en forma descondensada.

Al comenzar la mitosis, la cromatina se condensa miles de verm y se forman los cromosomas que ya contienen al material genético duplicado, en forma de cmmátidas. La mitosis se ha dividido en 4 etapas para su estudio; en ellas se observan la condensación de la cromatina hasta la formación de los cromosomas, la desaparición de la envoltura nuclear, la formación del huso mit6tico, la migración de Las cmmátidas hacia el ecuador del huso, la separación de las cmmátidas hacia los polos del huso, la formación de 2 núcleos y finalmente, la división del citoplasma celular entre Las 2 células hijas; todas estas etapas garantizan que estas nuevas 05Ilnlas posean el mismo material genético, así como el resto de los componentes celoleres.

1. Haga un esquema del núcleo, en el que aparezcan el máximo de detalles posibles representativos de su estructura.

2. Confeccione 2 listas de compuestos. En una de ellas mencione aquéllos que deben atravesar los poros de la envoltura nuclear del núcleo al citoplasma y en la otra lista,los compuestos que atraviesan los poros en el sentido contrario.

3. Haga un esquema de lo que ocurre: a) En el centro del nucléolo y descríbalo. b) En un lugar intermedio entre el centro del nucléolo y Lascapas más externas. c) En la superficie.

4. Compare los procesos de profase y anafase. 5. Busque en algún libro de Medicina Interna 2 enfermedades relacionadas con

alteraciones del cariotipo. Diga cuál es la alteración cromosómica existente y cuá- les son sus cousecuencias.

Resumen de la d ó n

Terminado el estudio de esta sección, el lector habrá podido percatarse de la complejidad de la organización celular. Este tema se completará cuando, en capítulos posteriores, se consideren la estructura y función de otros organelos, los cuales se tratan en forma muy vinculada a las funciones metabólicas y de otra índole que ellos realizan; tal es el caso de las mitocondrias y los ribosomas.

Durante toda la sección se puso de manifiesto la importancia general del& membranas en la organización del sistema celular. Tres de los capítulos de esta sección estndian diferentes membranas, de modo exclusivo, o vinculadas con otras estmcturas ("Membranas biológicas", "Organelos membranosos intracelnlares" y "El núcleo celular").

Resulta de gran interés que el lector haya comprendido la función de las diferentes biomoléculas y las interacciones que establecen unas con otras en la organización y función de los componentes celulares. Sin embargo, también debe resultar claro que las propiedades de los diferentes organelos no son una simple suma de las de sus constituyentes moleculares, sino que éstos integran sistemas que manifiestan propiedades y funciones que les son características y cualitativamente nuevas.

La membrana plasmática se estndió como prototipo demembrana biológica y a ella se refirió, en primer lugar, el modelo de mosaico fluido, aceptado universalmente en la actualidad para explicar las estructura y funciones, no sólo de la membrana plasmática, sino de las membranas biológicas en general.

La membrana plasmática, como se expresó, no es una simple barrera que Limita a la célula de su entorno, sino que se trata de un organelo muy activo y dinámico que participa en el paso selectivo de sustancias a través de ella y en ambas direcciones, sobre todo en virtud de las proteínas transportadoras específicas en ella localizadas.

Los organelos membranosos intraceinlares cumplen importantes funciones generales relacionadas con la compartimentación del espacio intracelnlar, el establecimiento de gradientes de concentración, la disponibilidad de áreas de superficie, el incremento de las velocidades de los procesos metabólicos y la propia generación de nuevas membranas.

En particular el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi se vinculan con la síntesis y procesamiento de biomoléculas, especialmente proteínas y Iípidos. El últi- mo de los organelos citados participa en la orientación del material sintetizado hacia distintos lugares de la célula o incluso hacia su exterior.

Los lisosomas por su parte intervienen enia degradación de biomoléculas que Pueden provenir del exterior o ser material de la propia célula. Por último, los

peroxisomas intervienen en reacciones de descomposición del H,O, y de detoxifkación. El citoesqueleto constituye un elemento fundamental de la arquitectura celular,

ya que posee una dinámica notable, dada sobre todo por la continua formación y desintegración de los diferentes filamentos y túbulos que lo constituyen. En estos procesos participan,además, diferentes enzimas y otros tipos de proteínas reguladoras.

El núcleo celular es un organelo de elevada complejidad y sus constituyentes fundamentales son las moléculas de ADN donde se conserva la información genética de las células. Este material adopta diversas formas organizativas durante el ciclo de reproducción de la célula y la más organizada son los cromosomas, que intervienen en el proceso de la mitosis.

Para concluir este resumen seiiataremos que si bien la organización didáctica del contenido obliga a estudiar los diferentes organelos de manera separada, éstos no deben ser considerados como entes totalmente independientes, sino que ellos funcionan como un sistema muy coordinado, lo cual ha sido puesto en evidencia en esta misma sección y será reiterado a lo largo de todo el texto.

To

\ n esta sección se tratará el estudio de la genética molecular, lo que equivale a decir, que se estudiarán los fenómenos relacionados con la herencia de las E características propias de los seres vivos, desde el punto de vista de los análi-

sis de las estructuras, propiedades y funciones de las moléculas que en estos procesos intervienen.

Todas las macromoléculas que participan en estos procesos se caracterizan por presentar propiedades informativas, por lo que en el primer capítulo se discuten brevemente algunos aspectos fundamentales de la información molecular y de su transferencia, así como su momento de expresión durante el ciclo de vida de la célula. Toda la sección está prácticamente encaminada al estudio de las 3 grandes vertientes que tienen que ver con la información genética, o sea, su trasmisión, conservación y expresión.

Lasección comienza con el breve análisis en el capítulo 24 del complejo proceso dela transferencia de información en los seres vivos, sus formas de expresión, así como los momentos del ciclo celular donde se hacen más evidentes estos mecanismos; en este mismo capitulo se hace un hreve estudio del ciclo celular y su regulación.

El fenómeno de la trasmisión de la información genética se refiere al hecho comprobado de que los seres vivos pueden trasmitir sus características a sus descendientes, haciendo que éstos sean esencialmente iguales a aquéllos, pero dentro de un amplio margen de variabilidad. El fundamento molecular de estos 2 aspectos se discute en el .

rnado de Biochernistry. Lubert Stryer. Cuarta edición. 1995

capítulo 25, dedicado a la replicación del ADN que garantiza la estabilidad de la información que se trasmite,en tanto en el capítulo31, dedicado a la recombinación genética y el 32 a las mutaciones, se analizan las diferentes fuentes de diversificación.

La conservación de la información genética implica varias faceta: en primer lugar la organización en cada organismo de las moléculas que la portan, que es contenido del capítulo 26 "Organización del Genoma Eucariunte"; en segundo lugar los mecanismos que mantienen y reparan las moléculas que han sufrido algún daiño, esto se trata en el capítulo 33 "Conservación de la información genética".

Cada organismo, para ser cual es, debe expresar la información que contiene en su material genético; este aspecto es uno de los más complejos, pues esa información debe ser copiada primero en una molécula específica de ARNm, como se verá en el capítulo 27 "Transcripción del ADN", y después en la secuencia de aminoácidas de las proteínas como se estudia en el capítulo 30 "Traducción". Para ello es necesaria la existencia de una relación entre estos 2 tipos de moléculas y por eso se dedica el capítulo 28 al estudio del código genético, en tanto en el 29 se trata el estudio de los ribosomas, que son los orgauelos dondeocurre la síntesis de proteínas. Una eficiente expresión de la información genética requiere de mecanismos de control que serán estudiados en el capítulo 34 "Regulación de la Expresión Genética".

Para terminar la sección se ha considerado conveniente incluir en el Capítulo 35 "Tecnología del ADN Recombiante" algunas aplicaciones de los conocimientos de la genética molecular, sobre todo aquéllus relacionados con la práctica médica.

El campo de conocimientos de la genética molecular se ha desarrollado extraordiiia- riamente en los últimos 30 años y en esta sección no se pretende hacer un análisis de todos los procesos relacionados con ella, ni siquiera hacer un estudio por~iieiiorizado de los mecanismos que aquíse exponen. Ha sido necesario hacer una selección cuida- dosa del contenido, teniendo en cuenta que este texto está dedicado principalulente a estudiantes de ciencias médicas, y de ahí la constante referencia a aquéllos aspectos que más o menos de forma directa pueden estar vinculados con esa esfera de conoci- ~iiieiitos.

Una de las características más sobresalientes de los seres vivos es la de poseer, conservar y trasmitir a sus descendientes un elevado grado de organización, que constituye a su vez un requisito indispensable para su funcionamiento. El tipo, el número y la composición de sus moléculas, la forma de disponerse en las células, sus intemlaciones mutuas, la especialización y diferenciación en la formación de órganos y sistemas, etcétera, están determinados desde el momento en que un ser comienza a existir. De la intemlación entre el organismo y el medio dependerá que esas caracterís- ticas se manifiesten en toda su intensidad. En este capítulo se tratarán los aspectos más generales que están relacionados con la forma en que esa elevada organización se deriva de propiedades específicas de moléculas concretas.

En los capítulos anteriores se ha hecho referencia a un término que tiene gran significado biológico, que en este momento es necesario profundizar para lograr una mejor comprensión del contenidodelas páginas siguientes; ese término es el de infor- mación molecular.

La información molecular es el fenómeno por medio del cual las estructuras hioló- gicas adquieren,mantienen y trasmitenun elevado grado de organización, a pesar de la tendencia natural al desorden. Existen definiciones más o menos complejas del término, incluso hasta con formulaciones matemáticas, que a este nivel de interpreta- ción no resulta necesario discutir.

En todos los casos el término está caracterizado por 2 rasgos básicos generales. Por una parte, su asociación con la disminución de la entropía, que caracteriza el funcionamiento general de los sistemas vivos y, por otra, su indisoluble vinculación con lo variado, lo diverso y lo diferente.

Lo más característico en la composición química de los seres vivos es la existencia de las macromoléculas, a partir delas cuales se forman todas las estructuras celulares, cuyas funciones son en última instancia las resultantes de las propiedades, las funciones !. las forma3 específicas de organizarse las macromoléculas que las constituyen. Es precisamente la organización estructural de esas macromoléculas la que condiciona la aparición de la información molecular.

Formas de la infonnaci6n molecular

Es necesario precisar que al nivel molecular podemos distinguir2 tipos principales de información: la información por secuencia o secuencial, y la información por conformación o conformacional.

La secuencial corresponde a macromoléculas donde se da en un todo armónico la unidad de lo monótono y lo diverso,pero donde lo diverso desempeña una funciónde codificación, la de constituir un conjunto de signos sucesivos con un ordenamiento lineal y con una significación precisa. Esta forma de organizarse la información es la más adecuada para su conservación porque puede existir en macromoléculas de elevada estabilidad, tanto química como metabólica, con lo cual puede mantenerse inalte- rable durante un tiempo prolongado. Del mismo modo esta forma es la más adecuada para su trasmisión, ya que por mecanismos más o menossencillos de codificación se puede reproducir esa información organizada de forma lineal como la sucesión de elementos diversos a lo largo del eje covalente de la macromolécula y distribuirlade manera equitativa en los organismos descendientes.

Pero este tipo de información, debido principalmente a estos factores, no es todo lo funcional quese requiere para dar cuentade las múltiples y diversas actividadesde un organismo, aunque se trate del más simple o el más complejo. Esto significa que no puede expresarse directamente mediante la realización de otras funciones específicas que no sean conservar y trasmitir su contenido.

La información conformacional está contenida también en macromoléculas, donde existe la unidad de lo monótono y lo diverso, pero este último se distribuye en las 3 dimensiones del espacio, ocupando posiciones precisas que hacen posible la realiza- ción de funciones específicas, determinadas por esa disposición espacial.

Esta distribución permite, por un mecanismo de complementaridad espacial, el reconocimiento de moléculas específicas de igual o diferente naturaleza. Esta forma de organizarse la información presenta serias dificultades para su conservación, pues estas estructuras tridimensionales se mantienen generalmente por interacciones débi- les y porello no presentan gran estabilidad. Su utilidaden la trasmisiónesaún menor, puesse trataría de duplicar y después distribuir equitativamente todas y cada una de las moléculas con funciones específicas en las células, de manera que las células hijas contengan la misma información que aquélla que ledio origen.

El fenómeno de la identificación o reconocimiento molecular es el nivel básico de manifestación de la información conformacional, pues mientras una molécula no po- sea la propiedad de reconocer o idenoficar a otra, no podrá la primera realizar ninguna acción específica sobre la segunda,^ lo que es lo mismo no podrá realizar funciones definidas.

Para que este reconocimiento se produzca las moléculas deben tener determinadas características estructurales, debe existir un sitio ubicado en la ~ u p e ~ c i e de la molécu- la, construido a expensas de la estructura tridimensional. Estesitio debe poseer una conformación complementaria a la sustancia que va a reconocer y presentar grupos químicos en posiciones precisas que permitan una interacción atractiva, generalmente no covalente, entre las 2 moléculas.

Una vez realizada la identificación se produce una reacción de inmovilización de la sustancia reconocida, formándose complejos que según el caso pueden tener diferentes destinos. La identificación puede ser seguida de acciones diferentes, según las propiedades de la macromolécula dada, unas veces ocurre la transformación de la sustancia reconocida, otras, suceden modificaciones de la actividad específica de alguno o todos los componentes del complejo, y en determinadas ocasiones se dan las 2 situaciones anteriores. En muchos casos el destino de este complejo y los mecanis-

mos por los cuales se realiza no han sido esclarecidos suficientemente, como sucede con el complejo antígeno-anticuerpo, como veremos en el capítulo SO. En resumen, los 4 estratos básicos de manifestación de la información conformacional serían:

1. Reconocimiento-inmovilización-hirnsconfoón. 2. Reeonocimiento-inmovilización-transeonformación-modulación. 3. Reconocimiento-inmovilización-transconformación-translocalización. 4. Reconocimiento-inmovilización-transconformación- ?

Nótese que en las 4 casas la idenaficación representa la primera etapa del proceso. A diferencia de la información secnencial, la información conformacional presen-

ta diferentes grados de actividad funcional. Para que un grupo de moléculas pueda realizar funciones diversas y específicas debe poseer información conformacional.

li.ansferencia de información

En capítulos anteriores ha quedado demostrado que en las macromoléculas funcionales, la conformación depende de su estructura primaria, de su secuencia, por lo que en éstas se funden los 2 tipos de información: la secuencial y laconformacional. Puede decirse que en estas moléculas la información contenida en la secuencia es precisamente la de cómo construir la estructura iridimensional. En ellas se produce la transición de lo secuencial a lo conformacional.

Pero la información secuencial, como hemos visto, es la adecuada para la trasmi- sión, por lo tanto, ésta debe provenir de otra molécula que sólo contenía este tipo de información y la de esta última, provino a su vez de otra macromolécula con informa- ción también de tipo secnencial.

En esto consiste una de las principales regularidades que se observa en los organismos vivos y que se refiere a la forma en que fluye lainformación en las células. No importa el número de etapas en que el proceso se desarrolle, ni los mecanismos moleculares implicados en cada una de ellas, ni las formas específicas en que lo realiza cada organismo particular: la información molecular se trasmite siempre desde una molécula con información secuencial hacia otra molécula con información conformacional; esto es lo que hemos denominado principio de transferencia de infor- mación.

Esa transferencia de información se manifiesta en los organismos vivos mediante 3 mecanismos básicos. El primero -la conservación- tiende a mantener la información lo más invariable posible, utilizando estmcturas de elevada estabilidad y procesos de rectificación y reparación. El segundo -la trasmisión- garantiza el paso de la informa- ción de un organismo a sus descendientes con el más elevado grado de fidelidad, de modo que todos los descendientes posean en esencia la misma información. El tercero -la expresión- consiste fundamentalmente en la dirección de la síntesis de moléculas, dondese produzca la transición hacia la información conformacional, y ésta se exprese en funciones específicas que permitan el mantenimiento, desarrollo y reproducción del organismo que la posee.

Estos 3 procesos se llevan a cabo en diferentes momentos de la vida celular, por lo cual a continuación se hará un estudio somero de las características de los principales estados o fases por los que atraviesa una célula durante su vida.

Todas las células al pasar de una generación a la siguiente experimentan una secuencia periódica de eventos que recibe el nombre de ciclo celular.

En muchos microorganismos y en células cultivadas de organismos superiores, tie-

Componentes celulares y Genética molecuiar 429

Fig. 24.1. Estudio de la replicaeión del ADN durante el cielo celular. (a) El eon- tenido celular de ADN aumenta de manera brusca en un momento determinado del cielo celular y define el periodo S. (b) La ineorpora- eión de [Y]-timidina durante el ciclo celular presenta un incremen- to que se corresponde con el pe- ríodo S y después desciende. Am- bas experiencias demuestran el carácter discreto de la síntesis del ADN.

nen lugar, previo a cada división, la duplicación casi exacta del tamaño de la célula y del númerode suscomponentes moleculares. Enmuchos huevosfertüizados, por oha parte, no se produce incremento del tamaño y, aparte del ADN, sólo un número reducido de moléculas se duplican durante las primeras divisiones celulares, esto se conoce como clivaje. La mayoría de las células que forman parte de los animales y las plantas caen dentro de una categoría intermedia, en la que existe generalmente una duplicación del tamaño celular, pero sin una duplicación exacta de todas sus moléculas.

La síntesis de los componentes celulares a lo largo del ciclo puede realizarse de forma continua o discreta. En este último caso su período de síntesis puede ser largo o corto y pudiera ocurrir en cualquiera de las etapas del ciclo.

El período o etapa que presenta cambios fácilmente observables al microscopio es, sin lugar a dudas, la división celular, que ya fue estndiada en el capítulo 23. Como el mecanismo básico general de la división celular es la mitosis, este período se designa como M. En un principio el ciclo celular se describía como formado sólo por 2 etapas: la mitosis (M) y el resto denominado interfase por encontrarse entre la telofase (última fase de una mitosis) y la profase (primera fase de la siguiente).

Otro evento de singular significación dentro del ciclo celular es el proceso de duplicación de la información genética, o sea, la síntesis del ADN, éste se conoce como replicación o autoduplicación y es el que hace posible que durante la mitosis cada célula formada contenga la misma información genética, haciendo que ambas sean de la misma estirpe celular.

Para determinar si la síntesis del ADN se producía de forma continua o discreta se realizó un experimento sencillo, pero concluyente. Se cultivaron células en un medio adecuado hasta obtener una población celular grande. En un momento determinado se le añade al medio ['4C]-timidma, a los pocos momentos el cultivo se lava para eliminar el exceso de reactivo, las células se fijan y la preparación se recubre de una película fotográfica -procedimiento conocido como autorradiografía- y después de un tiempo prudencial se revela la película.

Este experimento se basa en una idea muy simple. Si la síntesis del ADN se produce de forma continua durante todo el ciclo celular todas las células incorporarán [l4C1-timidina, pero si se realiza deformadiscreta, sóloincorporarán ['TI- timidinalas que en el momento de la exposición estén en el período de síntesis. Como puede apreciarse en la figura 24.1 los resultados fueron concluyentes: la síntesis del ADN se realiza de forma discreta en un momento determinado del ciclo.

Este proceso define otra de las etapas que, debido a estar caracterizada por la actividad de síntesis del ADN, se le ha denominado período o etapa S. Este proceso ocurre en un período que está separado de la división por 2 etapas conocidas como G, (entre M y S) y G, (entre S y M). La denominación de estos períodos proviene de la inicial de la palabra inglesa gap que significa brecha, hueco o hendidura.

Esta situación ha sido comprobada en múltiples organismos eucariontes, por lo que se considera que tiene carácter casi universal.

Para calcularla duración de las diferentes etapas del ciclo celular se procedió de la forma siguiente: mediante control visual se estableció que la fase M (mitosis) duraba aproximadamente 1 hora. El ciclo celular deM a M era de 26 horas. A un cultivo de células HeLa se añadió [3H]-timidina durante un breve tiempo y se fueron obteniendo muestras del cultivo en intervalos regulares de tiempo, para analizar el número de células que aparecían marcadas durante el período de mitosis. Las primeras células mitóticas no estaban marcadas y lo mismo sucedía con las siguientes, hasta unas 6 ó 7 horas después de la exposición a la ['HI-timidina; en ese momento el número de células marcadas crecía extraordinariamente. Era razonable pensar que estas primeras células mareadas eran las que estaban en la parte final del período S cuando se produjo la exposición; de esta manera pudo establecerse que la duración del período G, era de 6 horas. El mismo razonamiento condujo a dilucidar la duración de las demás etapas del ciclo. Unas 17 horas después de la exposición, el número de células mitóticas marcadas deseendía abmptamente,de ahíquela duración del período S seestableciera

en 17 - (6+1) = 10 horas, y el período G, duraría 26 - 17 = 9 horas (Fig. 24.2). En las células de los organismos adultos, la duración de los períodos M y S son

prácticamente constantes, de abíque las variaciones en la duración del cid0 dependen fundamentalmente de la duración de los períodos G, y G,, en especial del primero.

En organismos superiores es frecuente encontrar células especializadas que no se dividen o lo hacen raras veces. En estos casos, después de la división celular (M), la célula pasa a un estado metabólico particular que se diferencia esencialmente del período G,. Hace algunos años paracaraeterizar este estado se introdujo el concepto de período Go; para que una célula en este estado pueda llegar a dividirse tiene que introducirse primero en el períodoG,,en el cual se producen las condiciones necesarias para la replicación del ADN primero y la división celular después. En las células embrionarias de los primeros estados G, y G, casi no existen y aún se produce un acortamiento del período S, por un mecanismo que se estndiaráen el capítulo próximo, haciendo que el ciclo celular ocurra a gran velocidad.

Actividad biosintética durante el cielo celular

Para el estudio de la síntesis de los diferentes componentes celulares y sus variaciones durante el ciclo es necesario contar con células de crecimiento sincronizado, aue todas se encuentren en el mismo oeríodo del ciclo celular.

Todos los métodos descritos para la obtención de cultivos de células de crecimiento sincronizado pueden dividirse en 2 grupos: los de selección y los de induc- - -

ción. Generalmente los de selección tienen un rendimiento mucho menor que los de inducción.

Los métodos de selección consisten en aprovechar alguna propiedad especial de las células en algunas de las etapas del ciclo y, haciendo uso de ella, separarlas del resto. Por ejemplo, las células en G, son mucho más grandes que en G, y por ello es posible separarlas por centrifugación en gradiente de densidad (Fig. 24.3).

Los métodos de inducción química tienen un uso más generalizado y dependen

Fig. 24.2. Duración del ciclo celular en una célula animal típica. Los períodos de división celular (M) y de sínte- sis del ADN (S) están separados par 2 fases de duración variable U, y G,. El período Gu se utiliza para tipificar la situación de eélu- las que no se dividen o lo hacen raras veces, como las células espc- cidiradas de les organismos superiores. Aunque ubicados en igual posición en el esquema hay diferencias esenciales entre los perío- dos G. Y G . Los números dentro ,. " del círculo representan la duración en horas de cada una de las perío- dos en una célula animal típica.

Fig. 24.3. Sincranización por selección. (a) Las células cultivadas se colocan en tubos de centrífuga que contienen ficol en una concentración que va desde S % en la boca hssta 10 % en el fondo, creando así un gradiente de densidad.(b) Al ser eentrifugadas las células se desplazan hacia abajo, acumulándaae en una zona donde su densidad corresponde con la del medio de centrihgación. (t) Como las células en U, son muy grandes se desplazan mucho más hacia el fondo. El tubo se perfora par el fonda y se obtiene Is fracción que contiene las células en penada G,, y se cultivan nuevamente.

Componentes celulares y Genética molecular 431

/

Fig. 24.4. Sincronización por inducción. Un cultivo de células se incorpora a un medio que contiene timidina suficiente para alcanzar una con- centración final de 2 mM durante un tiempo igual a G, + M + G, (A). Como la timidina en esa concen- tración inhibe la síntesis del ADN, las células van acumulándose al final de G,. El inhihidor se retira (B) y después de algunas ciclos de división celular el proeedimifnto se repite (C), con la cual se logra un rendimiento considerablemente mayor.

de la acción selectiva de un inhihidor. Inhibidores de la síntesis del ADN como la fluordesoxiuridina, la hidroxiurea o elevadas concentraciones de timidina (2 mM) bloquean el crecimiento celular en el período S, mientras que inhihidores de la mitosis como la colchicina, lo hacen en metafase. Después de retirar el inhibidor, las células acumuladas en la fase del ciclo anterior donde actuó el inhibidor empleado, continúan el ciclo sincronizadamente. Se puede aumentar el rendimiento si el procedimiento se reaite más de una vez mic. 24.4). . -

Utilizando células de crecimiento sincronizado se han podido estudiar los procesos de síntesis de los principales componentes moleculares de las células.

Para determinar el momento del ciclo, cuando se produce la síntesis de un componente específico, pueden seguirse 2 procedimientos: medir durante todo el ciclo el contenido celular de ese componente, o medir la actividad hiosintética por la incorpo- ración de precursores marcados de forma radiactiva.

En contraste con la replicación, la síntesis de los ARN estudiada por la incorpora- ción de [3H]-uridina, parece ser continua durante todo el ciclo, con excepción de la mitosis, tanto en animales y plantas como en microorganismos.

La intensidad de este proceso, conocido también como transcripción, va aumentando en la medida que avanza el ciclo y comienza a disminuir en G, para llegar prácticamente a cero durante la mitosis. Los estudios realizados indican que al menos en la mayoría de las células esta situación ocurre con los 3 tipos principales de ARN (mensajero, rihosomal y de transferencia) (Fig. 245).

.r:

Fig. 24.5. Estudio de la transcripción durante el ciclo celular. (a) El contenida celular de ARN total aumenta de forma continua durante el cielo celular y sólo comienza a disminuir al final del período G,. (b) La

[jp2 - =

incorporación de un precursor de los ARN como la ['HI-uridina durante el cielo celular, va inirementándose hasta la parte final del U

periodo G,, donde desciende lentamente. Estas 2 experimentos evi- dencian que la síntesis de los ARN, la transcripción, se produce do manera ininterrumpida durante el cielo de vida de la célula, con excepción de la mitosis. (b)

Las proteínas en general tienen una síntesis continua a lo largo de todo el ciclo, con una marcada disminución durante la mitosis, como se evidencia por la incorpora- ción de ['HI-prolina. Esto concuerda con lo expresado para los ARN mensajeros, como se verá más adelante. No obstante, existen grupos de proteínas específicas cuya sín- tesis es discreta, esto es sólo en un período determinado del ciclo. Tal es el caso de las histonas cuya síntesis selimita al período S, simultáneo con la duplicación del ADN. El proceso de síntesis de proteínas recibe el nombre de traducción (Fig. 24.6).

El estudio de la síntesis de los lípidos de membrana se hace mucho más difícil por la heterogeneidad estructural de estos compuestos. Sin embargo, las experiencias midiendo la incorporación de ["HI-colina o ["]-inositol permiten afirmar que estos componentes celnlares también se sintetizan de forma continua durante el ciclo celular (Figura 24.7).

Estndios similares demuestran que también es continua la síntesis de polisacáridos complejos y otros componentes celulares.

Si se estudia la velocidad de síntesis de muchos de estos componentes y se calcula el incremento de concentración que debía producirse en un período determinado, y se compara con el incremento que realmente se ha producido, determinado de manera experimental, se comprueba que el incremento observado es siempre menor que el esperado.

Esto significa que los componentes celulares esián sometidos a un recambio constante, o sea, que son degradados constantemente. Los incrementos de concentración que se prodncenson entoncesla resultantedela intensidad con que transcurren los 2 procesos contrarios: la síntesis y la degradación. Estos resultados constituyen una evidencia más del principio del recambio continuo.

Los fenómenos de conservación. trasmisión v exnresión de la información genética u .

esián ubicados de forma continua o discreta a lo largo del ciclo celular; su ubicación y los mecanismos moleculares de esos procesos, son los aspectos que serán abordados en los capítulos siguientes.

fig. 24.7. Estudio de la síntesis de lípidos de membrana durante el cielo celular. (a) La figura muestra que el contenido celular de fusfolipidos aumenta de forma continua durante el ciclo celular. (b) Resultado del estudio de incorporación de ['HI-colina (precursor de la síntesia de fosfatidil-colina y esfingomielinas) muestra que ésta es continua durante el ciclo. Los 2 experimentos dcmucstran que al igual que otros componentes moleiulares, la sintesis de las lípidos de las membranas es un proceso continua.

Fig. 24.6. Estudio de la traducción durante cl cielo celular. (a) El contenido total d e prnir inas celulares se incremcnta de forma continua diirante el ciclo celular. (0) La incor- poración deaminoácidos a las pro- teínas, medida con PHI-prolina sc producc con intensidad variahle durante todo el ciclo. Los resultados de estos experimentos confir- man que la síntesis de proteínas se produce de forma continua.


434 lh

Reguiacih del cielo celular

Era de esperar que un proceso tan importante como el ciclo celular estuviera bajo un preciso sistema de regulación, pera hasta la segunda mitad de la década de los años 80 estos mecanismos eran casi desconocidos. Debido a los progresos alcanzados en el estudio de la transformación cancerosa se ha logrado comenzar a penetrar en las carac- terísticas moleculares de esos mecanismos. Quedan aspectos esenciales por resolver, pero existe en el momento actual una visión bastante aproximada de los mecanismos moleculares básicos que controlan el ciclo celular.

En este procesa existen mecanismos positivos que estimulan la proliferación celular, y los negativos, que la inhiben. En ambos casos, al menos en las células en cultivos y las de los individuos adultos, las señales estímulos quedesencadenan Las respwstas,provienen del exterior de la célula. El grupo mejor conocido de señales positivas está constituido por un gmpo de polipéptidos conocidos como factores decrecimiento, los cuales son especüicos para tipos particulares de células. Estos factoresseunen con receptores espe- cüicos localizados en la superficie celular; a partir de esa unión se produce la activación de un gmpo de proteínas quinasas, que en forma de cascada enzimática, van transñriendo lainformación mibidadel exterior hacia el núcleo celular, donde se activa la replicación del ADN primero y la división celular después.

Las señales negativas son menos conocidas, pero su existencia no se discute. Esta certeza nace de la observación de la inhibición del crecimiento por contacto, o sea, cuando se cultivan células éstas crecen y van cubriendo la superficie del soporte donde fueron sembradas, hasta que entran en contacto unas con otras, cuando el crecimiento se detiene.

Sin embargo, a pesar del gran número de señales ambientales que iduyen sobre la progresión del ciclo celular, las moléculas participantes en la última etapa del proceso de regulación se reducen a unas pocas familias de proteínas, algunas de las cuales presentan actividad enzimática.

Los estudios másintensos se han &do en levaduras, un eucariontemonocelular, en las cuales es mucho más Eácil la obtención de mutantes que en células de organimos superiores. Los mutantes que exhiben alguna alteración del ciclo celular han sido denominados CDC (cell division cycle) y se han ido numerando de acuerdo con el orden de aparición. Se ha comprobado que cada uno de ellos presenta alteraciones en un gen único. Genes homólogos a los CDC de levaduras han sido identificados en otrasespecies, incluyendo al hombre, y casi siempre se refieren con la mismanomen- clatura que los delevaduras.

Entre las familias proteínicas implicadas en este proceso se incluyen las siguientes: las ciclinas, las proteinas quinasas dependientes de ciclinas Cdk (cyclin-dependent kinases), los inhibidores de las Cdk (CDI), las fosfoproteínas fosfatasas y otras proteí- nas con diversas funciones, casi todassustratos de las quinasas. A estos grnpos deben agregarse todas las especies moleculares que intervienen en la replicación del ADN y que serán estudiadas en el capítulo siguiente.

Las ciclinas son un grupo de proteínas con relativo bajo peso molecular, que pueden ser consideradas como el componente principal de estos mecanismos reguladores. Su nombre deriva del hecho de que su concentración varía en forma cíclica durante el ciclo celular. En un momento determinado su síntesis es estimulada y su concentración aumenta de manera brusca en la célula, pero momentos después son degradadas a gran velocidad y su concentración intracelular disminuye. Por ejemplo, la ciclina B comienza a sintetizarse al final de la interfase y su concentración se incrementa notablemente, mientras el ciclo progresa hacia la mitosis, pero una vez alcanzada la metafase se degrada de forma que al final de la mitosis su concentración intracelular es casi cero. Las ciclinas funcionan como las subunidades reguladoras de las Cdk (Fig. 24.8).

qwímcu MiCdk4

Fie. 24.8. Variación de la concentración de ciclinas durante el cielo celular. Se muestra como la - concentración de eada una de las principales cidina fluctúa durante el ciclo celular. En todos los casos la concentración aumenta rápidamente en un momento, debido al incremento de la síntesis, Se alcanza un nivel máximo cuya duración es diferente para eada una, y después se produce un rápido descenso debido a 1s degradación de estas proteínas. Sin embargo, la concentración de las quinasas dependientes de ciciinas (Cdks) se mantiene invariable durante todo el ciclo. Como las auinasas son inactivas en ausencia de eiclinas en cada etapa del ciclo su especificidad será diferente en dependencia de la cielina a la cual está unida.

Las proteínas quinasas dependientes de ciclinas (Cdk) son enzimas que transfieren un grupo fosfato del ATPhacia residuos de serina o treonina de proteínas sustratos. Las Cdk resultan a su vez reguladas por ciclos de fosforilación -desfosforilación. La enzima mejor estudiada es la Cdk2 que contiene 3 sitios de fosforilación: uno en la treonina 14 (T14),otro en la tirosina 15 W15) y el tercero en la treonina 161 (T161). La fosforilación de los 2 primeros sitios tiene un efecto inhibitorio, mientras que la del tercero es activante. Existen quinasas específicas para la fosforilación en TI4 y Y15. La fosforilación en TI61 se realiza por la quinasa activadora de la Cdk2 (CAK), cuya subunidad catalítica es la Cdk7 y la reguladora es la ciclina H. Si la Cdk2 está fosforilada, pero no está unida a ciclinas, puede ser desfosforilada por la fosfatasa asociada a las quinasas (KAP), pero en presencia de la ciclina esta desfosforilación no es posible (Fig. 24.9).

ATP ADP

Fig. 24.9. Activación de las quinasas dependientes de eiclinas. La estruc-

@$i, T161\@ tura de las Cdks contienen 3 sitios

8 de fosforilación y uno de unión a las eielinas. En ausencia de las c' cielinas y de la FosForilaeión son inactivas. La fosforilación de los 3 sitios las mantiene inactivas aun

.- . @ cuando estén unidas a las eiclinas. El estado totalmente activo se al-

;\$ cama cuando la quinasa unida a la -O5 T161\@ eiclina está fosforilada sólo en la

~ ~ treonina 161.

A diferenciade las ciclinasllas Cdk se sintetizan de forma constitutiva durante todo el ciclo celular, pero son inactivas a menos que estén unidas a un tipo particular de ciclinas y de ahí so nombre. Las ciclinas no poseen actividad catalítica, pero son 1% que determinan la especificidad de sustrato de las quinasas.

Componentes celulares y Gedtica molccular 435

Entrelas fosfoproteínas fosfatasas que participan en el ciclo la más conocida es la Cdc25. aue cataliza la hidrólisis de los enlaces éster fosfóricos de la Cdk2 en T14 v

F i s 24.10. Las Minas v la oroeresión del

ten& de un compleja específico ciclinaK!dk. En G, el papel predominante lo tiene el complejo ciclina DICdk-4. En el resto de las fases In actividad de la Cdk-2 unida a diferentes eiclinas es la responsable de hacer progresar el cielo hasta alcanzar la división celular.

. - Y15. Otras fosfatasas menos específia tambien in te~enen.

Los inhibidores de las quinasas dependientes de ciclina (CDI) son un grupo de proteínas cuyas masas moleculares están en el rango de 15 a 30 kD, y los hay con un elevado grado de especificidad y otros mucho menos específicos.

Una vez conocidos los componentes moleculares que intervienen en la regula- ción del ciclo, es conveniente dar al menos una idea de cómo transcurre el proceso, aunque es bueno recordar que todavía no se conocen todos sus aspectos.

Al comenzar la etapa G, comienza a incrementarse la síntesis de la ciclinaD, la cual al unirse a la Cdk4 dirige la actividad de esta enzima hacia ciertos sustratos específicos, cuya actividad promueve la progresión del ciclo por esta etapa. En la transición entre G, y S, la ciclina D es degradada. Al final de G, había comenzado la síntesis de la ciclina E que alcanza su concentración máxima precisamente al comienzo de S. El complejo EICdk2 fosforila proteínas relacionadas con el comienzo de la replicación del ADN. La progresión de la etapa S depende de la actividad del complejo NCdk2 La relación entre las concentraciones delas ciclinas E y A modula la actividad de la proteína E2F, que es un factor que activa la expresión de los genes relacionados con la fase S. Al inicio de esta fase, cuando predomina la ciclina E, el complejo EICdk2 activa a E2F, pero en la medida que la fase progresa la concen- tración de la ciclina E disminuye y aumenta la de la ciclina A, que al formar el complejo NCdk2 provoca la inhibición de E2F. En el tránsito de S a G,comienza a incrementarse la concentración de la ciclina B. Los complejos formados por la Cdkl con la ciclina B son conocidos como factor promotor de la mitosis (MPF).

Al llegar a la metafase el MPF estimula la degradación de las ciclinas con la cual se produce la inactivación del propio MPF, y se induce la anafase. Las ciclinasA son degradas antes que las B. Esta inactivación del MPF y la degradación de las ciclinas son necesarias para la culminación de la mitosis (Fig. 24.10).

ATP

ATJ ADP

ADP

Falta aún mucho por descubrir sobrelas moléculas y mecanismos implicados en el control del ciclo celular, pero cada día el conocimiento científico refleja con mayor grado de aproximación la realidad de este proceso. Su conocimiento cabal no es sólo un problema interesante desde el punto de vista biológico, es también importante para la ~ráctica médica cotidiana. Se ha demostrado ane aleunos de los comnonentes de . este sistema están relacionados con la génesis del cáncer. De hecho fueron las investigaciones acerca de los mecanismos moleculares del cáncer las que dieron el impulso

necesario para la investigación en este campo. Es necesario tener presente que mien- trasmayor y más profundo sea el conocimiento sobre la génesis de esta enfermedad, mayores serán las posibilidades de encontrar un tratamiento eficiente para combatirla.

Resumen

El elevado grado de organizaci6n que caracteriza a los seres vivos se mantiene gradas a la informaci6n moleeular, éata puede ser de tipo seeueneial, adecuada para la conse~1sci6n y la trawiisi611, y de tipo oonformacíonal, apropiada para la expresi6n. El principio de transierencia de iniormaeión establece que la informa- d6n moledar Buye desde la seniencid hacia la conformacional.

El ciclo celular comprende todas las transformaciones que las células experimentan durante su vida En él se &Onguen 4 etapas: la M o de división celular, la S o de shteala del ADN, asZ como las etapas G, y G, que separan las 2 etapas anteriores. Los principales componentes maeromoleeulares de las células se sintetizan de forma discreta, corno el ADN y las hiptolfas; y de forma continua, comolos ARNs,las proteinas y los üpidos componentes de las membranas. Para el estudio de estos asoectos se utilizan las técnicas de cultivos de células de crecimiento sincron&ado y de captad611 de precursores radhcüvos, entre otres.

Los meeaatsnios moleculares de regulación del dclo celular no están totalmente conocidos. Se sabe que exbten factores reguladores positivos y negativos, asZ como un grupo de familias protelaicas implicadas en el proceso. Las cielines ac- túan sobre las Cdk y determinan su especWiddad de aeei6n, con lo cnai resultan fosforllados determinados sustratos en momentos claves del ciclo celular. Las fcdntasas y los inbibidores de las quinasas contribuyen a la modulsd6n ñna de estos mecanismos. El conodmiento del ciclo celular tiene importancia en la prácü- ca médica por su vinculad6n con la génesis del cáncer.

Ejercicios

1. &Qué relación existe entre la desaparición del nucléolo durante la profase y los datos conocidos sobre las características de la síntesis de ARN durante el ciclo celular?

2. Se dice que la existencia de las cromátides es la expresión citogenética de la duplicación del ADN ¿Por qué?

3. cuáles son las características estructurales que debe reunir una macromolécula para presentar información secuencial y cuáles para la conformacional?

4. Un cultivo de células no sincronizado se expone a "C- inositol durante un breve período, después se lavan las células para eliminar el exceso, se someten las células a un proceso de autorradiografía y al revelar la placa se encuentran que todas las células incorporaron el 14C-inositol con igual intensidad &Cuáles serían las conclusiones del experimento? ¿Cuál de los componentes celulares se estaba estudiando?

5. ¿Si el experimento de La pregunta anterior se hubiera realizado con células de crecimiento sincronizado, sena igual la interpretación de los resultados?

6. Algunos autores sugieren que cuando se trata de células eucariontes, sería más correcto decir la duplicación de la cromatina que la duplicación del ADN &En qué se fundamenta esta afirmación?

1.a transferencia de la iuforinación genética de padres a Iiijos constituye el fenó- inenn mis iinportantc de la materia viva,esto no sólo garantiza la sucesión deba vida, sino i1dei116s. constituye el inecanismo básico de conservación de las especies, pues los drscendientes siemprc poseen características estructurales y funcionales similares a los progcnitorcs. I'.n los orjianisinos monocelulares esta transferencia es directa, pues se prndiicc por el iiiccanis~no de división celular ya estudiado (capítulo 23). En los or~iiiisiiios pliiriceliilarcs, sin embargo, existen células especializadas en esta fuiicii>n que son Lis ci.luliis scxii;iles. [.as células sexuales niasculina (espermatozoide) y f~iiieiii~ias (i,viilo). portando cada una la información genética de la especie, se unen en la fecundacii,~~ y mediante procesos coiiiplejos, más o menos prolongados, dan origen al or~aiiisiiio ionipleto. Al ser los ganietos haploides en la fecundación se rcstituyc el nÚnier« diploide característico de la especie. Como la fecundación es especifica. todos los seres vivos darán descendientes iguales a sí, o sea, de la misma especie; esa transferencia de información de una célula o un organismo a sus descendientes tiene su fundamento molecular precisaniente en la duplicación o replicación de los ácidos desoxirribnnucleicos.

La replicación de los ADN de doble cadena es un proceso comple.jo que no está conipletainente esclarecido. Esta complejidad se deriva de diferentes factores como son: la estructura tridimensional de los ADN y su grado de superenrollamiento, la especificidad de las proteínas replicativas, la necesidad de una fuente energética y la elevada fidelidad que requiere el proceso.

Las dificultades para su comprensión aumentan al no existir una forma única de replicación para todos los organismos que contienen ADN de doble cadena.

En este textose examinarán alguna características comunes a la replicación de los ADN de doble hebra. Después se estudiará de forma más detallada cada aspecto del proceso, se comenzará por los organismos procariontes y se concluye con los aspectos conncidosdel pmceso en los organismeucariontes. Cada etapa se esiudiará de acuerdo con los conncimientos actuales. El aspecto más desarrollado será el sistema replicativo de la bacteria E. coli, por ser el mejor conucido de todos y porque a partir de lasinvestigacio- nes en este organismo se han podido comprenden muchosde los mecanismos implicados, y establecer los modelos, tanto teóricos como experimentales, para el esclarecimiento de un fenómeno tan trascendental en los seres vivos.

Historia del problema

Unas semanasdespués de dar a la publicidad el modelo molecular del ADN en 1953, JamesD. Watson y Fm~cisH. Cndipmpu~ieron un modelo general para la mplicación, eJ

Fig. 25.1. Experiencia de Messelson y Stalh. Esta experiencia demostró que al menos en la E col¡ la replicación tenia carácter semiconservativo. (a) Se muestra cómo las bacterias al crecer en un medio can "N, su ADN, al ser centrifugado en gradiente de CsCI, se agrupa en una fina banda donde su densidad corresponde con la del medio de eentrifugación. Si crecen en ''N forman también una banda, pero desplazada haeiael fonda del tubo, pues su densidad es mayor. Si se les hace crecer primero en ''N y se pasan al medio con "N, sólo se mantienen en ese media el tiempo necesario para un ciclo replicativo, aparece una sola banda cuya densidad es intermedia entre las 2 anteriores, lo cual significa que tadas las moléculas tienen la misma densidad y esta sólo es posible si cada una de ellas contiene una banda con "N y otra can "N, que la repltaeión es semiconservativa. (b) Se observa que el ADN de hac- terias quc crecieron en ''N y des- pués fueron transferidas a un medio con nitrógeno ligero forma una sola banda, pero que al dejarlas crecer después en un medio can nitrógeno ligero en cada ciclo replicativo,la bandaque representa al ADN hibrida se hace cada vez m i s tenua, en tanto la del ADN con nitrógeno ligero se hace cada vez más intensa.

cual consistía en que cada una de las cadenas de polidesoxinucleótidos servíademoldeo pahón para la formación de unanuevacadena complementaria alaoriginal. Esta hipóte- sis ofree'a 2 posibiüdades fundamentales: la conservativa, en la cual una vez sintetizadas las nuevas cadenas,éstas se separaban del molde y se apareaban entre sídando lugar a una nueva molécula de doble banda, y la semiconservativa, en la que las nuevas moléculas estan'an formadas por unacadenadel molde y otra recién sintetizada.

En 1957, MathewS. M&n y Franklin U! Stahldiseñamnuneleganteexperimen- topara dilucidar cuál de las modalidades era la que realmente ocum'a en la naturaieza EUos uolizaron cultivos de E. colidelos cuales extraían el ADN y locentrifugabanen un gradiente de densidad de CsCI, observando que dicho ADN se concentraba en una estrecha banda en el tubodela centrífuga, dondela densidad dela muestra coincidíacon la del mediode centrifugauón; cultivaron entonceslas bacterias enun medio cuya única fuente de nitrÓgenoeraNH,CI marcado con 15N; este Último no es radiactivo,pero símás pesado que el isótopo habitual I4N. Al extraer el ADN y centrifugarlo, se obtenía igualmente una banda, pero localizada más hacia el fondo del tubo. Si las células se hacían crecer en un medioligero (con "N) durante un tiempo prolongado, después se transferían a un medio pesado (con '=N) y se dejaban el tiempo necesario para que ocurriera un solo ciclo replicativo, seexhaía el ADN, secentrifugaba y seobtenía de nuevo unasola banda, pero su localuación era intermediaentre las 2 anteriores. Estas resultados se interpretan de la forma siguiente: si la replicación fuera conservativa al pasar al medio pesado, se encontrarían 2 tipos demoléculas,lasligerasque sirvieron de molde y las pesadas recién formadas.Alaparxer unasola banda,secompnieba qnesóloexisteunaespeeiemolecular y,como su posición en el tubo dela centrífuga es intermedia entrela pesada y la ligera, se concluye que está formada por una cadena pesada y otra Ligera, o sea, la replicación es semiconservativa (Fig. 25.1).

Los intentos por llevar a cabo la replicación in vitro comienzan a tener sus primeros éxitos cuando, en 1955, Arthur Kornbergdescubre una enzima capaz de formar polidesoxinucleótidos a la que llamó ADN polimerasa (hoy ADN polimerasa 1 o pol 1); después de múltiples esfuerzos infructuosos por utilizar sistemas de células animales se decidió utilizar extractos libres de células de E. coli y, como ADN a replicar, el del virus $X174; para ello se siguió el procedimiento siguiente: el ADN molde se obtuvo del $X174 y se marcó con tritio, el isótopo radiactivo del hidrógeno, el tritio serviría después continuamente como señal para identificar el molde. Se ariadieron al molde junto con dATP, dTTP, dCTP y dGTP, la ADN-polimerasa, ADN-ligasa (descubierta por aquel entonces) y NAD+. Uno de los dNTP estaba marcado con fósforo radiactivo que serviría para identificar el material sintético, al igual que el tritio para el molde. La interacción entre los reactivos tuvo lugar hasta que el número de unidades nucleotídicas polimerizadas fue exactamente igual al número de nucleótidos del molde, lo cual podía determi- narse fácilmente comoarando la radiactividad del tritio en el molde con la del fósforo en el material sintético. Varios medios físicos, incluidos el microscopio electrónico, demostraron que la replicación había ocurrido de forma completa. Experimentos posteriores pusieron de manifiesto el carácter infectivo del ADN sintetizado in vitro, con lo cual se comprobaba que era igual al molde utilizado, es decir, que tenían la misma estructura y función. Todo este trabajo se extendió durante 14 años hasta que se pudieron anunciar los resultados. A partir de ese momento comenzó, ya sobre bases firmes, el trabajo para desentrañar el mecanismo de la replicación.

Aspectos generales

Toda la información genética contenida en el ADN reside en su secuencia de bases, por lo tanto la función primordial de cualquier modo de replicación es duplicar la secuencia de bases de la molécula progenitora. La especiñcidad de los apareamientos de bases -adenina con timina y citosina con guanina- provee el mecanismo usado por todos los sistemas replicativos.

Otro aspecto común es que los nucleótidos son añadidos uno a uno al extremo 3 ' - 0 H de una cadena en crecimiento por enzimas llamadas ADN-polimerasas. La secuencia de bases de cada una de las cadenas del ADN es copiada en forma complementaria, así cuando en la hebra que sirve de molde aparece la timina, en la hebra nueva se incorporará adenina y lo mismo sucede al aparecer cualquiera de las bases.

En los ADN de doble hebra el proceso de replicación se produce copiándose ambas cadenas de manera simultánea, por lo que las moléculas formadas conten- drán una banda que proviene del ADN, que sirve de molde o patrón y una banda neoformada. Como la molécula de ADN que se está copiando está formada por 2 bandas complementarias, y cada una de ellas sirve de molde para la síntesis de una cadena nueva, resultará que gracias a este mecanismo las moléculas nuevas no sólo serán iguales al molde en su secuencia de bases, sino que serán iguales entre sí. De acuerdo con el mecanismo explicado, las moléculas de ADN de doble hebra que se obtienen como resultado del proceso contienen una cadena del ADN que sirvió de molde y una cadena nueva, lo que significa que durante la replicación se conserva la mitad de la molécula original, por lo que se dice que este proceso es semiconservativo (Fig. 25.2).

La reacción básica de la polimerización consiste en la adición de un desoxinucleósido trifosfatado al extremo 3 ' - 0 H del desoxinucleútido precedente, eon la liberación de pirofosfato, la cual conduce a la formación del enlace fosfodiéster; esto quiere decir que la cadena se va formando del extremo 5 ' -P al 3 ' -OH, luego el crecimiento de la cadena es unidireccional.

Fig. 25.2. Carácter semiconservativo. El modelo general de la replieaeiún acorde con la experiencia dc Mcsselson y Stahl consiste en que una molécula duplohelicoidal de ADN (a) se separa en sus 2 eadc- nas y cada una dc ellas sirve dc molde para la síntois de la cadena complementaria. Cada molécula nuera íh) está formada por una banda parental (en azul) y una neoformada (en rojo). Luego todas ellas san iguales entre sí.

Fig. 25.3. Reacción de polimerización. To- das las ADN polimerasas eatalizan la misma reacción. Tomando coma sustratas nucleósidos trifosfatados (NTP), los unen mediante la far- mación de un enlace fosfodiéster.

can liberación de P-P, cuya hidrólisis impulsa la reacción hacia la derecha. El ion MP* es imprescindible.

Esta reacción es muy reversible, pero el acoplamiento a la hidrólisis del pirofosfato favorece el crecimiento de la cadena -la reacción global de polimerización (Fig. 25.3).

Las cadenas de las moléculas de ADN son antiparalelas (de polaridad opuesta); esta disposición es la que permite me,jor apareamiento de las bases. En el - -

proceso de síntesis, las polimerasas se van desplazando sobre la cadena de ADN en la dirección 3 ' -t 5 ' a la vez que forman la nueva cadena en sentido 5 ' + 3 ' , lo une significa uue el uroceso Dresenta también carácter antiuaralelo: esto hace que la doble hebra que se va formando tenga ya una estructura en doble hélice como las moléculas originales, lo cual le confiere una elevada estabilidad (Fig. 25.4).

En resumen, la replicación se produce por complementaridad de bases, añadidas una a una en forma unidireccional y antiparalela, tiene carácter semiconservativo y está acoplada a la hidrólisis del pirofosfato.

Requerimientos de la replicaci6n

Para que la replicación tenga lugar hace falta un número considerable de molécn- las, en especial de macromolécnlas, entre ellas se encuentran los 4 tipos de nucleósidos trifosfaiados v los 4 desoxinucleósidos trifosfaiados. así como iones divalentes. esDe- . . cialmente el Mg2+ que siempre acompaña a los nncleótidos en sus reacciones. El total de proteínas que participa en la replicación es desconocido, pero se sabe que constitnye un número considerable, entre ellas se encuentran las proteínas estabilizadoras del

Etapas de la repiicauón

El estudio de la replicación ha sido dividido de forma tradicional en 5 grandes etapas, cuyo conocimiento no es uniforme, pues la complejidad de cada una es diferente. La preiniciación consiste en el ensamblaje del sistema replicativo; la iniciación, en la colocación adecuada del primer precursor: la elongación, en el crecimiento de la cadena y la terminación, en el final del proceso, así como la posterminación se refiere a modificaciones que experimenta la molécula recién formada hasta ser totalmente funcional.

Estas mismas etapas, aunque con contenidos diferentes, serán consideradas en los demás procesos -transcripción y traducción- relacionados con los mecanismos de transferencia de la información genética y se resaltará la similitud formal que existe entre ellos.

Como sucede casi siempre en la ciencia, los estudios experimentales sobre la replicación comenzaron por los organismos más sencillos y, a partir de ellos,se esta- blecieron no sólo los modelos teóricos, sino también los procedimientos experimentales para los estudios en organismos más complejos.

Este estudio comenzó por los organismos procariontes y especialmente por los virus que los infectan que, como utilizan una parte considerable del sistema replicativo del hospedero, pueden considerarse, teniendo presente las diferencias de complejidad, como una buena aproximación al estudio del proceso en las células bacterianas.

De todos los sistemas replicativos estudiados el mejor conocido es el de la bacteria E. coli, un procarionte, cuyo cromosoma contiene una molécula única de ADN circular dedoble hebra,de aproximadamente4x 106pb. Si se representa esa molécula como un círculo en el cual se va señalando la localización relativa de los genes, se obtiene el mapa genético de E. coli; este círculo ha sido dividido en 100 unidades denominadas minutos. Siguiendo el símil con el reloj, el punto O del mapa se corresponde con las 12, el 25 con las 3, el 50 con las 6 y el 75 con las 9, de esta manera la posición de un gen o una región del ADN queda definida por el minuto o los minutos que le corresponden en el mapa. Para dilucidar el mecanismo replicativo se han utilizado tanto técnicas bioquímicas,por ejemplo la extracción y purificación de los componentes del sistema, como procedimientos genéticos que consisten en la producción de organismos mutantes,en loscuales se detecta la falta de algunos delos componentes y se correlaciona con los defectos producidos en el proceso; esto hace que el sistema replicativo sea estudiado con más detalle y que pueda servir de punto de referencia para el estudio de los demás sistemas.

Es conveniente esclarecer la nomenclatura. En la genética de la E. coli, los genes se designan por 3 letras minúsculas y, cuando hay varios relacionados, se añade una letra mayúscula por orden alfahético; los relacionados con el metabolismo del ADNse nombran dnaA,dnaB,dnaC,etcétera. Por su parte, el productodel gen se escribecon los mismos símbolos, pero con la inicial mayúscula; de esta forma DnaB es la proteína productodel gen dnaB. Es costumbre utilizar las abreviaturas del nombre en inglés, pues es el idioma preferido en las revistas científicas de circulación internacional. En todos los casos se mencionará la palabra inglesa de donde proviene la abreviatura empleada.

Origen de la replicaci6n

El ADN de la E. coli se presenta en la célula con determinado grado de "empaquetamiento" y superenrollado de forma negativa. Para que la replicación pueda producirse es necesario aumentar el grado de superenrollamiento negativo y además producirla separación delas 2 cadenas, de forma quelas bases nitrogenadas queden expuestas y puedan servir de molde o patrón para el ordenamiento de las bases nitrogenadas de la cadena que debe sintetizarse.

En la E. coli esto ocurre siempre en un punto fijo del ADN, que se conoce como origen de la replicación, oriC localizado en los 84 minutos del mapa genético. En el ciclo celular bacteriano se llama Cal período de replicación del ADN, es aproximadamente de 40 minutos, y el tiempo necesario para la segregación del citoplasma y la formación del septumllamado D es constante e igual a 20 minutos, después de terminar la replicación del cromosoma. Por lo tanto, el ciclo vital de E. colitiene una duración aproximada de 60 minutos. Mucho se ha investigado sobre las características del ADN en esta región; se ha llegado al convencimiento de que se trata de una secuencia de bases específicas que sirve como señal molecular para indicar dónde debe comenzar la replicación.

Para localizar laseñal se tomaron fragmentos de ADN, seincorporaron aplásmidos que se replican de forma autónoma y se insertaron en la zona donde habitualmente comienza la replicación de plásmido. Si este ADN lograba replicarse, la secuencia introducida funcionaba como señal de iniciación, de lo contrario se probaba con otra secuencia. Por medio de estos estudios se ha podido determinar el origen mínimo de replicación, o sea,la secuencia de ADN más corta que puede cumplir eficientemente esa función. Se trata de una secuencia de 245 pb, muy conservada entre las enterobacterias y que contiene 3 regiones características:

1. Cuatro copias de la secuencia 5' -TTAT(C/A)CA(C/A)C-3' ,2 en un sentido y otras 2 en sentido contrario en posiciones muy conservadas, designadas R l a R4, que sirven para la unión de DnaA.

2 . h z o n a s d e 13uucleótidos, cada una rica en p a r e AT (5 '-GATCTNTlWTTTC3' ), se localizan a la izquierda de las anteriores y favorecen la desnaturalización local del ADN. En lasecuenciaseñalada y en todas de aquíen adelante N representa acualquier nucleótido.

3. Once copias de la secuencia 5 -GATC3', que es el sitio de reconocimiento de la metilasa codificada por el gen dam. La Dam metilasa reconoce esta secuencia y metila la citosina. Al parecer el grado de metilación es importante para la unión del ADN a la membrana de la bacteria.

Eventos previos a la iniciad611 (preiniciaci6n)

El primer evento es tener acceso al sitio oriC, lo cual se logra por la acción de las topoisomerasas de tipo U, que por su modode actuar, como se muestra en la figura 25.5, favorecen la formación de topoisómeros negativos que son los adecuados para la repücación. La preiniciacibn consiste en la separación de las 2 cadenas en el oriC, de Inanera que las proteínas replicativas puedan acceder a la secuencia de bases del ADN.

Como esta separación origina superenrollamientos positivos hacia a ambos lados de oriC, son necesarias las topoisomerasas tipo 1 y tipo 11 para mantener el superenrrollado negativo requerido para la replicación.

Los eventos queocurrenen oriC tienen el orden siguiente: la proteína DnaA se va uniendo a las secuencias de 9 nucleótidos R1-R4 de forma cooperativa, y además, favoreciendo interacciones entre ellas, de manera que al oriC pueden quedar unidas de

Compoaentes celulares y Genéticu md& 445

liig. 25.5. Acción de la topoisomfrasa 11. El ADN circular de la E. col¡ existe superenrollado negativamente y es la topoisomerasa 11 la que se une al AUN, y corta la molécula cn sus 2 bandas (a) luego cruza la banda intacta por la abertura y vuelve a sellar (b) haciendo cada v e z el topoisómero más negativo que es la forma que favorece la replieación. En la figura se rcpre- sentan las 2 mitades de la molécu- la en calores diferentes para difc- rcneiar su recorrido.

Fig. 25.6. Formación de la horquilla de replicaúón. Las regiones R1 a R4 sirven de sitio de unión a DnaA que, con Is cooperación de HU y el ATP, forman agregados que van eurvando al AUN hasta que éste queda enrollado a su alrededor. Esto crca tensiones que se alivian cuando las 3 secuencias ricas en pares AT se separan, originando pequefios sectores de hebras simples. La acción combinada del compleja DnaBIDnaC y las SSB estabilizan esta estructura en forma de ojal sobre la cual sf forma- rán las horquillas de replicaeión.

10 a 20 moléculas de DnaA. Este proceso requiere la hidrólisis del ATP y es muy estimulado por la HU, una proteína parecida a las histonas,la cual provoca dobleces de hasta 90" en el ADN y hace pensar que su función es cooperar con DnaA en el plega- mientodel ADN. De esta forma. el ADN se enrolla alrededor del multímero de DnaA provocando la separación de las 2 cadenas en la zona de 13 nucleótidos ricos en AT que se abren de manera secuencial, primero, la más cercana a R1 y después las otras. En esas condiciones DnaA guía la translocación hacia la zona abierta de un complejo formado por DnaB y DnaC, formando el llamado complejo de preiniciación.

En presencia de la ADN girasa (topoisomerasa 11) y de SSB,la DnaB que posee actividad de helicasa 5 ' 3 3 ' procede a alargar la abertura del ADN, para lo cual requiere la hidrólisis del ATP, de estamanera queda formada una estructura en forma de burbuja u ojal, donde las hebras están recubiertas por SSB. Los extremos del ojal forman las horquillas de replicación y obviamenteson 2; en cada una delas horquillas se produce la replicación y, como en la medida que avanza el proceso ellas se van separando, la replicación toma carácter bidireccional (Fig. 25.6).

Dna A + HU

Dna B: Dna C + ATP

DnaB DnaC + ATP

En resumen, la preiniciación consiste en la separación de las 2 hebras del ADN en oriC, para formar 2 horquillas de replicación. Para su formación son necesarias las proteínas DnaA, DnaB, DnaC, HU, ADN @rasa y SSB, así como la hidrólisis del ATP.

Iniciauón

Pdiahacerp~lahorq31aeswcesaiwotro~pode pmteúiasAlquedarsepaiwi;s las 2 hebras del ADN quedaexpuestauna secuencia deunos 70 nuclebodos,denom¡nadasitio deensamblajedel Uii&doroPAS@~earsambly~~).ElsiooPASsmnocidoporla proteína PriA, quese une a él y permite la unión posterior dePriB; entoncesse une DnaT y pmmuevehaciaeesitio latranslocaaóndeun~mplejo~nstituidoporDnaB:DnaC:PnC El complejo de 6 protanas formado se mueve sobre el ADN en las 2 direcciones gracias a la actividad de helifasa 5 ' 7 3 ' de DnaB y la 3 ' +S ' de%.

En lugares específicos el complejo reconoce alguna serial y a él se une la DnaG que tiene actividad iniciadora y forma polirribonncleótidos de aproximadamente 10 unidades de largo, el ARN iniciador. La acción iniciadora deDnaG dependede la presencia de DnaB; esta acciGn c-mhinada de iniciadoras y helicasas esuntemaque se repite en todos, o casi todos los sistemas replicativos estudiados. Al conjunto de todas estas proteínas, incluyendo a DnaG se le denomina complejo iniciador (Fig. 25.7).

~ -.. . -9As 5' 3'

3' I I I I I I I I I I 5' 1 PAS

Pri A. Pñ B: Dna t

5'

3' 5'

O Pri C: Dna B: Dna C

1 l I I W I I I I I I l I I I I l 1 I

I I I I 1 1 I I I I I I l I ~ l l l I I 5'

t &/+SD Dna 5' n

I I I I I I I I I Y - I / R W I I I I I l l l 3' l l l l l l l I I I I I I I I I

5'

-+ NTP

Fig. 25.7. Formación del corpúsculo iniciador. Al pmgresar la abertura del ojal se descubre el PAS al cual se unen en forma sucesiva PriA, PriB y DnaT, y estos a su vez promueven la incarpa-

polimerasa iniciadora y se forma el ARN iniciador.

Fig. 25.8. Inrorpuraeión de la ADN polinicrasa 111 al ADN preiniciado y formación del rcplisoma. El hi- brido ADNlARN iniciador cs reconocido por cl compleja y y el complejo r . El complejo y promueve la incorporación del anillo deslizante que forma la subunidad B, para la cual requiere la hidrólisis del ATP. Después el núrlco de la polimerasa del que sólo sc repre- renta la subunidad a desplaza al complejo y; de esta forma la polimerasa se desliia por cl hioride hasta encontrar el extrema 3'-OH del ARN iniciador, al cual roniien- l a a añadir los desoxinucleótidos complementarias a las de la hibra molde.

En estas circunstancias se une al sistema la holoenzima de la ADN polimerasa 111 en un proceso dependientede ATP. La enzima utiliza el C3 ' -0H de los ARN iniciadores para alargarlos, por la sucesiva adición de desoxinucleótidos uno a uno según la secuencia de las hases nitrogenadas del ADN molde. Este complejo proteínico recibe cl noinhre de replisoma.

La ADN polimerasa 111 de E. colies una enzima muy compleja formada por al incnos 10 suhunidadcs diferentes. Cada célula contiene de 10 a 20 copias de la Iioloeii~iina. por lo cual. para purificar 1 mg se deben utilizar de 2 a 3 kg de células. I'ma dcscriliir sil organización se emplean diferentes niveles de ensamblaje. El más sciicillo es cl núcleo de la poliinerasa formado por las subunidades a, E, 8; la subunidad tx posw actividad de polinicrasa, en tanto, la E es una exonucleasa 3 ' 4 ' que participa en el ineranis~node edición descritoal final del capítulo, y la subunidad R estinw- 1. .i 1. .I . dctividad . de la c. 111 segundo nivel de organización llamado Pol III'contieni ? iiúrlcos y un díincii~ de r. Para la forniación del nivel siguiente, llamado PolllI':: sc riqiiieri~ 121 incorporaii6~1 del roniplejo y que está formado por las subunidades y, 6,s , , x 9 VI. por lo tanto, en la formación del Pol III* intervienen 14 polipéptidos reprewnitados en la fórmula subunitaria c ( ~ E ~ ~ , T J , ~ ~ ' xyr. La holoenzima se completa roii la adición de la subunidad P.

I 3 h general la "procesividad" de la polimerasa se incrementa en la medida que se incorporan las subunidades al núcleo, pero tanto la procesividad como su alta velocidad tienen un requerimiento ahsoluto de la subunidad P; esto se debe a la forma en que la poliinerasa se ensambla sobre el ADN. Una vez formado el ARN iniciador,el complejo y se asocia al Iiíhrido ADN ) ARN y promueve la incorporación de la subunidad 8; esta proteína está formada realmente por 2 subunidades que presentan una forma circular hueca. El complejo y produce la abertura del anillo que después se cierra con el híbrido ADN ARN en su interior. Este proceso requiere ATP y es el únicomomento que la ADN polimerasa 111 necesita ATPpara funcionar. La estructura particular de la subunidad P le permite deslizarse sobre el ADN de doble hebra hasta localizar en una de ellas un extremo 3 ' -0H. En cualquier momento, el núcleo de la polimerasa desplaza al complejo y y se une al anillo deslizante formado por la subunidad 8; al núcleo se incorporan sucesivamente el restode lassubunidades. La importancia de que el complejo Pol 111* contenga 2 copias del núcleo (a&@) se verá inmediatamente cuando se trate la elongación. La incorporación de la ADN polimerasa 111 al ADN preiniciado se muestra en la figura 25.8.

Resumiendo, el hecho clave de la iniciación es la formación del ARN iniciador realizado por la DnaG; para que eso ocurra se requiere la participación de varias proteí- nas (PriA,PriB,PriC, DnaB,DnaC y DnaT) que forman el complejo iniciador. Con la incorporación de la ADN polimerasa ID y la formación del replisoma puede darse por terminada la fase de iniciación.

La elongación comprende la serie secuencia1 de eventos que iniplican el alargamiento de las cadenas del ADN y donde interviene otro grupo de proteínas eiizimáticas.

Es bueno destacar la diferencia entre 2 aspectos que pueden confundirse. Al tratar los aspectos generales se señaló que el crecimiento de las cadenas nuevas (hijas) es unidireccional, porque las enzimas provocan el crecimiento de la cadena del extremo 5 ' al 3 ' . Sin embargo, la replicación en las 2 cadenas cs hidireccional. II sea. la burbuja de replicación se mueve en las 2 direcciones a partir del punto de origcii. llegandoa formarse, en la medida que el proceso transcurre, 2 horquillas que se mueven en direcciones opuestas sobre la doble banda del ADN; por eso se veri lo que ocurre en una horquilla, pues igual sucede en la otra.

Una vez incorporado el primer desoxinucleótido, la pol 111 -utilizando la suhuiiidad para deslizarse- continúa incorporando uno a uno los desoxinucleótidos siguientcs.

cuyas bases son complementarias a la queocupa el lugar correspondiente en el ADU: luego se trata de un proceso repetitivo. En la otra hebra, la horquilla se mueve en dirección contraria a la síntesis, o sea, en dirección 3 ' +5 ' .Como la ADN polimcr;i;i 111 sólo sintetiza en dirección 5 ' -13 ' , el movimiento de la horquilla detendríii su funcionamiento, pero se sabe que esto no ocurre asi; en esta banda la síntesis sr pindu- cepor fragmentos, a los cuales se les conoce como fragmentos de Okasaki. en Iiont~r ;I

su descubridor el japonés Reiji Okasaki. La holoenzimadela ADN polimerasaIIIcontiene2 copias del míileo. por eso IIII:I

sola holoenzima es capazdesintetizar las 2 hebras de ADN de forma simiiltáiira: para ello la hebra conducida forma un lazo alrededor de la holoenzima. de iiiaiirra que cambia ladirección de la hebra, y permite que la enzima pueda alargar las 1 hebras al mismo tiempo (Fig. 25.9).

Cada cierto tramode la molécula del ADN se forma un nuevosegmento de ARN iniciador, que permite un nuevo crecimiento. En el proceso de la replicación del cromosoma de E. mliseforman entre 2 000 y 4 000de estos fragmentos mn una longitud de 1 a 2 kb. La ADN polimerasa ID es capazde incorporar unos 1000 desoxinucleótidos por segundo, de ahíquelasíntesis deun fragmentode Okasaki demora de 1 a 2 segundos. Cuando la pol U1 encuentra un híbrido ADN I ARN no puede continuar incorporando nucleótidos. Simultáneo al desplazamiento de la ADN polimerasa 111, el complejo y es capazde ensamblar anillos deslizantes de lassubunidades fi por delantede la horquilla, y hacia ese anillo se transfiere el núcleo de la polimerasa cuando el movimiento de la enzima cesa ai encontrar el híbrido ADN I ARN.

Este procesose va repitiendoconstantemente en una de las cadenas, por lo quese dice que lasíntesis es discontinua. En la otra banda, sin embargo, lasíntesis progresa sin interrupciones, puesse realiza en favor del movimiento dela horquilla,por lo que en ella la síntesis es continua; de ahí se describe la replicación como un proceso que es al mismo tiempo continuo y discontinuo -algunos autores lo llaman semidiscon- tinuo-, esta característicadel proceso se ilustra en la figura 25.10.

Como resultado del proceso descrito, una de las hebras del ADN se encuentra casi completamente replicada, en tanto la otra hebra presenta como productos de la replicación fragmentos que contienen ARN iniciador hacia el extremo 5 ' ; entonces interviene otra enzima, la ADN polimerasa 1. Esta enzima, además de la actividad polimerasa, posee actividad de exonucleasa 5 ' +3 ' para ADN de doble cadena o híbridos ADN ARN; debido a esta actividad, ella va eliminando uno a uno 10s

Fig. 25.9. Acción de la ADN polimerasa 111 diirante la ~longariún. Durante la fase de elongatián la ADN palimc- rasa Ill forma un tomplejaderom- posici6n asiiii61rica sohre las 2 hc- bras del ADU. En rada una de las hehras c\istr r l niidea unido a la suhiinidad / j i p c I i da la nioiili- dad nrccsari;i. l.** dciiiissuhunida- des SP agrupan iiiár I ix is la Iiehra rondiiit<ira: esta cstrurlura hace que el ADU hrnic un gran lazo alrededor de la polimerasa de forma que las 2 hrhras del ADN, al entrar el1 coniacto con la super& rir de Id eiiriina. queden ton una orientarWn 5 , -> 3 . y de esta far. ma la pf~lililcrnra 111 es capaz de sintetirar dc nirnera simultánea la hehra riinductora > la conducida.

Componentes celulares y Genética mwlecular 449

Para sellar esas mellas se requiere la ADN ligasa, que cataliza la formación del enlace fosfodiéster y sella la brecha que existía en el ADN (Fig. 25.12).

Fig. 25.12. Acción de la ADN ligasa. Utilizand<i romo cofaitor el NAD', la ADN ligasa de la E. col¡ une nudeótidos contiguas mediante la formación de un enlace fosfodiéster, con lo cual los frapientos formados en la banda conducida se unen unas ion otros y se forma una banda continua. -- m----

La ADN polimerasa 1 es una enzima más sencilla que la pol 111, pues se trata de una cadena polipeptidica única de 109 kD; además de las actividades mencionadas también posee actividad esonucleasa 3 , -5 ' , cuya importancia se verá más adelante. En su movimiento sobre el ADN es capaz de provocar el desenrollamiento.

La ADN ligasa es también una enzima sencilla, formada por una sola cadena polipeptídica de 77 kD y fue descubierta en 1966 en 5 laboratorios simultánea- mente. Para la unión de 2 oligodesosinucleótidos se requiere que estén formando parte de una doble cadena de ADN. La formación del enlace fosfodiéster entre los fragmentos necesita de una fuente de energía que en la E. colila proporciona el NAD' (Fig. 25.13).

Como las 2 horquillas se mueven en dirección opuesta, la cadena que se sintetiza de manera continua (en favor del movimiento de la horquilla) no es la misma en cada horquilla y recibe el nombre de banda conductora, en tanto, la que se sintetiza discontinuamente recibe el nombre de banda conducida.

En la E. colise conoce además otra enzima, la ADN polimerasa 11, cuya función parece estar más bien relacionada con los mecanismos de reparación del ADN, pues algunos mutantes que carecen de ella no presentan alteraciones en la replicación. El movimiento de las horquillas se favorece por la acción de las helicasas, y las torsiones que se generan se alivian por la topoisomerasa 1 (Fig. 25.14).

En resumen, la nota más sobresaliente de la elongación es la actividad de la ADN polimerasa 111 que añade uno a uno los desoxinucleótidos en una hebra dirigida por la secuencia de la hebra contraria; de esta forma el proceso transcurre rápidamente. Este alargamiento se produce de manera diferente en cada una de las 2 hebras, para la fibra conductora sólo hace falta la participación de la pol 111; la otra se alarga discontinuamente y requiere la participación del comple,jo ¡ni- ciador, la pol 111, la pol 1 y la ADN ligasa. En la E. coli se utiliza N.AD* como fuente de energía para la acción de las ligasas.

3. Mecanismo de acción de la ADN ligas.. La reacción ocurre en varias etapas. I,a enzima reacciona con el NAD' y forma un complejo intermediario E:AMP. En un pasa posterior la transferencia del grupo adenilato activa el extremo 5 '-P, ron lo cual se facilita la for- macibn del enlaec fosfodiéster. La ligasa y el AMP seseparan del ADN y la molécula queda hrmada intc- grarnente.

Fig. 25.14. Función de la topoisomerasa 1 en la elongación. (a) E1 desplazamiento de la Iielicasa va creando zonas de tensión por delante de la horquilla que dificultan su avance. 1.a topoisomerasa 1 relaja esas tensiones y facilita el proceso. (b) Esquema del mccanisma de la topoisomerasa 1 que consta de 2 pasos: Iro. corte de una banda del ADN que queda unido a la enzima y Zdo., paso de la otra banda por la brecha y cierre del corte.

Terminación

La terminación de un ADN circular puede imaginarse como un proceso relativamente sencillo. Al unirse las 2 horquillas que venían moviéndose en dirección opuesta,seforma una sola, pero en realidad estoseventos no son bien conocidos y se estima que deben ser muy diferentes en los ADN lineales y circulares.

En la E. coli, la terminación ocurre en una zona denominada terC que está localizada a unos 180" de oriC. Es una región larga,de aproximadamente 350 kb,flanqueada a ambos lados por los sitios de terminación terA, terB, terC y terD. Los terA y terB inhiben el desplazamiento de la horquilla de replicación que se mueve en dirección contraria a las agujas del reloj, en tanto, los terB y terC tienen el mismo efecto sobre la otra horquilla.

Se ha identificado que el producto del gen tus se une con elevada afinidad a los sitios ter e inhibe la replicación. Tus es una proteína de 36 kD, que se une al surco mayor del ADN en los sitios ter, de modo que su efecto presenta el fenómeno de la polaridad, es decir, inbibe el movimiento de una horquillaquesemueve en unsentido, pero no la que se mueve en sentido contrario. A pesar de estos datos aún faltamucho por aclarar en cuanto a terminación de la replicación.

Al terminar la replicación, las cadenas circulares quedan entrelazadas una con otra y se requiere un niecanismo llamado descatenarización, en el que interviene la topoisomerasa 11 para separarlas. El mecanismo de esta transformación es similar al estudiado para las topoisomerasa 11, con la diferencia de que en este caso es cortada una de las moléculas, y por la brecha que se origina se hace pasar la otra molécula (Fig. 25.15).

w~elnpxnmu quouema ua h saluouema souis!ue8~o uqqu! anb 'su+ ua so~gm!ldal seuiag!s ap u?pmqsuWal el u03 sop -qlnsai saio@~ sns u?!quq op!ual eq quouema ua u?pmgda~ el ap qpnlsa 13

.aluauilep~ed opauape~e~ h opepp ueq as o~geqda~ euials!s pp saluauoduio~ SO[ ap soye~ wpezuem souaui equanma as oiad 'saluoue~aid ap la u02 eaup[nui!s elaueui ap asopugpuesap op! eq saluo.ieJna ua uypeqda~ el ap o!pnlsa 13

'mma9 e awnh L (q) emvaqe el md epaloui ew el essd ñ sui!zua sl e sep!un uepanb anb (e) sepueq sns ua ep>?loui sun 8vaJ [en> ay emd 'J~~~JJ!J N(IV un ~p u<>!~e~![da.' el ap leug IB sopeuixq so;sua;e> sol axqap 11 ssa~auias!odaa el wp!xz!mwexa<l 'SI'SZ 3!d

La velocidad de movimiento de una horquilla de replicación en E. colies de 10 000 pares de bases por minuto. Las polimerasas de eucariontes son mucho menos activas y tienen una velocidad que vana entre 500 y 5 000 paresde bases por minuto según la enzima. Como una célula animal típica contiene aproximadamente una cantidad de ADN que es 50 veces mayor que el de la bacteria, el tiempo de replicación del ADN eucarionte sería unas 1 000 veces mayor que el de E. coli, esto es unos 30 días; Sin embargo, la replicación sólo demora unas pocas horas.

Los cromosomas de eucariontes utilizan múltiples puntos como orígenes de la replicación y ésta es bidireccional. Se han caiculado hasta 5 000 sitios de iniciación en un mismo cromosoma, cada uno separado por unos 30 000 pares de bases. En los huevos fecundados se han calculado hasta 50 000 sitios de iniciación, con lo que la duración de la replicación es de nnos pocos minutos. Sin embargo, todos estos oríge- nes no se activan simultáneamente, más bien existe un programa de activación, pues nnos puntos comienzan la replicación al inicio de la fase S, otros en un momento intermedio y otros al final (Fig. 25.16).

Fig. 25.16. Horquillas múltiples en los eueariontes. La replicaeión en eueariontes se produce con la formación de numerosas horquillas que al crecer bidireeeionalmente se encuentran unas con &ras y se fusionan, con lo cual se aumenta considerablemente la velocidad del procesa. Pera como se muestra no todos los sitias de iniciación se activan simultáneamente.

El enorme número de horquillas es un reflejo del número de polimerasas. Mientras la E. coli contiene de 10 a 20 moléculas por célula, los eucariontes contienen de 20 000 a 60 000 moléculas de la polimerasa a que es la principal.

La estructura nncleosómica del ADN eucarionte debe disociarse del complejo ADN-proteína y reformarse con las moléculas neoformadas. Se ha comprobado que esto sucede simultáneamente con la replicación del ADN. Las histonas sólo se sintetizan durante el período S, de ahí que es más correcto referirse a la replicación del cromosoma que a la del ADN.

Por último, se debe recordar que las células de los animales superiores, como el hombre, contienen una dohle dotación de genes (son diploides) y cuando se produce la duplicación de los cromosomas contendrá 4 copias de genes homólogos (tetraploides); esto significa que el número de copias de un mismo gen es variable durante el ciclo celular,en G1 es doble, durante el períodos la información se duplica y, por lo tanto, es cuádruple durante todo el período G2. En el período M la información se divide en 2 y van a parar a cada una de las células hijas, que reinician su ciclo celular con una dotación doble de la información genética.

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Replicaaón en eucariontes pluriceluiares

Del estudio de los sistemas simples se ha partido para reconstruir el proceso en eucariontes complejos. En estos estudios se han podido caracterizar varios genes implicados en el proceso y se ha emprendido la purificación de muchas proteínas replicativas; entre las especies estudiadas se encuentran numerosas líneas humanas. Para no hacer extensa la descripción del proceso en los organismos eucariontes, ésta se hará tomando como referencia el sistema replicativo de la E. Coli, que ya fue estndiado, pues en líneas generales los procesos se asemejan mucho. Sólo se insistirá en las diferencias y en las homologías funcionales, estructurales o ambas entre los componentes de uno y otrosistemas replicativos.

El origen de la replicación en eucariontes es más complejo y su estructura definitiva no ha sido dilucidada por completo; contiene secuencias funcionalmente homólogas al de E. coli, pero tamhién motivos estructurales específicos como algunos que sirven de sitios de unión para factores de transcripción. La unión de proteínas específicas produce también el desenrollamiento local de la doble hehra del ADN en sitios que sirven para alojar proteínas que formarán el complejo de preiniciación,cnya estructura no está del todo conocida.

El origen de replicación es reconocido por un grupo de 6 proteínas de pesos moleculares variables, que forman el llamado complejo de reconocimiento del origen, ORC (origin recognition complex). Se ha encontrado que existe una gran similitud en la secuencia de aminoácidos de estas proteínas, en especies tan diferentes como la Drosophila y el hombre, lo cual indica que realizan funciones similares en todos los organismos.

La proteína estabilizadora del ADN de hebra simple (SSB) recibe el nombre de proteína replicativa A (RP-A de replication protein) que se presenta en forma de heterotrímeros, los que estabilizan las zonas monofihrilares en la horquilla de replicación.

Se conocen 2 ADN ligasas cuya principal diferencia con la de los procarionteses que utilizan ATP en vez de NAD' como cofactor. También han sido caracterizadas varias helicasas. Los 2 tipos de topoisomerasas se han ohtenidode diferentes orgauismos eucariontes; las de tipo 1 se encuentran localizadas en zonas de intensa transcrip- ción, principalmente en el nucléolo, y la tipo 11 ha sido identificada como la principal proteína que participa en la organización molecular de los cromosomas, presenta asociada una actividad de proteína quinasa cuya significación es desconocida.

Existen al menos 5 ADN polimerasas: la cc que es la principal y presenta asociada una actividad de iniciadora; la p, es la más pequeña de todas las ADN polimerasas conocidas, aparece sólo en animales superiores y parece estar implicada en los mecanismos de reparación; la y que sólo aparece en las mitocondrias; la 6 resulta una proteína grande y es la única donde se ha descrito actividad de3 ' - 0 H exonucleasa; y la q que está relacionada con los mecanismos de reparación.

El ensamblaje del replisoma ocurre de forma similar al proceso en la E. coli, pero presenta algunas diferencias importantes. En los eucariontes participan 2 ADN polimerasas, la a que produce la iniciación de las dos hebras y la 6 que funciona en la elongación. El homólogo de la subunidad p es una proteína denominada antígeno nuclear de células pruliferantes (PCNA de pmlifeií1tingceUnudearmOgen), un trúnero que forma el anillo deslizante que proporciona el movimiento del replisoma. La translocación del PCNA hacia la horquilla de replicación se realiza por una proteína formada por 5 subunidades, que se denomina factor de replicación C (RF-C de replication factor) y, por lo tanto, es el homólogo funcional del complejo y. Una vez formado el replisoma, el proceso de la replicación ocurre de forma similar al de E. coli, sólo que en cada cromosoma existen numerosos orígenes de replicación, por lo cual cada replisoma tiene que sintetizar pequeños sectores de ADN. Aun en el caso de la hehra conducida, la longitud de los fragmentos de Okasaki es menor y se calcula entre 150 y 200 nucleótidos, que es el tamaño que se corresponde con la estructura de un

nucleosoma. La dificultad principal que no se presenta en la E. coiies la replicación de los telómeros, que será descrita en el acápitesiguiente.

Replicacióo de los telómem

Unode los grandes problemasquepresenta la replicación de un ADN nocircular, es la replicación de los extremos, que en los cromosomas recibe el nombre de telómeros. Desde el punto de vista ehvctural estos extremos se caracterizan por presentar pequeñas secuencias dedesoxinucleótidos,repetidas muchas veces, y la hebrade dirección 5 ' -3 ' posee un segmento final monofibrilar de 12 a 16 nucleótidos. La dificultad estriba en el hechodeque unadelas 2 hebras no puede replicarsecompletamente por losmecanismos conocidos y esoimplica la pérdida progresiva de material genético a partir de los extremos. Hace unos pocos años fue descubierta y purificada una enzima que cataüza la formación de los telómeros, por ello se le dio el nombre de telomerasa; tal vez lo más interesante, en la forma de actuar de esta enzima, es que emplea como cofactor una molécula de ARN, al cual utiliza como molde para añadir deso~ucleótidos a los extremos teloméricos. Como los telómeros presentan secuencias repetidas, el ARN puede aparea~mn~artedeesaseeuen&,~ lapartenoapareadasirvedemoldealatelumerasa para alargarla hebra de ADN. Una vez terminado el alargamiento, la enzima se desplaza, produce un nuevo alargamiento y asísucesivamente hasta que el númerode repeticiones seael característico de laespecie. El mecanismodesíntesis dela hebra complementaria no está esclarecido (Fig. 25.17).

A = Unión de la telomerasa ..........

.......... 5' C-C-A-A-T-C-C-C

B = Palimenzaci6n t .........

Fig. 25.17. Acción de Is telomerasa. La sin- G.G.G.T.T.A~;. .';~::

.......... tesis de las telámeros se lleva a cabo 5' c y ] por acción de la telomerasa en un proceso que puede ser dividido en 3 etapas. (A) La enzima se une al extrema del telómero, utilizando C = Translocalización .c

.......... el mecanismo de apareamiento de G-G-G-T-T-A . .',-:~

.......... bases entre su ARN y el ADN 5' <yr Ielamérieo. (B) Utilizando coma molde su ARN la enzima alarga el extremo 3 ' de la hebra del ADN. (C) Una vez alargado el Ielómero D = polimenración .......... la enzima se separa y vuelve a unir-

4 G-G-G-T-T-A , ~ L . ~ , ~ ~ ~ ~

.......... se al nuevo extremo y (D) comien- 5' C-C-C-A-A-T-C ra un nuevo cielo de polimeri- zarión.

Esiudios recientes uarecen demostrar aue la longitud de los telómeros está rela- - cionada con la posibiüdad de división de la célula, de modo que mientras más corto es el telómero, menor es la potencialidad proliferativa de la célula; esto ha hecho que la telomerasa se convierta en un posible blanco para el tratamiento del cáncer.

Fidelidad del proceso

La replicación del ADN ocurre una sola vez durante el ciclo de vida de la célula, de ahí la necesidad de que el proceso se realice con una elevada fidelidad

456 -ua*le*

de copia, que las moléculas hijas contengan exactamente la misma secuencia de bases nitrogenadas que la molécula paterna. En estudios con bacterias que se reproducen rápidamente y que permiten estudiar en corto tiempo varias generaciones de células, se ha calculado que en la replicación se comete un error, o sea, se incorpora una base errónea por cada mil a cien mil millones de bases incorporadas (loy a 10"). Si el genoma de la E. coliposee aproximadamente 4 x 10"b, la posibilidad de error es menor que una base incorrecta por ciclo replicativo. Ninguno de los mecanismos conocidos por sí solos son capaces de explicarlo, pero la acción conjunta de todos ellos puede crear un efecto potencializador, es decir, todos juntos provocan una fidelidad mucho mayor que la suma de todos ellos por separado. Algunos de estos mecanismos se comentarán a continuación y se hará énfasis en varios de ellos.

El primer factor de fidelidad es la elevada especificidad del apareamiento de bases formando los pares adenina-timina y citosina-guanina. El otro es la elevada especificidad de las polimerasas, las cuales sólo incorporan los desoxinucleótidos que forman pares complementarios al ADN que se está copiando.

Otro factor que contribuye a la fidelidad es la utilización de un ARN iniciador, ya que como éste es eliminado y reemplazado por el segmento de ADN correspondiente, estas zonas son rectificadas siempre. De usarse un segmento de ADN como iniciador, estas zonas no se leerían de nuevo y cualquier error en ellas se podría mantener.

Existe, además, un mecanismo de rectificación. A pesar de todo lo anterior, cuando se incorpora una base errónea entra a funcionar el mecanismo denominado de edición. La base incorrecta no forma pares de bases tan estables como la correcta y esa zona del ADN se debilita; esto hace que en ocasiones los desoxinucleótidos añadidos posteriormente no se unan bien a la banda complementaria, lo que sirve como señal a la ADN polimerasa 111, que con su actividad exonucleasa 3 ' 4 ' comienza a eliminar los nucleótidos mal apareados. Cuando llega a una zona donde el pareamiento es correcto detiene su acción y entonces la polimerasa 111 continúa alargando la cadena de forma adecuada. En este mecanismo también pueden intervenir endonucleasas que producen la hidrólisis del enlace fosfodiéster próximo a las bases mal apareadas, haciéndolo siempre en la cadena neoformada, pues ésta no tiene aún el patrón de metilación característico, y con ello se diferencia de la cadena que sirve de molde o patrón. Todos estos mecanismos contribuyeii a que los errores de copia sean mínimos y el proceso transcurra con una elevada fidelidad.

Inhibidores de la replicación

Existe un numeroso grupo de sustancias, de las cuales muchas de ellas son antihióticos. que actúan como inhibidores de la replicación y cuyo empleo ha contrihuido a dar la ! isión actual sobre el proceso. Atendiendo a s u mecanismode acción se clasifican en 2 grupos: los que actúan sohre el ADN molde y los que actúan sohre las proteína5 replicativas.

Al primer grupo pertenecen los colorantes de acridina, la actinomicina D y el etidio, que se intercala11 entre las bases y dificultan la separación de las cadenas; la netropsina ! la clistaiiiicina .A. que se unen fuertemente a zonas ricas en pares A-T; y la bleuiiiicina ! iieiicarzinostatina, que producen roturas de los enlaces entre los carhonos 3 ' ' 4 ' de la desoxirribosa.

Al segundo grupo pertenecen la afidicolina, que inhihe la ADN polimerasa alfa; y la novohiociiia ! el árido iialidíxico. que actúan sobre la topoisomerasa 11.

Un importante grupo de inhibidores lo constituyen los 2 ' - 3 ' didesoxirribonucleósidos trifosfatados, que se han empleado para determinar la secuencia de bases de los ADN; sólo actúan in vitro, ya que los nucleósidos trifosfatados no atraviesan la membrana celular (Fig. 25.18).

o o II

CH3, ,! CH - CH

CH: \ N C H 3 CH, N - CH3 / /

o = c c\= o , /CH,

CH, -N \ c = n

I \ /- - ,,CH,- CH HC-CH, I

O = C CH2 \

C H - C H \ NH /

Fig. 25.18. lnhihidores de la replicación. / HN \

CH3 O = C

En la figura se muestra la estructu- \ /C = O ra de la aelinoniirina D que está CH -- CH

1 \ F- CH compuesta por un anillo triple de

CH, NH ' . NH 1 fenoxazona y 2 polipéptidas cícli- : ~ CH3

cos laterales. Al interactuar ron el . . ADN el anillo de fenoxazana se intercala entre 2 pares de bases Actinomicina D (preferiblemente GC) y los pép- . ... . , ,

,, ( , ," . , ,.?, , tidos interactúan con lai zonas ve- cinas fortaleciendo la unión entre ,.: , .. ' . ,

las 2 bandas. La? proteínas repli- eativas al llegar al sitio donde está la actinomieina D no pueden separar las bandas del ADN y se detiene el movimiento de la horqui- N-C Ila. La novobioiina y el árido 0x0- 1 1 niliea par su parte san inhibidores OH H O 1 de las topaisomcrasas y su acción C = O

1 CH2

dificulta la replieaeión. NH, Navobiocina Ácido oxolínico LH3

A manera de conclusiones

Hasta aquise han desarrollado los aspectos más sobresalientes deunode los más importantes procesosde la niateria viva. Coniose vio al inicio,se planteaban unasene de problemas importantes para su realización, problenias c l i p complejidad hacían prever respuestas coniplejas y así ha resultado.

Pero cabría preguntarse ;por qué resulta tan complejo este proceso? ¿No existen mecanismos más simples e igtiahiiente probables para un proceso de esta naturaleza? ;.Por qué se requiere un iiúniero taii elevado de enziiiias. con tan elevados grados de coniplejidad estructural y fiuicional'>

Por supuesto. que estas respuestas no las tiene nadie. Cuando se analiza un meca- iiisniu de este tipo súlo podemos decir las ventajas que representa con respecto a otro alternati! o. sin llegar a saber por qué los organismos con estas características han sido seleccionados de manera evolutiva sobre otros: esa es la base del razonamiento que harenios a contiiiuacibii.

La replicaciuii se produce sólo una \ez durante la vida de la célula,por lo cual errores que se cometan durante el proceso pueden acarrear consecuencias trascenden-

tes para el organismo y para la especie. Según parece, ésta es la razón primaria del elevado grado de complejidad, lo que está apoyado, además, por el hecho de que en la medida que aumenta la longitud del ADN en las células es mayor el grado de complejidad del proceso y mayor el número de factores proteínicos especif~cos involucrados.

El elevado grado de precisión que requiere la transferencia de información, de generación en generación, con un elevado grado de fidelidad, obliga a la complejidad del proceso molecnlar que constituye su fundamento final.

Resumen

La trasmisión de la información genética de un organirmio a sus descendientes constituye el fenómeno más importante de ia materia viva, y aunque adquiere diferentes formas de acuerdo con el tipo de organismo, su fundamento f i i es el mecanismo de replicauón del ADN. Toda la información genética está codiñcada en la secuencia de bases nitrogenadas del ADN, y el apareamiento específico de ellas es el mecanismo básico utilizado en todos los sistemas replicativos. La replicaaón tiene un carácter reiterativo, pues los desoxinucleótidos son añadidos por el mismo mecanismo al extremo de una cadena en crreimiento, procede por complementaridad, acoplada a la hidróhis del pirofosfato y de forma antiparalela y semiconservativa.

La replicación más senciua es la de los virus de los proeariontes, cuyo estudio ha permitido esclarecer algunos de los mecanismos moleculares involucrados en el proceso. En la replicación del ADN de la E. cofi participan numerosas enzimas como las topoisomerasas, helieasas, polimerasas, ligasas, eícétera, así como otras muchas proteínas de carácter no enzimático, pero cuya participación es indispensable en el proceso. Para su estudio, este proceso se ha dividido en 5 etapas. La preioiciación ocurre en un sitio específico, denominado origen y en él las topoisomeras~s U aumentan el superenmliamiento negativo, las helicasas separan las 2 cadenas y las SSB estabilizan esta estructura que se denomina horquilla de iniciación. En la iniciación un conjunto de proteínas forman el wmplejo iniciador que mediante la hidróiisis del ATP, como fuente de energ'a, localiza una secuencia espeúñca y sintetiza un oligorribonucieótido complementario al ADN denominado ARN iniciador, el cual aporta el p p o 3 ' -0H necesario para la incorporación del primer desodrribonude6tido por la ADN- polimerasa Iii. La elongación ocurre de forma diferente en las 2 hebras. En la banda wnductnra el proceso es continuo y con la sola participación de la ADN-polimerasa Iii. En la banda conducida el proceso es discooünuo y resulta necesaria la formación de muchos ARN iniciadores en la medida que crece el tamaño de la horquilla. La ADN polimerasa JH añade los desoxinucleótidos hasta encontrar un ARN iniaador. Los ARN iniciadores son eliminados por la ADN polimerasa 1 que, además, Llena con desoxinucleótidos los sitios ocupados anteriormente por el ARN. La ADN ligasa une los fragmentos formados dando integridad a la cadena neoformada. El movimiento de la horquilla es facilitado por la acción combinada de las helicasas, las topoisomerasas 1 y las SSB. La terminación constituye la etapa menos conocida; existe un sitio específico para la terminación, al cual se unen proteínas que provocan la terminación de la replicación. En los ADN circulares se forman catenatos para cuya separación es neceaia la acción de las topoisomerasas U. Posterior a la tenninarión ocurre la modiñcación que consiste en la meolación de bases específicas, con lo cual se protege al ADN de la acción hidrolítica de las enzimas de restricción. Todo el proceso presenta una elevada fidelidad de copia que viene dada, entre otros factores, por la precisión del apareamiento de bases, la espedfíddad de las polimerasas, la e W - nación del ARN iniciador y el mecanismo de reetiñcación.

El estudio de la replicación en eucariontes está aún en sus primeros pasos, debido a la compleja estmctura de los cromosomas y a la dificultad para la obteo-

ción de grandes cantidades de mutantes que permitan seguir una estrategia similar a la uaüzada en procnriontes. No obstante, los estudios reaüzedos en virus y levaduras han dado sus primeros frutos. A partir de esos estudios, y con la identificación de genes y caracterización de proteínas involucradas en la replieación, es posible en estos momentos tener una representación bastante aproximada del proceso en los organismos superiores, aunque aún quedan muchos detalles importantes por esclarecer.

Numerasos son los antibióticos cuya acción espeeíñea consiste en actuar como inhibidores de la replieación, los cuales, además del beneficio que han reportado a la lucba contra las enfermedades infecciosas, han sido de ine&ble valor para el estudio del complejo proceso de la replicación del ADN.

Los resultados obtenidos experimentalmente en diferentes sistemas replicativos permiten intentar una descripción generalizada del proceso, que tendrá su expre- sión partinilar en cada organismo dado. La repiicación comienza en sitios especi- fim del ADN, denominados orígenes de repiicación, que contienen secuencias de bases nitrogenadas que sirven para la unión de proteínas espefíficas. La unión de estas proteínas producen el desenrollamiento local de la doble hebra del ADN, que por acción de otras proteínas es agrandado. Un sistema enzimático específico forma el ARN iniciador, que será alargado por el replisoma que contieue,almenos,las actividades de ADN polimerasa y de exonucleasa 3 ' -1 5 ' y que funciona en el mecanismo de edición. Una de las hebras se forma de manera conünua, en tanto, la otra se sintetiza por fragmentos que luego son unidos por Laacciónde ADN ligasas. Todo el proceso se caracteriza por la elevada velocidad de poümerización, la alta prwesividad y la extraordinaria fidelidad de copia.

Ejercicios

1. Demuestre que en el proceso de replicación se cumplen los principios siguientes: a) De los cambios graduales. b) De acoplamiento. c) De transferencia de información.

2. Teniendo en cuenta las características de su acción explique por qué es necesario que en la preiniciación intervenga la topoisomerasa II y durante la elongación la topoisomerasa 1.

3. ;Por qué algunos autores afirman que la replicación es un procesosemidiscontinuo? 4. cuál es la justificación molecular de la necesidad de formar el ARN iniciador? 5. ;Puedeun mutante de la E. colique carezca de Iielicasas realizar la replicación de

manera eficiente? 6. ¿Cuál esladifereiiciafuiiciot~al durantela replicación entre la ADN polimerasa 1 y

la ADN polimerasa III? 7. Para poder aislar con facilidad los fragmentos de Okasaki se prefiere utilizar bacte-

rias mutantes que son deficientes en la actividad dela ADN ligasa. ;Por qué cree usted que sea asi?

8. Teniendo en cuenta las características funcionales de todas las ADN polimerasas conocidas. plantee un modelo que pueda explicar cómo es posible la replicación de una ~iiolécula lineal (no circular) de ADN.

Y. Para investigar si existía un sitio para la terminaciónenelcromosomacircular de la E. coli se realizó el experimento siguiente: el ADN fue cortado y se extrajo un fragmento de gran tamaño, después los 2 extremos fueron unidos y se estudió el proceso de replicación, tomando muestras seriadas y analizándolas por autorradiografía. Deduzca cuáles deben ser los resultados esperados: a ) Si en efecto existe un sitio parala terminación. bi Si el sitio de terminación no existe.

En todos los organismos celulares el material genético está constituido por ADN de doble banda; aun cuando su estructura general es muy similar y eitá compuesto por las mismas bases nitrogenadas (A, T, C, C) existen notables diferencias entre las organizaciones particulares de los genomas en procanantes y eucariontes.

Una primera diferencia reside en el contenido de ADNde los diferentes organismos. Una bacteria típica como la E. coli posee un material genético equivalente a 4 x 10" bases. En un insecto como la Drosophiln nielu~~ogaster es de 1.6 x 10' y en los inamí- feros, de 4.8 x 10".

En segundo lugar, en los procariontes el ADN ocupa un lugar central en la célula. sin que exista una separación física entre él y el resto del organismo. En las células eucariontes el material genético (ADN) se encuentra separado físicamente del resto de la célula por una envoltura constituida de una doble membrana (capítulo 23).

Pero tal vez la diferencia más sobresaliente radica en la forma caractei-ktica que está organizado el material genético en los eucariontes. Como muclias de esas particularidades influyen notablemente en los mecanismos de expresión de la información genética y su regulación, se estudiarán primero las particularidades fundamentales de la orgaiiización del genoma en los organismos eucariontes.

En las células de eucariontes el ADN total se encuentrd dividido en un número variable de moléculas, caractei-ístico de cada e5pecie. y forinando con proteínas. estructuras muy complejas denominadas cn~musornas: el riúiiiero y la forma de los cromosomas son típicos de cada especie.

En un organismo existen 2 tipos fu~idanientales de células en cudnlo al iiúiiiero de cromosomas que contienen: las soináticas y las sexuales. Las primeras contienen el doble de croinosoinas que las segundas. por eso se dice que aquéllas son diploides y éstas ÚItimas. haploides. En las células soináticas los cromosornas se presentati por pares homólogos. los 2 miembros de la pai-eja son equivalentes, por lo que contienen una dotación genética doble con resprcio a la5 sexuales.

El ADN que forma parte de lo\ cromosomas es una sola molécula. que al parecer está en forma lineal y iio circular. A todo su la]-go está asociado con proteínas que son fundameiitnlineiite Iiistoiias. aunque existen otras no muy bien caracterizadas que ;unto con In\ historias determinan las foi-mas organizativas peculiares de los

Fig. 26.1. Loealizaciún de algunos genes en cromosomas humanos. (a) Se representa la localización de algunas genes del cromosoma 11 eomo son algunos protaoncogenea (POG), las cadenas de las globinas P (HBE),y(HBGZ y HBGI), 6(HBD) y p (HBB); paratohormona (PTH), fosfatasa ácida 2 (ACPZ), lactato deshidrogenasa A (LDHA), genes de las cateminas (CPSC). de las

de la colagenasa (CLGN) (b) La localización de algunos genes eu- yas alteraciones producen enfermedades eomo la deficiencia de inlerlerón (DIF), galactoseiiiia (GLM), porfiria hepática aguda (PHA) y anemias heniolíticas por deficiencia de la adenilato quinasa (AHAK), todos localizados en el cromosoma 9.

cromosomas. Como se vio en el capítulo 23, el grado de "empaquetamiento" del complejo ADN proteínas varía durante el ciclo celular, y las estructuras más compactas -los cromosomas propiamente dichos- existen sólo durante el período de división celular. Durante la interfase esta estructura se hace mucho menos compacta y se presenta en forma de cromatina. Como la mayoría de los estudios relacionados con la organización del genoma ha tomado como punto de referencia los cromosomas, en este texto se utilizará este término para referirse a estos complejos ADN proteínas, sin tener en cuenta su grado de "empaquetamiento". Cada cromosoma contiene un número característico de genes ordenados de forma lineal a lo largo de su estructura. Por procedimientos múltiples se ha podido conocer la localización de numerosos genes en los cromosomas humanos (Fig. 26.1). Durante la maduración de las células sexuales (gametogénesis) se produce la reducción del número de cromosomas, y cada gameto maduro (óvulo y espermatozoide) contiene solamente una sola copia de cada par de cromosoma, por lo tanto en las células sexuales cada gen está representado sólo una vez, a diferencia de las células somáticas que por ser diploides tienen una representación doble de cada gen

3 GLM

CPSC

AHAK

Aun cuando existen numerosos enfoques para tratar este problema, y de cada uno de ellos puede derivar una concepción distinta de gen, de acuerdo con las características de éste que más se pretenda destacar y como consecuencia de la profundización de los conocimientos sobre la naturaleza del gen, para los objetivos de este capítulo se utilizará la definición más empleada en la actualidad. Se da el nombre de gen a uno o varios sectores de una molécula de ADN, que contiene en su secuencia de bases nitrogenadas la información necesaiia para llevar a cabo la síntesis de una cadena poliniicleotídica especifica. Este ADN puede codificar la síntesis de todos los tipos de ARN, especialmente los ribosomales, los de transferencia y el mensajero. En este último caso, la secuencia de bases es traducida en secuencia de aminoácidos durante la traducción.

Al conjunto de todos los genes contenidos en una célula se le da el nombre de genoma. Las secuencias, que pueden ser exactamente iguales en ambos cromosomas o diferir en algo. siguen originando en esencia el mismo producto, aunque con pequetas diferencias, esto hace que en una población puedan existir numerosas formas del mismo gen. Uno de los ejemplos más sobresalientes en seres humanos es el gen que codifica la cadena !J de la hemoglobina, este gen está localizado en el cromosoma 1 I y de él se han reportado más de 200 formas que difieren por lo general en el cambio de alguna base nitrogenada que, aunque en muchos casos determina cambios en la secuencia aminoacídica de la proteína, sigue siendo esencialmente la B-globina (tabla 26.1).

Tabla 26.1. Diferentes tipos de alelos en la cadena /I de la hemoglobina

Tipo Defecto molecular Fenotipo

Hb S Cambia en P6 glu-val Sicklemia

Hb C Cambia en P6 glu-lis

Hb E Cambia en P26 glu-lis

Hb M e,,\, ,,,, Cambiaen P53 his-tir Meta Hb

Hh M S"*A,,%<"7" Cambia en P63 his-tir Meta Hb

Al conjunto de formas alternativas del mismo gen que pueden ocupar el mismo sitio en el cromosoma (locus) se le da el nombre de alelos. Pueden existir numerosas formas alélicas del mismo gen, pero una célula diploide sólo puede contener 2 como máximo, una en cada uno de los cromosomas homólogos. Si el par está representado por genes idénticos, y por tanto sus productos son indistinguibles, el organismo es homocigótico para esa pareja, pero si se trata de formas alélicas, entonces es heterocigótico. Es muy difícil encontrar algunas células u organismos pluricelulares que no sean Iieterocigóticos para uno u otro par de genes; esta diferencia en la estmctura de los genes se refleja en su producto, o sea, en la proteína y su función. Se utiliza el término de genes de tipo silvestre para referirse al gen que supuestamente consewa su formaoriginal, a sus formas alternativas se les denomina mutantes. por cuanto es la mutación el mecanismo fundamental en la formación de los alelos. En ocasiones algunos de los alelos mutantes codifican un producto que no es funcional. Suponga que existe un gen "A" que es de tipo silvestre y su mutante "a" que da un producto anormal, incapaz de realizar cualquier función. Existen 3 combinaciones posibles para esta pareja de genes (Fig. 26.2):

1. Los 2 genes son de tipo silvestre, por lo que el organismo es homocigótico (AA) y todo el producto génico es normal.

2. Un gen es de tipo silvestre y el otro es mutante (Aa), el organismo es heterocigótico y sólo contiene aproximadamente la mitad del producto génico normal.

3. Los 2 genes son mutantes (aa), el organismo es homocigótico, por lo que todo el producto génico es anormal. Si ese producto realiza una función importante para la vida, la célula en esas condiciones no sobrevivirá o lo hará en condiciones precarias.

El conjunto de genes presente en una célula constituye el genoma, pero el par de ellos que determina u11 carácter particular recibe el nombre de genotipo. La manifestación externa del ge~iotipo recibe el nombre de fenotipo; éste puede definirse desde muchos puntos de vista, desde la posibilidad de inetabolirar una sustancia o reconocer una señal química, hasta los rasgos más externos del organismo como el

Fig, 26.2. Posibles combinaciones de alelos. Pueden existir numerosos alelas de un mismo gen, pcro en un organismo dado sólo pueden haber 2, uno por cada cromosoma. Si se representa en azul el gen de tipo silvestre que es dominante y en rojo el mutante reeesivo, podemos encontrar 3 eambinaeioiiea: (a) Los 2 genes san tipo silvestre y el organisiiio es homoeigótieo domi- ziante. (h) Un gen es tipo silvestre y el otro mutado, ari como el organismo cs heteroeigótieo. (c) Los 2 genes son mutantés y el organismo es homocigótico reeeslvo. De- pendiendo de las raraderístieas del producto génico el heteracigólim pucdc manifestar o no un fenntipo anormab

Componentes celulares y Cienetica molecuiar 463

L,

Fig. 26.3. Determinación genética de los grupos sanguineos ABO. Los eritroeitas poseen un polisacárido unida a lípidos o proteínas de sus membranas, éste posee carácter antigénieo y está formado como se muestra en IP figura por glucosa (Glu), galaefora (Gal), furnsa (Fue) y N-acetilglucosamina (NAGlu), y es denominado antíge- no O. El gen A codifica la enzima A que añade al polisacáridoun resto de N-aeetilgalactosamina (NAGal) y lo convierte en el antigeno A. Por su parte el gen B codifica la enzima B que añade al nntígeno O un resta de galactosa y lo ronvier- te en el antigeno B. Si la persona pasee los 2 genes poseerá también las 2 enzimas y aproximadamente la mitad de sus anlígenos serán A y la otra mitad será B, por lo que ella será del grupo AB. De no poseer ninguna de estas genes, entonces será del grupo O.

color de los ojos, la forma de las extremidades. etcétera. Los caracteres acostumbran a clasificarse en dominantes o recesivos, de acuerdo con los patrones de trasmisión génica. En ocasiones se comete el error de hablar de genes dominantes y recesivos, pero en realidad estos términos sólo se refieren al carácter determinado por el genotipo.

Estos conceptos son relativos y contrarios, o sea, la existencia de uno determina la existencia del otro. En un inicio se decía que el carácter era dominante cuando siempre se expresaba en el fenotipo, mientras que el recesivo sólo lo hacía si estaba en estado homocigótico; aquí se concebía el fenotipo como las características más externas del organismo. En la medida que se han ido perfeccionando el conocimiento sobre la expresión de los genes y los procedimientos que permiten localizar y cuantificar el producto génico, la concepción del fenotipo y con ella la del carácter recesivo se han modificado; es de esperar que con las nuevas técnicas introducidas que permiten detallar la estructura del gen, la diferencia esencial inicial entre estos 2 conceptos tienda a desaparecer. La distinción entre caracteres dominantes y recesivos es muy importante en la práctica médica, pues hay enfermedades que se trasmiten como un carácter dominante y otras como recesivo, todo lo cual el médico debe tener muy presente para hacer los asesoramientos genéticos del paciente y de la familia.

Un ejemplo permitirá esclarecer los conceptos definidos hasta el momento. Para los grupos sanguíneos ABO existen básicamente 3 alelos. El grupo sanguíneo A es dominante y está determinado por el alelo A. Nótese que aquí el fenotipo no es algo externo, pues por la sola observación del sujeto no es posible determinar su grupo sanguíneo. El grupo sanguíneo B es también dominante y lo determina el alelo B. El grupo O tiene carácter recesivo y se origina por el alelo O. Una persona con la combinación génica AA será del gmpo sanguíneo A, en tanto la del genotipo BB será del B. Las combinaciones genotípicas A 0 y BO originan fenotipos A y B, respectivamente. El genotipo 00 corresponde al grupo sanguíneo 0 . Ahora bien, como A y B son dominantes, la persona que tenga un genotipo AB expresará amhos genes por igual y será del gmpo sanguíneo AB. Cuando 2 genes que determinan el mismo caricter se expresan de igual forma en el fenotipo, se dice que los caracteres son codominantes.

Esto tiene su explicación molecular. Las sustancias que determinan el grupo sanguíneo ABO son pequeños heteropolisacáridos que forman parte de la membrana de los eritrocitos. Como se muestra en la figura 26.3, los sujetos del grupo sanguineo O

tienen en sus eritrocitos el polisacándo mostrado en (a). El gen A codifica una enzima que añade la N- acetil-galactosamina al extremo del polisacárido, cambiando su especificidad reaccional; en tanto el gen B codifica la enzima que añade galactosa, otorgando una especificidad diferente. En los sujetos AA 6 A 0 la estructura resultante será como se muestra en (b). en los BB ó BO es como en (c). En los 00 es como en (a). mientras que en los AB se encontrarán como en (b) y (c) aproximadamente a partes iguales.

Genes y ADN

De acuerdo con numerosos estudios el ADN contenido en una célula diploide Ii~iinana es aproximadamente 7,3 x 10" g. Si el peso molecular promedio de un par de iiucleótidos es de 1,025 x 10~" g se deduce que la célula diploide humana contiene alrededor de (7,3 x 10~"/1,025 x 1W) 7,l x 1 O9 pares de bases por genoma diploide, ó 3,s x 10' por geiioma haploide.

Si todo este ADN codificara proteínas de aproximadamente 500 aminoácidos cada una, podría producirse más de un millón de ellas. Como para cada aminoácido se requieren 3 bases harán falta (500 x 3) 1 500 pares de bases. A partir del genoma total serían (3.5 x lO''I1,S x 10') 2,3 x 10"proteínas.

Por varios métodos genéticos se ha determinado que la célula humana contiene aproximadamente de 70OX a 100000genes. Si se mantienen los mismos "supuestos" anteriores, pan la codificación de 100 000 proteínas senm necesarkai [(7 x 109 x (3 x IW)] 2,l x 10* pares de bases, lo cual representa [(2,1 x 107)1(3 x 10') aproximadamente 1071, es decir, que sólo aproximadamente el 10 %del ADN contiene información para la síntesis de riioléculas específicas (proteínas. ARNr y ARNt). De aquí se deduce que la mayor parte del ADN está implicada en los mecanismos de regulación de la expresión genética o en otras funciones aún desconocidas.

Si se aísla el ADN de una bacteria y se cona mediante emiiiias en unos 500 a 1 000 fragmentos y se centrifiigaii en un gradiente de densidad de CsCI. se observan que se reúnen en una zona única y estrecha (Fig. 26.4).

Esto se debe a que la densidad del ADN es proporcional a su contenido en G + C y la composición promedio de cada fragmento, que contiene varios cientos de bases, no varía mucho de uno a otro. Si se aplica el mismo procedimiento al ADN de un mamífero se obtienen 2 zonas, la mayor con una composición aproximada de A + T del 60 %,pero la menor con más del 90 P/a de A + T. lo cual constituye un hecho inusual. Al ADN contenido en esta zona se le denomina ADN satélite, &te ha sido observado en muchos organismos y en el ser humano constituye del 0.5 al 1 lo (10' pares de bases) del genoma.

Una característica importante del ADN satélite es lade estar formado por secuencias repetidas organizadas en tándem, una a continuación de la otra. Estas secuencias generalmente son cortas, de 5 a 10 bases, pem pueden llegar a tener de 100 a 200 bases. Las secuencias características de la D. mrlarioguster son las siguientes:

Se ha podido determinar la localización de este ADN satélite, para ello se procedió de la forma siguiente: se tomaron muestras de ADN satélite y a partir de él se fonnó ARN niarcado con YHJ-undina. Se fijaron células cultivadas sobre un portaobjetos y se trataron con álcalis para desnaturalizar el ADN. Con este tratamiento el croinosoma queda pr8cticarnente intacto. Se añadió el [M-ARN y se dio tiempo suficiente para permitir la hibridación. Se lavó la preparación para eliminar el exceso de reactivo y se sometió a un proceso de autorradiografía. Al revelar la placa se encontró que el ADN satélite se localizaba fiindameiitaliiieiite en los centrómeros y con menor frecuencia en los telomeros; se Iia pensado que esté relacionado con la fijación del hubo durante la división celular, pero esto no ha sido comprobado. No debe confundirse al ADN satélite con los satélites descritos en la estructura de algunos cromosomas, pues aliuque la palabra puede tener en ambos casos la misma connotación (una estructura asociada con otra) se refiere en cada caso a conceptos diferentes.

- 1.683

Densidad

Fig. 26.4. Dcteecián del ADN satélite. Si el ADN de los procarionles se corta con nurleasas espeeífiras cn un grupo reducida de fragmentos de gran tamatio y después se centrifugan en gradiente de densidad, estos fragmentos sc agrupan en una zona estrecha del tubo de centr¡fugaciÚn donde la densidad de ellos sea igual a la del medie. El ADN de eurariontes. al scr somc- tido al misma procedimiento, se concentra en 2 zonas de densidad diferente. La de menor densidad corresponde al ADN satélite.

Componentes celulares y &netica molecular 465

Fig. 26.5. Curva Cal. Si se desnaturaliza el ADN de la E. col¡ (azul) y se sigue el proceso de renaturalizaeión, se obtiene una lima continua corno corresponde a una sola especie moleeular. El ADN de marniferos (rojo) presenta varias curvaturas, lo cual indica que éste se comporta de forma heterogénea. Una frac- ción (1) presenta una reasociación rápida y otra (4) es lenta, a la vez que se observan otras 2 (2 y 3) aue iiresentan una velocidad de

Estos hallazgos impulsaron a realizar el estudio más a fondo acerca de las características de los ADN de eucariontes. Un procedimiento que ha dado muchos resultados es el estudio de la cinética del proceso de renaturalización. Para ello se extrae el ADN de un organismo y sin fraccionarlo se desnaturaliza. después se coloca en condiciones que permiten la renaturalización, siguiendo el proceso en función de la concentración inicial de ADN (Co) y el tiempo (t). Cuando esto se hace con el ADN de la E. coli se obtiene una curva típica que se muestra en la figura 26.5 (a); se interpreta como si el proceso ocurriera por la presencia de una sola especie molecular. Cuando se hace con ADN de mamíferos se obtiene una curva que aparece en la figura 26.5. (b), . . - que presenta varias mesetas como si en el proceso intervinieran más de una especie molecular, una de renaturalización rápida, otras intermedias y otra lenta; esto se debe a la existencia de secuencias con mayor o menor grado de repetitividad.

. . reasociación intermedia; esto sip- 90 nifica que el ADN de marniferos '. . se comporta coma si ealuviera for- 100

mado por 4 especies moleeularei. 1 0 l . I2 10~1 1 , ,O2 I$ 16 ,/6 IU? Cot(M.5 )

El análisis detallado de estas curvas y el uso de otros métodos complementarios permiten distinguir4 tipos de secuencias en el ADN de eucaiontes: las altamente repetidas, que aparecen por varios cientos o millones de copias y se corresponden con las de renaturalización rápida; las medianamente repetidas, que se presentan en un número de copias que va de 10 a varios cientos; las moderadamente repetidas con un número de copias de 2 a 10 y junto con las anteriores representan la fracción de velocidad intermedia de renaturalización; por último, las secuencias de copia única que son las de menor velocidad de renaturalización. En forma de copia única se encuentra la mayoría de los genes de lacélula, pero en realidadconstituye la menor fiacción del ADNcelular. Ejemplos de secuencias moderadamente repetidas son los genes de las histonas y de los ARNt. En algunos casos estas secuencias no son exactamente repetidas y los productos génicos presentan pequeñas diferencias en su composición. Las secuencias medianamentr repetidas en general no son codificantes y se cree que tengan alguna función reguladora. Las altamente repetidas incluyen al ADN satélite y algunos genes, como los que codifican los precursores de los ARNr, para los que se han calculado que existen unas 24 000 copias para el de 5 S y unas 500 copias para el precursor de los otros 3 tipos.

Estructura del gen

Una vez analizadas las características generales de los ADN de eucariontes, es conveniente detenerse a examinar la estructura interna del gen. Como ya se señaló, un gen está constituido por uno o más segmentos específicos del ADN, cuya secuencia de bases contiene la información necesaria para la síntesis de moléculas específicas, o sea, proteínas, ARNt y ARNr.

Si se compara la longitud de algunos genes de eucariontes con la de sus productos se observa que éste es generalmente mucho menor que aquél. Así, de acuerdo con la

longitud de su gen, la cadena P de la hemoglobina debía poseer unos 500 aminoácidos cuando en realidad sólo contiene 146 aminoácidos.

Hechos como éste comenzaron a ponerse de manifiesto a mediados de la década de los años 60 y despertaron un vivo interés. Después de múltiples esfuerzos se ha podido comprobar que los genes eucariontes no son continuos, sino que se encuentran interrumpidos por secuencias de nucleótidos que no codifican para la proteína dada; por lo tanto la caractenstica general del genoma de poseer zonas codificantes y no codificantes se repite a pequeña escala en la estructura misma del gen. Así cada gen está constituido por un número de secuencias codificantes que alternan con secuencias no codificantes. Las primeras reciben el nombre de exones (e.rit, salida, alude al hecho de que estas secuencias una vez transcritas abandonan el núcleo) y las segundas, el de intrones (inside, dentro, pues una vez transcntas quedan dentro del núcleo). El número de exones es variable para los diferentes genes; el de las globinas presenta 3 exones, las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas 5, la ovoalbúmina 8, la conalbúmina 18 y la cadena a del colágeno 53 (tabla 26.2).

mbla262. Características estructurales d e algunos genes humanos

Pmteína Residuos Cromosomas Gen@b) Exones

Colágeno Inl lo00 17 18 000 51

Factor Mn 2 332 X 186 O00 26

Receptor de LDL 839 19 45 000 18

La secuencia de bases así como la longitud de los intrones no parecen presentar regularidad alguna, pero suelen ser mayores que los exones. La única regularidad que ha sido observada es una pequeña secuencia que se encuentra al inicio y al final de cada intrón, pues todos los conocidos comienzan por GT y terminan con AG; esto puede comprobarse en la figura 26.6, donde se muestran los resultados de un estudio de la secuencia de las uniones entre intrones y exones en más de 100 genes.

Ex6n Intrón Exón

( O O 86---------------- 5 130 0 1

; ;; 16 8 1 10 o 3 .--............. 84 ; l;i 123 28 ~ i g . 26.6. características de 10s intrmes. La figura representa la secuencia de bases nitrogenadar alrededor

16 10 139 0 41 .... ~ ........... 1 67 32 de las uniones exón-intrón y la intrún-exón. así como demueslra

Total a n a l i ~ a d o ) ~ 139 ---( 1 130 -1 la cio constancia y del par del AG par en el GT final. en el ini-

Componentes celulares y Gen6tica molecular 467

Fig. 26.7. Estructura generalizada de un gen cucarionle. Si leemos el gen de izquierda a derecha, lo primero que encontramos es la regiún del pro- matar, can sur secuencias reguladoras especialmente TATA en la rana de -30. El sitio para el Cap corresponde al primer nucleútido que será transerito y ocupará el extremo 5 ' -P del ARNni. El triplete ATG señala el sitio donde debe comenzar la traducción. Lue- go ovones e intrones se alternan de acuerdo can el gen específico de que w trak. Después del Último a ú n ap-e una zona que contiene lasffuenOaMTAAA,queindiaq~e unay 20 bases más adelante está el sitio donde debe incoiporaise la cala de poli A. El punto exaclo de la ter- minación no ha sido tobimente esclarecido.

Todo parece indicar que la fragmentación de los genes no es al azar. Son muchos los ejemplos que demuestran que cada exón codifica para una zona específica de la proteína con características estructurales y funcionales muy definidas, o sea, un dominio. Esto ha hecho pensar que los intrones pudieran haber tenido una importante función en la evolución, que favorece el intercambio de segmentos génicos al formar nuevos arreglos que darían lugar a proteínas diferentes, a partir de bloques de otras proteínas. La presencia de los intrones hace más flexible al genoma de los eucariontes, lo cual aceleraría el proceso evolutivo. Por otra parte, estos exones pueden arreglarse de forma diferente, al ser transcriios en su ARNm o durante el procesamiento de estos últimos, dando lugar a la formación de proteínas diferentes a partir del mismo segmento de ADN. Una vez más se trata de conceptos relativos, pues en muchos casos los intrones de un gen representan otros genes. Así en el gen NFI, cuya alteración produce una enfermedad llamada neurotihromatosis 1 , presenta un intrón de gran tamaño en el cual están ubicados otros 3 genes.

Por ultimo, es bueno señalar que no toda la secuencia de bases que aparece en los exones se traduce en secuencias específicas de aminoácidos. Hacia el extremo 5' aparece una secuencia de bases. cuya función está relacionadacon la iniciación de la traducción y facilita la incorpornción del ARNm al ribosoma. Otra secuencia aparece hacia el extremo 3' y está relacionada con el mecanismo de terminación. En esta zona existe una señal que indica el lugar doiide debe producirse la modificación del extremo 3' del ARNm. coiiocida como sitio de poliadenilación y que se estudiará con más detalles en el capítulo siguiente (Fig. 26.7).

Unidad de Transcripción A

Por su parte, los procariontes tienen generalmente su ADN formando una sola cadena, cuya asociación con proteínas no resulta tan regular como en los eucanontes. Casi siempre contienen sus genes en copia única y éstos no presentan secuencias intercaladas. Cuando en algunos casos los genes pueden ser mayores que su producto, las adiciones se encuentran hacia los entremos, de manera que la secuencia codificadora es casi siempre continua.

" Promotor I

E n procariontes,los genes cuyos productos están relacionados funcionalmente se organizan en operones (capítulo 34) y son transcntos en un ARNm policistrónico, que contiene información para más de una cadena polipeptidica. Todo el sistema se controla por medio d e una secuencia específica d e bases -el operador- y puede activarse o desactivarse regulando el funcionamiento de éste.

Esto no sucede en eucariontes. Muchos genes eucariontes funcionalmente relacionados pueden formar gmpos (cluster) denominados familias génicas. La actividad de los miembros de la familia es habitualmente (pero no siempre) regulada de forma coordinada.

-30

TATA \ ATG

Exón 1 uih.611 1

OS I oz I OZI OZ 1

ontogenético del organismo. El ejemplo mejor conocido es el de los genes de la hemoglobina. Esta proteína es un tetrámero formado por 2 subunidades de tipo a y 2 de tipo p. Hay varias formas de estas subunidades que se diferencian en unos pocos aminoácidos y la forma presente depende de la etapa del desarrollo del organismo.

Fig. 26.9. Familias multigénicas complejas. El grupo está formado por genes que se transeriben de forma independiente. La figura representa la familia de las cenes rima las hiitonas en (a) el - . eriza de m&, (b) la ~ros&hila mdanogaster y (c) en el tritón, una especie de salamandra marina. La flecha indica el sentida de la transcripción.

En el caso de las subunidades de tipo P, existen 4 variantes (E, y, 6 y B). Durante el período embrionario (menos de 8 semanas después de la fecundación) sólo se produce la cadena E, de la semana 8 a la 41 se sustituye por la y y a partir del nacimiento por la p y una pequeña fracción de la F; igual sucede con las subunidades de tipo a. La familia a está localizada en el cromosoma 16 y la P en el 11 y curiosamente están organizadas en el mismo orden en que se activan (Fig. 26.10).

Fig. 26.10. Familias multigénicas complejas controladas por el desarrollo. Este grupo está compuesta par genes que se activan e inactiva" de acuerdo ron el momento del desarrollo. (a) La familia géniea de la a-globina en el cromosoma 16, 5 es una cadena embrionaria, la al y a 2 se producen dcsde la da fetal hasla la adultez. ~5 y yial representan seudogenes. (b) La familia génica de la R-globina localizada en el cromosoma 11; E es una cadena emhrionaria, Gy y Ay son fetales y las R y S comienzan en la vida ktal v semantienen hasta el estado adulto. yi 151 representa un seudagen. Como se indica en las flechas, estos genes se organizan en el mismo orden en que son activados, la cual no siempre sucede.

Genoma humano

El estudio del genoma humano es uno de los campos irás importantes y mis complejos de la biología celular contemporánea. El tamaño y la organización cromosómica de éste son similares al de otros aniiiiales. pero los métodos empleados para su estudio resultan más coiiiplicados. El desxrollo de la tecnología del ADN recombinante ha permitido encoiitr;ir pr»cediiiiieiitos directos para continuar, profundizar y rectificar resultados eii~~«iiti.;idos rii décadas anteriores por estudios indirectos, a los cuales muchc coiiirihiiyi, el c\tiidi« de la correlación entre las enfermedades de origen gent9ii.o y los Ii;ill;iz~(is hioqiiíiiiicos y citogenéticos de los pacientes. A manera de concliisiiiii de este c;ipíiiil« se iiiencionarán las características más notables del geiionia de los \eres liiiiiimc~.

El genoina Iiuiiiniio est5 c(iii\titiiid<i pnr iii«léculas de ADN organizadas en 22 pares de cr»iii»siiiii;is ;iutiisi,iiiic<is. el par de cromosomas sexuales (XY) y el niitocondrial (t:iinhiL.ii Ilaiiiiido cr«in«s«ma M 6 25). Sus dimensiones pueden expresarse en tEriiiiiios de iiúiiicni toiiil de p rez de bases o de genes. El genoma nuclear haploide hiiiii;iiiii coiiticiic 3.3 x 10" pb y el iiiitocondrial 16 569 pb.

Pnih;ihleiiiciite cl Ii<iiiihre tiene entre 50 000 y 100 000 genes estructurales, que codilicnii I:i seciiciici;~ aiiiiiinacídica de proteínas o la nucleotidica de ARN ribosoinales y de irmslereiicia. A csie estiinado se ha llegadopor medio de numerosos procedimientos y resiilin ;ip«y;id« pnr el número de genes localizados en un segmento de ADN de loii~iiiid coiiocidii. que ha sido estudiado en gran detalle. No debe confundirse el núiiiero de y i e s con el de proteínas. pues como se podrá ver en capítulos posteriores un iiiisiiio gen puede dar lugar a más de una proteína y, además, existen otros mecanismos que prodiicen la formación de un gran número de proteínas a partir de un segmento génico limitado.

El cniiiins~iiia iiiitocondrial presenta una mayor densidad de genes (por ausencia de intmnes y espaciadores mucho más cortos) y presenta 13 genes para proteínas, 22 para ARNr y 2 para ARNr (125 y 16s).

Se Iiaii locdizado unos 800 loci, cerca de 120 en el cromosoma X y los restantes en los autosóiiiicns. Cada uno contiene como mínimo 1 200 pares de bases en información codificada. pern son mucho mayores debido a los intrones y las secuencias que los tlanquenii. t;iiito hacia el extremo 5' como hacia el 3'. Hacia la zona adyacente al extreiiin S' se encuenti-an las regiones reguladoras, y hacia la 3' la secuencia AATAAA conocida como sitio de poliadenilación.

Entre uno y otro gen se hallan secuencias espaciadoras de varias kb cuyas funciones. si Im tieiieii. son desconocidas. Éstas consisten en secuencias repetidas, de las cuales la iiiis frecuente es la llamada familia Alu, pues contiene la cuarteta AGCTíTCGA que es reconocida por la enzima de restricción Alu 1 (de Arthrobacter luteus); estas secuencias repetidas est6n presentes cientos de miles de veces en el genoma humano, especialmente en los espaciadores. pero en ocasiones en los intrones.

De todos los estudios realizados hasta el presente pueden derivarse algunas característic;is generales en cuanto a la organización de los genes humanos en los cminosoiiias y que pueden resumirse en las siguientes:

l. En general los genes cuyos productos están relacionados evolutiva o funcionalmente aparecen agrupados en los cromosomas, sin embargo no existen agrupaciones génicas para estructuras y funciones de órganos particulares, como oídos, corazón, pulmón u organelos subcelulares como lisosomas, mitocondrias, etcétera.

2. Los genes que codifican las enzimas que catalizan reacciones sucesivas en una vía metabólica particular no se encuentran por lo general agrupados en el mismo cromosoma. Así, los genes para las enzimas galactoqninasa, galactosa-1-fosfato undil-transferasa y la gaiactosa-4-epimerasa, que propician la entrada de la galactosa

a la vía glucolítica están localizados en los cromosomas 17,9 y 1, respectivamente. Igual sucede con las enzimasdelciclodela urqpues IacarbamilfosPato sintetasa 1, ornitina transcarbamilasa, argininosnccínico sintasa, argininosnccínico liasa y la arginasase encuentran codificadas en los cromosomas 2, X, 9,7 y 6, respectivamente. Un hecho curioso es que la triosafosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, enolasa y lactato deshidrogenasa, relacionadas todas con la vía glucolítica, presentan sus genes agrupados en el cromosoma 12.

3. Los genes que codifican para las subunidades de proteínas heteroméricas se hallan usualmente en cromosomas diferentes; mientras el gen para la subunidad a d e la hemoglobina está en el cromosnma 16, la subunidad P está codificada en el 1 l. Lo mismo sucede con las formas isoenzimáticas de la lactato deshidrogenasa cuya subunidad M se codifica en el cromosoma 11 y la H en el 12. Una excepción notable es el fibrinógeno, cuyas 3 subunidades se codifican por genes localizados en el cromosoma 4.

4. En contraste con lo anterior, algunos genes coditican más de una cadena polipeptidica; esto se debe fundamentalmente al procesamiento posterior del ARNm; así sucede con la insnlina cuyas 2 cadenas son codificadas por un gen único nbica- do en el cromosoma 11. Es también el caso del gen de la proopiomelanocortina localizado en el cromosoma 2 que da origen a 7 polipéptidns con funciones diferentes.

5. Los genes quecodifican laformacitosólica y mitocondrial de la misma enzima se encuentran en cromosomas diferentes, como sucede con la transaminasa glutámico-oxalacética, cuya forma citosólica se codifica en el cromosoma 10 y la otra en el 16 y la isocitrato deshidrogenasa en el 2 y el 15, respectivamente.

6. Una característica sobresaliente es la existencia de los pseudogenes, o sea, secuencias de bases similares a la de genes funcionales, pero que no se expresan al parecer por haber perdido algún sector indispensable para su transcripción; estos pseudogenes ocupan una porción considerable del genoma. Los más conocidos son los de las cadenas a y p de la hemoglobinaen los cromosomas 16 y 11, respectivamente.

El desarrollo que han alcanzado las diferentes técnicas, para el estudio de los ácidos nucleicos, hace tener esperanzas de que en los próximos años se conocerán muchos más elementos acerca de la estructura y la organización del genoma humano. A este objetivo debe contribuir de fonna sobresaliente el Proyecto del Genoina Humano. que pretende establecer la secuencia de bases de todas las moléculas de ADN contenidas en los cromosomas humanos y realizar estudios comparativos con secuencias de otros organismos, para determinar la función de cada uno de los segmentos de ADN. Esta investigación es transcendental para la biología contemporánea y debe estar terminada para los primeros años del próximo siglo.

Resumen

El material genético de todos los organismos celulares está consütnido por el ADN, que puede exLsür en una sola molécula como en los proeariontes, o en varias como en los encariontes, en los niales, además, está separado del reato de la célula por una doble membrana. El ADN de eucariontes se encnentra asociado con proteí- uas, formando el par cromatina-cromosoma. El número y la forma de los cromosomas son caracterLsticos de cada especie. En los cromosomas se hallan secuencias de bases nitrogenadas que contienen la infomci6n neeessria para la &tesis de las proteínas, los ARNr y los ARNt: éstos son los genes. El conjunto de todos los genes en un organismo deíine el genoma Un gen puede tener muchas formas al6Ucas pero una dlula s61o puede tener 2. Si son ignales, la d u l a es homaeig6tica, y heterocig6tieasi sondesiguales. La pareja de genes que determina

un earácter forman el genotipo y su manifestsción externa es el fenotipo. Un ejemplo caraeterísocn de la relación genotipo-fenotipo en seres humanos lo constituyen los g m p sanguíneos ABO.

En la célula eucarionte existen distintos tipos de secuencias nueleotídicas en el ADN: las altamente repetidas, mediana y moderadamente repetidas y las semen- cias únicas. Los genes casi siempre se encuentran en secuencias de copia única, aunque existen notables excepciones como los de las historias y los ARNr. Las secuencias altamente repetidas se locaüzan en los centrómeros y con menor frecuencia en los telómeros; su hinaón es de800nocida Los genes eucariontes son diseonünuos, pues presentan secuencias hieraladas no codificantes (htrones), separando las codificantes (exones). Los geoes cuentan además con sus promotores y con sus seeuenciasfnncionales -aunque no ccdiñcantes- tanto hacia el extremo 5'-P como hacia el 3'-OH.

Muchos genes relacionados funcionalmente se agrupan, formando famiüas génicas que pueden ser simples, complejas o reguladas por el desurolio ontogenético del organismo.

El genoma humano constituye un caso especial dentro de los organismos eucariontes por la importancia extraordinaria que tiene su mnoeimiento pmfnn- do. Se han LoealVado más de 800 genes en los cromosomas humanas y a partir de n u m e m estudios se han podido precisar algunas de sus caracterísocas más sobresalientes: los genes que ccdiñcan proteinas espeóficas de un órgano o tejido no están agrupados en el mismo cromosoma, así como tampoco los relacionados con una vía metabólica; las subunidades de protehw heteroméncas se codifican por genes localizados en cromosomas diferentes; algunos genes ccdiñean más de una cadena poüpeptidica; también se encuentran separados los genes que ccdiñcan formas diferentes de la misma e m k q por Último, la presencia de pseudogenes en una proporción notable del genoma es un heeho apreciable en el genoma humano.

F.stos conocimientos tienen no S610 una importancia teórica, sino también prác- tica sobre todo en el campo de las ciencias médicas-

Ejercicios

1. Un gen A tiene un alelo A ' . Si el genotipo femenino es AA y el masculino A ' A ' ¿cuáles serán los posibles genotipos de los descendientes?

2. ¿Cuál sería el resultado de la pregunta anterior si los genotipos masculino y femenino hubieran sido AA ' ?

3. Se ha calculado que en el ADN de la E. coli existen 1 500 genes. Si cada uno codifica una proteína de 500 aminoácidos y el ADN total es de 4 x 10' pb. ¿Cuál será la proporción codificante de ese ADN?

4. ¿Cuáles son los tipos de secuenciai de ADN que encontramos en las células eucariontes y qué relación tienen con las funciones del ADN?

5. A un cultivodecélulas sele añade ['HI-uridina durante lominutos. Las células se lavan para eliminar el exceso de reactivo. Se sigue entonces la marca radiactiva por los compartimentos celulares. En los primeros minutos después de la exposición toda la radiactividad se localiza en el núcleo de todas las células. A medida que pasa el tiempo se observa que las células se comportan deforma diferente, mientras en algunai de ellas la radiactividad permanecía en el núcleo, en otras se localizaba en el citoplasma ¿Cómo pueden explicarse estos resultados?

6. Se sabe que la ARh' polimerasa tarda aproximadamente 5 minutos en sintetizar el ARNr de 28 S. Calcule cuántas moléculas pueden formarse en 8 horas si: a) Existe un sólo gen para el ARNry se transcribecon una sola polimerasa cada vez. b) Existen 100 copias del gen y cada uno es transcrito por una sola molécula de la

enzima. c) Existen 100 copias del gen y cada uno es transcrito por 100 polimerasas

simultaneamente.

Componentes celulares y Genética molecdar 473

Con anterioridad se estudió cómo la replicación del ADN es el fundamento molecular de la transferencia de información de una célula u organismo a sus descendientes. Se asegura que en el ADN radica la información que determina las característi- cas estructurales y funcionales de las células que lo contienen; luego en las células deben existir mecanismos por medio de los cuales se logre la expresión de la informa- ción genética, ese mecanismo en líneas generales consiste en sintetizar proteínas, cuya secuencia de aminoácidos está codificada en la secuencia de bases nitrogenadas del ADN, y este proceso consta de 2 etapas fundamentales.

En la primera la secuencia de bases del ADN se copia en una molécula específica de ARNm,esta etapaes la transcripción. La segunda consiste en utilizar lasecuencia de bases del ARNm para, a partir de ella, sintetizar una cadena polipeptídica con una secuencia específica de aminoácidos, esta etapa es la traducción (Fig. 27.1).

Estos 2 procesos que ocurren de manera continua -en algunos casos basta simultá- neamente- constituyen el mecanismo fundamental, mediante el cual el ADN determina las características estructurales y funcionales de unacélula y de un organismo como un todo; por eso, como se vio anteriormente, no es imprescindible la duplicación exacta de todos los componentes celnla~s al producirse la división celular, pues basta con la división del ADN y los componentes celulares que intervienen en su expresión para quelas células hijassean de la misma especie que las parentales.

Aspectos generales

La transcripción es el proceso central en el crecimiento y desarrollo de las células, en lacual los genes que se encuentran en el ADN de los cromosomas sonselectivamente localizados, reconocidos y transcritos, produciendo ARN mensajeros, ribosomales (estructurales) y de transferencia (adaptadores). El notable progreso en Los últimos años de la genética bacteriana,el ADN recombinante, la bioquímica-física, etcétera, ha ampliado considerablemente los conocimientos sobre este proceso. Aun cuando puedan existir diferencias en los mecanismos de transcripción en diferentes organismos, hay una serie de características comunes a todos ellos que se enumeran a continuación.

Los precursores de la síntesis de los ARN son los 4 ribonucleósidos trifosfatados, ATP, GTP, UTP y CTP. En la reacción de polimerización, los ribonucleótidos son añadidos uno a uno al extremo de una hebra en crecimiento por enzimas denominadas ARN polimerasas dependientes de ADN o ARN polimerasas.

Fig. 27.1. Relación transcripeiún traducriún. En los proeariontes (a) al no eiis- tir envoltura nuclear la traducción comienza generalmente antes de terminar la transcripciún. En los cuearionles (b) cl ARNm se forma en el núcleo y alli se procesa antes de ser transportada al citoplasma donde es traducida.

La secuencia de bases del ARNes complementaria a la hebrade ADN, quese está copiando. Aunqueel ADN es en general dedoble hehra,en cada sector específicosólo una de ellas se utiliza como molde o patrón para la síntesis de ARN.

La hebra de ARN crece en el sentido 5 ' -3 ' ,mientras va copiando la hebra del ADN que está en dirección 3 ' -5 ',luego la síntesis es antiparalela y nnidireccional. La reacción básica de polimerización consiste en la adición de un ribonucleósido trifosfatado al extremo 3 ' - 0 H del nucleótido precedente, con liberación de pirofosfato, formándose un enlace fosfodiéster. Al igual que en la replicación, la polimerización avanza acoplada a la hidrólisisdel pirofosfato. Las ARN polimerasas son capaces por sí mismas de iniciar la síntesis, luego no hay necesidad de un iniciador.

En resumen, la transcripción se produce por el mecanismo básico de complementaridad de bases. añadidas en formas gradual, unidireccional y antiparalela, sin necesidad de un iniciador y acoplada a la hidrólisis del pirofosfato.

Etapas de la transcripción

En el estudio de este procesoseseguirá el mismo ordenamiento quecon el estudio de la replicación: la iniciación, la elongación y la terminación, así como los eventos previos a la iniciación (preiniciación) y los posteriores a la terminación (postermi- nación). En primer lugar se analizará c6mo ocurre el proceso en los organismos procariontes, queson los mejores conocidos. Más tarde se tratará la transcripción en eucariontes dondese ha producido un extraordinario avance en los últimos años. La transcripción es un proceso más simple que la replicación. En la E. coli una sola enzima es suficiente para la realización de todo el proceso; se comienza por describir las características estructurales y funcionales de la enzima para no intermmpir la secuencia de los eventos moleculares.

Esta enzima debe realizar múltiples acciones para llevar adelante la transcripción: reconocer el comienzo de lacadena de ARN que se debesintetizar en una doble hebra de ADN, para lo cual debe identificar una secuencia de bases específica,debido a las irregularidades de la estructura del ADN en esa zona del genoma; colocar cada nucleótido en su posición correcta de acuerdo con la secuencia de bases del ADN; realizar la síntesis total de la molécula de ARN desde el principio hasta el final; reconocer las señales que indica el lugar apropiado para la terminación del proceso; debe además reconocer sitios reguladores tantoen el ADNcomoen el ARN transcrito, y poder interactoar con factores proteinicos y pequeñas moléculas que modulan la actividad de la enzima en su recorrido sobre el ADN.

La ARN polimerasa mejor conocida es la de E. coli,quefue descubierta por Weisy Gladstoneen 1959. Esta enzima está constiiuida por 5 subunidades; 2 subunidades a de 136 kDdemasa molecular cada una; una P de 150 kD; una p 'de 155 kD, y una ode7U kD, para un total de más de 450 kD. Es una de las mayores enzimas conocidas. Cada célula bacteriana contiene aoroximadamente unas 3 000 moléculas de la enzima.

Diversos procedimientos experimentales permiten afirmar que la subunidad P está relacionada con la unión de los ribonucleótidos sustratos y de los inhibidores de la polimerización, así como la subunidad p ' en la unión con el ADN. Ambas subunidades contienen un ion Zn2+ por molécula. La función de la subunidad a está relacionada con el ensamblaje de la enzima. Ninguna de las subunidades presenta actividad catalítica, ni de unión con el ADN en ausencia de las otras. La suhunidad a s e disocia fácilmente de la holoenzima, quedando el núcleo constituido por el resto de las subunidades. Recientemente se ha reportado la existencia en la E. coli de, por lo menos, 5 subunidades o diferentes.

La holoenzima presenta una forma más bien alargada, con una longitud máwma de 25 nm, es lo sufcientementegrande paraentrar en contactocon casi 75 pares de bases del

ADN, sin embargo, el núcleo sólo presenta 10 nm de longitud que le permite cubrir aproximadamente 30 pb.

El núcleo de la enzima tiene gran afinidad por el ADN, y se une a éste fuertemente en cualquier lugar de la cadena.

Eventos previas a la inieiaci6n (preinieiación)

Los eventos de preiniciación consisten en la localización, por parte de la ARN polimerasa, de un sitio específicodel ADN y laseparación de las 2 cadenas, de forma que la secuencia de bases sea accesible a la enzima.

Por convención se representa la hebra de ADN, que no es copiada, y se designa como la hebra codificante por ser muy parecida en su secuencia al ARN, ésta se debe escribir de izquierda a derecha en el sentido 5 ' 3 3 ' . La otra hebra se denomina molde porque esa es precisamente su función. La primera base que se transcribe se toma como referencia y se designa como +l. Las escritas a su izquierda llevan números negativos y las que van hacia la derecha números positivos -la posición O no existe-, por ejemplo:

Téngase presente qnesi en la secuencia escrita a partir dela adenina +1 sustitui- mos las T por U, tendríamos la secuencia del ARN transcrito primario.

El elemento central en la regulación de la transcripción es el promotor, que se define como un segmento de ADN, éste contiene las señales para la unión adecuada de la holoenzima de la ARN polimerasa y su posterior activación para formar un sitio capaz de iniciar la transcripción. El promotor contiene, además, en sío en sus alrededo- res, otras señales que controlan la unión específica de proteínas reguladoras. Estas proteínas modulan la efectividad de la unión de la polimerasa con el promotor. Para designar la efectividad que tiene la transcripción en los diferentes promotores se utiliza el concepto de fortaleza del promotor, de donde se derivan los promotores fuertes (muy efectivos) y débiles (poco efectivos).

Al parecer el reconocimiento entre la ARN polimerasa y el promotor se debe a la presencia de un grupo de donantes y aceptores de puentes de hidrógeno orientados específicamente, que interactúan con grupos similares en el dominio de unión de la enzima; estos determinan la especificidad del reconocimiento. A la estabilidad contribuyen otras interacciones menos específicas, pero más fuertes, como las interacciones iónicas entre las cargas negativas de la parte monótona de la estructura del ADN y residuos básicos del dominio de unión de la proteína, y quizás interacciones hidrofóbicas entre el metilo de la timina y grupos apolares de la superficie de la enzima.

En este momento es conveniente hacer la distinción entre 2 términos quese utili- zarán frecuentemente y se refieren a las secuencias consenso y a las conservadas, ambas derivan del análisis de sectores homólogos del ADN. Las secuencias consenso seconstrnyen a partir de las bases que ocupan una determinada posición, en la mayoría de los casos estudiados, aunque como tal no exista en ninguno de ellos. Las conservadas son las secuencias que aparecen completas en la mayor parte de los casos esiudia- dos,lnego son reales. Las secuencias consenso en general sólo existen como posibilidad (Fig.27.2).

En los promotores conocidos se distinguen 2 secuencias consenso importantes. La primera aparece alrededor de la posición -10 y tiene la estmctnra TATAATG. La otra

GTC::' 1: .: TGTC ACG:;'; -I: 1 8 ACG TAT(7;' :r ,. ! TAT CCG; l i:.<.< i ~ C C G TACL, ' : L -1,. 1 TAC ATT. . 1 ..., i. . ATT . , ,~ .- . , I I - . .. . . .. - . . - ,

Fig. 27.2. Secuencias consenso y conservadas. Las secuencias consenso (a) se obtienen a partir del análisis dc un número de secuencias de sectores equivalentes del ADN, y no siempre existen en la realidad. Las secuencias conservadas (b) son aquéllas que se mantienen casi in- alterables en todos loi organismos analizadas.

Componentes celularw y Genética molecular 4?7

secuenciaimportante aparece alrededor de la posición -35 y contiene típicamente 8 pares de bases,porejemplo,TGlTGACA,dondeexisteun predominiodepam AT. Ladistancia entre las posiciones más conservadas de -10 y -35 es por lo general 17 (? 1). En la figura 273 se muestra la estructura primaria de algunos promotores.

Región -35 Región -10

lac ACCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCG'r'Lt.'r(iTTGTGT<iAATTGTGA gal P2 ATTTATTCCATGTCACACTTTTCGCATCTTTGTTA'iGC7rATGGTTATTTCA

trp AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTrr'.:4CCTAGTACGCA+\GTT

Fig. 27.3. Estructura del promotor. Se muestra la secuencia del promotor de 3 upemnes. En azul, la secuencia de -35 que parcee estar muy conservada. En rojo, la región -10 can su secuencia consenso TATAAT. La letra roja corresponde con el primer nucleátido, en ser transcnto que generalmente es A.

La fortaleza de los promotores está relacionada con estas características. Si la secuencia se asemeja más a la consenso, la fortaleza del promotor aumenta, disminuyendo en la medida que se hace más diferente. La distancia entre las secuencias que &a la mayor fortaleza esde 17 pb.

La subunidad 0, al unirse al núcieo de la polimerasa,aumenta la afinidad por estas secuencias, de manera que permite a la enzima unirse a esta zona específica del ADN. Se cree que la unión se produce primero en la zona de -35 y después en la otra más cercana, pero ambas son indispensables.

La unión de la polimerasa en el sitio adecuado provoca un desenrollamiento local del ADN (favorecido por el elevado contenido de pares AT) que incluye aproximadamente las bases de -10 a +5. Esta estructura es muy estable y recibe el nombre de promotor abierto (Fig. 27.4).

Fig. 27.4. Unión de la ARN polimerasa al promotor. Para realizar la unión al promotor, la ARN polimerasa ras- trea la señal sobre el ADN (a) has- La localizar el oromotor (bi al cual . . sc une firmemente y logra una desnaturaliración limitada (c), que c permite el acceso a la seeufneia de bases de la hebra molde.

Una vez formado el nromotor abierto. la enzima comienza a deslizarse sobre el ADN hasta anibara la primera base que va a ser copiada. En ocasiones para la unión de la polimerasa con el sitio adecuado se requieren proteínas adicionales (capitulo 34).

En resumen, los eventos de preiniciación comprenden el reconocimiento de seña- les específicas, la unión ADN-enzima formando un promotor cerrado y su transforma- ción posterior en un promotor abierto. La enzimasedesliza hasta la posición +l para dar comienzo al proceso.

La iniciación de la transcripción comienza con la unión al complejo, formado por la polimerasa y el promotor abierto del ribonucleósido trifosfato que formará el extremo 5 ' -P de la cadena naciente de ARN. La unión del segundo nucleótido y la forma- ción del enlace fosfodiéster forma también parte de la iniciación; por lo tanto, consiste en la formación de un complejo temario entrela polimerasa, el ADN y un segmento de ARN, lo suficientemente largo para que el complejo sea estable y no sedisocie.

La ARN polimerasa contiene 2 sitios de unión para nucleósidos trifosfatados, llamados sitios de iniciación y de elongación. El primero une frecuentemente nucleótidos de purina (93 % en una serie estudiada), casi siempre ATP (52 % en la misma serie), luego la primera base en ser copiada es casi siempre la timina, que ocupa la posición +1 en nuestro ejemplo. Una vez formado el par AT se incorpora otro nucleósido trifosfatado al sitio de elongación; sólo se incorporará aquél capaz de formar un par con la base +2, por ejemplo, la citosina (Fig. 27.5).

Cuando los 2 sitios están ocupados se produce la reacción y queda formado el primer enlace fmf0diktc.r. Innicdiahmente drspués M* produce el muvimiento de la polimeraid hacia el nucleútidu siguiente. El final de la iniciación está determinado por laseparación del factor a y la formación de un complejo temario estable. Se creía que esto ocurría con la formación del primer enlace fosfodiéster, pero estudios posteriores demostraron que se requiere la incorporación de 6 a 9 nucleótidos para que esto ocurra, como se muestra en la figura 27.6.

Fig. 27.5. Iniciación. Una vez formada el promotor abierto la polimerasa comienza a unir los nucleótidos, dirigida par una de las bandas del AUN. Cuando la cadena contiene de 6 a 8 nucleótidos se separa la subunidad a y sólo continúa ae- tuanda el núcleo de la polimerasa.

Fig. 27.6. Final de la iniciación. Al separar- se la subunidad a se produce un cambia de confarmacjón en la polimerasa que reduce sus dimensiones, haciendo que el número de bases cubierto por la enzima sea mucha menor.

Una vez liberado el factor o, la volimerasa adauiere una nueva conformación v se forma un complejo temario (polim&a : A D N : A ~ naciente) que es muy estable:

La reacción de elongación comprende los pasos siguientes:

1. Unión a la enzima del nucleósido úifosfato sustrato, es específica tanto para la base como para la ribosa.

2. Ataque nucleofilico del P(a) al 3: - 0 H con la formación del enlace fosfodiéster, generando pirofosfato.

3. Liberación del pirofosfato de la enzima, que es hidrolizado por las pirofosfatasas. 4. Translocalización de la polimerasa a lo largo del ADN en un nucleótido, con el

desenrollamiento por delante y el reenrollamiento por detrás.

Lazona deelongación tieneunalongitud constantede 17 ~b.10 auesneiere ane esto se debe a una propiedad de la enzima y no alasecuencia de b&essdel bN.'¿a veiocidad promedio de la elongación está entre 30 y 60 nucleótidos por segundo (Fig. 27.7).

Fig. 27.7. Elongariún. Un nucleósido trifosfato, cuya base es complementaria a la del molde, es coloca- do en el sitio de elongación; se forma el enlace fosfadiéster con la liberación de P-P y la polimeraso avanza hacia el próximo nueleó- tido. Estos eventos se repiten tantas veces como nueleótidos tenga el gen que se está transeribicnda.

Un detalle interesante es que el desplazamiento de la polimerasa no se produce a una velocidad constante; hay zonas en que el desplazamiento es más rápido-qne en otras, inclusoexisten pausas donde laenzima se detiene totalmente, estas pausas están relacionadas con las zonas ricas en pares CG. La polimerasa en su movimiento va desenroilando la doble hebra del ADN, y esto es más diñd en las mnas donde predominan los pares CG.

Durante esta fase al núcleo de la polimerasa se une la NusA (69 kD) y al parecer evita la terminación prematnra de la cadena; su acción no es procmtiva, pues con frecuencia se asocia y disocia de lapolimerasa.

En la elongación se forma un híbrido ADN:ARN, pero mucho más corto que el formado en la iniciación de la replicación. Algunos autores aseguran que la zona híbrida sólo comprende unos 12 pares de bases. En la medida que la polimerasa avanza, el ADN vuelve a enrollarse detrár: de ella.

En resumen, la elongación consiste en el aumento gradual de la cadena polirribonucleotídica por acción fundamentalmente del núclGde la ARN polimerasa. El complejo de la ARN polimerasa, moviéndose sobre el ADN, es estabilizado por proteínas auxiliares que impiden la dislocación de la enzima.

Terminaaón

La terminación de la síntesis del ARN ocurre en sitios de secuencia de bases específicas en la molécula del ADN. Se conocen numerosas de estas secuencias y todas tienen las características que se muestran en la figura 27.8.

Dirección de la transcripción T>

Secuencias repetidas invertidas

1 1

/ Zona rica ZOnarica I I ienGC enAT

Transcripción ' o ' ARNm

Existen 3 regiones importantes:

1. Una secuencia repetida-invertida con un segmento no repetido central, o sea, la secuencia en una hebra del ADN sena del tipo:

ABCDFG .... ZZYYZZ ...... G'FrE'D'C'B'A',

donde: A y A', B y B' y las demás son bases complementarias. De esta forma la secuencia es capaz de formar pares de bases intracatenarios, dando lugar a una estmctura en «tallo y asa» enel ARN y posiblemente también en el ADN.

2. Una secuencia rica en CG muchas veces esta localizada dentro del tallo, aunque puede parcialmente encontrarse dentro del asa.

3. Es usual quese presente a continuación una secuencia rica en AT,que sale fuera del tallo y hace que el ARN contenga una adenina seguida por 4 a 8 uridinas.

Todo parece indicar que la formación de la estnictura en "tallo y asa", en la molé- cula del ARN, está implicada notablementeen el mecanismo de la terminación. Se ha comprobado quemientrasmayor seael contenido de pares GC dela estnictnraen "tallo y asa", y mayor la longitud de la cola de poli(U), la terminación será más efectiva.

No se conoce con exactitud cómo se produce la terminación, pero parece estar relacionada con una pausa en el movimiento de la polimerasa. E1 proceso incluye: el cese de la elongación de la cadena de ARN, la liberación del ARN neoformado y la liberación de la ARN polimerasa del ADN (Fig. 27.9). En el proceso de terminación intervienen proteína específicas, cuya acción no está totalmente esclarecida.

Existen 2 tipos de mecanismos de terminación: la señalada con anterioridad, que es reconocida por la propia polimerasa.

El otro tipo de terminación ocurre por la acción de una proteína específica denominada rho (p); ésta es una proteína oligomérica que no se uneni a la polimerasa ni al ADN. Su unión al ARN le estimula una fuerte actividad de nucleosidotrifosfatasa OVTpasa). Aun cuando el mecanismo del factor rho no está totalmente esclarecido, se

Fig. 27.8. La señal de terminación. Las ca- racterísticas de la secuencia del ADN en la zona de terminación pueden dar lugar a una estructura eruciforme en el ADN y a una estructura de "tallo y asa'' en el ARN transcrito.

-- -

@omponentes celulares y 8enética moiecuiar 481

Fig. 27.9. Terminación. La terminación cona- la de los pasos siguientes: cese de la elongación, separación del ARN neoformada y separación de la ARN polimerasa.

Fig. 27.10. Uniún de Rllu al ARN. El factor Rho se une a una secuencia espe- cífica del ARN, lo cual estimula su acción hidrulitica provocando la terminación de la transcripción.

encuentra relacionado también con la existencia de pausas en el movimiento de la polimerasa, aunque no se ha detectado ninguna homología en las secuencias estudiadas. Rho es una proteína formada por 6 subunidades de 46 kD cada una, cuya agre- gación se estabiliza por la unión al ARN en presencia de ATP; cada monómero se une a un segmento de 12 a 14 baies, por lo que en total se unen de 72 a 84 bases (Fig.27.10).

En resumen, la terminación incluye el detenimiento de la elongación, la libera- ción del ARN y de la polimerasa. En ocasiones son necesarias secuencias específicas del ADN y en otrasse requieren proteínas específicas.

Eventos posterminación

En procariontes los distintos tipos de ARN sufren diferentes grados de modifica- ción antes de ser totalmente funcionales. A continuación se tratará someramente este proceso llamado de maduración.

Los ARN mensajeros no sufren modificaciones; la estructura tipica de un mensajero contiene 4 sectores funcionalmente diferentes. Una secuencia inicial hacia el extremo 5 ' ,conocida como secuencia conductora y que contiene una zona rica en purinas y un triplete de bases especítico, el AUG, llamado también codon deiniciación (Fig. 27.11).

Hacia el extremo 3 ' contiene también una secuencia de longitud variable,conocida como secuencia de terminación. Un tercer tipo de sector está constituido por las secuencias codificadoras, aquéllas que contienen la información para la síntesis de polipéptidos específicos.

La figura 27.12 resume las principales características estructurales de los ARNm de procariontes.

Fig. 27.11. Extremo 5' del ARNm de praiariontes. Hacia el extrema 5' del codon de inieiació~ (en rojo) aparece una mna rica en purinas conocida como secuencia de Shine y Dalgarno, y es la que va a permitir la fijación del ARNm al ribasama cm la pasickh precisa.

Fig. 27.12. Estructura de un ARNm palicistrónico. Las ARNm de prucariontes son policistrónicos, contienen la información para varias cadenas polipeptídicas (G1, G2, G3 y G4), cada una de lar cuales presenta su mdon de iniriaeión (AUG) y de terminación (UAG) separados por sceueniias espaciadoras (El , E2 y E3), la zona conductora hacia el extremo 5' que contiene la secuencia de Sliine y Dalgarno (SD), así como la zona no traducible del exlrema 3'-OH.

Los ARN mensajeros de procariontes contienen típicamente información para varias cadenas polipeptídicas, por lo que reciben el nombre de policistrónicos. En la E. coliun solo ARN mensajero codifica para 3 enzimas relacionadas con el metabolismo de la lactosa, y uno sólo, para las 10 enzimas de la síntesis de la histidina.

Enhelas secuencias codiñcadorasse encuentran zonas delongiind variable conocidas comoespaciadores. Los ARN policistrónicos tienen una longitud tipica de 3 000 a 8 000 bases, aunque los hay mayores como el de la histidina que contiene 12000 nucleótidos. Los ARNm de procariontes se comienzan a traducir generalmente antes de que tennine su hanscripción,~ sea, los 2 procesos son simultáneos. lo que indica que estas moléculas no debenexperimentarningún proceso demaduración; esel tip de ARN de mayor labilidad metabólica, pues su nda media alcanza como promedio 1,8 minutos.

En cuanto a los demás tipos de ARN, su síntesis no difiere de la del mensajero, pero hay hechos que indican que ni los ARNt ni los ARNr son los transcritos primarios (productos inmediatos de la transcripción) comoson:

1. El extremo 5' presenta un nucleósido monofosfato y no un trifosfato, como cabe esperar de un transcrito primario.

2. Los ARNt y los ARNr son mucho más cortos que los transcritos primarios. 3. Todos los ARNt contienen bases raras que no aparecen en las moléculas recién

sintetizadas.


- -

Todos estos cambios se realizan después de la transcripción en un proceso llamado modificaciones postranscripcionales o maduración.

El ARNt mejor conocido es uno de la E. coli que lee el codon GAU y transfiere tirosina, que está formado por85 nucleótidos. La E. coli tiene 2 genes para este ARNt que están adyacentes y presentan 2 secuencias idénticas de 350 bases,cada unacon un espaciador de 200 nucleótidos. Los 2 genes son transcritos en un solo ARN, que es cortado cuando se hacompletadosu síntesis. La transcripción comienza 41 bases antes del extremo 5 ' -P del ARNt y termina 224 bases después del extremo 3 ' -0H.

Primero ocurre la transformación del extremo 3 ' por la eliminación de las bases en vanos pasos enzháticos, hasta dejar d o 2 nucleótidos después del CCA; después se eliminan las bases anteriores al extremo 5 ' , quedando éste formado. La enzima ribonucleasa P (Amasa P) bidroliza la molécula en el lugar adecuado, pues reconoce su estructura tridimensional en esta zona; inmediatamente la misma enzima elimina los 2 nucleótidos sobrantes del extremo 3 ' ,con lo cual la molécula adquiere su tama- ño definitivo. Por último, se produce la modificación de las bases nitrogenadas en sitios específicos y se forma la pseudouridina, la tionridina, la metilguanosina y la isopenteniladenosina (Fig. 27.13).

Fig. 21.13. Maduración del ARNI. Las pasos indicados en el esquema se explican detalladamente en el texto.

Maduración de lm ARNr

Los ribosomas bacterianoscontienen 3 tipos de ARN conocidoscomo ARNr de S S, 16 S y de 23 S, los cuales contienen 120,l S41 y 2 904 nucleótidos, respectivamente. Estas moléculas junto con las de algunos ARNt son sintetizadas en un precursor que contiene más de 5 000 nucleótidos. Un caso típico puede ser el siguiente:

ARNr 16s - ARNt(ne) - ARNtiAla) - ARNr 23s - ARNr 5S - ARNtiAsp) - ARNtiTrp)

El transcrito primario va siendo hidrotizado en la medida que se va formando por un conjunto de enzimas del tipo de las endonncleasas y exonncleasas; esta forma de transcribir los ARNr tiene la ventaja de que éstos son sintetizados en la misma pro- porción (1:l:l) en que son utilizados por la célula en la formación delos ribosomas.

En resumen, las características mássobresalientes de la maduraciónen procariontei se resumen en los puntos siguientes:

1. Todos los ARNt y ARNr son procesados, no asílos ARNm. 2. Se requieren cerca de 10 tipos de ARNasa que generan tanto el extremo 3'-OH

como el 5'-P. 3. Las ARNasas reconocen preferentemente a las estructuras tridimensionales más

que a las secuencias de bases. 4. Las bases rarasson formadas por transformación enzimática de las comunes.

Los conocimientos sobre la transcripción en eucariontes se han iocrementado intensamente en los últimos 10 años y han mostrado que el proceso es mucho más complejo que en los procariontes, aunque en líneas muy generales es similar. A conti- nuación se hará un breve resumen de los hechos más sobresalientes de este proceso en los organismos superiores.

La transcripción en el núcleo de los eucariontes se realiza por 3 tipos de enzimas ARN poümerasas denominadas 1, II y III. Además, existe una enzima en las mitocondrias y otra en los cloroplastos. La pol 1 se localiza en e1 nucléolo y realiza la síntesis de los ARNr. La tipo 11 es del nucleoplasma y realiza la síntesis de los ARNm, en tanto la de tipo 111 que es también del nucleoplasma, lleva a cabo las síntesis de los ARNt y del ARNr de 5 S. Cada enzima está formada por unas 10 subunidades y las 3 mayores presentan gran similitnd con las subunidades a, P y ' de la E. coli. Estas enzimas se distinguen por su sensibilidad al inhibidor a-amanitina, que tiene un efecto intenso sobre la polimerasa 11, menos marcadosobre la 111 y ninguno sobre la 1.

La reacción de polimerización catalizada por estas enzimas es similar a la de las polimerasas de procariontes. Todas ellas requieren de varias proteínas adicionales llamadas factores de transcripción. Estos factores son especíñcos para cada polimerasa y pueden dividirse en 2 grandes grupos: los generales y los genicoespecíficos. Los generales son aquéllos necesarios para la transcripción de cualquier gen por una polimerasa dada, y asíexisten factores generales de la polimerasa 1, de la 11 y de la 111. Los genicoespecíficos sólo se han descrito para la polimerasa 11, pues se trata de la enzima que debe transcribir genescon mayor grado de variabilidad en su expresión. Los factores de transcripción generales de la polimerasa 1 son UBF y SL-1; los de la poümerasaIIsonTFm,TFIIB,TFIII>,TFIIE,TFIIF y TFW; y losdelapoherasa m son TFIIIA, TFIIIB y TFIIIC. Los genicwspecíficos sólo se mencionarán en los caros necesarios.

La formación del complejo de preiniciación comprende 3 etapas básicas, en cada una de las cuales participa al menos un factor de transcripción. El primer paso consiste en la unión de un factor de transcripción a una secuencia específica del promotor. El

Componentes celulares y @enética molecular 485

segundo, en la unión de otro factor de transcripción que va a servir como una especie de puente para la unión de la poliunerasa. El tercer paso es la unión de la polimerasa.

Fig. 27.14. Transcripción de genes organizadas en tándem. La figura simula una inicrafotografía electrónica. Cuando un gen se encuentra repetido en el genama y eslá organizado en tándem, o sea, uno a conti- nuación del otro, al producirse la transcripción eoii numerosas polimerasas es posible observar una imaflen arborescente.

Fig. 27.15. Promotor del ARNr de SS en eucariontes. La más curioso en la estruchira de este promotor es que una de las secuencias que lo integran se localiza en el interior del gen entre las posiciones 47 y 96.

Sólo en el c& de la ARN poliherasa U hay factores de transcripción queseintegran al complejo con posterioridad a la entrada de la enzima.

Síntesis y maduraei6n de los ARNr

La transcripción de los ARNr (excepto el de 5 S) se realiza en el nucléolo por accióndela Af ipoherasa 1. Las genes 'km repetidos numerosas veces y organizados en tándem. En el ser humano cada unidad de tramcripción en dirección S ' -P -> 3 ' -0H contiene los genes para los ARNr de 18; 5,8 y 28 S, está formada por un segmento de ADN de aproximadamente 13 700 ph y separada de la siguiente por un espaciador de 30 000 pb. Estas unidades se encuentran localizadas en los cromosomas 13,14,15,21 y 22. cada unidad daorigen a un transcrito primario de45 S quedurante la maduración produce los ARNr definitivos. La transcripción puede ser vista mediante el microscopio electrónico, donde se obtiene una imagen arborescente (Fig. 27.14).

La formación del preARNr de45 S demora de3 a 4 minutos. Durante lasíntesis se le h;insfieren m& de 10~grupasmeolos alas basa y ribosas de nurieótidm es@n>s. una vez terminada la transcripción, una ARNasa h id rob un enlace fosfodiilster que reduce el tamaño dela molécula en algunos cientos de nucleótidos en el extremos ' -P; después se produce un corte hacia el extremo 3 -0H del preARNr de 18 S, que es el que adquiere su forma definitiva al eliminarse los restantes nucleótidos del extremo S ' -P. ~kultán8oadicho~mcew,este~RNse va uniendoaproteínas hasta formarla subunidad menor del ribosoma, que esliberada hacia el citoplasma donde sele incorporan otros 4 grnpas meolm. La maduración del otm fragmento se produce de forma similar.

Los genes para el ARNr de 5 S están localizados en el cromosoma 1 y su transcripción la realiza la ARN polimerasa IU, y no tiene profeso de maduración.

Por métodos de ingenieríagenética han podiodeterminarselas secuencias necesarias parasu transcripción, lo más asombroso es que para lasíntesis se requiere de una zona de unos 50 nucleótidos que comienza en la posición +47, dentro del gen. Un factor general de transcripción 4 une a esta secuencia-y permitela unión de lapolkerasa 111, que comienza la transcripción en la posición +1 que es ocupada por una G. Las alteraciones producidas en la secuencia alrededor del punto de iniciación sólo cambian el sitio de iniciación, sin embargo, el proceso se-ve seriamente afectado por cambios en la zona de +47, por lo que se concluye que la única señal necesaria es la que aparece en el interior del gen. La proteína que alüse une fue el primer factor activador de la transcripción, purificado a partir de células de eucariontes (Fig. 27.15).

L

Síntesis y maduradón de los ARNt

Los genes de los precursores de los ARNt son transcritos por la ARN polimerasa 111, de muchos de ellos se conoce totalmente la secuencia de bases y a partir de ella se han podido precisar las secuencias necesarias para la transcripción. Hacen falta 2 regiones: la primera,localizada entre las posiciones +10 y +20 y la segunda, entre +S0 y +60 del ARNt maduro -lasseñales están dentrodel gen- y éstas corresponden a las asas D y TC, respectivamente; luego estas zonas tienen una función dual: en la estructura tridimensional de la molécula y en la promoción de la transcripción de sus genes (Fig. 27.16).

Los ARNt se forman a partir de un precursor de mayor tamaño, que es procesado hasta el estado definitivo. La maduración incluye la reducción del tamaño en los 2 extremos, la modificación de las bases nitrogenadas (aproximadamente una de cada 10),la adición del extremo CCA y la eliminación de los intrones que comprende los pasos siguientes:

1. Hidrólisis por endonucleasas de los enlaces fosfodiéster en las uniones exón-intrón e intrón-exón, y se forman un extremo3'-P y unos'-OH.

2. Una quinasa transfiere un Pdel ATPal exón, formando un extremo S'-P. El Pde la posición 3' del otroextremo se traslada a la posición 2' espontáneamente.

3. Por acción de una ligasa (similar a la ADN ligasa) se unen los 2 extremos en una rearci6n dependiente del \TP.

1. I'na fosi'ata>a elimina el Pde la posiriún 2'.

La fipura 27.17 muestra todoel Droceso. ~es&és que el proceso de madukdón se ha completado -y nunca antes- los ARNt

maduros son transportados hacia el citoplasma.

Unidades de transeripei6n

Antes de describir la maduración de los ARNm es conveniente hacer algunas consideraciones. En primer lugar, los ARNm de eucariontes son monocistrónicos, sólo tiene información para la síntesis de una cadena polipeptídica. Tanto el extremo 5 ' -P como el 3 ' - 0 H están modificados por una estructura en forma de casquete, el primero, y por una larga secuencia de adeninas repetidas, poli(A), el segundo. Los ARNm maduros no contienen las secuencias de bases que corresponden a los intrones en el ADN, pues son eliminadas durante la maduración.

Fig. 27.16. Promotor del ARNt en eucarioii- tes. Hay 2 secuencias integradas de manera funcional en el promotor de este gen g que se encuentran dentro de éste. Esas secuencias corresponden can 2 asas del ARNt maduro; luego desempeñan 2 funciona importantes.

Componentes celularrs y Genetica molecular 487

I

l 1

J

Fig. 27.17. Eliminación de intrones en los ARNt En la eliminación de los intrones, los 2 exones son procesados de forma diferente. Una endonueleasa (EN) hace el corte en los sitios de unión del intrón. El fosfato de la posición 3' pasa a la 2' espontáneamente, en tanto, una quinasa (Q) adiciona un grupo fosfato al extremo S', que después es activado par una ligasa (L) que le transfiere un grupo adenilato. Por último, se forma el enlace fosfodiéster, mientras que una fosfalasa (F) elimina el grupo fosfato de la posición 2'.

Al segmento de ADN que contiene la secuencia de bases que transcribe la ARN polimerasa 11 se le denomina unidad de transcripción. Estas unidades pueden ser simples si dan origen a un solo tipo de ARNm, o complejas si dan lugar a más de uno. Una unidad simple de transcripción típica contiene la zona del promotor por la cual se une la polimerasa 11; estos promotores presentan una secuencia consenso (TATAAT) aproximadamente entre las posiciones -25 y -35. Otras secuencias se encuentran más alejadas hacia el extremo 5 ' y sirven como sitios de unión para los factores genicoespecíficos y, por lo tanto, pueden variar en número y estructura en concordancia con cada gen en particular; estos factores de transcrioción oueden incrementar la intensidad del oroceso cientos de veces. a partir del nivel basa1 de expresión que logran los factores generales. Otras secuencias más alejadas pueden actuar como elementos potenciadores (Fig. 27.18).

La incorporación de nucleótidos comienza en la base +1 a la cual durante la maduración se añadirá el casquete (cap); después aparecen exones e intrones de forma alternativa. En el último exón aparece unasecuencia consenso, la AATAAA, que indica el punto donde debe añadirse la cola de poli(A). El sitio exacto donde termina la transcrivción no está del todo conocido.

as unidades c&nplejas son menos regulares y pueden presentarse las situaciones siguientes:

1. Varios sitios de iniciación y uno de terminación, pero con procesamiento diferente del transcrito primano.

2. Un sitio de iniciación y varios de terminación, con procesamiento diferente. 3. Varios sitios de iniciación y terminación, pero con igual procesamiento. 4. Un sitio de iniciación y uno de terminación, con diferente procesamiento.

Otras secuencias reguladoras Sitio

-110 -40 -35 -25 de CAP

En la figura 27.19 se muestra un resumen de las posibles unidades complejas de hanseripción.

Fig. 27.18. Estructura general de los promotores eucariontes. Los pmmo- tares eucariontes son más cample- jas que los proeariontes. El sitio para el CAP corresponde can el primer nueleótido en ser transerita, por lo que representa la posición + l . En la región de -25 a -35 se encuentra la secuencia TATAAA, entre -40 y -110 se encuentran 2 secuencias que pueden correspon- derse con alguna de las representadas en el cuadro inferior y en olra zona que puede ser la representada- estar más hacia el extremo 5' o incluso hacia el extremo 3'- se encuentran secuencias que estimulan mucho la transcripción (enhancer), pera que no parecen ser constantes en todos los genes.

ARN m

ARN m

// Fig. 27.19. Unidades transcripcionaks com-

b ....~e.= . . // .... . .~

> . , .. .. plejas. (a) El gen de 1s ealcilonina ..? .! . ., . , , gen -+A? V.,.l , . ! , , . '

// con un solo sitio de iniciación (i) y

ii h A, A, 2 de ~>oliadenilaeión (A) y madu-

ARN m m?' ARN m

ARN m I I I

ARN m m l A 7 -

ración diferente que, según el primer caso,da origen a la cakitonina en el timides y, según el segundo raso, origina un péptido relacionado con la ralcitanina que aparece en el hipotálamo y en otras regiones del SNC. (b) Unidad- con varios sitios de iniciación y de poliadenilación, como sucede con el gen de la amilasa de ratón que en el primer casa da lugar a la en. aima salivar y en el segundo, a la panereátiea. (e) Hay un solo sitio de iniciación y de poliadenilación, pem el procesamiento es diferente roma los genes del gamma fib"nógen0 de la rata que origina el tipo A, en el primer caso, y el tipo^^, en el segunda. (d) Presen- cia de varios sitios de iniciación y de poliadenilación, pero no hay diferencias en la maduración, como se observa en el gen que codifica diferentes formas de la enzima dihidrofolato reduetlsa de ratón. Estas diferentes variantes pueden dar lugar a proteínas disímiles que, sin embargo, están codificada en el misma segmento de AUN.

Síntesis y maduración de loa ARNm

Fig. 27.20. Iniciación en eueariontes. A medida que el ARNm se va formando, una transrnetilasa que utiliza S-adcnosil-metianina (SAM) como eofactor, metila diferentes nucleótidos de adenina, lo cual convierte al eafactor en S-adena- sil-homaeisteína (SAH). Cuando el ARNm tiene un tamaño adecuado comienza a unirse con protehas, dando lugar a la formación de las partículas de ribonucleoproteinas heterogéneas nucleares (PNPhn).

La síntesis del ARNm, una vez comenzada, se produce de forma ininterrumpida hasta el final, se copian tanto los exones como los intrones. De manera simultánea algunas de sus adeninas son metiladas (0,l %)y el ARN naciente va uniéndose con proteínas formando las partículas de ribonucleoproteínas que contienen ARN nuclear heterogéneo (PRNnh) (Fig. 27.20).

Poco después de comenzada la síntesis -menos de 100 nncleótidos- se produce la incorporación del casquete, proceso que al parecer consta de los pasos siguientes:

1. Una fosfatasa elimina el P(y) del extremo 5 ' -P. 2. La guanilato transferasa incorpora el grupo guanilato del GTPal extremo 5 ' -P-P,

formando un enlace anhídrido 5 ' -P-5 y el pirofosfato que es hidrolizado por las pirofosfatasas, lo cual favorece la reacción energéticamente.

3. Un grupo de transmetüasas transfieren sucesivamente grupos metilos ala posición 7 (Cap O) de la guanina y a la posición 2 ' del primer (Cap 1) y segundo (Cap 2) nucleótidos, utilizando como cofactor la S-adenosil-metionina (Fig. 27.21).

El significado de esta metilación se discute, pero 2 conclusiones parecen ser convincentes: la transformación del extremo 5 ' -P protege al ARN de la acción de las exonucleasas, y esta estructura está relacionada con la unión del mensajero al nbosoma (capítulo 30).

La terminación no está bien esclarecida. La polimerasa 11 continúa su acción después de la secuencia AATAAA, pero entre 500 y 2 000 nucleótidos posteriores se producen el cese del crecimiento de la cadena y el fin de la transcripción. En pocos segundos (90 a 120) la cadenase corta en un punto que dista 15 a30nucleótidos dela secuencia AATAAA, y las poli(A) polimerasas van incorporando uno a uno los nucleótidos de adenina hasta un total que puede variar entre 120 y 250 nucleótidos (Fig. 27.22).

presentan la estructura completa.

Sitiodepoli (A)

/ Terminación

- - ~ 1 ~ . 27.22. Formación de la cola de Poli A.

-- La secuencia AATAAA indica que, en unos 20 pb más adelante, se

5 debe oroducir la incor~oraeión de El iminación de nucleótidos

.. I A U A A A 5' ' Adición de poli (A)

4 5' &.,4-,\-. ..., \- 3'

2 5 0

. la cala de poli adcnina POMA). Al realizarse la lrsnscripción, una endonueleasa hidroliza el ARNm en cl sitio adecuado y la poli(Al polimerasa adiciona adeninas que pueden llegar alcanzar el nJmero de 250.

De esta manera quedan formados los extremos 5 ' y 3 ' a los pocos minutos de terminada la transcripción; estos extremos no experimentan ninguna otra modifíca- ción durante la maduración.

El siguiente paso consiste en la eliminación de los intrones, donde intervienen ribonucleoproteínas que contienen los ARN nucleares pequeños U1, U2 y U5 (Fig. 27.23).

Fig. 27.23. Corte y empalme de exones en el ARNm. El primer corte se produce en el extremo 5 ' del intrón, que va seguido de su cireulari- zacián y el segundo corte, concluye con el empalme entre los 2 exones. En todo el proceso intervienen las ARNpn y proteínas es- pecificas.

Los intrones se eliminan uno a uno, esta etapa al parecer comprende los pasos siguientes:

1. Se produce la unión del preARNm con las ribonucleoproteínas, y la asociación del U1 a la zona de unión exón-intrónfavorece la hidrólisis del enlacefwfodiéster para formar un exhemo libre 3 ' - 0 H en el exón.

2. Existe una secuencia de bases en el intrón separada de su extremo 3 ' por 20 a 40 nucleótidos -en las levaduras es UACUAAC-, que está muy conservada y favorece la formación deun asaintraintrón, a10 cual contribuye el U2. Esta asase e s t a b i i por la formación de un enlace fosfodiéster 2 ' -5 ' entre el extremo 5 ' -Pdel intrón y una adenosina próxima al extremo 3 ' de éste.

3. Se produce la hidrólisi del enlace fosfodiéster en la unión intrón-exón, generando un exón con el extremo 5 ' -P. En este naso narticioa el U5. El intrón senarado es . . atacado por las nncleasas y los nncleótidos son reutilizados.

4. Se produce el enlace fosfodiéster 3 ' -5 ' que une los extremos de los 2 exones. Esto puede realizarse ya que durante todo el proceso de corte y empalme se forma un gran complejo ribonucleoproteínico que mantiene unidos a todos los componentes del sistema.

Todo el proceso requiere ATPcomo cofactor -que no puede ser sustituido por ningún otro NTP- y Mgha bajas concenhaciones, pues muy elevadas tienen un efecto inhibitorio.

Como se dijo anteriormente si la unidad transcriptiva es simple, el corte y el empalme se producen siempre de la misma forma, originando siempre un mismo ARNm; pero en las unidades complejas se emplean diferentes sitios de iniciación o de incorporación del poli(A), o formas distintas de corte y empalme que pueden originar ARNm diferentes y que, por lo tanto, darán origen a distintas proteínas. Se ha insistido en que la maduración del ARNm constituye un punto de control fundamental en el mantenimiento de los niveles adecuados de ARNm en el citoplasma.

Sobre el transporte de ARNm al citoplasma poco se sabe, solamente está comprobado que ocurre una vez que el proceso de maduración ha concluido. Al contrario de los ARNm de procariontes, los de eucariontes son muy estables en el citoplasma y tienen una vida media de horas; se ha pensado que esto se debe a la modificación de sus 2 extremos. Un fenómeno curioso es que la cola de poli(A) se va acortando en el citoplasma. Dos experiencias son claves en estas conclusiones: se aislaron ARNm que eran muy estables, se les eliminó la cola de poli(A) y se inyectaron en el citoplasma de una célula y se comprobó que presentaban un recambio muy rápido. Por otra parte, se tomó el ARNm de histonas que no contiene poli(A), se le añadió éste, se inyectaron en el citoplasma celular y se observó que la velocidad de recambio disminuyó considerablemente.

El conocimiento de estos procesos ha permitido conocer el origen de algunas enfermedades, de las cuales las más conocidas son algunos tipos de talasemia; ésta comprende un grupo de entidades nosológicas que se caracterizan por la ausencia total o parcial de una de las cadenas de la hemoglobina.

En algunos pacientes que presentan el tipo (no sintetizan cadenas P) se ha descubierto una mutación que origina un cambio G -, A en el extremo 5 ' del segundo intrón; esto inactiva a este sitio y se produce un ARNm a partir de otro sitio donante dentro del intrón. En otros casos del tipo P' (producen un bajo nivel de cadenas p) se han localizado mutaciones en el primer intrón, donde se crea un nuevo sitio aceptor. Se produce un corte y empalme anormales, utilizando este nuevo sitio con preferencia al normal y disminuyendo asíla formación de cadenas B normales. Por último, se han descrito casos del tipo u" (no sintetizan cadenas u) que han perdido las 5 bases inmediatas al primer exón, con lo cual se pierde el sitio donante para el corte y el empalme. Al no poderse utilizar este sitio se emplea otro que está localizado dentro del exóii.

Todos estos fenómenos son conocidos recientemente por lo que existen muchos puntos no esclarecidos. Es de esperar que en los próximos años se tenga un conocimiento más completo de los mecanismos empleados y del significado bio- lógico de este complejo proceso de síntesis de los ARNm en las células eucariontes.

Inhibidores de la transcripción

Pudieran considerarse 2 tipos de inhibidores: los que impiden la separación de las cadenas del ADN, que por lo general son también inhihidores de la replicación, y los que actúan de forma directa sobre las polimerasas. Los primeros ya fueron tratados en el capítulo 25. Entre los segundos se encuentra el antibiótico rifampicina, que actúa sobre la ARN polimerasa, impidiendo la fase de iniciación. Una sustancia conocida como u-amanitina inhibe la síntesis de ARN en eucariontes por actuar sobre la ARN polimerasa ii. Además de sus acciones terapéuticw por locual serían ya nificientemen- te importantes, estos inhibidores son de inapreciable valor en el laboratorio, pues su uso hapermitidoesclarecer muchosaspectos de estos complejos procesos (Fig. 27.24).

Componentes celulares y Cknetica molecular 493

CH, CH,

Fig. 27.24. Inliihidores de la transcripción. En la figura sc muestra la cstrui- tu ra química de la rifanipiiina B, uno de los inhihidures de la transcripción más empicado en las investigaciones sobre este tema. La a-amanit ina perniite diferenciar las 3 palimcraaas de eucariontes. pura la I u resistente a su acción, la 111 se inhibe poro, pero la 11 es inhibida de manera intensa por esta sustancia.

Rifamicina B

1

o = I

C-C-N-C-C -N-C-CH,- N-H

a- Amanitina

Resumen

La transcripción es el proceso central en el crecimiento y desarrollo de la célula, en la cual la información genética contenida en el ADN se copia en un ARN especíñco, ribwmal, de transferencia o mensdero. El desarrollo técnico alcanzado en los Úitimos años ha permitido obtener una visión comprensible, en principio, de este fenómeno. Lea precursores de la transcripción son los nucleósidos iri- fosfatados que son Unidos mediante enlace fosfodiéster 3 ' -5 ' , por acción de la ARN polimerasa, según la secuencia de bases de una hebra del ADN.

En los proeariontes -especialmente en la E. coi& una sola enzima es eapaz de reaüzar todo el procmo, ésta es una proteína oligomérica a la cual se unen otras subunidades en diferentes fases del evento. Para comenzar la transcripción la polimerasa debe unhe íntimamente al promotor y lograr la aperinra de la doble hebra del ADN, en este paso la subunidad a es fundamental; luego comienza la incorporación de los ribonueleósidos trifosfatados cnyas bases son complementarias a las del ADN; la proteína NusA impide la terminación prematura de la cadena. La terminación se produce gracias a una señal especíñca en el ADN, aunque en ocasiones la proteína Rho determina el m e de la síntes'i, sin que al parecer existan

señales para ello. Despuk de terminada la síntesis comienza el profeso de madura- ción. Los ARNm no sufren modiñcaciones, pero los ARNr y ARNt se sintetizan en forma de prenirsores de gran tamaño, quedeben ser acortados hasta alcanzar su forma deñnitiva

En los euuuiontes existen 3 tipos de ARN polimerasa: el tipo 1 es del nucléolo y rraliza la síntesis de los ARNr; los 11 y iii son del nucleoplasma y llevan a cabo la síntesis de los ARNm, la primera, y de los ARNt y el ARNr de 5 S, la segunda.

Los ARNr derivan de un transerito primario de 45 S, que es metilado en bases y ribosas de uucleótidos especíñeos y acortado hasta su tamaño deñnitivo. Es m- nasa que en el ARNr de 5 S, la señal que promueve la transcripción es intragénica. Los ARNt también se originan de un precursor mayor; en su procesamiento se incluyen la redueeión del tamaño, la eliminación de intrones, la adición del extremo CCA-OH y la modiñcación de Las bases nitrogenadas. Como en el caso de los ARNr de 5 S, las sesales promotoras son intragénicas. Los ARNm se sinteíizan por la polimerasa U a partir de una unidad de transcripción, simple o compleja. El promotor se encuentra fuera del gen y en él existen varias secuencias necesarias para la transcripción. El proceso de copia incluye tanto los exoues como los intrones. La señal de terminación -si existe- no ha sido aún identificada. La maduración consiste en la modificación del extremo 5 ' -P por un nucleótido de guanina metilada (Cap); la transformación del extremo 3 ' -OH, en una larga cola de adeniua -poli(A)- y en el corte y empalme de la cadena para la elimina- ción de los intrones. Se ha comprobado que una misma unidad de traoseripción puede originar varios tipos de ARNm maduros por diferencias en la maduración.

Un hecho hte-te lo constituye el hallazgo de que algunos tipos de talasemia se deben a trastonios en el profeso de maduración de los ARNm de la globina.

Ejercicios

1. Para hacer una experiencia de transcripción in vitro se sintetizan artificialmente 3 polidesoxinucleótidos con la siguiente estructura:

a) TGTTGACA 18 bases AATATTG b) TGTTGACA 16 bases TTTATAG c) TGTTGACA 17 bases TATAAAG

¿Puede usted determinar cuál de ellos funcionará como el promotor más fuerte y cuál como el más débil? Argumente su respuesta.

2. En una exoeriencia donde se oretendía investigar el oroceso de trauscrioción. se - añadió al sistema rifampicina y se vio que la iniciación quedaba bloqueada. Si se ;úiadía estreptoligidina ocurría la iniciación, pero quedaba bloqueada la elongación ¿Cuáles serían las conclusiones que este experimento aporta sobre el mecanismo molecular de la transcripción?

3. En un experimento posterior se comprobó que la rifampicina se unía fuertemente a la subunidad p ' de la polimerasa y que la estreptoligidina se asociaba con la subunidad p ;Cuáles serían las conclusiones más importantes de estos experimentos con respecto al mecanismo de acción de la ARN polimerasa?

4. ¿Qué consecuencias traería para la transcripción una alteración de la proteína NusA quedisminuyera su afinidad por el núcleo de la polimerasa?

5. ¿Cuál es la característica más sobresaliente de la transcripción realizada por la ARN poümerasa iü ?

6. La cordicepina inhibe la acción de la poli(A) polimerasa. ¿Qué consecuencias pudiera tener su acción sobre las células prowriontas y eucarioutas? Argumente su respuesta.

Componentes celuiates y Genetica molecuiar 495

Fig. 16.11. Mecanismo de la inhihiciún competitiva. La similihid estructuraldel inhibidor con cl sustralo hace que aquél pueda unirse al centra activo, pero sus diferencias le impiden la transformación. La enzima auccinato-deshidrogenasa une al ácido sucrinico y actúa sobre los hidrógenos colocados eii carbonos adyacentes. Cuando el ácida malónieo, que tiene una estructura similar, se une al centro activo de la enzima produce una inhibi- ción, pues no puede ser transfar- mado, quedando unida al centro activo y, por tanto, impide la entrada y transformación del sustrato verdadero.

Nótese que parte de la enzima se encuentra en forma de complejo E1 que no da producto, pues no puede unir al sustrato, lo que significa que existe una disminución del número de centros activosútiles y, por tanto, una menor velocidad de la reacción.

Una característica de los inhibidores competitivos es quesu estructura es semejante a la del sustrato. En la figura 16.11 se muestra cómo la succinato desbidrogenasa puede ser inhihida de forma competitiva por el malonato, cuya estructura es muy similar a ladel succinato, que es el sustrato naturaldela enzima.

Wbieióo no competitiva

, . disminuye de alyna forma la capacidad catalítica de la enzima. Se acepta que la unión enzima-inhibidor se produce en un sitio diferente del centro activo y que esa unión

En la figura 16.12 al igual que en el caso anterior semuestran además los resulta- I - dos del experimento sin el inhibidor.

, "M

1 . - 1 - ~d 1%

Fig. 16.12. Inhihidares no competitivas. El inhibidor no competitivo no se alo- ja en el centro activo y no puede impedir la entrada delsustrala,pera de alguna forma dificulta su trans- formación; en supreaencialaseur- vas que se obtienen difieren en el valor de INm, pero no alteran el valor de -1lKm. Variaciones en la concentración del inhibidor dan origen a una familia de curvas que se cortan en el eje de las abeisas en el punta -I/Km.

Y"

I 7 VM

,

modifica las propiedades catalíticas de la enzima, posiblemente modificando la con- formación del centro activo de forma que no impide la unión del sustrato pero dificulta grandementesu transformación.

El esquema de la reacción con la participación de un inhibidor no competitivo será

,' Los efectos de este inhibidor sobre los parámetros cinéticos son contrarios al

~ / ' anterior, se observa una disminución de la Vm sin alteraciones de la Km; ni siquiera en ,/ , concentraciones elevadísimas de snstrato se logra eliminar la inhibición.

.S" , " , ! ,'

Si la Km no se ha modificado quiere decir que no existe impedimento para la -':, unión de la enzima con el sustrato. oero la afectación de la Vm indica aue el inhibidor

E + S +ES+ E + P E + I d E I ES + 1 + EIS E1 + S + EIS

La enzima existe en un estado libre y en forma de varios complejos (EI, ES y EIS) de los cuales sólo ES da productos. Si suponemos que la unión de S a la enzima no

iduye sobre la unión de 1 y viceversa, entonces la constante de disociación de E1 será igual a la de EIS y viene dada por cualquiera de las ecuaciones siguientes:

El valor aparente de Vm' que se obtiene en presencia del inhibidor se relaciona con la Vm de la reacción sin el inhibidor por la ecuación

[Il ~ m ' = Vm. (1+ -) Ki

En este caso también la enzima existe en forma de varios complejos de los cuales sólo ES puede dar productos, pero no existe ningún impedimento para la unión con el sustrato; la existencia de esos complejos determina una disminución del número de centros activos útiles en la preparación y, por tanto, una disminución de la velocidad de reacción.

Los inhibidores no competitivos no son análogos estructurales del sustrato; el iodoacetato es un potente inhibidor no competitivo de las enzimas que poseen grupos sulfibidrilos en, o cerca de, su centro activo.

Algunos medicamentos utilizados diariamente en la práctica médica son inhibidores ennmáticos, como el caso de las sulfamidas que se emplea en el tratamien- to de infecciones bacterianas.

En general las armas químicas suelen ser también inhibidores enzimáticos que al bloquear determinadas reacciones puedeu dañar un órgano o tejido específico. si la enzima que resulta inhibida está presente sólo en él, o al organismo en su totalidad si la enzima inbibida está muy distribuida en la economía.

La lucha contra la producción, almacenamiento y utilización de las armas quími- cas debe constituir una posición de principio de todo científico, pues es parte del comportamiento ético impedir el uso de los avances de la ciencia en perjuicio de la humanidad.

Resumen

La einética enzimstica es la parte de la enzimologh que se ocupa del estudio de la velocidad de las reacciones enzimáüeas v de las factores aue la modiscan.

En los eshidias ein6üeos se deben obsekar algunas reglas que permitan hacer una interpretación ademada de las resuliadas, wmo son medir siempre veldda- des ini&es y variar en cada experimento sólo uno de las factores que pueden alterar la velocidad. Los principales factores que iníinyen sobre la velocidad de la reaeO6n son las concentraciones de etuimas, mistraios y wfactores, la temperatura, el pH y la presencia de activadores o inhibidores.

La velocidad de las reacciones enzimátieas es diredamente proporcional a la wnceniración de enzima, lo cnal consütuye el tundamento de toda la cinética enzimática. La wncentración de sustrato innuye sobre la velocidad de forma muy característica. A medida que la wncentraci6n de mistrato aumenta se produce un aumento de la velddad, pero en concentraciones muy elevadas de mistrato se produce un estado de saturación de la enzima que no permite mayores incrementas de velocidad. Para explicar este comportamiento se emplea la teoría deMiehaellis- Menten, según la cnal bastan 2 parámetms para explicarlo, uno, la Km define la

-dad de la enzima por el sustrato y el otm, Vm es un indicador de la capacidad cataüoca de la emima

Cuando en la reaceión intervienen 2 susiratos, uno de los mpeetos más importantes que se debe determinar es el orden en que se iigsn lm sustratos y se liberan los productos. Atendiendo a este punto de vista se describen los mecanismos ordenados, los azarow y el ping pong.

La inilueneis de la mncentraeión de los whctores es similar a la del sustrato. La velocidad varia con el pH y existe una wna de pH ópümo donde la veloci-

dad es la mayor. Variaciones del pH en ambas lados de esta wna determinan una disminución de la velddad.

Al aumentar la temperahva la velocidad de reaeeión aumenta, pero pasado un limite comienza a disminuir, pues se producen alteraciones de la estructura . . tridimensonal de la emha.

Los activadores producen un aumento de la velddad de la reacción, se distinguen 2 principales, aquélios que se unen a la enzima libre y los que se unen al nishsto. Por su parte los inhibidores disminuyen la velocidad de la reacción, bien porque modiñean la Km, en cuyo caso son de tipo competitivo, o por alteraciones de la Vm, que reciben el nombre de no competitivos.

Los eshidios einéticm son importantes para el conocimiento del meraniSrno de a d 6 n de las enzimas, con el propósito de conwerio y modifi~~rlo. Muchos medi- eamentos y algunas armas químicas suelen ser bbibidores enzimáticos espeáfim.

Ejercicios

1. ¿Cuáles son las razones por las que en los estudios cinéticos debe siempre medirse velocidades iniciales?

2. En una experiencia cinética se observa que al aumentarla concentración de enzima no se produce el esperado aumento proporcional de la velocidad. ¿A qué factores pueden deberse estos resultados?

3. Si 2 enzimas actúan sobre el mismosustrato con Km de 4 x 10" v 7 x 10." resuec- , . tivamente ¿Qué conclusiones pueden derivarse deestos valores?

4. Calcule el número de recambio de una enzima que al estar en una concentración de 10" M forma 3 x 10.' M del producto en un segundo.

5. Una enzima cataliza la reacción:

Alanina ------, Etanolamina + Co,

en un experimento realizado a pH=8 y a 30 "C se obtienen los datos siguientes:

V" (pmol de CO, min-')

Calcule la Km para la reacción

6. En el estudio de la reacción:

L-aspártico -, L-ala + Co,

se encontró que el P-hidroxi-aspártico era un inhibidor de la enzima. Al tratar de determinar qué tipo de inhibidor era se obtuvieron los datos siguientes:

[L-aspárticol vo (mmol de CO, min-') (mg de proteína)-' mmol 1.'

sin inhibidor con inhibidor

Constmya una gráfica de l/vu vslI[S] y determine de qué tipo de inhibidor se trata.

Uno de los problemas centrales de la genética molecular consiste en conocer cómo la información contenida en el ADN y transcrita en un ARNm puede dirigir la síntesis de una cadena polipeptídica específica, o sea, cuál es la relación entre la secuencia de bases del ARNm y la de los aminoácidos de una proteína; éste es el contenido del problema del código genético.

El código genético surge como una necesidad natural, debido a las diferencias existentes entre la estructura de las moléculas que conservan la información (ADN) y aquéllas que la expresan en funciones específicas (proteínas). Se acostumbra decir que esta información está en 2 lenguajes diferentes: el primero, en forma de una secuencia de bases y el segundo, de aminoácidos. Al pasar la información del ADN al ARNm se mantiene en el mismo 1engnaje.por lo que el proceso se denomina transcripción. Pero al pasar del ARNm a las proteínas hay un cambio de lenguaje y por tanto es una traducción. Para traducir es necesario poseer la relación de equivalencia que existe entre los signos utilizados en un lenguaje y los empleados por el otro. En esto consiste la necesidad del código genético.

En nuestros días la solución de este problema pudiera parecer algo muy sencillo, pues bastaría con determinar la secuencia de bases de un gen y la de aminoácidos de la proteína por él codificada y correlacionarlas, pero esto no fue posible en los primeros años de la década de los 60 cuando se enfrentó la solución de este problema. Los métodos dedeterminación de la estructura primaria de las proteína estahan ya establecidos desde el trabajo de Sanger con la insulina (1956) pero los procedimientos que permitieron hacer lo mismo con el ADN, con un elevado grado de fidelidad, no aparecen hasta finales de la década de los 70 cuando el código ya había sido descifrado.

Este estudio comenzará por un esbozo de los trabajos fundamentales para descifrar el código genético y después se realizará un análisis y se destacarán sus caracterís- ticas principales. Desde el punto de vista bioquímico el código se define como la relación de equivalencia entre la secuencia de bases del ARNm y la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Primeros pasos

El problema del código genético fue formulado por primera vez por GwrgeGamour en 1953, y en su solución participaron numerosos investigadores, empleando fundamentalmente métodos químicos y biológicos.

~~

(;IIIIIOII W P U ~ I I que la cadnia polipeptídira ce forma directamente $obre la doble h6lire del 4DN. estando rada aniinoúcido situado rn un hueco rntrc 4 nucleútidoc: este hueco tendría aproximadamente la forma de un rombo. Dos nucleótidos pertene- cían a una banda y 2 a la otra. El «código de rombos rojos» de Gamowasegura precisamente las 20 letras, pues como utiliza 4 bases da origen a (4') 256 combinaciones; no obstante, esta forma de codificación directa imponía algunas Limitaciones a la secuencia de aminoácidos de la proteína, esto quiere decir que una vez fijado un aminoácido, el siguiente no podía ser cualquiera de los 20, sino un número muy reducido de ellos. Sin embargo, las investigaciones demostraron que tal limitación no existía en las proteínas, cuyas secuencias de aminoácidos eran conocidas.

El descubrimiento de quela síntesis de proteínas se realizaba en una estructura citoplasmática (los ribosomas) y la existencia de los ARNm rechazaron definitivamen- te la hipótesis de Gamow.

Por razonamientos teóricos se estableció la relación de codificación -que se com- probó después experimentalmente-, o sea, cuántas bases son necesarias para codificar un aminoácido. Como el lenguaje del ARNm sólo tiene 4 letras (A, U, G, C) y el de las proteínas 20, la relación no podía ser 1:1, pues las proteínas constarían de 4 aminoácidos; si fueran 2 las bases alcanzaría para (4'=16) 16 aminoácidos; pero con 3 bases (4L64), el número de combinaciones era mayor que el número de aminoácidos, por lo que qurdú est;il~lrcid~~ que a cada aiiiinoátid~~ en la proteína le correspondían 3 bases en el 4RSm. \ la relación de codificación ei 3:l. I.:ste triulete dr hase*;. uor ser la , . . . unidad de codificación, recibió el nombre de codon.

Teniendo en cuenta que son posibles 64 combinaciones de bases y que sólo 20 aminoácidos diferentes se incorporan en la síntesis de proteínas,se deduce que al menos para algunos aminoácidos existe más de un codon, o sea, el código es degenerado. Los codones que se traducen en el mismo aminoácido reciben el nombre de sinónimos.

Otra consideración importante se refiere a la forma en que el ARNm es traducido, si el código es o no superpuesto. Si el código no es superpuesto cada base nitrogenada formará parte de un solo d o n , mientras que si fuera superpuesto formaría parte de más de uno:

3. UAG14GCIGCCKCUKUUFnrAPAGkGCMCl Superpuesto

Esta alternativa pudo resolverse teniendo en cuenta que se conocía la secuencia de aminoácidos de algunas proteínas. Si el código fuera superpuesto, un cambio en una base ocasionaría el cambio de más de un aminoácido continuo en la proteína. Sin embargo eran conocidas algunas proteínas en las cuales sólo se producía el cambio de un aminoácido por otro, lo que implica que el código no es superpuesto.

Las 3 primeras características del código fueron: que estaba formado por tripletes (codones), éstos no eran superpuestos y que el código tenía carácter degenerado.

Descifrado del código

Los primeros experimentos encaminados a descifrar el código fueron realizados por MarshallNirembergy Heinrich Matheien 1961. Ellos tuvieron un éxito inicial al conseguir un extracto celularcutable que sintetiraba pn~teínat activamente, logra- run dirinir la sintesis de un oo1ioi.otid11 oor traducción de un u~~lirril>onucleútid. . . sintético que actuaba como ARNm (Fig. 28.1).

Este sistema fue útil no sólo en la dilucidación del código genético, sino también para esclarecer muchos aspectos relacionados con el mecanismode síntesis de proteínas.

Los polinucleótidos se s i n t e h n uolizando una enzima - pokueleóodo fosforilasa-, descubieka en 19.55 por Maiianne Grumberg-Managoy Sevem Ochoa. Esta enzima se diferencia notablemrntrde la SR\; polinier~w, pues utili7a rmni,suctratus lus nuclcíkid~n difi*ifatad~m: como nolibera oimtififat~~ suaccii~n nu orwrmaiuulada ala hidrólishde éste, y lo m& importante es que esta enzima no es di&¡& por un molde de ADN, por lo que la secuencia del polinucleótido es al azar dictada por la proporción relativa de los diferentes nucleósidos difosfatos presentes en la mezcla de reacción.

Fig. 28.1. Obteiieión de extractos celulares sintetizadores de proteínas. Las bacterias s o n l r i tu radas con

Fosfoenol Piluvillo Piruvato Quiiiasa Buffer pH= 7.8

poli ( U )

aluminacomo ahrnsi\o y SP le aña- dc desoairi-ihonucleasa que. al hidrolizar CI D N , eiita que en el extracto pueda aparecer ARNni cndógeno. Uiia primcra ientrifu- gac ih a haja velocidad eliniina la alumina ) los restos reliiliires que no estan bieii Iionmgeneizn<liis. Una segunda centrifugaiióii a 30 U00 g sii.\c p a r a e l iminar membranas y paredes cclularrs, lo que deja un sol>i.ea~dante cl cual se denniiiinó S-30 (sol>i'enadante de 30 000 gi ron el qisc Sr realiza- ron los prinicrus expcriiiieittos. Una tercera rentrifugaiión a 100 OOU g permite separar los rihasomas, y a El procedimiento consistíaen preparar unconjunto de tubos de ensayo,de com- partir del sohrenadante S.lo0 se

~osición similar, en cada uno de los cuales se añadía un aminoácido diferente marcado ~ i w d r i i ohtmei- 10s AKNt p las con '"C. eiizitiias aiti\adoi.as. El prcpara-

Cuando al sistema se le añadía poliuridina se obtenía la formación de do S-100 sr utilizb en experinicn- (0s posteriores.

polifenilalanina. Se logró de esta manera descifrar la primera palabra del código: el codon UUU significa fenilalanina (Fen).

Por un procedimiento similar se pudieron asignar otras 2 palabras: el CCC para la prolina (Pro) y el AAA para la lisina (Lis). Los polímeros de poliguanosina no pudieron emplearse porque forman una compleja estructura tricatenaria que no sirve de matriz para la traducción.

La etapa siguiente consistió en determinar la composición -no la secuencia- de los demás tripletes. Si la enzima polinucleótido fosforilasa se incuba con UDP, el resultado por supuesto es el poli U. Si se incuba con UDP y GDP se obtiene un copolímero que contiene U y G. La secuencia de bases es azarosa, pero controlando la proporción de nucleótidos se puede calcular la frecuencia con que deben producirse cada uno de los codones. La tabla 28.1. muestra los resultados obtenidos en un polinucleótido preparado a partir de una mezcla que contenía 76 % de U y 24 % de G.

T ~ M P 281. Frecuencia relativa de tripletes de bases obtenidas al controlar la propor- ción de cada una en la mezcla de reacción

Triplete Probabilidad Frecuencia -

UUU

UUG

UGU

GUU

UGG

GUG

GGU

GGG 0,24 x 0,24 x 0,24 = 0,012 3J

Nota: Aparecen 4 clases de frecuencias para los 8 rodoncs posibles.

componentes celulares y GenCtica molecular 499

500 mhqd

Si se utiliza este polímero en un sistema como el descrito anteriormente, con 20 tubos de ensayo que contengan los 20 aminoácidos, pero sólo uno de ellos marcado con "C, se puede medir la frecuencia con que cada aminoácido se incorpora al polipéptido que se sintetiza (tabla 28.2).

Tabla 28.2. Coniposición de los codones según la frecuencia de incorporación de los aminoácidos

--

Aminoácido Cantidad incorporada Composición del codon

Fen

Val

Len

CsS

m Gli

La comparación de los 2 resultados sugiere que los codones correspondientes a la valina (Val), cisteína (Cis) y leucina (Len) contienen 2 U y 1 G, mientras que los del triptófano (Trp) y glicina (Gli) tienen 2 G y 1 U.

Por variaciones en la composición del polímero se lograron otras combinaciones hasta determinar todos los codones que contenían U, después se procedió de igual forma para los que contenían C y por último, los que tenían A. Los de G no se determi- naron por las razones expuestas.

Mediante este procedimiento se pudo conocer la composición (no la secuencia) de aproximadamente 50 codones.

Otros experimentos de gran relevancia fueron realizados para asignar los codones que faltaban y para comprobar los existentes.

Una nuevalínea experimental fue asumida por Nirembergy otros. En 1 9 6 4 ~ cono- cía que algunos polinucleótidos sintéticos estimulaban la unión de los ARNt con sus aminoácidos correspondientes y los ribosomas, este complejo de 3 componentes podía ser identificado por el método de nltracentrifugación, en un gradiente de densidad de sarnosa Desafortnnadamente este método de análisis era demasiado laboiiaw; Niremberg y otros diseñaron una forma ingeniosa y rápida de aislar el aminoacil-ARNt unido al ribosoma y al ARNm, utilizando un filtro de nitrocelulosa. Los ribosomas quedaban adheridos al filtro, sin embargo, los aminoacil-ARNt pasaban por el filtro fácilmente, excepto que estnneran unidos a los ribosomas. En particular Nirembergy PhiUpLeder (1964) fueron capaces de inducir launión de Fen-ARNt al ribosoma, utilizando poli U sin otro homopolímero, el complejo formado fue retenido en el filtro de nitrocelulosa. La utilización de copolimeros como ARNm sintéticos, traía por resultado la adsorción de aminoacü-ARNt-ribosoma, cuyo aminoácido coincidía con los resultados de los experimentos realizados en los sistemas libres de células. Estos experimentos también demostraron la ektenciade un complejo aminoácido-ARNt-ARNm-ribosoma como intermediario durante lasíntesis de proteínas.

Los trinucleótidos estimulaban la formación del complejo,dando una confirmación directa del carácter de tripletes del código genético. Nirembergse dio cuenta que era más fácil sintetizar trinucleótidos de secuencia conocida que un ARNm; su trabajo que co- menzó con el triplete GUU correspondiente a Val, progresó rápido, y alrededor de 50 de los 61 codones fueron asignados directa y convincentemente por este método.

maklédicd

Otra Línea experimental diferente siguió H. Ghobind Khorana (1966), quien com- binando procedimientos enzimáticos y de síntesis orgánica logró la síntesis de polinucleótidos de secuencia conocida, a partir de la polimerización de dinucleó- tidos; uno de ellos fue el poli (AC) que produce ACACACACAC, el cual puede ser leído en grupos de3 bases como ACAlCAClACAlCAC de manera que el polipéptido sintetizado, tomando este polímero como ARNm, constaría de 2 aminoácidos alternantes, que fue el siguiente:

Por los experimentos descritos anteriormente, se sabia que la composición del codon de la treonina (Tre) era de 2 A y 1 C y el de His de 2 C y 1 A, por lo tanto ACA codifica para Tre y CAC para His.

La utilización del poli(UG) producía:

Cis-Val-Cis-Val-Cis-Val

con lo que se comprobaba que UGU correspondía a la Cis, y se asignó el GUG a la Val. Khoranalogró también la polimerización de trinucleótidos, por ejemplo, el poli

(UAC) que puede ser leído de 3 formas diferentes:

l.UACIUAC(UACILIACIUACvACvAC queoriginapolitirosina 2. ACUlCUbCUbCUbCUbCUli\.CU que codifica politreonina 3. CUA(CUA(CUA(CUA(CUArUA(CUA que forma polileucina

Experimentos como estos consiguieron no sólo determinar la secuencia de muchos de los codones de composición conocida, sino además, corroborar los que habían sido asignados por otros métodos.

Los codones que indican el final de la cadena polipeptídica y que no codifican ningén aminoácido también fueron asignados por la utilización de polímeros de secuencia conocida.

Si se utilizaba el poli(UAUC) la traducción podía comenzar en 4 sitios diferentes,

originando sólo 4 codones diferentes (UAU, AUC, UCU y CUA) que produce la secuencia alternante Tir-Leu-Ser-Ile que puede comenzar con cualquiera de ellos. Esta situación se repetía con muchos polinucleótidos del tipo poli(MNPQ).

Cuando se ensayó el poli(GUAA) se esperaba encontrar un resultado similar, pues éstedebe producir también 4codonesypor tanto un tetrapéptido repetido:

Sin embargo, se encontró que no se producían largos polipéptidos, sino que se formaba sólo 2 productos: el tripéptido Val-Ser-Lis y el dipéptido Ser-Lis. A partir de

Fig. 28.2. El código genético casiuniversal. Estructura actual del código genélieo. Nótese que cn la mitad izquierda predominan los aminoácidos apolares y en la de- rceha los palarcs; estas 2 mitades difieren en que la segunda base sea pirirnidinica a la izquierda, o puríniea a la derecha. Ocho de las 16 casillas están ocupadas por el mismo aminoácida, la que significa que la tercera base es redundante. Sólo 2 aminoácidos están codificados por un eodon cada uno. INI se refiere al eodon de ini- ciación y TER a los de termina- ción.

los codones ya asignados (VakGUA, Ser=AGU y Lis=AGG) se pueden alinear los péptidos con los distintos tipos de secuencia y se obtienen los resultados siguientes:

1.GUAAGUAAGUAAGUAAGUAAGUAA Val - Ser - Lis - ?

2.UAAGUAAGUAAGUAAGUAAGUAAG Val - Ser - Lis - ?

3.AAG UAA GUA AGU AAG UAA GUA AGU Lis ?

4.AGUAAGUAAGUAAGU AAGUAAGUA Ser - Lis - ?

Lo que muestra que la síntesis se detiene en el codon anterior al UAA y esto indicaba que éste debía una señal de terminación.

Experimentos similares mostraron que el poli(AUAG) producía sólo el tripéptido ne-Asp-Arg y el dipéptido A S ~ - A ~ ~ , probando que UAG era otro codou de t d n a - ción. Por último, con poli(UGA) sólo se formaba polimetionina y poliaspártico, lo que llevó a la conclusión aoe UGA era también un codon de terminación.

Como resultado he una broma de laboratorio a estos 3 codones se le dieron nombres propios -ámbar para el UAG, ocre al UAA y ópalo al UGA- y éstos se utilizan comentemente en la literatura científica.

Codon de iniciación

En los sistemas in vitro la síntesis de proteínas comienza en cualquiera de las bases del polinucleótido sintético utilizado, pero in vivo esto no es así, se requiere de un codon de iniciación. Por experimentos in vitrose ha podido determinar que el más utilizado para ello es el AUG, aunque en muy pocos casos también el GUG; esto fue corroborado más tarde en numerosos estudios de secuencias de ADN. Estos codones tienen además la función de codificar aminoácidos especficos -el AUG metionina y el GUG valina- para incorporarlos dentro de la cadena. En el capítulo30 se explicará cómo la célula puede diferenciar una de otra.

Como resultado de todos estos trabajos a ñnales de 1966 el código genético había sido descifrado completamente El total de codones y su signüicadoaparece en lafigura28.2.

Aunaue el códizo fue descifrado nor exoerimentos in vitro. la exactitud de la - asignación de cada codon ha sido confirmada por análisis genéticos y bioquímicos. La

U C A G

U

- - - . : c .

2.

Fen

Fen

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Ser

Ser

Ser

Ser

Pro

~ r n

Pm

Pro

Ile

Tir

Tir

Ter

Ter

His

~ i -

GIN

GIN

Tre

Cyr

C Y ~ Ter

Tic

.1rg

~ c g

,Are

112

U

C

A

G

U

c A

AIN

G

Ser 1 U

-

reciente tecnología de secnenciación del ADN ha dado la confirmación definitiva a este problema, qne parecía un sueño casi imposible, cuando fue postulado en 1953 y que poco másde 10 años después quedaba totalmente resuelto.

Universalidad del cádigo

Tanto los experimentos de Niremberg como los de Khorana fueron realizados utilizando los componentes del sistema hiosintético de proteínas de la E. coli, pero después fueron realizados repetidamente utilizando bacterias, vinis, hongos,plantas y animales, incluyendo a los mamíferos. Los resultados en todos los casos coincidieron y llevaron a postular la universalidad del código.

Más tarde se ha encontrado que el sistema informativo de las mitocondrias presenta desviaciones con respecto al código universal. Esas variaciones ya fueron estudiadas en el capítulo 37 (tabla 37.4). Para otros organismos el código mitocondrial ofrece otras variaciones.

Estos descubrimientos Limitaron el carácter universal del código y por ello hoy se dice que es casi universal.

Mucho se ha escrito y especulado sobre la forma de organización del código, tratando de descubrir cuáles son las leyes que subyacen en su organización. Aunque este objetivo no parece haberse alcanzado totalmente, se han podido señalar algunas de sus regularidades más sobresalientes.

El punto central de la atención ha sido el carácter degenerado del código. Para 32, o sea, la mitad de los codones, se tiene una degeneración completa de la tercera base, el aminoácido queda codificado totalmente por las 2 primeras bases (por ejemplo, UC codifica Ser) para los demás (con la excepción de las parejas UGAAJGG y AUAIAUG) la degeneración es casi completa, pues sólo requiere el carácter purínico o pirimidínico de la tercera base. Esto se resume diciendo que los codones del tipo XYU y XYC son siempre sinónimos al igual que los del tipo XYA y XYG, con las excepciones mencionadas (tabla 28.3).

p b h ~83. Grupo 1 de codones, donde las 2 primeras bases son suficientes para la codiiicación del aminoácido

X Y N Aminoácido

G C 6 Ala

G U 5 Val

U C 5 Ser

Nota: Grupa 1. Para el cadon XYZ. Z =(A,G,C,U)

CampoacatescdularrsyOenaicamdsailiu 503

Teniendo esto presente se pueden agrupar los codones sólo por las 2 primeras bases, en 2 grupos de 8 cada uno: en el primer grupo los pares XY, que codifican los aminoácidos con independencia total de Z y, en el segundo, los que varían según Z sea purínica (Pu) o pirimidínica m).

La columna n indica el número de puentes de hidrógeno que puede formar la pareja XY al unirse a un par complementario (X'Y'). El valor n pudiera Uamarse grado de complementaridad, que en el primer grupo es 6 y 5 (promedio 55) y el segundo 5 y 4 (promedio 4 5). Se puede pensar que mientras mayor sea n,menor valor tendrá la interaccióu Z-Z', ya quela unión XY-X'Y' es suficientementeestable. E1 valor de la tercera base será discutido nuevamente en el siguiente acápite. Estas características han hecho suponer que el código primitivo era de sólo 2 letras y que ha evolucionado hacia su estado actual de 3 letras.

lhblpZ&4. Grupo 11 de codones, donde la tercera base tiene una función determinante

X Y N Aminoácido

2FRi Z=Pi

No*: Grupo 11. Para CI codan XYZ.

La secuencia de bases codifica sólo la secuencia de aminoácidos de la proteína, pero su estructura tridimensional depende de su secuencia. Alteraciones en la secuencia pueden ocasionar alteraciones en la conformación y, por lo tanto, en la función. Como se vio en la sección de biomoléculas,en esto influye notablemente la polaridad de la cadena R de los aminoácidos, los de carácter hidrofóbicos son los determinantes en el plegamiento de la cadena. La sustitución de un aminoácido apolar por uno polar puede causar cambios drásticos en la conformación de la proteína; alteraciones de este tiposólo ocurren cuando existe el cambio de una purina por una pirimidina que esté ocupando la segunda posición del codon. Los cambios en la primera base también influyen menos en la naturalera polar o apolar del aminoácido codiíkado. Sin embargo debido al carácter degenerado del códigoes muy poco probable que esto suceda.

Si se toma como ejemplo el codon GUG y se analizan todos los cambios posibles y sus resultados, se verá en la figura 28.3 que de 9 cambios posibles, sólo en un caso que afecta la segunda base, la val se cambiaría por un aminoácido polar (glu) y, por tanto, podría influir notablemente en la estructnra de la proteína. En codones de otros aminoácidos hidrofóbicos estoes menos evidente,pero en general 2de cada 3 cambios no producen alteraciones en el carácter hidrofóbico del residuo de aminoácido.

No obstante, lo dicho anteriormente, en ocasiones existen aminoácidos que son tan vaiiosos en la estructura de la proteína, que no admiten ser cambiados por ningún otro aunque éste sea muy semejante, por ejemplo, un aminoácido cuya cadena R aporte el grupo catalítico al centro activo de una enzima.

Una vez conocido el código genético, o sea, la relación entre la secuencia de bases del ARNm y la de aminoácidos de las proteínas, es necesario conocer cómo se realiza el proceso de descodificación,cómose lograla conversión de un lenguaje en otro. Al estudio detallado de los mecanismos de este proceso está dedicada el capítulo 30. Ahora sólo se estudiará brevemente el fundamento del proceso de descodificación.

Para poder descifrar el código hace falta otro tipo de ARN llamado de transferencia y cuya estructura fue estudiada en la sección de biomoléculas. Es necesario recordar que en estas moléculas existen 2 sitios bien definidos que ocupan los extremos de la estructura de la aL». En uno de ellos (el extremo 3 ' -OH) se encuentra el triplete 5 ' XCA-3 ' a cuyo 3 -OH se une un aminoácido específico; en el otro extremo se encuentra el asa anticodon con su secuencia característica 5 ' ---Pi--U--XYZ-- Pu(modificada)--3 ' ,donde XYZ representa el anticodon. Es este triplete el que se une al codon del ARNm durante la traducción, por la formación de pares de bases complementarias. Por ejemplo, si el anticodon tiene la secuencia 5 ' -- AAA-3 ' su codon complementario será el UUü. A este tipo de ARNt se unirá por el extremo 3 ' -0H el aminoácido feuilalanina. Si el anticodon fuera 5 ' --GGG-3 ' se complementaría con el codon 5 ' --CCC-3 ' y el ARNt llevaría en el extremo 3 ' -OH a la prolina. La reacción de unión del aminoácido al ARNt correspondiente se estudiará con más detalles en el capítulo 30.

Teniendo en cuenta que existen 61 codones que codifican aminoácidos, cahría suponer la existencia de 61 tipos de ARNt con sus anticodones correspondientes a cada uno de los codones del ARNm. Esta idea fue sustentada inicialmente al hallar que cuando se purificaba ARNt de la leucina (leu-ARNt) y se examinaba en un sistema artificial de síntesis de proteínas, había una especie (leu-ARNt,) que incorporaba el aminoácido cuando se utilizaba poli(UC), pero no al emplear poli(UG), mientras otra especie (leu-ARNt,,) lo hacía con el segundo pero no con el primero, esto significa que el leu- ARNt, lee el codón CUU y el leu-ARNt,,, el GUU.

Sin embargo, la idea un codon-un ARNt no prosperómucho tiempo debido a los experimentos de Holley, quien logró establecer la secuencia completa de bases del ala-ARNt de levadura. Esta molécula lee 3 (GCU, GCC y GCA) de los 4 codones de la alanina. El examen de la secuencia de las zonas no apareadas mostró que en un solo sitio había una secuencia 5 ' - -GC--3 ' por lo que esta pareja debía ser parte del aniicodon (se debe recordar que por convención, las secuencias de los ácidos nucleicos se escriben del extremo 5 ' al 3 ' y el apareamiento se realiza en sentido antiparalelo, por lo que el codon 5 -- AUC-3 ' debe tener un anticodon 5'--GAU--3 ' ).

Esto implicaba que el anticodon fuera la secuencia 5 ' --IGC-- 3 ' , en la cual 1 simboliza el nucleótido raro de inosina. Como el ala-ARNt responde a los 3 codones (GCU, GCC y GCA) entonces, la inosina no forma puentes de hidrógeno o puede formarlos con U, C y A. Si fuera la primera situación también leería el codon GCC, lo cual no sucedía, por lo tanto, 1 puede formar puentes de hidrógeno, aunque no sea en la forma de los pares habituales U-A y G-C (Fig. 28.4).

La aparición de la inosina en el aniicodon se debe a que siempre que en la primera posición aparezca A en el transcrito primario, ésta es desaminada enzimáticamente produciendo hipoxantina. que es la base que forma parte de la inosina.

La explicación a este fenómeno fue propuesta por Francis Crick (1965) con la idea del acoplamiento vacilante (wobble). Hasta ese momento se creía que apareamientos diferentes de A-U, A-T y G-C no aparecían en los ácidos nucleicos. Esto es cierto en el

Fig. 28.3. Importancia del carácter degenerado. A partir del coda" GUC se pueden ohteiicr Y codones, cam- hiando una sola base cada vez. Sin embargo en 3 ocasiones el si~nif i - cado del codoii no cambia y de las 9 posibilidades sólo en un caro sc altera cl c a r á c t e ~ polar del aniinuácido codificado.

Fig. 28.4. La inosina como formadora de pares de bases. La inasina (en calor) puede formar pares de bases con la eitosina (arriba), uracilo (centro) y adenina (abajo), por lo cual su aparición en el anticodan del ARNt noimpide el apareamien- to con el codon del ARNm. La aparición de la inasina en la primera posición del anticodon permite que varios codonea sean lei- das par el mismo ARNt.

ADN por las características estructurales de la molécula, como se n o en la sección de biomolécnlas. Sin embargo, como el apareamiento codon-anticodon se produce entre 2 moléculas de ARN no es necesario consemar la eshuciura regular de la doble hélice. Crick demostró que pueden existir otros apareamientos en la interacción codon- anticodon, pero que esto requería en primer lugar que las 2 primeras bases fonnaran apareamientos típicos, para que segarantizara unaestabilidad máxima y,en segundo lugar, queel terrer par de bases no produjera mucha distorsión como ocurre habitualmente con los pares purina-purina, identificando como posibleslos apareamientos que aparecen en la figura 28.5.

Laposibidad deformarlos4 paresadicionalesde bases (A-1,U-1, C-1 y G-U) explica cómo una sola molécula de ARNt puede aparearse con varios codones.

Ahora es comprensible el caso de los ala-ARNt de levadura. Uno deellos,estudiado por HoUey, que tiene el anticodon IGC puede formar pares de bases con 3 de los codones (GCU, GCC y GCA), pues la inosina puede aparearse con U, C y A. El otro (denominado ala-ARNt,,) sólo acopla con el codón GCG, para lo cual serían posibles 2 anticodones el CGC y el UGC, pues G puede formar pares de bases con C y con U. Si fuera el UGC entonces debía leer también GCG y GCA, pero como este no es el caso, el anticodon debía ser CGC y lo es en realidad.

Aunqueensolución los tnnucleótidosse aparean mal,pues su tamaño no les permite estabilizarse por las interacciones de apilamiento de bases; en el proceso de traducción estas interacciones codon-anticodon se estabilizan debido a vanos factores:

1. Tanto elcodoncomoel ant idon forman parte de moléfulas mayom,locual permite que la unión entreellos pueda estabilizarse por apilamiento de bases.

2. Hacia el lado 5' del antidonsiempre hay una U,loquesugiere quedebe tener alguna participación en la estabilización de la unión codon-anticodon.

3. El apareamiento se produce normalmente cuandoambos (ARNt y ARNm) están unidos a los ribosomas. Es posible que esa unión haga que el codon y el anticodon se posicionen de fonna que la estabilidad de la unión sea máxima.

Fig. 28.5. Modelo de acoplamiento vacilante. Según la hipótesis del apareamiento vacilante en la unión del cadon con el anticodon, pueden aparecer pares de bases que no se encuentran normalmente en el ADN. En cada casa el anticodon esti en rojo y el codon en azul. La flecha indica la dirección 5'->3'. En todas las casos sólo se representa la tercera base. Obsérvese que las codones que aparecen en la misma horizontal son siempre sinónimos.

Resumen

Desde el punto de vista bioquímieo el código genético es la relación de equivalencia entre la sxuencia de bases nitrogenadas de los ARNm y la secuencia de aminoácidos de las protelnas. El d o n es la unidad de e o d i i i d n y está formado por 3 bases, por lo que la relaci6n de d c a c i 6 n es 31. Cada base niirogenada del ARNm forma parte de un solo codon, lo que quiere decir que el eódigo no es super-

puesto. Por lo general cada aminoácido es &cado por más de un codon, lo que significa que el código es degenerado.

El deseiffado del código fue posible gracias a 2 grupos de trabqjo principalmente el de Niremberg y el de Khoraoa El primero, utüizaodo un sistema Ubre de células y poliaueleótidos sintéticos, como inicio, y írinucleótidos de secuencia conocida, después, logró establecer la estructura de numerosos codones. El segundo, utilizando poliaucieótidos de secuencia conocida conñrmó las asignaciones hechas por Niremberg y estableció la secuencia de otros codones, entre eLlos, los de termi- nación. A ñnales de 1966 el código estaba totalmente descifrado.

Todas las bacterias, virus, hongos, vegetales y animales utilizan el mismo códi- go; d o en las mitoeondrias aparecen variaciones, por lo que se considera que el eódigo tiene carácter quasiuniversal.

Los máü& de la edmcúua del código Llevan a la idea de que su forma acíuai es resultado de un proceso evolutivo, en el cual se ha ido ganando en seguridad. El earáeter degenerado posibüita amplias variaciones en la secuencia de bases del ADN, y por lo tanto del ARNm, sin modiñcar esencialmente la edmcíura primaria de las pmieinas.

El proceso de deseodificación se Lleva a cabo en los ribosomas con la participa- ción de los ARNt, que contienen el triplete anticodon, que al aparearse con el codon facilitan que cada amino4cido ocupe una posición precisa en la cadena polipeptidica. El apareamiento se produce con mayor fuerza en las 2 primeras bases que en la tercera, lo que expiica que un mismo ARNt pueda leer varios codones.

Ejercicios

1. Como se observa en la figura 28.2 existen 6 codones para la Leu, Ser y Arg ¿,Cuál será el némeromínimo de Leu- ARNt,Ser-ARNt y Arg-ARNt que debe tener una célula para sintetizar proteínas eficientemente si todos los codones son utilizados con la misma frecuencia?

2. El codon UAC codifica Tir y el UAG es un codon de terminación ¿Podría un tir-ARNt aparearse al UAG y provocar que la síntesis de la proteínacontinuara más allá de su límite normal?

3. El codon de iniciación preferencial es el AUG, perose ha visto que también puede emplearse el GUG y en ambos casos se incorpora Met ¿Pudiera explicarse esta situación, suponiendo que un mismo ARNt pueda leer los 2 codones?

4. Los ácidos aspáriico y glutámico ocupan la misma casilla del código, difieren sólo en la tercera base ¿Cuáles deben ser los anticodones del asp-ARNt y el glu-ARNt paraque en la cadena polipeptídica no pueda incorporarse uno de ellosen vez del otro?

5. Un bioquímico afirmó haber establecido la secuencia de bases de un Tir-ARNt cuyoanticodon tenía la secuencia 5 ' - ICA-3 ' .pero este hallazgo se puso en duda por todos sus colegas ¿Cuáles serían las razones que hicieron poner en duda el hallazgo anunciado?

6. Un ARNm es modificado artificialmente incluyéndole una G entre los codones 15 y 16, y se observa que el polipéptido sintetizado difiere del original en la secuencia de aminoácidos a partir del 16; después se hace una segunda modificación al ARNm y se observa que ahora la secuencia de aminoácidos del polipéptido sólo difiere del original en los aminoácidos 16,17 y 18 ¿En qué consistió la segunda modificación? ¿Cómo se pueden explicar los 2 resultados obtenidos?

Componentes wlulaues y Ckn6Pica moleculau s(n

Una vez esclarecido el aspecto informacional empleado en el proceso general de expresión de la información genética, cabe discutir los aspectos estructurales y funcionales de las partículas donde ocurre el fenómeno de descodificación, cuyo resultado es la síntesis de una molécula de proteína.

Los ribosomas fueron observados por primera vez con la ayuda del microscopio electrónico por George Palade, en 1955, por lo que algunos autores aún los siguen llamando gránulos de Palade. Con posterioridad se ha podido demostrar la presencia deéstos en el citoplasma de todas lascélulas animales y vegetales, hongos y bacterias, así como en algunos organelos citoplasmáticos, especialmente los cloroplastos de las células vegetales y las mitocondrias.

Los ribosomas son los más abundantes de los componentes celulares. En una bacteria en fase de crecimiento activo pueden encontrarse cerca de 20000 ribosomas, los cuales contienen aproximadamente el 10 % de las proteínas y el 80 % del ARN celular. En eucariontes la proporción de proteínas es menor, pero mayor su número absoluto, y contiene la mayor parte del ARN celular.

: Los rihosomas bacterianos se encuentran unidos al ARNm que a su vez está unido al ADN. En el citoplasmade los eucariontes los ribosomas están comúnmente asociados al citoesqueleto y en ocasiones a membranas del retículo endoplasmático; todo esto significa que durante la traducción no están libres en las células, sino asociados directa o indirectamente con alguna de las estructuras celulares.

El interés en el estudio de los ribosomas no radica sólo en su participación en la síntesis de proteínas, sino además, en el proceso de su propia formación a partir de sus componentes molecnlares. También es de interés la interrelación funcional que se establece entre sus componentes, que se manifiesta en el hecho de que, ellos por separado, no pueden dar cuenta de ninguno de los principales eventos que tienen lugar cuando todos están organizados en la forma adecuada.

Los avances tecnológicos alcanzados en los años que van desde mediados de la década de los 60 basta nuestros días, han permitido comenzar a desentrañar la estructura molecnlar de los ribosomas, la organización tridimensional y la biogénesis, así como han posibilitado una primera aproximación a la relación estructura-función de estos organelos.

Este capítulo comenzará por el estudio de los rihosomas bacterianos, especialmente los de la E. coli, lo que servirá de referencia para la comparación con los de otro origen. Los aspectos funcionales de estas partículas, sin embargo, sólo serán completamente comprensibles después del estudio del capítulo siguiente.

Primeros indicios

La historia del conocimiento de los rihosonias se remonta al descubrimiento en los primeros años de la década de los 50, de que la capacidad de diversos tipos celulares para sintetizar proteínas se relacionaba con el contenido celular de ARN, y quelamayor proporción de éste aparecía en forma de pequeñaspartícnlas (queentonces denominaron microsomas) en el citoplasma celular; esto sugería que las partículas debían intervenir de alguna forma en la síntesis de proteínas, pero la importancia real de los ribosomas sólo se puso de manifiesto después de algunos años de intensa investigación bioquímica.

El trabajo principal fue desarrollado por Paul C. Zamecnik y otros, quienes añadían a homogenatos de hígado de rata, aminoácidos marcados con "C y ATP como fuente de energía para lograr detectar la formación de pequeñas cantidades de proteínas. Mediante un proceso de eliminación llegaron a establecer que varios organelos celulares, entre ellos el núcleo y las mitocondrias, no eran necesarios para la síntesis de proteínas, pero que los ribosomas eran esenciales. También lograron identificar otros componentes esenciales para la síntesis de proteínas, entre ellos, los ARNt y la enzima que une los aminoácidos a los ARNt correspondientes. Estos sistemas, sin embargo, producían una escasa cantidad de proteínas. Los avances posteriores se llevaron a cabo con los trabajos presentados por Marshall W. Niremberg y J. Heinrich Matthaei, acerca de los sistemas libres de células, descritos en el capítulo anterior.

A partir de ese momento se comenzó el estudio intensivo de los ribosomas, la separación y la caracterización de sus componentes, la función de cada uno de ellos en la traducción, el ensamblaje de la partícula y su regulación, que son los aspectos que se tratan a continuación.

Composición molecular

Los ribosomas de la E. colise han estudiado con mayor intensidad que los de cualquier otro organismo; al ser analizados en la ultracentrífuga presentan un coeficiente de sedimentación de 70 S, con un peso de partícula de 2 520 kD y están constituidos por 66 % de ARN y 34 % de proteínas.

Esta partícula puede ser disociada en 2 subunidades de tamaño desigual. La menor presenta un coeficiente de sedimentación de 30 S, se le conoce como subunidad 30 S, con un peso de 930 kD; está formada por una molécula de ARN de 16 S que tiene un total de 1 541 nucleótidos, para un pesomolecular de560 kD, lo que representael60 % del peso de la subunidad, el 40 % restante lo constituyen 21 proteínas con un peso total de 370 kD, que se han designado S1 a S21 para indicar que pertenecen a la subunidad menor (small, pequeño) del ribosoma.

La subunidad mayor presenta un coeficiente de sedimentación de 50 S, se le conocecomo subunidad 50 S, con un peso de partícula de 1590 kD; está formada por 2 moléculas de ARN, una de 23 S que contiene 2 904 nucleótidos y otra de 5 S que contiene 120 nncleótidos, que en total representan 70 % del peso de la partícula, el 30 % restante lo constituyen 31 proteínas designadas L1 a L34 (large, grande). Aun- que se considera que hubo un error en la asignación inicial de los números a las proteínas, aún se sigue usando la numeración del 1 al 34. El cuadro 29.1 resume los aspectos principales de la coinposición de los ribosomas procariontes.

Cuadro 29.1. Composición molecular de los ribosomas de procariontes y encariontes

Propiedad Ymcanontes Eucariontes

Subunidad mennr Peso molecolar 0,9 x 10' l,44 x 10'

ARN 16 S 18 S Peso molecular 0.51 x 10' 0,7 x loL

Proteínas 21 35 Pesomolecnlar 8 300 - 25 800 11 200 - 41 500

Peso total de proteínas O39 x 10" 0,74 x 106 Sedimentación 30 S 40 S

Subunidad mayor Peso molecular 1,s x 10"

ARN tipo/peso 5 S/ 40 O00 23 S/0,98 x 10"

Peso total de ARN 1,02 x 10' Proteínas 32

Peso molecolar 5 300 - 24 600 Peso totaide proteínas 0,78 x 10' Sedimentación 50 S

Se ha podido establecer, tanto la secuencia de bases de los 3 ARNr como la de aminoácidos de las 52 proteínas ribosomales. Por análisis de secuencia de ARNr de diferentes orígenes se han elaborado los modelos correspondientes de estructura secundaria de cada uno de los ARNr de la E. coli. En general se observa gran conserva- ción en la secuencia y la organización consiste en la alternancia de zonas pequeñas apareadas y no apareadas (Fig. 29.1).

Fig. 29.1. Estructura secundaria del ARNr de 5 S. Como se muestra en la figura para el ARNr de 5 S los de- más ARNr muestran una estruetu- ra, caracterizada por la alternancia de zonas cortas de apareamiento y zonas de no apareamiento también cortas.


En cuanto a las proteínas no parecen presentar relación estructural alguna según su secuencia aminoacídica y sus propiedades inmunológicas. Existen 2 excepciones: la S20 es idéntica a la L26. en el 80 % de los casos se aísla asociada a la snbunidad menor, pero en algunos casos aparece en la mayor reflejando posiblemente que se localiza en la zona de unión entre las 2 subunidades. La L7 difiere de la L12 sólo por presentar un grupo acetilo unido al grupo amino terminal. Esta proteína, designada L7kl2, forma dímeros en solución, por lo que existen 2 dímeros por ribosoma. Todas las demás proteínas están presentes en una copia por ribosoma, lo que significa que todos los rihosomas de una bacteria tienen exactamente la misma composición.

Estructura tridimensional

El modelo asimétrico es el más aceptado como conformación general del ribosoma de la E. coli, en el cual la partícula 70 S aparece más o menos redondeada con un diámetro aproximado de 23 nm.

La subunidad menor es una partícula asimétrica alargada hacia los polos, con dimensiones aproximadas de 23 x 11 nm, ésta se presenta dividida en 2 partes desigu'a- les por una especie de depresión. La menor, recibe el nombre de cabeza y ocupa el tercio superior; la mayor; se designa como base, de la cual sobresale una pequeña porción denominada plataforma, que estáseparada de la cabeza por una hendidura. La distribucióndel ARN y las proteínases aproximadamente concéntrica, pero no homo- génea, pues las proteínas están hacia la periferia y el ARN, que tiene una disposición en forma de V, está hacia el centro. Este modelo que aparece representado en la figura 29.2 (a) hasido confirmado con numerosas pruebas experimentales.

La snbunidad mayor consiste en un cuerpo principal de forma hemisférica con un diámetro aproximadode 23nm que tiene3 protuberancias que difieren en su forma y tamaño: una protuberancia central redondeada y 2 laterales; una de ellas tiene forma de varilla y contiene las proteínas L7/L12 y se extiendede 8 a 12 nm haciaun lado de la partícula; la protuberaiicia del lado opuesto es más bien redondeada y se caracteriza por la presenciadela proteína Ll. En una proyección perpendicular a la protuberancia L7/L12 aparece una muesca o depresión en la superficie de la partícula. Ladistribu- ción de los ARN (hacia dentro) y las proteínas (hacia afuera) es más homogénea que en la subunidad 30 S; sus rasgos esenciales se recogen en la figura 29.2 (b).

En el rihosoma 70.9 lasubunidad menor está colocada asimétricamentesobre la mayor,lo que permite que la plataformade la 30 S entreen contacto con la subunidad 50 S, ya que la depresión entre la cabeza y la base de la subunidad menor queda alineada con la muesca de la suhunidad mayor como se representa en la tigura 29.2 (c).

Localización de los componentm

Muchas de las proteínas y algunas wnas de los ARNr, que componen los ribosomas, han sido localizadas mediante diferentes procedimientos de los cuales los de mejor resultado han sido los métodos inmunológicos asociados con la niicroscopia electróni- ca, la dispersión neulrónica y la formación de enlaces cruzados. A continuación se expone una versión simplificada de cada uno de ellos, sus especificaciones, así como algunos de los resultados obtenidos.

Para el primero se procede de la siguiente forma: se obtienen las proteínas ribosomales,se aislan y purifican,después cad'a una de ellas por separado se utiliza, mediante métodos de inmunizacibn, para obtener anticuerpos específicos para cada una delas proteínas ribosomales. A una suspensión de ribosomasse le añade un anticuerpo específico contra una de sus proteínas y después de dejar que la reacción antígeno-anticuerpo se lleve a cabo, ia muestra se prepara para su observación por microscopio electrónico. Las microfotografias muestran la posición del anticuerpo

El método dediFpemión neuhónica permitegtudiar la estnictura interna del ribosoma Si una bacteria se hace crecer en un niedio que contenga agua pesada \que contiene driiterio. isíotopu pkwdu del Iiidrúgcnu > lJ,O),sus protein&\ilas ribusi>malr\) conlen- drán el isótopo. Se procede entoncesa reali&la reconstnicción del ribosoma, utüizando proteínas ligeras (que contienen hidrógeno) combinadas con 2 proteínas pesadas (que contienen denterio). Una vez reconstmidos los ribosomas, se les hace incidir un haz de neutrones que al atravesar la partícula se dispersa. El ángulo de dispersión es diferente parael hidrógeno y paraeldeuterio,sisemidesepuededetenninaraqué&tanciaestán las proteínas pesadas dentro del ribosoma. Repitiendo la experiencia wn okas proteínas se puede ir ubicando la posición relativa de cada una de ellas. (Fig. 29.4).

Fig. 29.4. Resultados de la dispersión neutrónica. Se muestra erqueniá- tieanientc 1"s resultados del m&>- du dc dispersión neutrónica apli- cado a la suhunidad 30 S del nhosoma de la E. ceoli.

La formación de enlaces cruzados se realiza tratando los rihosomas con algún reactivo que pueda formar enlaces covalentes entre grupos cercanos (el más empleado es el 2-imino- tiolano); después las partículas son disociadas en sus componentes y por métodos electroforéticos se identifican los componentes que resultaron unidos por el agente entreemzador. Este método permite conocer las moléculas que están más próxi- mas unas aotras. Variandolas características del reactivo se pnede aumentar la distancia entre las proteínas qne resultan unidas. Por métodos similares puede conocerse la disposición de diferentes sectores de los ARNr; este procedimiento ha sido de suma importancia para cnnocer las moléculas que se encuentran ubicadas en la superficie de contacto entre las 2 subunidades (Fig. 29.5).

Fig. 29.5. Resultado de los experimentos de cntreiruzamicnto. A partir de los resultados obtenidos con los reactivos de entrecruzamiento se ha construido este esquema de la suhunidad mayar del ribosonia de la E. crili. Nótese las amplias relaciones estructurales de la proteína 1.2 y las escasas de L9 y L25.

Utilizando estos 3 procedimientos se ha podido localizar la posición de muchas proteínas en las 2 subunidades y además algiinos sitios funcionales, por lo que se ha podido determinar que las proteínas S3, S7, S10, S14 y S19 están en la zona de la cabeza; S4, SS, S8 y S12 en la depresión que separa la cabeza de la base, y S6 y S11 en la plataforma. La protuberancia central contiene la L18 y los 2 extremos del ARN 5 S, las 4 moléculas de L7L12 están en la rama de la derecha y la L1 y L9 en la cresta de la izquierda.

Por procedimientos diferentes se han podido conocer algunas de las zonas de interacción entre los ARNr y las proteínas (Fig. 29.6).

Extremo 3'iicl5S

Extremo 3del 23s

Dominios funcionales

Los ribosomas de todos los organismos presentan en general 2 regiones funcionales: la traduccional y la de salida o secrecibn; ubicadas en lugares opuestos. El dominio traduccional incluye la cabeza y la plataforma de lasubunidad menor, asícomo la protuberancia central y las laterales de la subunidad mayor; es en este dominio donde han sido localizados varios sitios funcionales (Fig. 29.7).

Fig. 29.6. Laralizaiiún de los ARNr. Se muestran algunos sectores de los ARNr que han sido localizados por diferentes procedimientos en la suhimidad menor (izquierda) y la mayor (derecha) del fibosoma de la E. coli.

Fig. 29.7. I>oiiiinios en el ribosenia. Los ribosoinas presentan 2 dominios distinguibles: d traduciiunal que aparece en la parte supcrior de la línea disrontinua y el de salida o secreción que aparece en la inferior. La figura muestra la iinión al dominio traduecianal de los ARNt y proteínas que intrrviencn en la traducción (P), así como d dominio de secreción unido a menihra- nos celulares hacia donde está sa- liendo el polipGptido recién sintetizado. El ARNm~re representa en rojo.

Componenoes celulares y Gen6tica molecuiar 515

Durante la traducción existe una especialización funcional de las 2 subunidades, mientras en la de 30 S se produce el reconocimiento codon-anticodon, en la subunidad 50 S es donde se produce el enlace peptídico que unirá los aminoácidos durante la síntesis de las proteínas. Para la actividad ribosomal es necesario que las 2 subunidades se encuentren unidas, pues la unión de ellas permitela formación de los sitios funcionales del ribosoma como el P o peptidil, el A o aminoacil y el E o de salida. La función de estos sitios en la síntesis de proteínas se estudiará en el capítulo siguiente.

El sitio de unión de los aminoacil-ARNt está localizado en la zona de lacabezade la subunidad 30 S donde se ubican las proteínas S3, S10, S14 y S19, así como las S4, S5,S8 y S12. En esta misma zonaesdondese unen otras proteínas queson necesarias durante el proceso de traducción (capítulo 30), también se encuentran los sitios de unión a los factores de iniciación 1,2 y 3, y los factores de elongación FE-Tu y FE-G (Fig. 29.8).

FE-Tu FE-G l 1 FI- 1.2.3.

Fig. 29.8. 1,ocalizaciiin de interaeeión con proteínas no rihosomales. Se representa la zona de interardón de la subunidad menor ion algunas proteínas no rihosomales que participan en la iniciación de la tra- dueeiiin. Para una explicaciiin más detallada ver el rapitulo siguiente.

Diferentes experimentos indican que la proteína S11 participa en el reconocimiento codon-anticodon, luego este evento ocurre en la plataforma que es donde se localiza dicha proteína. El extremo 3'-OH del ARNr de 16 S interactúa durante la iniciación de la traducción con el extremo 5'-P del ARNm y también está uhicadi~ en esta zona.

La protuberancia derecha (L7L12) dela subunidad mayor está implicada en la bidrólisis de GTP a la cual seencuentra acoplado el proceso de traducción.

Por último, existen evidencias de que la proteína L27 está relacionada con la actividad de formación de los enlaces peptidicos. La localización de esta proteína entre la protuberancia central y la izquierda (Ll),cercana a la plataformade la 30 S. hace suponer que es en este sitio donde se lleva a cabo la unión de los diferentes aminoácidos.

Si el dominio traduccional está bastante hien conocido, todo lo contrario sucede con el de salida o secreción. Pocas proteínas (L7 y L19) han sido localizadas en esta zona, por donde la cadena polipeptidica recién formada abandona al rihosoma.

Biogénesis de los ribosomas

Para la formación de los ribosomas es necesario la presencia simultánea de todos sus componentes, las 3 moléculas de ARNr (5,16 y 23 S) y las 52 proteínas. Como se estudió en el capítulo 27, los ARNr de la E. coliestán codificados en el ADN en forma continua y se transcriben al um'sono en un precursor de gran tamaño, que es profesado hasta que cada uno alcanza su forma defmitiva. La E, colitiene 7 copias de estos genes.

j También los genes que codifican proteínas nbosomales se encuentran organiza- d~ en grupos (operones) y varias de estas proteínas se transcriben en un solo ARNm policistrónico. Estos grupos de genes se encuentran localizados en diferentes sitios del cr*osoma bacteriano; se han descrito 7 operones que controlan la síntesis de las proteínas ribosomales (Fig. 29.9).

Fig. 29.9. Operones de las proteínas rihosamales. Las proteínas rihosomales están codificadas en 7 segmentos de ADN de longitud variahle. Cada unode ellos s i transerihe en un solo ARNm que se traducv secueneialmente. A, B y B' representan subunidades a, y P', res- peetivamente de la ARN polimerasa. EF-G y EF-Tu representan proteínas no ribosomales indispcn- sahles para la traducrióii. En rojo apareeen las proteína? que cantro- lan la expresión de rada uno de las fragmentos (aperones).

Las subunidades ribosomales se han podido reconstruir a partir desus componentes purificados, con lo cual se pretende conocer el orden exacto en que cada uno de los componentes es integrado en la formación de la partícula.

Todo el sistema de síntesis de los ribosomas está sometido a un fino y complejo control que será analizado detenidamente en un capítulo posterior.

Los ribosomas del citoplasma de los eucariontes son de mayor tamaño que los de procariontes con un coeficiente de sedimentación de 80 S con un peso de partícula de 4420 kD y están constituidos por 60 % de ARNr y 40 % de proteínas.

La subunidad menor presenta un coeficiente de sedimentación de 40 S con una masa de 1 400 kD y está formada por una molécula de ARN de 18 S que contiene 1 900 nucleótidos, con un peso total de 700 kD que representa el 50 % de la partícula; el 50 % restante corresponde a unas 35 proteínas con un peso total de 700 kD.

La subunidad mayor -de 60 S y un peso de 2 820 kD-presenta en su composición 3 moléculas diferentes de ARNr,unade 28 S con 4 700 nucleótidos, otra de5,8 S con 160 nucleótidos y la tercera de 5 S con 120 nucleótidos; ellos 3 constituyen e1 65 % del peso de la partícula que incluye además unas 50 proteínas. En la figura 29.1 se recogen los principales aspectos de la composición molecular de los ribosomas eucariontes.

La complejidad estructural de estos organelos hace que su estudio no esté tan avanzado como en los procariontes, por lo que no se puede contar hasta el momento con un modelo detallado de su estructnra.

La biogénesis de los ribosomas ocurre en el nucléolo donde se sintetizan los ARNr de 28,18 y 5,s S; el de 5 S se produce en el nucleoplasma. Las proteínas ribosomales son sintetizadas por los ribosomas en el citoplasma y son transportadas al núcleo

Componentes celulus y C k m m & b 517

donde se produce el ensamblaje de las subunidades que más tarde son llevadas al citoplasma donde se forman los ribosomas funcionales de 80s.

En los organelos los ribosomas presentan formas variadas. En las mitocondria$ de encariontes inferiores (hongos) son algo mayor que los de E. coli; en las plantasson algo menores que los del citoplasnia de la propia célula; en los mamíferos sin embargo, son mucho más pequeños con un tamaño total de 60 S y una baja proporción de ARNr (25-31 %).En los cloroplastas los ribosoma tienenun tamaño semejante a los de las bacterias pero con una mayor proporción de ARNr. Ni la composición detallada ni la estructura tridimensional de estos ribosomas ha sido estudiada en detalle.

En los procariontes varios ribosomas se unen a un mismo ARNm formando los polirribosomas o polisomas,éstos pueden estar libres en el «citoplasmaa o unidos a la membrana plasmáüca

En eucariontes la mayona de los ribosomas se encuentran en forma de polisomas y sólo una pequeña fracción se hallacomo ribosomas libres. Es fácildistinguir 2 tipos de polisomas: los que aparentemente están libres en el citoplasma y los que se encuentran unidos a las membranas del retículo endoplaimático, éste es el único tipo de membranas eucanontes al cual pueden unirse los ribosomas.

Los polisomas adheridos forman modelos característicos como asas, rosetas, círculos, espirales e hileras dobles en los que participa un número variables de ribosomas (de 5 a más de 20). En algunos tipos celulares predomina un solo modelo, por ejemplo, espirales en los plasmocitos e Iiileras dobles en los fibroblastos, mientras que en otros hay mezclas variadas.

Los polisomas libres sintetizan principalmente proteínas para el uso de la célula, en tanto la. adheridos lo hacen para la secreción, membranas u organelos membranosai, oero no existen diferencias estructurales entre ellos. La orouorcióo de ribosomas libres . A

y adheridos puede variar notablemente durante la vida celular, una célula exocrina, por ejemplo, Comienza su proceso de diferenciación con una población predominante de pdisomai libres, que elaboran las proteínas necesarias para su crecimiento y repro- ducción, pero al estar completamente diferenciada, presenta casi todos sus polisomas adheridos y sólonnafracción muy pequeña en forma libre.

Resumen

Los nbosomas son los organelos especialuados en la sín- de las proteínas y constituyen un componente universal de todas los orgaoianos celulares.

Los ribosomas procariontes están formados por 2 subunidades de tamaño diferente. La menor o de 30 S tiene un ARNr de 16 S y 21 proteínas., su fnnción fundamental consiste en el reconocimiento don-anticodon. La mayor o de 50 S presenta 2 tipos de ARNI, el de 23 S y el de 5 S y 31 proteinss, su función espeeíñca fundamental es la formación del enlace peptidieo. La partícula funcional o de 70 S es la que funciona d-te la t r a d u d n .

Su estnietura iridimensional se define a partir del modelo asiméirico. La subunidad de 30 S consta de una cabeza, una base y una plataforma, y la de 50 S consta deun cuerpo hemwíérico con 3 protuberancias y una muesca En el ribosoma funcionai la unión de las 2 subunidades conserva el carácier asimétrico.

Empleando técnicas inmunológicas asociadas con la microscopia electrónica, ladispersión ueutrónica y la formación de enlam cruzados se han podido determinar la posición de varios componentes ribosomaies, así como algunos de sus sitios

fqcionales. La mayoría de las localizaciones se han realizado en el dominio trridueeional y muy pocas en el de saüda o secretar.

', La formación de los ribosomas es un proceso complejo que requiere de la pdcipación simultánea de todos sus componentes, para lo cual es necesario la sínmis tanto delos ARNr como de las proteínas. Algo se ha avanzado en los úIomos año$ en la monstrueeión in viho de los ribosomas. ks ribosomas eueariontes son mayores y más complejos. La subunidad me-

nor o de 40 S presenta un ARNr de 18 S y unas 35 proteínas. La mayor o de 60 S tiene 3 ARNr de 28; 5 3 y 5 S y alrededor de 50 p r o t e h . Juntas forman lapart'm- la funcional de SO S.

La estructura de los ribosomas de organelos (mitowndrias y doroplastos) es mucho menm conocida.

En las células los ribosomas se agrnpan formando poüsomas que pueden estar aparentemente libres en el citoplasma, o unidos a membranas formando figuras mcterísticas. Los poüsomas Libres elaboran proteínas Otoplasmáticas, en tanto los adheridos sinteüzan proteínas de Secreei6n o de componentes membranosos.

1. ¿Cómo se evidencia en la estructuración de los ribosomas el principio de organizacion de las macromoléculas?

2. ¿Cómo procederka usted para determinar la posición de alguna de las proteínas que forman parte de los rihosomas?

3. ¿Cuáles son las principales diferencias entre los ribosomas procariontes y los eucariontes?

4. ;Existen algunas diferencias entre los polisomas libres y los unidos a membranas en los encariontes?

5. En el ciclocelular deloseucariontes existe una etapa en que cesa la biogénesis de los ribosomas ;,Puede usted deducir en cuál y por qué?

6. Desde hace tiempo se sabe que la estreptomicina es un inhibidor de la iniciación de la traducción; después se demostró que este antibiótico se une fuertemente a la proteína S12 ;Cuáles son las posibles conclusiones que pueden derivarse de estos 2 hechos?


La traducción constituye la etapa crucial en el mecanismo de expresión de la información genética. Es en este proceso donde tiene lugar la síntesis de la proteína específica que ha de cumplir una función determinada en la célula o el organismo, con lo cual la información contenida en los genes quedará totalmente expresada. En la traducción se realiza el tránsito del genotipo al fenotipo.

La explición de la biosíntek de proteínas en ténninos moleculares constituye por tanto un problema central de la biología molecular. En 1961 es que se obtuvieron los primeros progresos significativos en el estudio de este proceso, a partir de extractos bacterianos que sinteüzaban proteínas activamente. Estudios más recientes en eucariontes permiten afirmar que,en líneas generales, el proceso ocurre deformasimüar en todoslos organismos vivos y que lasmayores diferencias radican en sus mecanismos de control.

El estudio de la traducción incluye 3 grandes aspectos: el informacional o del código, que ya fue estudiado en el capítulo 28; el topográfico o de la estructuración del sistema sintetizador de proteínas, visto en el capítulo 29, y el químico, o sea, el problema concreto de la síntesis de las proteínas, es decir, la iniciación de la síntesis, la unión de los aminoácidos en el orden correcto, la Liberación de la cadena polipeptídica neoformada, la adquisición de su conformación y, en ocasiones, las modificaciones que ocurren simultánea o posteriormente a la síntesis. A este último aspecto esiá dedicado el contenido del presente capítulo.

Como se hizo en los casos anteriores este proceso se estudiará en primer lugar cómo ocurre en procariontes, especialmente en la E. colicorno punto de referencia para el estudio en eucariontes, basado en el sistema de reticulocitos de conejos que es el que ha sido estudiado de forma más completa.

Primeros aportes

A mediados de la década de los 50 Críckpropuso la hipótesis de que no existía una interacción directa entre los aminoácidos v los ácidos nucleicos aue los codificaba v qneera necesariauna molécula adaptadora sin poder precisar nada sobre ella. Esta idea se vio corroborada pocos años después cuando en 1957, Hoaglanddescubrió un tipo de ARN capaz de unirse específicamentecon aminoácidos y que se denominó soluble, pero que más tarde se nombró detransferencia (ARNt).

Un aspecto interesante del problema fue resuelto en una elegante experiencia realizada porHowardDintzW, quien determinóla dirección en quese produce la síntesis. Para ello se utilizaron reticulocitos que sintetizaban hemoglobina activamente. Las célulasse exponían a aminoácidos marcadoscon 'H durante diferentes períodos, que siempre eran

Fig. 30.1. Colinealidad ARNm proteína. A medida que el ARNm se va leyen- do en el sentido 5 ' -->3 ' , la rade- na polipcptidiia se va sintetizando desde el extremo N-terminal hacia cl extrcnio C-terminal; dc esta forma la posición de tos aniinoáeidos en la cadena polipeptídica queda determinada por la posición de los eodoncs correspondientes en el ARNm.

menores que el requerido para la síntesis de la proteína. La hemoglobina se extraía y se separaban las cadenas a y fi que eran entonces tratadas con tripsina. A los péptidos resultantes se les medía la radiactividad y se comprobaba que ésta era mayor hacia el extremo carbofico. De hecho había un gradiente de incremento de radiactividad desde el extremo N terminal hacia el C termina1,por lo tanto, esa era la dirección de la síntesis. Los experimentos para dilucidar el código genético ya habían mostrado queel ARNm se leía en el sentido 5 ' -->3 ' .A esta relación entre la dirección de lectura del ARNm y la de síntesis de la cadena polipeptídica se le denomina colinealidad.

Otro hecho sobresaliente fue puesto al descubierto en el laboratorio de Frederick Sanger, quien dejó establecido que existe un codon específico para la iniciación y que éste es leído por un ARNt específico que difiere estructuralmente del resto de las moléculas del mismo tipo.

Sangertambién pudo determinar que este ARNt era cargado con la metionina y que a ésta se unía un gmpo formilo, formando la formilmetionina, primer aminoácido que era incorporados la síntesis de proteínas.

El interés por los mecanismos de síntesis de proteínas es tal, que son muchos los hombres y los laboratorios que han realizado aportes al esclarecimiento del proceso hasta el nivel en que se encuentra en nuestros días.

Características generales

La traducción tiene lugar en un organelo citoplasmático específico (los rihosomas) y se produce forma unidireccional desde el extremo N terminal hacia el C terminal, colinealmente a la lectura del ARNm (Fig. 30.1). Tiene carácter gradual y repetitivo, pues los aminoácidos van incorporándose uno a uno mediante el mismo mecanismo. También posee carácter acoplado, pues la energía necesaria para el proceso proviene de la hidrólisis de nucleósidos trifosfatados. Tiene carácter dirigido, pues el orden que los aminoácidos ocupan en la cadena polipeptídica está determinado por el orden de los codones en el ARNm.

Para la realización de la traducción se requiere de más de 200 macromoléculas y hanscwe a una velocidad promedio de unas 10 aminoácidos incorporados por segundo.

,y.---- \

En el estudio de la traducción se considerarán de manera secnencial las mismas etapas que en los procesos anteriores, o sea, los eventos previos a la iniciación, la iniciación, la elongación, la terminación y los eventos posteriores a la terminación.

Eventos previos a la iniciación

Se tomará como evento prelio a la iniciación el proceso mediante el cual los aminoácidosson unidos enzimáticanieiite a su ARNt especuieo y que recibeel nombre de activación de aminoácidos.

La formación de un enlace peptídico entreel grupo carboxilode un aminoácido y el grupo amino de otro es tem~odinánucamentedesfavorahle. Además, los aminoácidos por síno pueden reconocer los codones sobre el ARNm y ordenarse en la forma adecuada, estos 2 obstáculos son salvados por la reacción de activación.

Lae~quecataliiaestareacuónfueaislada por primera vezafinales deladécada de los 50 a partir de extractos de hígado de rata, y ha ido recibiendo diferentes nombres hastalaactualidad en que seconoce con elnombre genéncodeaminoacil-ARNt sintetasa

Esta enzima constitnye hasta el 10 % de las proteínas celulares, lo que equivale de unas 1 000 a 5 000 moléculas por célula con sus variaciones de acuerdo con el estado de la actividad celular.

Hasta el momento se conoce que en las bacterias existe una enzima para cada uno de los 20 aminoácidos. Cualquier modificación del aminoácido ocurre con posterioridad a la acción de la enzima. Como un aminoácido puede ser unido a más de un ARNt (especies isoaceptoras) debe existir en ellos alguna analogía estructural que le permita ser reconocidos por la misma enzima.

Las aminoacil-ARNt sintetasas constituyen una familia de enzimas que estmcturauiiente pueden clasiñcme en 3 gmp: tipo 1,consisten en e h a s monoméneas fi>rm;idas por una U I L I i:ulrn;r pdipcplidira de 110 a 121) kD. como las acth ante\ de s,alinae iwlcucinadcla I.^cr1l~tipoll,fi1n~~~p1r2suhiinidUdnHli.i1tica\de 1Mla IWI kl). mmolasdepmlina,tr¡ptófanoy metioninadelaE &,y tipom,fonnadaspor4nibunidades iguala 2 a 2 de aproximadamente 280 kD, como de la fenilalanina de la E. d i .

Todas ellas catalizan la esterificación de un aminoácido al ARNt correspondiente, lo cual se conoce generalmente como «cargar» el ARNt Para simbolizar al ARNt específico para un aminoácido, por ejemplo para la alanina, se escribe ARNt"'" y para señalar con cuál aminoácido está cargado se escribirá Ala-ARNt, por lo que la escritura completa sería Ala-ARNP. Es importante recordar esta notación pues en ocasiones, se utilizan con fines experimentales ARNt cargados con un aminoácido diferente al que le corresponde y la notación ayudará a distinguir de qué se trata en cada caso.

Los estudios sobre el mecanismo de reacción hacen posible su separación en 2 etapas, la primera, llamada de activación propiamente dicha, y la segunda, de transferencia; ambas etapas son reversibles (Fig. 30.2).

N"i

Fig. 30.2. Activación de los aminuácidos. Los aminoácidos son unidos en una primera etapa al fosfato a dcl ATP, Comando un aminoaeiladenilato que en una segunda etapa reacciona ron el ARNt correspondiente, transfiriéndole su grupo aminaacilo; ambas etapas de la reaccibn son reversihles y calalizadas por las aminoacil-ARNt-sintft~sas~

En la primera etapa la enzima en presencia de iones Mg2+ transfiere el aminoácido por su grupo carboxilo alfosfata másinterno del ATP,formándoseun enlace anhidrido mixto de alta energía. Esto da lugar a la formación de pirofosfato que abandona la enzima y un aminoaciladenilato que permanece unido al centro activo de la sintetasa. La hidrólisis del pirofosfato favorece el sentido de la reacción.

En la etapa de transferencia el grupo aminoacilo del aminoaciladenilato se transfiere al restoderibosadel extremo 3 ' - OHdel ARNt correspondiente,formándose el aminoacil-ARNt y AMP. Existen 2 familias de enzimas que se diferencian en que una de ellas transfiere el aminoácido hacia el 3 ' -0H y la otra hacia el 2 ' -OH, lo cual depende de la forma en que se produce la unión enzima sustrato. De todas formas el grupo aminoacilo puede migrar del 3 ' al 2 ' , y viceversa, unas 10 000 veces por segundo. Como ya fue expresado, la reacción general es reversible y presenta una constante de equilibrio que varía entre 0,3 y 0,7, dependiendo del aminoácido, de lo que se deduce que el enlace éster del aminoacil-ARNt tiene un contenido energético comparable con el del enlace anhídrido de ácido del ATP.

Del mecanismo expuesto se infiere que las sintetasas poseen una doble especificidad, pues por una parte deben reconocer al aminoácido específico y por otra al ARNt que le corresponde. La traducción correcta del mensaje genético depende en elevado grado de la especificidad deesta reacción, pues no se conoce un mecanismo de rectifi- cación como el de la replicación. De las 2 etapas, la de mayor especificidad es la segunda. Esto se pudo comprobar cuando se utilizó la sintetasa específica para la isoleucina, e incubándola con valina se logró la formación del valil-AMP, pero al añadir el ARNtV" en vez de producirse la transferencia del grupo valilo al ARNt, se estimuló la hidrólisis del valil-AMP.

Casi todos los aminoácidos una vez unidos a su ARNt correspondiente estánen condiciones de unirse a los ribosomas para la síntesis de proteínas, no obstante, existe una notableexcepción. Se trata de aquél que va a servir parala iniciación.

Como ya se estudió en el capítulo 28, el codon de iniciación es el AUG (y en algunos organismos el GUG), que además codifica la metionina. Smgerdescubrió que existen 2 tipos de ARNt""', uno que se emplea en la iniciación, el ARNty, y otro para las posiciones interiores, el ARNt"?. La misma sintetasa cataliza la unión de los 2 ARNt a la metionina, pero el Met-ARNt,"" es posteriormente modificado por la acción de una transformilasa específica que utiliza como donante activado de formilo el N1"formiltetrahidrofolato (FH,), como aparece representado en la figura 30.3. El producto de la reacción se denomina N-formilmetionil-ARNt (fmet-ARNtmh'"). Esta enzima sólo reconoce al ARNt y no al ARNtm, lo cual hace suponer la existencia de diferencias estructurales entre los 2 ARNtM". La formilación de la metionina en el ARNt es esencial para la iniciación de lasíntesis de proteínas. La traducción de ARNm virales añadidos a extractos bacterianos es bloqueada por la adición de trimetiprima, un potente inhibidor de la dihidrofolato reductasa,sin embargo,la inhibición essupri- mida por la adición de N'Uformil-FH, o defmet-ARNt, .

ARN,,--CH. O A R N , , - ~ ~ ~

Fig. 30.3. Reacción d e formilaeión del metionil ARNf iniciador. Una en- Transformilasa

, > zima tronsforniilaaa, que utiliza romo donante d e farmila al y - ( > «F( 1 , , . - 0 OH N1"f<,rmil-tetrahidrofolato, modi- li:,-,, .,.. , . - . , . , ~ : , -,-:, - , z

fica el grupa amino de la metimina ic:i'll_ H unida al AKVt,. Esta reacción es !C'k!.#.

- ~

indispensable para la iniciación de la traducción en procariontes. cil. 'i

r+

Iniciación

La traducción comienza con la formación de un complejo de iniciación 70 S. Los comoonentes one interachían son las 2 subunidades del ribwma. ARNmfmet-ARNt?'" y GTP; se reqiiere además la participación de 3 proteínas llamadas factores de inicia- c i h e identificadassimbólicamente comoFI- 1,FI-2 y FI-3. LosFI-l y FI-3son proteí- nas básicas, relativamente estahles al calor y formadas por una solacadena polipeptídica; el FI-1 con un peso de 8,9 a 9,4 kD y de 21 a 233 M>, el FI-3. Por otra parte el FI-2 es una proteína ácida y termolábil con un peso de 90 a 118 kD.

A continuación se describe la secuencia de eventos que llevan a la formación de este complejo. Para lograr una mejor comprensión se ha dividido en 4 fases Wig. 30.4).

GDP + @ GDP + @

+O+.+' 5' \ --'

Formación del complejo de preinieiauón

En el citoplasma celular los ribosomas se encuentran asociados como partículas 70 S y disociados en un equilibrio dinámico. En concentraciones fisiológicas de Mg" casi todos están asociados. La disociación de los ribosomas se produce por la acción combinada de FI-1 y FI-3. El FI-1 aumenta la velocidad de disociación de los ribosomas, con lo cual se incrementa el número de subunidades 30 S libres a las cuales se une entonces el FI-3 impidiendo su reasociación con las subunidades mayores. Como el complejo30 S:FI-3 es incapaz de unirse a la 50S,de hecho desplaza el equilibrio hacia la disociación, permitiendo la unión de más FI-3. El F1-2 ligado a GTP se une entonces,

Fig. 30.4. Etapa de iniciaci6n. Al disociarse los r ihowinas estimulados por FI-l. éste se une a la suhunidad mcnore impides" rcasoriacióti ion la mayor. El resto de los factores quedan tamhiéii incorporados a la suhunidad menor; entonces puede ocurrir que el Ir-:GTP incorpore al fmet-ARNt, e que el FI-3 incorpore al ARNni. El pase siguiente complcta la incorporación de todos los eomponentcs y la fase se completa al rcincorperarse la suhunidad mayor.

Componentes celulares

en una unión que es altamenteestahilizada por FI-1 y FI-3. Por su parte la unión del FI-1 es estabüizadapor FI-2 y FI-3. En experimentos in iitrose ha mniprobadoquecadafactor por separado puedeunine a la 30 S,perolaprmencia delos 2 restantesestab'üizala unión.

Lus3factores se unen contiyamente y muy cercadelextremo3'-OH del AUNrde 16 S y adyacentes a la zona de unión de la 50 S. A la estructura así formada se le denomina complejo de preiniciación.

Incorporación del fmet-ARNS

El factor directamente involucrado en la incorporación del fmet-AUNt, es el FI-2, lo cual se comprobó en experiencias in vitro donde era el único capaz de lograr la incorporación del ARNt, a los ribosomas, utilizando el trinucleótido AUG como ARNm. El FI-2 es incapaz de unirsea formilnietioninalibre o unida a polinucleótidos, pero lo hace fuertemente a cualquier ARNt cargado con metioninaque tenga bloqueado el gmpo amino. Parece ser que el fmet-ARNt., se une sólo al ribosoma de forma muy débil y elcomplejo FI3:GTP &tabiliza la unión.'La incorporación del fmet-ARNti determinala salida delFI-3 del complejo. Este evento puede ocurrir antes o después del que se describirá a continuación.

Incorporación del ARNm

La incorporación del ARNm se produce por la intervención delFI-3. El ARNm tienc un sitio de unión al ribosoma determinado por la secuencia 5'---AGGAGGU---a' o parecida (secuencia de Shine y Daigarno) enuna posición similar hacia el lado 5'-P del codou de iniciación; ésta se aparea con una zona rica en pirimidinas del extremo 3'-OH del ARNrde 16 S la 5'- GAUCACCUCCUA--3'. Este apareamiento posicionael codon AUG deformaque pueda apareane con el anticodon del fmet-ARN:. El estudio de varias secuencias ha demostrado que la longitud de esta secuencia del ARNm es variable y que el número de pares de bases entre ellas vaiía de 3 a Y; mieniras más pare de bases se f m e n más eficiente es la unión y nienos dependencia existe de la presencia del FI-3. La-mnade unión al rihosoma estácompuesta por las proteínas S7,Sl,Sll,S12, SI8 y S21.

Normalmente la zona del extremo 3'-OH del ARNr de 16s está en forma de una horquilla determinada por el apareamientointracatenariode las ha% que no permiten la unión con el ARNm. La acción combinada del FI-3 y de la proteína S1 logran separar las bandas de la horquilla y permiten la hteracción por apareamientode b a s e n & el AUNm y el ARNr de 16 S.

Formación del complejo de iniciación 70 S

La subunidad 50 S se une ahora y provoca la hidrólisis del GTP mido al FI-2, con lo cual EI-1, FI-2, FI-3,GDP y Pi abandonan el ribosoma y el tinet-AUNt, devieneactivo para la formación del enlace peptídico.

El W P actúa como un modulador alostérico. Si se emplea GDPCP (Fig. 30.5) éste se une al FI-2 y el complejo FI-2 j GDPCP se une al ribosoma, pero no se separa de él al incorporanela 50 S. Si previamente se remueveel GDPCP,e fonna una 70 S totalmente tiuicional,osca,la hidmlisisdel GTPnoesimprescindible para la ubicacióndelfmet-AIZN:, sólopara cambiar el efector de GTP a GDP y con ello variar la conformación del FI-2. Se ha postulado que esto produce a su vez una transconforniación del fmet-ARNt que le permite interactuar con la peptidü transferasa. Este paso se hadenominado acomodación.

Para liberar al FI-2se reuuiere la narticinación del FI-1 en cuvaausencia nila hidrólisis del GTP permite la liberación del FI-2 ni la incorporación de la 70 S. Parece ser que al hidrdizarse el GTP,el El-2 quedaunido al GDPqne dehe intercambiar con el F1-l para ahandonarel ribosoma

Las proteínas L11 y la L7L12 están involucradas en la hidrólisis del GTP. El contac- to enhp FI-2:GTP y la prominencia L7L12 produce en esta Úitima una ~amconfonnación que activala GTPasa unida el ribosoma.

h

Fig. 30.5. Estructura del GDPCP. La figura mucstra las estructuras del GTPy del GDPCPque presenta cómo, en éste último, el grupo fosfato más externo está unido al resto de la molécula por un grupo mrtilcno, por lo cual este compuesto no es hidrolizable romo cl GTP y resdta dc gran utilidad como su análogo.

La etapa deiniciación es la más compleja de todas pero téngase presente que de la adecuada ubicación del codon de iniciación depende que el resto del proceso se lleve a eabo con la fidelidad requerida.

Una vez que se ha formado el complejo de iniciación de 70 S al nivel del codon de iniciación,comienza un proceso de carácter cíclico, en el que cada aminoacil-ARNt se incorpora al sitio A del ribosoma, cuyo sitio P está ocupado por la fmet- ARNt,; se produce la formación del enlace peptídico entre los aminoácidos activados y el mori- mientodel ribosoma hacia un nuevo codon del ARNm con lo cual vuelve a iniciarse el ciclo,ésta es la etapa de elongación. También en la elongación se requierela participación de orotehas esoecíiicas no ribosomales, que se conocen como factores de elongación y se s&bolizan como FE-ni. FE-% FE-G; SU estudio se realizará porfases comoen el caso anterior (Fig. 30.6).

Incorporaa6n del aminoad-ARNt

Al producirse el complejo de iniciación de 70 S, un segmento de aproximadamente 30 nucleótidosdel ARNm queda cubierto por el ribosoma, pero sólo 2 moléculas de aminoacil-ARNt pueden estar en contacto con el ribosoma al mismo tiempo, de ahí que en la síntesisde proteínas sólo intervienen simultáneamente 2 de los 10 codones cubiertos por los ribosonias; cada uno de los aminoacil-ARNt ocupan sitios diferentes en el ribosoma. El únicositio que puede ser ocupado por el aminoacil- ARNt entrante es el sitio A (de aminoacil) o de entrada. Previo a la entrada del aminoacil-ARNt, el sitio expone el codon que corresponde al siguiente aminoácido que debe ser iiicorpo- rado a la cadena polipeptídica.

El codon que representa el último aminoácido que ha sido añadido a la cadena ocupa el sitio P (de peptidil) o donador, donde se localiza el polipéptido que ha sido sintetizado hasta ese momento, o el fmet-ARNt, al inicio del proceso.

El factor que interviene en la incorporación dcl aminoacil-ARNt al sitio A se obiuvo originalmente como una fracción única, a partir de extractos de la E. coliy se IeUamó factor T, que m á ~ tardefueseparadoen2 componentes, uno queera estableal calor y por ello se le Ilanió FE-Ts (la s por stable) y otro que era inestable y se nombró FE-TU (la u por unstahle).

Componentes celulares y Genética molecdar 527

~

Fig. 30.6. Elongaóón. Las 3 ctapns fundamentales de la elongación se repiten de manera continua tantas veccs como aminoácidos tiene la proteína, por eso esta etapa tiene carácter reiterativo. (a) El complejo como queda al final de la iniciación. (b) Se ha incorporada el arninoacil- ARNt al sitio A del ribosoma, que en el paso siguiente (e ) queda unido al aininoaril qiie ocupaba el sitio P. Se produce la transloeación (d) y comienza un nuevo ciclo de elongación.

La formaactiva del FE-Tb esun complejo binario con el GTP, queentonces puede unirse al aminoacil-ARNt formando un complejo ternario, por lo que es probable que la función del nucleótido de guanina sea la de garantizar la conformación adecuada del factor. Como sucede en la iniciación, la hidrólisis del GTPconstituye el mecanismo de variar el efector y con ello su conformación.

La forma activa del FE-Tu puede ser regenerada por EF-Ts, que reacciona con el complejo FE-Tu:GDP y desplaza al GDPal tiempo quese forma un complejo entre los 2 factores FE-Tu:FE-Ts (este fue el que inicialmente se llamó factor T); el FE-Ts es a su vez desplazado por el GTPformándose el complejo FE-ni:GTP, que puede unirse a un nuevo aminoacil-ARNt y el FE-Ts que puede reciclarse (Fig. 30.7).

Las interacciones entre FE-Tu, FE-Ts y GTPson reversibles in Wtro, no así la unión con el aminoacil-ARNt, esto es lo que dirige la reacción en un solo sentido.

El FE-TU es una cadena polipeptídica única de 393 aminoacidos, con un peso molecular de 43 kD y es una de las proteínas más abundantes de la E. coli, pues existen unas 70 000 moléculas por célula, lo que representa el 5 % del total de proteínas celulares. Esto es suficiente Dara ooder ligar el ~ o o l total de aminoacil-ARNt de la - - célula y aproximadamente 10 veces el número total de ribosomas. La cantidad del FE-Ts es aproximadamente igual al número de ribosomas, lo cual implica que la mayor parte del FE-Tu se encuentra en forma de complejos binarios o tern&os.

En la formación del complejo ternario con el FE-TkGTP, la característica estructural más importante del aminoacil-ARNt pareceser el brazoaceptor, aquel donde se une el aminoácido. Los cambios en el nucleótido final de adenina impiden el reconocimiento del aminoacil-ARNt. El único aminoacil-ARNt que no puede ser reconocido por el complejo FE- Tu:GTPes el fmet-ARNti,lo que excluye la posib'idad que la fmet pueda ser incorporada en respuesta a un codon AUG interno. Una razón de este com-

e Fig. 30.7. Ciclo del factor de elniigarión T. 1. El FE-Tu (en azul) unido al GTP

GTP (en rolo) ~ w x e i a n a con el

D ainiriuaeil-,\RNt. 2. El cornplqjo formado se incorpora al rihosoma. 3. E1 GTP es hidrolizado a GDP y ronq>le,io TuIGDP abandona cl ribosanm 1. En ese nionicnto interviene ci FE-% que se une al FE-TU drsplazando al GDP. 5. Con posterioridad el GTP desplaza al FE-Ts; ron lo cual el factor queda eii cuiidiciones para recomenzar el ciclo.

portamiento pudiera ser la estructura del brazo aceptor del ARNti el cual delante del ACCA-aminoacil contiene un C:A no apareado en vez del par presente en todos los demás ARNt. Otro hecho sería la presencia del grupo amino bloqueado, pues se ha comprobado que el bloqueo del grupo amino en otros aminoacil-ARNt impide su unión con el complejo FE-TxGTP.

Estudios con GDPCP han demostrado que la hidrólisis del GTP ocurre con posterioridad a la incorporación del complejo aminoacil-ARNt / FE-Tu : GTP al ribosoma pero, previa a la formación del enlace peptídico, se produce la hidrólisis de un GTP por cada aminoacil-ARNt que es incorporado.

Formaci6n del enlace peptidico

El enlace peptídico se forma en una reacción en la cual se transfiere el gmpo unido al ARNt que ocupa el sitio P (sea un péptido o el fmet) hacia el grupo amino del aminoácido unido al ARNt aue ocuoa el sitio A. catalizada Dor una actividad de peptidiltransferasa presente en la subunidad 50 S del ribosoma. Estudios recientes indican que existe una notable participación del ARNr en esta actividad catalítica, aunque el concurso de proteínas ribosomales no ha sido descartado totalmente.

Aunque el sitio activo se localiza completamente en la subunidad mayor,la actividad puede ser detectada sólo en el ribosoma completo. La necesidad de la subunidad menor puede entenderse como un mecanismo de seguridad que evita la unión azarosa de aminoacil-ARNt por la subunidad mayor solamente.

Unode los problemas aúnno resueltos de lasíntesis de proteínas es laexplicación de cómo es posible que 2 ARNt ligados a codones contiguos puedan localizar sus brazos aceptores lo suficientemente cerca uno de otro para permitir la formación del enlace peptidico, teniendo en cuenta la estructnra hidimensional de los aminoacil-ARNt.

El ciclo de elongación se completa con la translocación, en la cual el ribosoma avanza 3 nucleótidos a lo largo del ARNm. Al formarse el enlace peptídico el ribosoma

Componentes celulares y Gedtica moIecular 529

/' ' 'S\

\, e Fig. 30.7. Cielo del factor de eloiigatión T. 1. El FE-Tu (eii arul) unido al GTP

GTP (en ro)o) reacciona con el

b aininuaeil-.\RNt. 2. El complejo formado se inrorpora al rihnsorna. 3. El GTP es hidrolirado a GDP y romplqio 'I'uIGDP abandona cl rihosonia. 1. En ese niomento in- teniei ie PI FE-Ts que se une al FE-Tu desplarando al GDP. 5. Con posterioridad el GTP desplaza al FE-%, ron lo cual el factor queda en cundiriones para recomenzar el cielo.

portamiento pudiera ser la estructura del brazo aceptor del ARNti el cual delante del ACCA-aminoacil contiene un C:A no apareado en vez del par presente en todos los demás ARNt. Otro hecho sería la presencia del grupo amino bloqueado, pues se ha comprobado que el bloqueo del grupo amino en otros aminoacil-ARNt impide su unión con el complejo FE-'k:GTP.

Estudios con GDPCP han demostrado que la hidrólisis del GTP ocurre con posterioridad a laincorporación del complejo aminoacil-ARNt / FE-Tu ; GTPal ribosoma pero, previa a la formación del enlace peptídico, se produce la hidrólisis de un GTP por cada aminoacil-ARNt que es incorporado.

Formaaón del enlace pept ídi

El enlace peptídico se forma en una reacción en la cual se transfiere el grupo unido al ARNt que ocupa el sitio P (sea un péptido o el fmet) hacia el grupo amino del aminoácido unido al ARNt oue ocuoa el sitio A. catalizada oor una actividad de peptidiitransferasa presente en la subunidad 50 S del ribosoma. Estudios recientes indican que existe una notable participación del ARNr en esta actividad catalítica, aunque el concurso de proteínas ribosomales no ha sido descartado totalmente.

Aunque el sitio activo se localiza completamente en la subunidad mayor, la actividad puede ser detectada sólo en el ribosoma completo. La necesidad de la subunidad menor puede entenderse como un mecanismo de seguridad que evita la unión azarosa de aminoacil-ARNt por la subunidad mayor solamente.

Uno de los problemas aún no resueltos de lasintesis de proteínas es la explicación de cómo es posible que 2 ARNt Ligados a codones contiguos puedan Localizar sus brazos aceptores lo suficientemente cerca uno de otro para permitir la formación del enlace peptidieo, teniendo en cuenta la estructura tridimensional de los aminoacil-ARNt.

El ciclo de elongación se completa con la translocación, en la cual el ribosoma avanza 3 nncleótidos a lo largo del ARNm. Al formarse el enlace peptídico el ribosoma

Componentes celulares y Ckn6tic.m m1ecuiar 529

porta un ARNt descargadoen elsitio P y un peptidil-ARNt en el sitio A. Como parte de un mismo mecanismo, en la translocación se expele el ARNt del sitio P y simultánea- mente el peptidil-ARNt se mueve del sitio A hacia el sitio P. El ribosoma entonces presentaunsitio A no ocupado, que permitirálaentrada del siguiente aminoacil-ARNt En esta fase intervieneel FE-G (la G alude a que liga nucleótidos de guanina) que constituye una de las principales proteinas de la célula con un peso molecular de 72 kD y representa e1 2 % de las proteinas celnlares,lo que hace queseencuentre en cantidad aproximadamente igual al número de ribosomas.

Como en los casos anteriores, se debe formar un complejo FE- G GTP que garantiza la conformación adecuada para la unión al ribosoma y después la hidrólisis del GTP no sólo proporciona la energía necesaria para el movimiento, además cambia la conformación de la proteína permitiéndole abandonar el ribosoma.

Los ribosomas no pueden unirse simultáneamente al FE-Tu, y al FE-G, por lo que la síntesis de proteínas sigue un ciclo en el cual estos factores son alternativamente unidos a, o liberados de, los ribosomas.

Este ciclo de elongación se repite tantas veces como aminoácidos sean necesario incorporar a las proteínas, por lo cual constituye el período de mayor duración de todo el proceso.

Terminación

La terminación de la síntesis de proteínas implica un fenómeno poco frecncntc. pues se trata de la interacción de un codon directamente con una proteína.

Se han caracterizado 3 proteinas que intervienen en la terminación y sedenomi- nan factores de liberación FL. El FL-1 reconoce los codones UAA y UAG, en tanto FL-2, los UGA y UAA y requiere que el peptidd-ARNt se encuentre en el sitio P. Parece ser que los factores de liberación realizan su acción en el sitio A, ya que algunos ARNt mutantes capaces de reconocer codones de terminación compiten con ellos por entrar al ribosoma. El FL-3 estimula la acción de los 2 restantes.

La actividad de los factores de liberación implica la separación de la cadena polipeptídica neoformada y al desensamblaje de todo el aparato biosintetizador (Fig. 30.8).

lhducción en eucariontes

La traducción en eucariontes, como ha sido estudiada en reticnlocitos de conejos, sigue en heas generales elmismo procedimiento queen los organiFmosprocariontes. No obstante, en cada paso se destacan diferencias específicas que vienen dadas principalmente por 3 factores fundamentales:

1. Los ribosomas eucariontes son más grandes y complejos que los procariontes. 2. Los ARNm deeucariontes son casi siempremonocistrónicos,codifican parauna sola

cadena polipeptídica. 3. En el proceso interviene un número mucho mayor de proteínas no hbosomales.

Estos elementos hacen n e d o detenerse en cada etapa para resaltar las principales diferencias, ya que no se cuenta aún con datos completos como en el caso de los prucariontes.

La iniciación es la etapa quepresentamayoresdifemncias. Se handescrito más de 15 pmteínas noribo~malesqueparticipanenlainiciación. Pamsignülcarsuorigeneucarionte se escribe la letra "e'' delantedel símbolo del factor.

Enla formación delpooldesubunidades de 40 S intervienen el eF'I-3 quese uneaeua y el eFI-6 que se une ala de 60 S, y tienen en ambos casasunefecto antiasociante. El eFI- 2:GTP forma un complejo temario con el met-ARNt, (los eucariontes no utilizan formilmetionina) que después se incorpora al ribosoma antes de la entrada del ARNm,por lo cualsu ubicación no depende de unainteracción codon-anticodon. El e n - 3 participa

en la incorporación del ARNm después que ha sido ubicado el met-ARNt,, por un mecanismo diferente a como ocurre en procariontes. El ARNm se une al rihosoma por su extremo 5' donde existe la estmctura del casquete al cual previamente se ha unido una proteína específica. La subunidad 40 S semueve entonces alolargo del ARNm, utilizando la energía de bidrólisis del ATP hasta encontrar el primer codon de iniciación que siemprees el AUG. El eFI-3 contribuye a esta unión al desestahikar la estructura secun- ddadel ARNm que impidesu unión al ribosoma. Cuando se produce launión del codon deiniciación con el anticodondel met-ARy,el ribosoma deja demoverse y entonces por la acción del eFI- 5 se produce la incorporación de la subunidad 60 S impulsada por la hidróKidel GTP.

Los eFI-2, eFI-3 y eFI-5 son imprescindibles para ia formación del complejo de iniciaciónde 80 S, los demás factores conocidos, en-1, eFI-4A, eFI-4B, eFI-4C, eFI-4D y eFi-4F interactuando con los primeros mejoran grandemente la eficiencia del proceso. Los factores Co-eFI-2A, Co-eFI-2B y Co-eFI-2C controlan la formación del complejo t e d o e F I - 2 I GTP 1 met-ARN$

Mención especial merece el eFI-2, éste ha sido purificado a partir de múltiples organismos y en diferenteslaboratorios, presentaun peso molecular de alrededor de 145 kD; se trata de una proteína polimérica formada por 3 subunidades diferenies, la a con peso de 35 a 38 kD; la P, de 52 a 56 kD, y la y, de 48 a 52 kD. La subunidad u liga GTP con baja afidad,pero GDP con a f idad muy elevada y puede ser fosforilada por una proteína quinasa independiente de AMPc que es estimulada por la deficiencia de p p o s hemos en el reticulocito, los ARN de doble hebra y el interferón,conlo cual se inactivael factor y se inhibela iniciación. La P puede ser fosforiladapor la caseína quinasa II pero esta modifi- cación no altera su funcionamiento. La y no es fosforilada por ninguna de las quinasas anteriores y es la que se une al met-ARNt,.

Fig. 30.8. Tcrniinación. Al aparecer cn el sitio A el codo" de termiiiaeióii, el factor de liberaiiiin interacriens directamente ion el ARNm y dc- termina no súlo la separación de la prateiiia neoformada, sino adeniás. la dcrurganiraribn de todo el sistema sintetirador.

Componentes celuiares y Genética molecuiar 531

Como la afinidad del eFI-2 es mayor para el GDP (que favorecela conformación inactiva) que para el GTP (que favorece La activa), es necesaria la participación deotra proteína denominada eFI-2A para realizar el intercambio GDPIGTP, pero su mecanismo es desconocido.

Las fases de la elongación son iguales a las descritas para los procariontes. La incorporación de los aminoacil-ARNt se lleva a cabo con la formación previa de un complejo ternario aminoacil-ARNt:GTP:eFE-la que, al posicionarse en el ribosoma, provoca la hidrólisis del GTP y libera el complejo binario eFE-1a:GDPque se activa con la participación del eFE-lb; estos 2 factores, además de eFE-ly de función desconocida,suelen agruparse formando un complejode elevado peso molecular quese ha denominado eFE-1.

La incorporación del aminoacil-ARNt va seguida de la formación del enlace peptidim. La translocación se produce por la participación de eFE-2 una proteína de 100 kD que unida al GTPse asocia al ribosoma y provocasu desplazamiento. Es interesante que este factor seamodificado por la toxina diftérica que transfiereel grupo ADP-ribosadel NAD' a un resto de histidina modificado de la proteína, con lo cual se producen su inactivación y la inhibición de la elongación. Se ha descrito la existencia de un eFE-3, que es una proteínade 125 kD conactividadesde GTPasa y ATPasa quesonimpreseindibles parala elongación, pero su función específica no se ha determinado.

En eucariontes existe una sola proteína que actúa como factor de liberación (eFL) que está compuesta por 2 subunidadrq idénticas de 55 kD. Para unirse al sitio A donde aparece el codon de terminación forma un complejo con el GTP, cuya hidrólisis parece ser el últimoevento dela terminación, necesario para ladisociación de todo el sistema sintetizador de proteínas.

Posterminación

La cadena polipeptídica formada en el ribosoma suele experimentar modificaciones que pueden producirse simultánea a su formación (modificaciones cotraduccionales), o una vez que ha sido liberada del ribosoma (modificaciones postraduccionales), que dan lugar a la forma definitiva y funcional de la proteína.

En los procariontes el grupo formilo de laformilmetionina es eliminado antes de terminar la traducción por la acción de una desformilasa específica, y en ocasiones, tanto en procariontes como en eucariontes, enzimas del tipo de las aminopeptidasas catalizan la separación de varios aminoácidos a partir del extremo N terminal. La eliminación de los aminoácidos parece estar influida por los aminoácidos que ocupan las posiciones siguientes: la metionina permanecerá como primer aminoácido, si el aminoácido que ocupa el segundo lugar es arginina, asparagina, ácido aspártico glutámico, isoleucina o lisina; mientras que será separada si los aminoácidos que ocupan el segundo lugar las alanina, glicina, prolina, treonina o valina. Frecuentemen- te el grupo aminoterminal así formado es acetilado por acción de transacetilasas.

Algunas cadenas laterales de los aminoácidos son modificadas, por ejemplo, durante la síntesis del colágeno se produce la hidroxilación delos restos de prolina y de lisina; tambiénsonesterificadosgrupos fosfatos arestos de serina, tirosina y triptófano de numerosas proteínas.

Los gmpos prostéticos son añadidos a las proteínas como el hemo de la hemoglobina y como los cofactores que se unen de forma covalente a la enzima como la biotina, el FAD, etcétera.

Un evento postraduccional importante es la formación de los puentes disulfuro entre 2 cisteínas que contribuyen a la estructura tridimensional de muchas proteínas.

La cadena proteínica puede ser bidrolizada en diferentes puntos como sucede con los zimógenos del tubo digestivo, como el pepsinógeno, el tripsinógeno, etcétera, que parecen ser formas de almacenamiento de la enzima y que sólo alcanzan su estado funcional en el momento de su acción.

La proinsulina es hidrolizada con la liberación de un segmento polipeptídico denominado péptido C que se encuentra en el centro de la molécula, haciendo que la forma funcional de la hormona esté formada por 2 cadenas polipeptídicas, cuando se ha sintetizado como una cadena polipeptídica única. En la hipófisis se forma una proteína que es procesada mediante proteólisis parcial específica y que puede dar lugar a varias hormonas de acuerdo con la posición de los enlaces peptídicos que son hidrolizados.

El ensamblaje de las proteínas formadas por subunidades también se produce después de la traducción. Este ensamblaje parece ser más sencillo en procariontes, donde en muchos casos todas lassubunidades de una aroteína multimérica se forman a partir de un solo ARNm policistrónico y, por lo tanto, se traducen de manera simultá- nea; en los eucariontes cada subunidad se forma a partir de ARNm diferentes.

Distribución de proteínas

En los organismos eucariontes tiene una significación especial el proceso de distribución de las proteínas. Todas las proteínas se forman en los ribosomas pero deben realizar sus funciones en diferentes compartimentos celulares y, en ocasiones deben ser llevadas hacia el exterior de las células. Las proteínas que permanecen en el citosol, así como las destinadas a las mitocondrias, los peroxisomas y el núcleo son sintetizadas por ribosomas libres; las destinadas a otros compartimentos o hacia el exterior se sintetizan en nbosomas unidos a las membranas del retículo endoplasmático. A manera de ilustración se describirá el tránsito de proteínas a través de los sistemas membranosos de lacélula, entre otras cosas por ser el mejor conocido.

Las proteinas que deben ser procesadas en el retículo endoplasmático se forman en un estado de preproteína, pues contienen hacia su extremo N terminal un pequeño péptido de 22 a 30 aminoácidos denominados péptido señal. Cuando este péptido ha sido traducido es reconocido por un complejo nucleoproteínico conocido como partí- cula de reconocimiento de la señal que está formada por un ARN de aproximadamente 300 nucleótidos y 6 proteínas de diferentes tamaños. Esta partícula actúa también sobre el ribosoma, bloquea la traducción y posteriormente transporta los ribosomas hacia las membranas del retículo, transfiriéndolos a una proteína receptora quees parte integral de la membrana. La unión del ribosomaa su receptor recluta haciaesazonaa un grupo de proteínas que se organizan en forma de canal denominado aparato translocador, y hacia el cual es transferido el ribosoma. La unión del ribosoma al aparato translocador se realiza de forma que el dominio de secreción queda en contac- to con la luz del canal, y al continuar la síntesis de la proteína ésta es descargada hacia la luz del retículo (Fig. 30.9).

Formando parte del aparato translocador se han identificado al menos 4 proteínas, todas ellas con actividad enzimática. La peptidasa señal separa el péptido señal del resto de la cadena polipeptídica, en tanto la péptido señal hidrolasa produce la degra- dación hidrolítica del péptidoseñal hastasus aminoácidos constiiuyentes. Las 2 enzimas restantes actúan sobre la cadena polipeptídica en crecimiento. La oligosacaril transferasa cataliza la transferencia de oligosacáridos hacia residuos específicos de serina o asparagina, en tanto, la tiol disulfuro isomerasa cataliza la formación de los enlaces disulfuros y contribuye a la formación de la estructura tridimensional de las proteinas.

Las proteínas que pasan a la luz del retículo contienen pequeñas secuencias aminoacídicas que indican su destino. La presencia hacia el extremo C terminal de la secuencia KDEL determina que la proteína permanezca en el retículo, en tanto la señal KxKx ó KKxx u otras con 2 lisinas dirigen las proteínas hacia el aparato de Golgi. La presencia de manosa-6-P en el extremo de los oligosacáridos orienta las proteínas hacia los ribosomas. Se cree que existe otra señal para las proteínas que forman gránu-

Componentes cslulans y aeddca molacuiir 533

En los eventos previos a la iniciación tiene lugar la activación de los aminoácidos, reacción en la cual se libera AMP por lo que representa un gasto energético equivalente a 2 ATPpor cada aminoácido que es activado. En la iniciación un GTPes hidroüzado cuando el formil metionil-ARNt se incorpora al sitio P. Durante la elongación se requiere un GTP para la incorporación de cada aminoacil-ARNt y otro más para la translocación. Como esta etapa tiene carácter repetitivo, representa el mayor gasto; también en la terminación se consume un GTP.

Para tener una idea real del gasto que el proceso representa se tomará como ejemplo la síntesis de la a-globina que como sesabe tiene 141 aminoácidos. La activación de esos aminoácidos representa un gasto total de 282 ATP. La iniciación y la tennina- ción consumen un GTP cada una. En la elongación harían falta 2 GTP por cada aminoácido, por lo tanto el total sena otra vez de 282 ATP. En total serían 566 molécn- las de ATPpor cada molécula de la w-globina.

Debido a las diferencias entre los componentes del sistema tradnccional en procariontes y eucariontes, los inhibidores del proceso en un tipo de organismo, suelen no serlo en el otro, aunque existen excepciones.

Los principales inhibidores de la traducción son antibióticos que no sólo han tenido valor en el tratamiento de las enfermedades infecciosas, sino también en el esclarecimiento de muchos de los aspectos de mecanismos de la traducción.

La puromicina permitió comprobar la existencia de los 2 sitios funcionales del ribosoma. Este antibiótico actúa como un análogo del aminoacil-ARNt (Fig. 30.101, pero no del fmet-ARNt, lo cual demostró que uno y otro se ubican en sitios diferentes. La adición de puromicina a un sistema de síntesis de proteínas provoca la terminación prematura de la cadena, originando pequeños péptidos de diferentes tamaños.

Fig. 30.10. Mecanismo de acción de la puromicina. Existe una gran similitud estructural entre la puromicina y el aminoaeil-ARNt, por lo que el antibiótico se une al sitio A del ribosoma e impide la entrada del ARNt cargado, provocando la lerminación abortiva de la síntesis de la proteína.

La estreptomicina se une a la proteína S12 e impide la incorporación del ARNti cargado o causa errores de lectura del código, si el proceso está en fase de elongación.

El cloranfenicol inhibe la peptidil transferasa. La eritromicina se une a la subunidad S0 S e impide su reasociación con el complejo de iniciación de 30 S, pero no tiene efecto sobre la elongación (Fig. 30.11).

CHOH

~ i g . 30.11. Inhibidores de la traducción. Los principales inhibfdores de la traducción son antibiátieos, algunos de ellos sólo tienen acción sobre organismos procariontes (*), otras solamenle sobre eueariontes (**) y muy pocos sobre ambos.

Componentes celulares y 'Cicdtica tn~kauiir 535

Resumen

La traducción comtitnye La etapa cm& del proceso general de expresión de la información genética, pues en ella se producen las proteínas cuyas funciones espeúñeas determinan un organismo.

Este proceso tiene lugar en los ribosomas y se produee unidireecionalmente del extremo N-terminal al C-terminal miheal a la l e a del ARNm. Tiene d e - ter gradual y repetitivo y está acoplada a la bidr6Lisis de NTP, para su realización se requieren más de 200 macromoléculas espeúfiq. Para su inmrporación a las protehas los amino6ddos deben ser activados, lo cnai se logra con su unión a los ARNt espeáñeos por enzimas denominadas aminoacil-ARNt-sintetasa

La iniciación consiste en la formación del eomplejo de iniciación de 70 S, para lo cual es necesario la separación de las subunidades de los ribosomas y La unión espeeíñca a la menor del ARNm y del fmet-ARNt,. En esta etapa son necesarias 3 proteínas espeúñcas llamadas factores de iniciación, también se requiere la ener- gía de hiddüsis del GTP.

La elongaaón consiste en la incorporación uno a uno de los aminoad-ARNt determinados por los d o n e s que aparecen sucesivamente en el ARNm y para lo cnai se requieren de los factores de elongación y de la bidr6üsis del GTP.

Durante la terminación almuias nroteínas e s n ~ e a s conocidas como fadores de liberación interaciúan eon el d o n de te&ción y no 8610 determinen el 5nal de La síntesis, sino también el desensamblaje del sistema bioaiiatéom. En muchas d o n e s las proteínas son modiñcadas durante o con pterioridad a la traduc- ción hasta ser totalmente funcionales.

La traducción en eucariontes es similar en iíneas generaies a como ocnrre en p d o n t e s , p e r o existen diferencias sobre todo en el número mayor de proteínas no ribosomales que el pmceso requiere.

Existen numemBos antibiótieos cuyo mecanismo de a d n consiste en inhibir alguna de las fases de la traducción, pero estos antibiótieos han contribuido considerablemente al conocimiento del proceso.

Ejercicios

1. Demuestre que en el proceso de la traducción se cumplen los siguientes principios: a) De los cambios graduales. b) De acoplamiento. c) De interrelación. d) De transferencia de información.

2. ¿Por qué en los experimentos de Nirembergy otms (capítulo 28) se podían utilizar, como ARNm, polinucleótidos que no contenían el codon AUG para la iniciación?

3. ¿Qué significado tiene en cuanto a la fidelidad de copia de la traducción las propiedades de las enzimas aminoacil-ARNt-sintetasa?

4. La enzima nucleósido-difosfato-quinasa cataliza la reacción:

ATP + GDP = ADP + GTP

¿por qué cree usted que la inhibición de esta enzima provoca una inhibición de la traducción?

La recombinación genética es uno de los procesos más importantes en que participa el ADN celular, durante su transcurso se produce el intercambio de grandes segmentos de ADN entre 2 moléculas. Sin el oroceso de la recombinación. los cromosomas fueran una combinación fija de alelos particulares sujetos únicamente a los cambios mutacionales; el lugar de los daños provocados por las mutaciones se agrandaría en muchas veces, pues pasaría del gen al cromosoma; las mutaciones dañinas se irían acumulando hasta anular funcionalmente al cromosoma. Al intercambiar los genes de uncromosoma a otro la recombinación permite la separación de lasmutaciones dañi- nas de las beneficiosas. haciendo nosible la eliminación de las orimeras v la conserva- ción de las segundas. Desde el punto de vista de la evolución, un cromosoma viene a ser algoasícomo "un ave de paso", una asociación temporalde aielos, cuya existencia particular en los grandes períodos evolutivos sería e h e r a .

Exisíen numerosas formas de recombinación genética, teniendo en cuentael modo en que se produce el intercambio de los bloques de ADN y de acuerdo con el tipo de organismo donde se produce. El mecanismo es complejo y no está totalmente escla- recidoni enlos organismos mássimples, a pesar del extraordinarioavance logrado en su comprensión durante los últimos años.

En este capítulo se discutirán brevemente los conocimientos actuales sobre los mecanismos moleculares de la recombinación genética, tomando como referencia el sistema mejor conocido que es el de la E. coli, algunas evidencias experimentales sobreel procesoen eucariontes, la función de la recombinación en la evolución de los seres vivos y por último, se pondrá de manifiesto la aplicación de muchos de los conceptos relacionados con el estudio de la genética humana, sobre todo en el campo de la medicina.

Historia del problema

A pesar de que el gen como unidad del fenómeno hereditario fue descubierto por GregorMendel, quien además estableció las leyes que rigen su segregación, a mediados del siglo XIX, esto quedó casi olvidado hasta principios del siglo XX cuando prácticamente las leyes de Mendelfueron "redescubiertas". Es a partir de ese momento que comienza el desarrollo de la genética. Entre los años 1910 y 1925 Thomas Hunt Morgan y suscolaboradores llevaron a cabo extensos estudios sobre la genética de la mosca del vinagre Drosophila melanogaster; mediante cuidadosas observaciones vi-

suales detectaron más de 100 anormalidades fisicas, debidas a mutaciones en los genes oue se exoresaban en variaciones en el color de los oios. la forma de las alas, las " . antenas, etcétera. Morgan determinó que estos caracteres se segregaban en 4 grupos que se correspondían con el número de cromosomas de la DrosophiIa, introduciendo el concepto de ligamiento para aquellos genes que por estar ubicados en el mismo cromosoma con frecuencia se segregan unidos. Sin embargo, en algunos casos se observaba que los descendientes se apartaban del patrón de ligamiento, esto quiere decir que aparecían caracteres mezclados; a este fenómeno se le dio el nombre de recombinación.

El proceso de la recombinación pudo ser observado durante el estudio microscó- pico de la meiosis de las células germinales, donde los cromosomas homólogos se disponen uno al lado del otro en una estructura denominada sinapsis, y luego se observa la fusión de éstos en determinados puntos denominados qniasmas.

Las experiencias de transformación del neumococo realizada por Fred Griffiths, en 1928, constituyen también un proceso de recombinación genética, aunque en aquel momento no se conocía.

Desde entonces el fenómeno de la recombinación fue observado cada vez con más frecuencia en los estudios experimentales y se obtuvieron numerosos datos acerca de él, tanto cualitativos como cuantitativos, que permitieron la construcción de mapas genéticos basados en la frecuencia de recombinación. Sin embargo el mecanismo inolecular continuaba siendo un misterio.

Un paso significativo fne dado en este sentido cuando en 1964 Rohin HolIida'; a partir de la interpretación de numerosos resultados experimentales, propuso un modelo que satisfacía todos los requerimientos y en el cual desempeñaba una función iiiiportaiite mi intermediario en el que 2 cromosomas recombinantes se mantenían unidos de forma co\ alente. en una región determinada por una conexión entrecruzada formada por el intercambio recíproco de2 de las 4cadenas de las 2 moléculas de ADN que participan en el proceso. Esta estructura se conoce hoy como el intermediario de Hollidaq.

Este intermediario tuvo una comprobación física en 1970, cuando pudo rer visoalizado por microscopia electrónica. En los últimos años estudios con extractos de la E. coli y con productos génicos purificados, que estaban involucrados en la recombinación, han profundizado el conocimiento del proceso al nivel enzimático. Al estudio de la recombinación a este nivel está dedicado el contenido de este capítu- lo.

Tipos de recombinación genética

La recombiiiaciún se expresa en fenómenos diferentes entre los microorganismos que son generalmente Iiaploides y los orgaiiismos diploides. En los haploides siempre se requiere de la existencia de una molécula de ADN extraña o de un segmento de ellaquese traslada de un lugar aotro. En los diploides el intercambiopuedeproducir- se entre 2 moléculas que se encuentran en cromosomas homólogos.

En el proceso de transformación una molécula de ADN que aparece en el medio, por haber sido liberada por otra bacteria, es captada e incorporada al cromosoma bacteriano, determinando la aparición de caracteres nuevos en la bacteria receptora, como sucedió en el experimento de Griffiths. Por su parte la transdncción necesita de un virus como vector, el cual asimila un segmento de ADN de una célula infectada y lo transfiere a otra que lo incorpora a su genoma. Por último, la conjugación se produce por el traspaso directo entre bacterias de pequeñas moléculas de ADN circulares llamados plásmidos. En todos estos casos se requiere la existencia de grandes zonas de secuencias homólogas entre el ADN donante y el aceptor, las secuencias deben ser idénticas o casi idénticas. Debido a este requerimiento estos procesos pertenecen al tipo llamado recombinación homóloga o general.

Un segundo tipo se presenta cuando un virus infecta una bacteria y el ADN viral experimenta un proceso de integración al ADN bacteriano, donde no existe homología entre la secuencia donante y la aceptara, sino que se produce por la presencia de secuencias específicas que permiten que enzimas determinadas las reconozcan, cor- ten y empaten con el ADN viral, este tipo recibe el nombre de recombinación por sitio específico.

En la transposición un segmento de ADN miga de una parte a otra de la molécula o de un cromosoma a otro en los organismos diploides, sin que se requiera la existencia de secuencias homólogas.

En ocasiones se emplea el término de recombinación ilegítima para aquellos casos que no se ajustan a ninguno de los señalados, cuyos mecanismo y requerimientos son desconocidos.

En lo que se refiere a organismos superiores se suele hablar de recombinación sexual para designar aquélla que se produce en las células sexuales, y recombinación somática cuando ocurre en el resto de las células.

Modelo de HoWday

En la figura 31.1 aparece representado el modelode Holliday, éste comprende 2 grandes etapas: la iniciación y la maduración.

Dos dobles hélices homólogas se alínean una al lado de la otra (apareamiento) (A) y cada una de las banda$ es cortada mediante enzima5 en unlugar específico (B),se crea mi extremo Libre que abandona la hebracomplementaria a la cual estaba unida por puentes de hidrógeno, se asocia con la cadena complementaria de la otra molécula (invasión de hebra) (C D) y se establece una ioteracción fisicaentm las 2 moléculas a recombinar. Esta estructura puede estabilizane por la acción de la ADN ligasa que forma los enlaces fosfodiéster correspondientes en cada hebra (E). La hebra invasora puede ir estableciendo cada vez un mayor número de puentes de hidrógenos con la molécula invadida, desplazando a la cadena original (migración de hebra) (F). La estructura así formada recibe el nombmde intermediario de Holliday.

Este intermediario no es estático y su posición puede ir variando en un sentido o en otro por el mecanismo demigración,~ puede rotar sobresu eje cilíndrico (isomerizauón) (G, H) adquiriendo una nueva forma.

Laconstrucción demodelosespaciales ha probado, sorpresivamente, que no existen impedimentos estéricos para la existenciade esaestructura y quecasi todas las basesse encuentran apareadas.

La migración de la hebra puede dar lugar a la formación de zonas heterólogas de ADN,segmentos donde el apareamiento delas bases está alteradocon la formación de áreas que son genéticamente heterocigóticas; éste es uno de los hechos que más ha apoyado el modelo de Holliday.

Estudios teóricos y prácticos han llevado a la conclusión que la velocidad de migración es lo suficientemente elevada como para permitir la formación de zonas hbridas en condiciones fisiológicas.

Dada la simetría de la estructura, la maduración puede ocurrir de 2 forma$, dando lugar a 2 pares de cromosomas recombinantes.

La ruptura de arriba abajo o de izquierda a derecha (1) libera moléculas de ADN de igual tamaño en las cuales pueden existir regiones heterocigóticas, y que los genes que están en los flancos pueden mantenerse en su posición original o con igual probabilidad pudo haberse realizado una recombinación recíproca (J, K).

Este modelo es muy atractivo como mecanismo general de la recombinación porque puede dar cuenta de las propiedades genéticas de cromosomas recombinantes

Fig. 31.1. El modelo general de Hoilidag. El modelo de recombinación propuesto por Hollidag plantea que 2 nioléeiilas de ADN se aparean Val ?seproduieun~orteencadauna de las bandas (b). Los extremos libres invadcn la molécula contraria le y dl, formando piicntcs de hidrógeno can la cadena complementaria. La ADN ligasa sella la brecha (el y se produce la inigra- eióii de la hebra (fl, dando el intermediario de Holliday. Obsérve- se que en este momento existe una zona formada por 4 cadenas de ADN enrollada una sebrc otra. La isomerizarióii por rotación (g g h)

el corte posterior en uii sentido \ci.tieal u horizontal (il daii lugar a 2 moléculas recombinadas ikl. La zona heter6luga o heterorigó- tiea se observa cuando en iin sce- tor de la molécula, una de las cadenas aparece en rojo y la otra en azul.

que se producen en las formasmás complejas deintercambio de genes que se conoce, la meiosis de los eucariontes.

Dos hechos importantes conviene recordar:

1. La recombinación ocurre con la conservación netadel material genético, por cada 2 cromosomas que entran al proceso salen 2 cromosomas.

2. Los cromosomas recombinantes se producen en pares recíprocos, no en general entre la población, sino durante eventos individuales de entrecruzamiento.

Comprobación del modelo

Aunque el modelo de Holliday fue propuesto sobre la base de estudios genéticos en eucariontes, su confirmación se realizó por estudios en procariontes, especialmente en la E. coli.

El genoma de la E. coliestá constituido por una gran molécula circular de ADN y que en el citoplasma bacteriano se encuentran moléculas independientes de ADN también circulares, pero de mucho menor tamaño que reciben el nombre de plásmidos.

Si ocurriera la recombinación entre 2 moléculas circulares de ADN debe formarse una estructura semejante al número 8, como se muestra en la figura 31.2 o una molécu- la doble, dimérica, de acuerdocon el momento en quese observe la estructura.

Este tipo de estructuras en forma de 8 fue observado en el microscopio electrhico a partir de plásmidos extraídos de la E. coli.

Aunque la existencia de la estructura en 8 puede considerarse como una evidencia del mecanismo propuesto, no es suficiente para demostrarlo, pues se pueden obtener estructuras similares por la existencia de 2 círculos concatenados o por 1 solo círculo que se ha torcido sobre si mismo dando lugar a esta imagen. Para eliminar esas posibilidades los extractos fueron tratados con una enzima de restricción que provocaba 1 solo corte en cada una de las moléculas; si se tratara de alguno de los casos mencionadas debía obtenerse 1 ó 2 moléculas lineales de ADN según el caso; si fuera el intermediario de Holliday lo que se está visualizando, el resultado sería una estructura de forma similar a la letra griega chi (x) con 2 pares de brazos de igual longitud. Esta fue la estructura visualizada (Fig. 31.3), con lo cual quedó demostrada la existencia del intermediario de Holliday.

Fig. 31.2. Recombinación de moléculas rir- culares. Cuando las 2 moléculas recomhinantes san circularesexiste una estructura intermedia que recuerda la figura del número 8.

Fig. 31.3. Moléculas circulares recombinadas. Cuando las moléculas circulares recombinadas re tratan can una enzima de restricción, que haga sólo un corte en cada una de las moléculas, se origina una figura similar a la letra griega ehi.

Componentes celulares y Genetica molecular 541

Formaa6n del intermediario de Holliday

Existen 3 modelos fundamentales propuestos para explicar la formación del intermediario de Holliday, con el propósito de ajustar el mecanismo propuesto a los datos experimentales sobre todo en cuanto al grado de heterologíq del ADN recombinado.

El modelo descrito en la figura 31.1 supone que cada una de las moléculas de ADN una vez apareadas son cortadas mediante enzimas en un sitio específico. La hebra que posee el extremo libre invade la otra molécula en zonas de secuencias homólogas y posteriormente el mecanismo de migración aumenta la zona de ADN heterólogo. La brecha existente es sellada por la acción de la ADN ligasa; de esta forma la zona heteróloga es similar en ambas moléculas.

Un mecanismo alternativo (Fig. 31.4) plantea que el corte se produce en una sola hebra de una de las 2 moléculas (Fig. 31.3) y ésta invade la otra molécula en zonas homólogas. Se produce entonces la migración de la hebra mientras que la ADN polimerasa 1 va llenando el espacio que queda en la otra molécula. En algún momento posterior se produce la invasión de la otra molécula y con ello aparece el intermediario de Holliday cuando Las bandas son selladas por la ligasa. En este caso las zonas heterólo- gas son de tamaño diferente.

Fig. 31.4. Modelo de alternativo de reeombinacián. En este modelo una de las cadenas invade a la otra (a, b y e ) y la hebra que queda desapareada es rellenada por la ADN polimerasa 1 (c, d

~ ~ - -

ve). Desoués es aue se oraducc la invasión de la hebra contraria (0 Y el vroceso sigue izual . . . . - . al modelo ya descdto. Obsérvese que en este casa la zona heteróloga es diferente en cado una de las moléeulw recombinadas.

Un tercer modelo se muestra en la figura 31.5, según el cual se produce cierto grado de desnaturalización del ADN en las cadenas apareadas, lo cual posibilita la invasión recíproca de las bandas si existen secuencias homólogas. Se producela mi- gración en los 2 sentidos, para lo cual es necesario la participación de la topoisomerasa 1, originándose 2 zonas de entrecruzamiento que por 1 solo corte dan lugar al intermediario de Holliday. Aquílas zonas heterólogas son iguales en tamaño.

Por estudios con bacterias mutantes se han podido identificar 12 genes involucrados en el proceso de la recombinación, que son principalmente de las fami-

Fig. 31.5. Modelo de recombinación sin corte. Una desnaturalización local permite la invasión reeiproea de las 2 molleulas (b), que +,a aumentando en longitud (e y d). El paso de isomerización por rotación (e y 0 y el corte (g) dan lugar al intermediaria de Holliday (h) que se madura y da 2 moléculas recombinadas, cuyas zonas heterólogas son de igual longitud.

lias rec y ruv. Además, están los relacionados con las proteínas que participan en el metabolismo general del ADN, como la ADN polimerasa 1, la ADN ligasa, las SSB y las topokomerasas 1 y 11.

No todos los genes de la familia rec han podido ser caracterizados con igual profundidad,lo cual supone que el proceso no está completamente esclarecido. Sin embargo, el conocimiento actual permite una buena aproximación al mecanismo molecular del proceso.

Estudios experimentales han demostrado que mutaciones en el gen recA pueden reducir hasta 1 000 veces la recombmación genética. La pmteúia RecA es un polipéptido de 40 kD cuya síntesis se incrementa notablemente en situaciones que afectan de forma negativa el metabolismo del ADN (luz ultravioleta, ácido nalidíxico, bleomicina o mitomicina C), haciendo que pase de su nivel normal de unas 2 000 moléculas por célula a 50 000 aproximadamente, o sea, el 6% del total de las proteínas celulares.

La primera actividad enzimática conocida de RecA fue su acción proteolítica, cuyo significado se aclara en el capítulo 33 y que no está relacionada con la recombinación.

Con nostenondad se demostró aue la interacción con ADN de cadena simple . ~~ ~

(DNs) dcsarn,llaba en ella una fuerte actividad de adellusintrifosf3tax~ cA'rPüsa) !. le permitía catiilizar la ;isUiiilaiii,n de esa hehra a una moliriila de :\DN de dd~le hebra (ADNd), donde existieran zonas de secuencias homólogas.

En experimentos de recombinación la cantidad de RecA nec-ana es directamente proporcional a la cantidad de ADNs en el sistema en forma estequiométrica; un monómero de 40 kD es necesario por cada 3 bases de ADNs. La RecA puede unirse tanto al ADNs como al ADNd,pero de forma diferente y compleja. Su unión al ADNs es más simple y no requiere ATPpues si se añade,éste es hidrolizado rápidamente y RecA seune y se separa alternativamente del ADNs. En contraste, en condiciones íisiológicas,


la unión de RecA al ADNd requiere ATP y es unas 100 veces más lenta que su unión al ADNs. El sitio de unión del ADNs y el ADNd es el mismo o son tan próximos que llegan a superponerse.

El producto de recB es un polipéptido de 140 kD que se asocia al producto de recC, un polipéptido de 128 kD y al de recD de 58 kD, formando una proteína multimérica conocida como RecBCD. Mutaciones en estos genes disminuyen la recombinación al nivel del 1% del tipo silvestre, muy importante aunque menos que recA. Tiene una potente actividad de exo y endonucleasa. Lo más sobresaliente es una actividad de endonucleasa de sitio específico comola enzimade restricción que reconoce la secuencia 5'-GCTGGTGG-3', conocida como motivo chi (x). La enzima corta el ADN en el cuarto o sexto nucleótido después de 3'. Los productos de los demás genes de la familia rec son menos conocidos, aunque se sabe que RecF es una proteína de unión al ADNs, R e d es una exonucleasa para ADNs y RecQ es una helicasa.

La otra familia génica implicada es NV. RuvAes una proteína de 22 kD que forma tetrámeros los cuales sc unen al ADN que presente forma de X. RuvB es una débil ATPasade 34 kD que se une al complejo ADN RuvA, y RuvC que sólo tiene 19 kD es capaz de resolver los intermediarios de Holliday por rupturas endonucleolíticas.

Cuando RecBCD se incuba con ADNd, ATPy ADNs su actividad de nucleasa se suprime y achía desenrollando el ADNd, como una helicasa, exponiendo ADNs que es cubierto por las SSB. Se ha propuesto un modelo a partir de los estudios cinéticos de la enzima. En condiciones fisiológicas un extremo de RecBCD se une al ADNd y comienza a desenrrollarlo a una velocidad de300 nucleótidos por segundo. La cadena formada es liberada en el otro extremo a una velocidad de 200 nucleótidos por segundo. La diferencia de velocidades origina un asa de ADNs, que va creciendo a medida que la enzima se desplaza sobre el ADNd. Estas bandas simples interaccionan con las SSB que las cubren totalmente, apareciendo cadenas simples que pueden servir de sustrato a RecA para comenzar la recombinación. Cuandoaparece el motivo chi (v) corta la hebra y genera el extremo libre necesario para la acción de RecA, que se polimeriza en forma helicoidal alrededor del ADNs y forma un surco donde se puede alojar,tanto el ADNs como el ADNd, por lo cual sesupone que un ADN trifibrilar achía como intermediario de la recombinación.

Una vez formado el complejo ADNs:ADNd:RecA se produce la asociación entre las 2 hebras si existe homología de secuencia, de no ser asíse produce la hidrólisis del ATP y la separación del complejo que vuelve a unirse en otro sitio hasta formarse un apareamiento estable (Fig. 31.6).

invasora.

La homología que se requiere no es absoluta de lo contrario, las zonas heterólogas nose formarían. En pmebasrealizadasse hademostrado queel ADN con una homología de1 90% pueden ser recombinado, en tanto otros con un 70% no puede recombinarse; el límite de máxima tolerancia no es conocido aún. En este primer paso se produce el apareamiento de 300 a 500 pares de bases, después el ATPes bidrolizado y el complejo se disocia. Para la migración es necesario la acción reiterada de RecA que se asocia y disocia bidrolizando ATPen cada ciclo.

En esta primera etapa intervienen las SSB, aun cuando RecA puede hacer todo el proceso hasta la formación del intermediario de Holliday, este evento mejora extraordinariamente su eficiencia si al sistemase añade SSB, con lo cual se requiere de menos cantidad de proteína RecA y de hidrólisis de ATPpara lograr un grado igual de recombinación en relación con preparaciones que no contienen SSB.

Mientras la hebra invasora no se encuentre unida de forma covalente con la ADN ligasa, no se presentará ningún problema topológico, pues existe un extremo libre que permite la relajación de las tensiones que se van creando a medida que la migración avanza. Pero una vez quela brecha hasido selladaaparecerán los problemas topológicos que pueden ser resueltos con la participación de la topoisomerasa 1, que por ruptura y formación de enlaces fosfodiéster permite aliviar las tensiones en forma similar a como ocurre en la replicación.

La enzimología de la maduración es menos conocida. El descubrimiento de las enzimas codificadas por los genes de la familia ruv ha comenzado a esclarecer esta etapa final del proceso de recombinación. Sin embargo, aún queda mucho por aclarar. Se espera que los modernos métodos de análisis genéticos permitirán que en los próxi- mos años todos los mecanismos implicados en el proceso de recombinación genética queden totalmente aclarados.

Signiñcado biológico de la recomb'iauón

La recombinación genética es un fenómeno fundamental en los seres vivos, pues constituye uno de los principales mecanismos de intercambio de información genética entre ellos. El hecho de que un organismo pueda captar e incorporar a su genoma segmentos extensos de ADN provenientes de otras fuentes, como sucede en la transfor- mación, constiiuye un factor trascendente en la evolución delos seres vivos, pues ello le permite la adquisición de nuevos caracteres que pueden representar una ventaja selectiva. Lo mismo sucede con la transducción cuya diferencia esencial consiste en que el material genético es transportado de una célula a otra por la acción de un virus. El virus de laimnunodeficienua humana productor del síndrome deinmunodeficiencia adquirida (SIDA) cuando penetra en las células del sistema linfoide forma un ADN que con posterioridad se integra al genoma celular mediante un mecanismo de recombinación por sitio específico.

En organismos con reproducción sexual la recombinación genética representa el mecanismo fundamental -aparte de la mutación- para la creación de nuevos genotipos por una redistribución de los genes parentales, lo cual en muchos casos puede originar genotipos ventajosos que representarían una mejoría en la adaptación al medio aumentando la supervivencia y la reproducción.

Pero la recombinación puede representar también un mecanismo de defensa o depuración contra las mutaciones dañinas y una forma de hacer perdurables las beneficiosas. Si no existiera la recombinación al producirse una mutación dañina, sobre un gen, comenzaría un proceso irreversible sobre el cromosoma que la porta que conduci- ría inevitablemente a su desaparición funcional. Una nueva mutación agravaría el proceso y así sucesivamente. Los efectos de mutaciones beneficiosas serían opacados por los daños establecidos. Como ya se ha dicho la localización de un gen en un cromosoma sólo es temporal, pues al producirse la recombinación ese gen puede tras- ladarse a otro cromosoma y de esta forma 2 mutaciones dañinas pueden ser físicamente separadas, incluso una beneficiosa de otra dañina como se muestra en la figura 31.7.

Durante la gametogénesis en la división meiótica ocurre la recombinación de los cromosomas homólogos, con lo cual pueden aparecer gametos con genotipos diferentes a los parentales.

Se ha planteado también la existencia de recombinación entre lascélulas somátieas embrionarias, lo que ha permitido desarrollar toda una teoría para explicar la forma- ción de la gran diversidad de inmunoglobulinas por las células linfoides, como se discute con mayor amplitud en el capítulo 82.

Fig. 31.7. Separación de genes mutados. En uno de los 2 cromosomas homólogos ha ocurrido una mu- tación henefieiosa que se representa en rojo (a) SE muestra el prace- so de mutación, pero ahora se trata de una dañina representada en negro. El organismo que herede ese cromosoma heredará los 2 genes mutantes; pera romo apare- ec en (b) un proceso de reeombi- nación separa las 2 mutaciones durante la evolución, los organismos que adquieran la mutación beneficiosa se pafirán adaptar mejor al ambiente sin llevar consigo la mutación dañina.

En la mitosis de las células somáticas se han observado entrecruzamientos de cromátides similar a los de la meiosis, pero no ocurre recombinación, pues en este caso las cromátides que intercambian son hermanas y por lo tanto iguales.

En resumen, el proceso de recombinación genética es uno de los principales mecanismos que intervienen en la producción de la gran variabilidad de los seres vivos, hasta tal punto, que se puede afirmar que en una especie dada no existen 2 individuos totalmente iguales.

Resumen

La reeombinaci6n genética es uno de los procesos más importantes en que participa el ADN celular, durante &te se produce el intercambio de grandes bloques entre 2 moléculas de ADN. Existen diierentes tipos de reeomb'ici6n de acnerdo con las caracterísüeas de la molécula donante v la motora La transformaci6u. traasduM6n y coqjngaci6n pertenecen al grnpo denominado recombinaci6n general u homóloga; en tanto la transposia6n es de tipo heter61oga. Al nivel moleeular la reeombiici6n consía de 2 eíapas: la mieid6n, con la formación del intermediario de Holliday, y la mad-6n.

Se ha planteado un modelo general para explicar el proceso en ténninos enzimstim; &te comienza con la parüapaci6n de la proteína RecBCD que al moverse sobre el ADN crea una zona desnaturalizada de varios cientos de bases que se mantiene gracias a la intemeneión de las proteínas SSB. Una de estas cadenas invade a la otra molécula que participa en el pmceso.

En e& momento interviene la proteína R e d que se une a la hebra invasora formando un complejo ADN-ReeA, que explora la otra molécula hasta encontrar una zona de homoloela en la secuencia de bases. oara lo cual orovoca la desnahiralizeci6n pare% de la moléeula receptora. Al Gcontrar la zona hom6lnga se produce el apareamiento de bases entre la hebra invasora y la molécula receptora. A medida que el apareamiento progresa se crean zonas de t e d n en la m o l h - la que pueden ser eliminadas con la parücipaci6n de la topoiwmerasa L La rota- ción de la molécula formada da lugar a la aparici6n del intermediario de Holliday.

La mptura del intermediario produce 2 nuevas moléculas recombinadas, pero de esta etapa es pow lo que se conoce y 5610 recientemente se ha encontrado una enzima producida por el fago T4 que reeonoce esta estructura como sustrato.

La freeuencia en la reeombinaeión de 2 o más genes ha permitido la elabora- d6n de mapas geneticm en varios organismos.

La remrnbinación genétira es el principal mecanismo capaz de explicar la gran diversidad de organismos que componen una especie, de abí su valor en el pmceso evolutivo. Además puede significar un mecanismo de pmteeei6n, pues permite la separación de las mutaciones dañinas de las beneficiosas. Se espera que en Ina pr6ximos años se produz~an notables avances en nuestro conocimiento sobre los mecanismos moledama de la reeombinaci6n genética

Ejercicios

1. ¿Qué significado tuvo en la historia del conocimiento de la recombinación genética la aparición del modelo de Holliday?

2. ;SegÚnelmodelode Holliday puedeañrmane que en todo procesade recombinación se obtienen siempre 2 moléculas recombinadas?

3. ¿Qué entiende usted por una molécula de ADN heterocigótica? ;Qué función desempeña en la recombinación?

4. ¿Cuáles son las principales analogías y diferencias entre los modelos propuestos para explicar la formación del intermediario de Holliday? ¿En cuál de ellos es imprescindible la participación de la topoisomerasa I?

S. Los organismos que carecen de la proteína RecA realizan la recombinación con muy baja frecuencia ¿Cómo explicaría usted este fenómeno en esos organismos?

6. ¿Por qué puede afirmarse que la recombinación genética ha desempeñado una importante función en el proceso evolutivo de los seres vivos?

Componenies celulares y Ckn6tica molecular 547

Los seres vivos se desarrollan en dependencia del medio y si bien de éste obtienen todo lo necesario, también pueden experimentar daños debido a la presencia en su ambiente de agentesfísicos y químicos capacesde interactuar con las biomolécnlas y provocar alteraciones en ellas. Esta situación también puede originarse como resultado de interacciones entre las propias sustancias componentes de los seres vivos en condiciones especiales.

La actividad del hombre en ocasiones puede modificar de forma negativa las características del medio, sea de forma accidental o deliberadamente, con el propósito de hacer daño. La contaminación ambiental es sin dudas uno de los grandes problemas de nuestro tiempo que requiere del concurso internacional para su solución defuiitiva.

En este capítulo se estudiarán aquellos agentes que pueden alterar el material genético y por tanto, provocar la aparición de variaciones fenotípicas en los individuos y en su descendencia.

Después de aclarar los conceptos fundamentales y la terminología que se debe emplear, se estudiarán los mecanismos que originan las mutaciones,sns consecuencias positivas y negativas analizadas desde diferentes puntos de vista, para terminar con el análisis de algunas situaciones relacionadas con la práctica médica.

El análisis de las mutaciones en procariontes permitirá su estudio detallado y su comparaciónposterior con los encariontes, principalmente en el hombre.

Definiciones y nomenclatura

En este tema se emplea un conjunto de términos que deben ser definidos antes de comenzar el estudio de los contenidos.

Concepto de mutación

Se denomina mutación a toda alteración permanente que se produce en el material genético, el ADN, y que se trasmite a los descendientes durante el ciclo replicativo. Como ya fue visto en el capítulo 25 y se analizará con más detalle en el capítulo 33, no todas las alteraciones son trasmitidas a los descendientes, gracias a un sistema de mantenimiento y reparación del ADN. El organismo que se Origina como Consecuen- cia de una mutación y que difiere del organismo original recibe el nombre de mutante.

El agente capaz de provocar la aparición de una mutación se denomina agente mutagénico o mutágeno, el cual puede ser de naturaleza fisica o química y puede originarse en el interior o exterior del organismo. Por último, el mecanismo por el cual un mutágeno origina la mutación recibe el nombre de mutagénesis.

Si la E. colique existe en la naturaleza es capaz de formar leucina a partir de una fuente carbonada y una nitrogenada, el organismo se nombrará leui y se considera que es el tipo silvestre. Si por la acción de un mutágeno se obtiene un mutante que no es capaz de crecer en un medio carente de leucina (ha perdido la capacidad de sintetizar ese aminoácido),entonces se nombra leu'. En este sistemade nomenclaturael tipo (+) es siempre el tipo silvestre, aunque no sea el que existe en la naturaleza, y el tipo (-) es el mutante. Para referirse al genotipo se utilizarán letras minúsculas y para el fenotipo las mayúsculas.

Tipos de mutaciones

Las mutaciones pueden clasificarse atendiendo a numerosos criterios de los cuales los más utilizados son los que se definen a continuación. Según su origen las mutaciones pueden ser espontáneas o inducidas. Algunas mutaciones se producen como consecuencia del normal funcionamiento de la célula y reciben el calificativo de espontáneas y ocurren en una proporción que es característica para cada organismo. Las mutaciones que se producen como consecuencia de la acción del hombre sobre determinados organismos reciben la denominación de inducidas. Laefectividad de un mutágeno debe medirse por su capacidad para incrementar la proporción de las mutaciones en un organismo determinado.

Teniendo en consideración el grado de afectación que el mutágeno origina en el material genético, las mutaciones pueden clasificarse en 2 grandes grupos: aquéllas que pueden visualizarse en el microscopio por afectar un sector grande del ADN, que reciben el nombre de mutaciones cromosómicas (también llamadas aberraciones estructurales), y las que afectan sólo una o muy pocas bases nitrogenadas por lo que tienen un nivel molecular o submicroscópico y se denominan mutaciones génicas.

Las aberraciones cromosómicas estructurales más importantes son: la deleción, cuando falta una porción del cromosoma; la inserción, cuando aparece un segmento adicional, y la translocación, cuando un segmento de un cromosoma aparece en otro. Para su estudio detallado debe consultarse un texto de citogenética.

Mutaciones génicas

Las mutaciones génicas se producen fundamentalmente por alteraciones en la secuencia de bases del ADN. Estas alteraciones pueden ser consecuencia del cambio de una base por otra, entonces se les denomina puntuales. Los cambios de más de una base son fenómenos que aunque probables resultan muy poco frecuentes. Otros tipo se producen por la adición (inserción) o sustracción (deleción) de una o más bases (Fig. 32.1).

A T G G C A C G T C A

Fig. 32.1. Principales mutaciones génieas. Las principales mutaciones génieas son aquéllas que se producen por el cambio de una base por otra (ir- quierda), la inserción dc una base (centro) o la deleeión de una base (derecha). Como puede inferirse de la figura, las consecuencias de cada tipo dcbcn ser diferentes.

Se llama transición al cambio de una punna por otrao una pirimidha por otra, en tanto recibe el nombre de transversión el cambio de una pnrina por una pirimidina, o viceversa.

Las mutaciones pueden ocurrir en las secuencias de bases que codifican aminoácidos de la cadena polipeptídica o radicar en secuencias reguladoras (promotores, etcétera). Las que afectan las secuencias codificantes pueden estar localizadas en diferentes partes del gen y pueden alterar el codon de iniciación, los intermedios o los de terminación, lo cual indica que las consecuencias de las mutaciones pueden ser muy diversas.

Cuando una mutación se produce en la zona de codificación del gen puede no alterar la secuencia de aminoácidos en una proteína y se denomina silente. Existen casos en que la mutación provoca el cambio de un aminoácido por otro similar que no altera la función de la proteína y entonces se denomina mutación neutra.

Mutagénesis

Son numerosos los agentes que pueden actuar como mutágenos pero pueden reunirse de acuerdo con el mecanismo por el cual producen las mutaciones en los siguientes grupos.

Mutágenos anáiogos de bases

Un análogo de base es una sustancia que no es ninguna de las bases habituales del ADN, que puede ser incorporada a éstedurante la repücación por formar pares de bases con alguna de las bases normales; que por tautomerización (capítulo 8) puede cambiar so patrón de apareamiento en el siguiente ciclo replicativo y originar un cambio de bases en el ADN.

Un ejemplo de este tipo es el bromouracilo que es un análogo de la timina y por eliose apareacon la adeninaen su forma ceto,pero al cambiar a su forma enol forma par con la guanina (Fig. 32.2) y en el siguiente ciclo replicativo aparecerá un par GC donde antes existía uno AT.

H l Fig. 32.2. Análogos de bases. La parte su-

/"-" O N perior dc la figura muestra la es-

/ N .ii, "-/ \ \:: H-C/ \ C P C ,y.---(:: (. . , . tructura dc la timina y del

\ 4 ,\ \ - 7 f ' ',;, 5-bromourarilo, donde sc advier-

82 - y <.-i' "NN- \ Y-" .'\

te su siniilitud estructural. En la H / N - ~

\ Y ) . . : parte inferior se muestra, eúma en

N=C N=C .<' -- x ,i' -3 'N-H la forma cela, el 5-bromouraeilo

'H (j 'il I forma paresde havescon laadenina

H y actúa como un análogo de la timina. ~ e r o en forma enal se

Adenina 5-Br-Uracila (forma ceto)

Guanina S-Br-Uracilo (forma enoi)

. . aparea con la guanina y sustituye a la eitosina.

Para que esto suceda se requieren de 2 ciclos replicativos, como se muestran en la figura 32.3.

Otro ejemplo es la 2-aminopurina que sustituye a la adenina; no tautomeriza, pero puede aparearse con la ümina y con la citosina; aunque el apareamiento con la citosina es muy débil es lo suficientemente fuerte para provocar en el siguiente ciclo replicativo la transición AT->GC.

Fig. 32.3. Mutaciones por análogos de hases. Cuando durante un cielo replieativo se incorpora el 5-bromouracila, en su forma ceto, formará pares de bases can la adenina, pero en el eielo siguiente cambia a su forma enal y se aparea con la guanina, originando en el próximo cielo la aparición de un par G:C donde existía originalmente un par A:T.

Fig. 32.4. principales mulágenos químicos. Se muestran la7 eihichiras de los mutágenm quimiem más utilizados El &ido nitrnio (a), la hidroxilamina (b), sulfonato de etilmetana (e) y la N-nitr^N'-metil- N-ni- guanidina (d).

Un mutágeno químico es una sustancia que reacciona con alguna de las bases del ADN y la modioca de forma que cambia su patrón de apareamiento; los más poderosos son el ácido nitroso (HNO,), la hidroxilamina, el sulfonato de etilmetano y la N-metil-N'-nitro-N-Ntrosoguanidina (Fig. 32.4).

O O-CH, SS /

8 'c~H,

El ácido nihosotransforma los grupos aminos en cetónicos y por tanto, transforma la citosina en uracilo, la adenina en hipoxantina y la guanina en xantina (Fig. 32.5), que forman los pares UA, HC y XC; esto provoca los cambios GC en AT y AT en GC cuando la citosina y la adenina son desaminadas. La desaminación de la guanina en xantina no provoca mutaciones, ya que GC da XC. Por un proceso muy complejo la hidroxilamina reacciona con la citosina y la modifica de manera que forma pares con la adenina, por lo queocurre un cambio de GC en AT.

El sulfonato de etilmetano (o de etiletano) es un agente alqnilantes, provoca la adición de grupos alquilos a las bases ~trogenadasdel ADN y pueden reaccionar con la guanina y en menor grado con la adenina. La adición de un grupo alquilo en el N-7 dela purina produce 2 efectos,el apareamiento de G con T y la labilización del enlace

.NH, I -

!! 8 1

N / / C \ C t,x,L .. .. I I I - i ! l C ,-,+ \ N / C (!4 \.V /(:

!

N-glicosídico del nucleótido que se hidroliza rápida y espontáneamente creando un sitio apurínico, que si no es reparado, en el siguiente ciclo replicativo puede dar origen a la aparición de cualquiera de las bases en la cadena complementaria.

El N-metil-N'-nitro-N-uitrosoguanidiua es un poderoso mutágeno que achía por alquilación. En una población bacteriana produce cerca de 1 % de mntantes y muchos de ellos múltiples. Las mutaciones se producen en grupos muy cerca unas de otras. Se supone que su acción se realiza en la horquilla de replicación.

Otro grupo importante de mutágenos son las llamadas especies reactivas del oxí- geno que son un grupo de radicales libres que se forman a partir del oxígeno en diferentes reacciones redox. Como todo radical estas especies son muy reactivas y pueden alterar tanto las bases como la pentosa del ADN.

Algunos colorantes como el naranja de acridina, la proflavina y la acroflavina son moléculas planas de 3 ciclos, cuyas dimensiones son aproximadamente iguales a las de un par de bases, esto le permite intercalarse entre 2 pares de bases y al ocurrir la replicación generalmentese producen inserciones de una base (muy pocas veces de 2) y con mucha menor frecuencia deleciones; el mecanismo se desconoce.

Radiaciones

La luz ultravioleta,los rayos gamma, los rayos X y otras radiaciones ionizautes son poderosos agentes mutagénicos. Su mecanismo de acción, así como sus consecuencias se estudiarán con más detalle en el capítulo 33.

Consecuencia de las mutaciones

Las más frecuentes de las mutaciones génicas son las puntuales, las cuales se definen como el cambio de una base por otra. En este caso pueden originarse varias situaciones: en primer lugar puede producirse una mutación silente, pues debido al carácter degenerado del código genético estudiado en el capítulo 28, los cambios,

Fig. 32.5. Efecto de agentes dessminantes. Los agentes desaminanles, como el ácido nitroso, actúan sobre las bases nitrugenadas y al desaminorlaseanvierten la eitosina en uraeila (arriba), la adcnina en hipaxantina (centro) y la guanina en xantina (abajo). En algunos casos estos eamhios pueden afee- tar el patrón de apareamiento.

Componentes celulares y Cknt5tica molecular 553

sobre todo en la tercera base, pocas veces acarrean cambios en el aminoácido codificado; en segundo lugar puede originarse una mutación neutra, lo que significa que, aunque se produce el cambio de aminoácidos, éstos son tan simüares que no producen afectaciones del producto génico; por último, puede producirse un cambio de aminoácidos que afecte sensiblemente la estrnctura y por consiguiente la función de La proteina codificada, modificando el fenotipo y éstos son los que pueden reconocerse como mutantes (Fig. 32.6).

T T T G C C C T A A G T

U U U G C C C U O A G T U U U G C h U A G T

Fig. 32.6. Consecuencia de las mutaciones puntuales. Al producirse el cambia de una base par otra, las consecuencias pueden ser diferentes debido al carácter degenerado del código genética. El cambio de A x G da origen a una mutación silente (derecha), pues se codifica el mismo aminoácido; C x A produce una mutación neutra, pues cambia la leucina par la isoleucina que son aminoácidos del mismo tipo (centro); por último, el cambio de T x G, si debe originar un fenotipo mutante, pues la leurina que es un aminoácida apolar se cambia por arginina (izquierda) que es del tipo polar iónico.

Otro tipo importante son aquéllas que transforman el codon de iniciación, lo que impide la síntesis de la proteína, pues en las concentraciones fisiológicas de Mg2+, sólo con el codon AUG puede iniciarse la síntesis.

En otros casos están implicados los codones de terminación que pueden dar lugar a 2 situaciones diferentes: una es que un codon de lectnra sea convertido por el mutágeno en un codon de terminación, con lo cual provoca la terminación abortiva de la cadena polipeptídica; la otra, ocurre cuando un codon de terminación es convertido en un codon de lectura, lo cual ocasionará un aumento en el número de aminoácidos de la proteína haciéndola generalmente inservible (Fig. 32.7).

Fig. 32.7. Mutaciones que afectan la termi- nación. En el primer casa (izquierda), el cambio G x A da origen a la aparición de un eadon de termi- nación y la terminación anticipa- da de la síntesis de proteínas. En el segundo casa (derecha), el cambio A x C transforma un codon de terminación en uno de tirosina y can ello prolonga la cadena polipeptídica más allá del limite normal.

C C C T G G C A T T A A G C C

C C C U G G C A U U A A G C C

Pio - Trip - His - m

C C C U G A C A U U A A G C C

Pla T- C C C U G G C A U U A C G C C

Pro ~ T n p His - m - Ala

Estas mutaciones pueden afectar también las zonas reguladoras, por ejemplo, la fortaleza de un promotor depende enhp otms factores de la secuencia consenso TATAAT, por lo que una mutaci6n que aleje la secuencia real de la consenso debilitará al promo-

tor, y la que lo acerque, lo hará más fuerte. Situaciones similares pueden originarse en otras secuencias reguladoras como seestudiará en el capitulo 34. Las inserciones y las deleciones provocan un corrimiento del marco de lectura, pues como los codones son leídos uno a continuación del otro, la adición de una base dará lugar a una lectura diferente a partir del punto de inserción. Igual sucede con las deleciones (Fig. 32.8).

G C A A T C C T T T T T C A G G G G A A A

G C A A U C C U U U U U C A G G G G A U Alii 1 1.w - Feii - Gln GIi 1.1\

+<; G C A A T C G C T T T T T C A G G G G A A A G C A A T C T T T T T C A G G G G A A A

G C A A U C G C U U U U U C A G G G G A A A G C A A U C U U U U U C A G G G G A A A

Ala , IIc 4 a h 1 &L : GL && Ala - lic Fcn - Fen - úlii - Git - Li,

Las consecuencias de inserciones y deleciones son diferentes según el punto donde se producen, teniendo mayor connotación aquéllas que ocurren en los codones iniciales, pues originan un producto totalmente alterado. Este tipo de mutaciones puede alterar también las secuencias reguladoras, pues en ocasiones 2 secuencias típicas deben estar separadas por un número determinado de bases para ser efectivas,el aumento o disminución de este número puede alterar la función regnladora.

Mutaciones mayores

Con una frecuencia muy haja ocurren cambios que afectan secuencias de muchas bases (hasta miles) y que taxnbiéndebenser consideradas como mutaciones; las principales son deleciones, duplicaciones y rearreglos. Las deleciones de 100 hasta l 000 pb ocurren espontáneamente, pero pueden ser estimuladas por agentes de entrecruzamiento; presumiblemente los largos segmentos entrecruzados son eliminados de alguna forma, quizás con la participación de algún mecanismo de recombinación.

En una duplicación (o triplicación que también puede ocurrir) una secuencia de bases se repite y aparece organizada en tándem (Fig. 32.9). La longitud del segmento duplicadoes típicamente tan larga que incluye a variosgenes. Estemecanismoes poco frecuente en bacterias, pero se observa en anfibios durante el mecanismo de amplificación genética y en células de mamíferos relacionado con los mecanismos de resistencia a algunas drogas como se discute en el capítulo 84.

Parece ser que la duplicación de genes ha desempeñado tina función importante en el proceso de la evolución; como un gen duplicado puede mutar independiente- mente del otro, a partir de un gen Único puede producirse una familia de genes que tiene un grupo de características comunes, pero posee aspectos específicos que los diferencian y que, además de una ganancia de material genético, puede dar origen a proteínas con funciones similares, pero con algún grado de diferenciación. El ejemplo más sobresaliente lo constituye el gen de la globina, que al parecer era único en un inicio y que por mecanismos de duplicación y después por mutaciones independientes ha dado lugar no sólo a las cadenas que componen los diferentes tipos de hemoglobina, sino también a la mioglobina, una proteína muscular relacionada con el almacenamiento de oxígeno en determinadas fibras musculares.

Un rearrrglo típico es la inversión, un segmento de ADN que es separado y reinsertado con una orientación invertida (Fig. 32.9). Los rearreglos de este tipo generalmente originan un fenotipo mutante con respecto a los genes involucrados, pero si no son esenciales para el crecimiento a veces no son detectados.

Los mecanismos moleculares de la duplicación y el rearreglo no son conocidos, presumiblemente impliquen errores de replicación, recombinación, o ambos.

Fig. 32.8. Inrercienes y dcleciones. 1.n in- serriiin (izquierda) y la deleciún (derecha) de una hase alteran la secuencia de aminoácidos de la proteína. a partir del punto doiidc se produjo la mutacióii. ObsCrve- se que mientras mis cercana sea la rnutacibn al inicio del gen, en nia- )or grado alterará la estructura de In pwteina que el gen codifica.

A G C T G C T A T C C G A T C C A C G A T A C C C T +

A C C T C C T A T C G C I A T C C C A T C G A C C A T A G C G A T A G G C T + +

A G c T C T A T C G C G A T C G A G A T A G C G C T

¢-

Fix. 32.9. Mutaciones niayorcs. La dupli- cación y la inversión de grandes sectores del ADN constituyen fe- nómenos que ao son pocu fre- eucntfs y que generalmente implican varios genes. Los mecaiiis- inus de producción de cslus tipos dc niirtaciones son desconocidos.

Componentes celuiares y Oenttica molecdar 555

Supresión

Fig. 32.10. Reversión intrafihica. La estructura de la prolcína representada en la figura sc mantiene exclusivamente par una interacción iónica entre 2 aminoácidos espe- cifico~. Si una mutación afecta a uno de ellas, la proteína puede rc- aperar su conformación inicial por otra mutación que restituya el mismo aminoácido u otra de lo misma carga, o un aminaáeido que cambie la carga del otro aminoScido que interviene en la interaceión.

Hasta ahora sólo se ha visto el proceso de obtención de mutantes a partir del tipo silvestre, el fenómeno contrario también existe y se le denomina retromutación o reversión. Una forma de reversión seria queel mutante recuperarael genotipo original, pero eso no siempre ocurre, pues existen muchas formas de reversión.

Si se colocan lo4 bacterias Leu- en un medio carente de leucina no se obtiene crecimiento alguno, pero si colocamos lo7 bacterias Leu-se recogen unas pocas colonias Leu', esto se debe a que estas bacterias elaboran su propia leucina y se les llaman revertantes. El hecho de que muestren un fenotipo Leui no significa necesariamente que presenten el genotipo leu+ original.

La reversión es debida a mutaciones espontáneas y por lo tanto, es un proceso azaroso que no está influido por el medio carente de leucina, pero éste permite detectarlas. En el laboratorio es posible estimular la reversión con el empleo de mutágenos.

Algunos análisis matemáticos de las frecuencias de mutaciones espontáneas demuestran que el genotipo original sólo se lograría en una por cada 15 x 10'Océlnlas, peroexperimentalmen~ sedei&estraqne el fenotipo original se obtiene en una frecuencia de una por cada 108células. La explicación seria que la mutación ocurre en otro sitio diferente, que permite recuperar el fenotipo original, a este tipo se ledenomina mutaciones de segundo punto o supresoras. En ocasiones la segunda mutación ni siquiera ocurre en el mismo gen, por lo que deben distinguike las supresiones intragénicas de las extragénicas.

El estudio del producto génico ha demostrado que en la mayoría de los casos la sustitución del aminoácido original permanece, pero ha aparecido un segundo cambio que compensa al primero. Considérese el ejemplo hipotético que se muestra en la figura 32.10, de una proteína de 97 aminoácidos cuya estructura está determinada completamente por una atracción iónica entre un aminoácido (+) en la posición 18 y otro (-) en la 64; si ocurre una mutación que cambia al aminoácido 64 por uno (+), la proteína será totalmente inactiva. En este caso se puede lograr la reversión de3 formas principales:

1. Una mutación que haga que a la posición 64 regrese el aminoácido original. 2. Una mutación que cambie el aminoácido (+)de la posición 64 por otro (-) aunque

no sea el original. 3. Una mutación que produzca la aparición deuu aminoácido (-) en la posición 18.

En todos los casos señalados se recuperada el fenotipo original, aunque sólo en el primerose restituiría el genotipo silvestre.

Otra situación ocurre con las mutaciones que provocan alteraciones del marco de lectura; una inserción puede revertir como consecuencia de una deleción y viceversa, en estos casos mientras más próxima se produzca la segunda mutación, mayor será la probabilidad de obtener el fenotipo silvestre.

Los casos analizados hasta el momento corresponden a supresiones intragénicas, pero también existen las extragénicas. Suponga que una proteína está formada por 2 subunidades, cada una de las cuales está codificada en un gen diferente. Si una muta- ción en uno delos genes afecta el sitio de reconocimiento entre las 2 subunidades, no se podrá formar el dímero y la proteína estará inactiva. Si ocurriera una mutación en el otro gen que modificara el sitio de reconocimiento de manera que pudiera formarse el dímero. se restituiría el tiuo silvestre.

Otro tipo de mutaciones extragénicas se encuentra en el caso de las mutaciones queoriginan codonesde termiuación, en estos casosla síntesis dela proteína dada se interrumpe cuando el codon mutado aparece. Una mutación en ARNt que permita leer ese codon actuaría como supresora.

Mutaciones en humanos

El genoma humano surge como consecuencia de un largo proceso de evolución y no está exento de alteraciones mutacionales. Los actuales métodos de análisis han permitido demostrar la existencia de mutaciones de todo tipo en los seres humanos; en algunos casos estas mutaciones no tienen ninguna significación y se descubren como resultado de estudios masivos en grandes poblaciones, que se realizan en busca de situaciones anormales, por lo que surge el concepto de polimorftsmo que se refiere a la existencia de numerosas formas (secuencias) de una misma proteína, tengan o no un significado patológico.

El c m más sobresaliente es el de la hemodobina de la cual se conocen alrededor de 400 tipos diferentes,aunque sólo unos pocos de ellos causan alteraciones morbosas.

Las deleciones también aparecen en humanos y son causas de diferentes enfermedades, un resumen de éstas se presenta en el cuadro 32.1.

Cuadm 32.1. Algunas enfermedades debidas a deleciones génicas

Gen Enfermedad

Factor VI11 de la coagulación Hemofilia A

Factor IX de la coagulación Hemofilia B

21-hidroxilasa Hiperplasia adreual congénita

Fenilalanina hidroxilasa Fenücetonuria

Receptor de LDL Hipercolesterolemia familiar

Colágeno I a l Osteogénesis imperfecta severa

Hipoxantina guanina fosforibosil transferasa

Síndrome Lesh Nyham

Como resumen de las distintas alteraciones que pueden presentar los genes humanos el cuadro 32.2 muestra diferentes causas de p-talasemia, una enfermedad que se caracteriza por la síntesis de cantidades insuficientes de la P-globina, ésta es una de las cadenas polipeptídicas que componen la hemoglobina. Se puede apreciar como existen mutaciones que afectan a los exones y a los intrones e incluso a secuencias repladoras, a codones de iniciación y de terminación, etcétera.

Cuadro 32.2. Mecanirnos moleculares productores de talasemias

Mecanismo molecular Ejemplos

1. Mutaciones puntuales a) Transcripción defectiva

mutaciones del promotor

b) Defectos de maduración del ARNm corte anormal

nuevo sitio de corte

intrón dentro del gen

sitio de poliadenilación

G a A intrón 1 posición 1 G a A intrón 2 posición 1 G a C intrón 1 posición 5 (2)

GAG a AAG en codon 26 (5)

G a A en 110intrón l(3) G a T en 654 intrón 2 (4)

AATAAA a AACAAA (4)

c) Traducción defectiva terminación premahua codon 17 A a T = lis a ter

codon 39 C a T = glN a ter (3)

2. Deleciones a) Transcripción defectiva parcial de 619 ph (6)

b) Defectos de maduración 25 pb extremo 3' de intrón 1

c) Traducción defectiva 2 bases en el codon 8 4 bases en codones 41/42

3. Inserción corrimientodel niarco delectura 1 base en 819

1 base en 71/72 (4)

( 1 ) En negros americanos. (2) En indius asiáticos

(3) ITu ineditei-ráncos. (4) En chinos.

(5) Currespiiiide a H h E. (6 ) La Hh Leporc.

Resumen

Las mutaciones son alteraciones que se producen en el material genético y que se trasmiten a los descendientes. Los agentes mutagénicos o mutágenos son aqué- iios capaces de producir mutaciorm, que pueden ser de nahiralem ñsica o química.

Los principales tipos de mutaciones géniw son las puntuales, por sustituci6n de una base; las hedones , por la adici6n deuua base, y las deldones, por la sustrac- ción de una base.

Las mutaciones pueden ser espontáneas si se producen como coll~eeueucia de la actividad normal del organismo o inducidas cuando en ellas interviene la mano del hombre, con intenciones experimentales, accidentalmente, o por una actitud criminal.

Las mutaciones pueden provocame eon la utilizadón de análogos de bases como el bmmouracilo y la Zaminopurina; mutágenos quimicm corno el ácido nitmso, la bidmxüamk, la N-meol-N-niímN-ni-dina y el dionato de eülmetano, los cuales modifican las bases nitmgenadas cambiando su patrón de apareamiento. 'IgmbiQi son mutagéniw las radiaciones ulúavioleta, las ionizantes y las susíanfias intercalantea como el naranja de acridina, la pmflavina y la aeroflavina

Los efeftos causados por las mutaciones pueden ser diferentes según el tipo de mutación (puntnal, h e d 6 n y deleeión) y el sitio donde se producen (secuencias codificantes o reguladom).

Otros tipos de mutaciones afectan grandes sectores del ADN como las grandes deleeiones, las duplicadones y los rearreglos cuyos mecaniwos son desconocidos.

La supresión es el mecanismo por el cnal a parür de un mutante se logra obtener el fenotipo dvestre y ésta se debe ala ocurrencia de una segunda mutación en el mismo gen (intragénica), o en un gen Merente (extragénica).

Existen numerosos ejemplos de mutaciones en humanos muchas de las cuales son causas de enfermedades, el ejemplo más destacado como sucede en otms aspee tm ya estudiados es el gen de la globina, que codifica la podón pmteínica de la hemoglobina.

Ejercidas

1. Qué tipo de mutación (transición o transvenión) se produce si un cultivo celular es tratado con: a) bromouracüo b) 2-aminopurina c) ácido nitroso d) hidroxilamina e) sulfonato de etilmetano

: f) N-metil-N'-nitro-N-nitrmoguanidina 2. ¿Qué tipo de mutaciones se originan con el uso de las llamadas sustancias in-

tercalantes? 3. A continuación se muestra la secuencia de la hebra codificante de un segmento de ADN queusteddebe tomar como referencia para responder las preguntas siguiente:

1. Escriba la secuencia del péptido que se codifica. 11. Cómo se modifica esa estrnctura si:

a) cambia A x T en la posición 12 b) cambia T x C en la posición 15 c) cambia T x A en la posición 8 d)inserta un G entre 16 y 17 e) deleción de la C de la posición 21 0 cambia T x A en la posición 2 g) cambia G x A en la posición 27 h) cambia A x G en la posición 30

4. ¿Cómo pudiera suprimirse una mutación por otra dentro del mismo gen? 5. ;Cómo puede suprimirse una mutación por otra que ocurra en un gen diferente? 6. Si 2 células bacterianas tienen el mismo fenotipo, jnecesitan tener el mismo

genotipo?

Componentes celulares y Genbtica nmlecuh 559

No existe Nnguna otra biomolécula cuya integridad tenga para la célula el significado vital que tiene el ADN. Todas lascaracterísticas estructurales y funcionales de la célula están codificadas eii última instancia en estas grandes y complejas moléculas. La pmihi- lidad de expresar esas características como la de poder trasmitirla a sus descendientes dependen en elevado grado de la integridad estmctural de estas moléculas, tanto de su estructura primaria como de su arquitectura tridimensional.

No obstante, las posibilidades que tiene esta molécula de sufrir alteraciones es bastante elevada, ya sea durante su funcionamiento como molde para la replicación y la transcripción, como por su snsceptibilidad a la acción de agentes fisicos y químicos provenientes del exterior o del interior de la célula.

No es de extrañar que durante los millones de años de la evolución, tndos los organisnios. desde los unicelulares hasta los plnricelnlares hayan desarrolladomecanismos que lc periiiitaii conservar dentrode ciertos ümites la más elevada fidelidad de la información contenida enel ADN.

En la sección de hiomoléculas quedb demostrado que la sola estructura del ADN, con siis elevadas estabilidades quimicofisica y metabólica constituye un primer nivel de seguridad en la conservación,su asociación con proteínas en organizaciones de cada vez iiiayor complejidad aumentan el grado de seguridad que se incrementa aún más en los eucariontes, donde el ADNestá confinado al núcleo y separadodel restodela célula por una envoltura de doble membrana

El ADN noconstituye una molécula invulnerable a la acción de agentes queoriginan en él cambios que pueden traduciiseen daños a su estructura y por ende enalteraaonesde sus funciones.

En este capítulu .se examinarán l a principales clanos que puede experimentar el ADN celular, así como los diferentes sistemas que tienden a comervar la información original, tanto durante la actividad normal de lacélula comoeii respuestas algún agente agresor, por último. sc estudiari cómo algunas alteraciones en los sistemas de conservación pueden originar alteraciones niorbosas en los seres humanos.

Cuiiio fiierhtudiacli~ eii el rapítulo31,las bacterias pnedencapturar ADNdel medio cxtracelular e incorporarlo a su genoma por el fenómeno de transformación; éste sin embargo. tiencsus limitaciones. La bacteria escapazdedistinguirentrrel ADN propio?. elextraño,lo que viriir dado porqiic cada cspccie hacteriana posee un grupo de enzimas que metilan el ADY e11 posicioiirs esl~ecíficas. principalmente en adenina y citosina. creando un patróii de iiietilación que indica el origen del ADN; este proceso se conoce como niodificaciún. Si~iiiiltáiieaineiite existe un conjunto de endonucleasas que si al

interactuar con el ADN en los mismos sitios no encuentran el natrón de metilación característico de su especie, entonces lo hidrolizan; este fenómeno se denomina res- tricción. En su conjunto el sistema de modificación-restricción protege a la célula contra la contaminación de moléculas extrañas de ADN.

En la tabla 33.1 se relacionan algunas de las enzimas de restricción mejor caracterizadas y sus sitios de acción.

Aunque cada especie presenta su propio patrón de metilación, cualquier molécula de ADN de origen extraño que logre incorporarse a la bacteria, será reconocido como ajeno y resultará hidroluado por las endonucleasas.

lhbla 33.1. E n z h a s de restricción y sus sitios específicos de acción

- -

Enzima Microorganismo Sitio específico

A.

EcoRl Esrherichia coli GXAATITC

BamHl B.rii>iiloliq~i~f~~cie~~,s H G*GATCC

Bgll B. globigli A*GATCT

Hindlü H. inIluenzae A*AGCm

Sall S. nlbus G G*TCGAC

T-1 T riqrioficus T*CGA

B.

Ball B. albidum TGG*CCA

Hael H. aemphL<_ GG*CC

SmaI S. marcescens CCC*C&G

* Indica el punto del corte.

Lcycnda: A: Generan fragmentos monofibrilares. B: No generan fragmentos nionofibriiares.

Los sistemas de modificación-restricción se clasifican en 3 grupos, cuyas caracte- rísticas principales se muestran en la tabla 33.2.

lsbla33.2. Características de los diferentes tipos de enzimas de restricción

Caracterísoca Tipo 1 . Tipo U ~i~ m

Actividad modificación-reshicción

~cturapmteúi ica Requerimientospardla mhicción

Requerimientmpardla metilación

Secuencia específica

Sitio de hidrólisis

Restricción g metilación

Sitio de melilación

Multüuncimial simple

3 subunidade diferentes ATP, SAM, Mg"

SAM (ATP, Mg")

T-G-A-N -T-G-C-T

1000 pb del sitio de unión

Mutuamenteexcluyentcs Especíñco

*aradas

Simple

Mg2*

SAM

h h d m m i ~

En el sitio de unión

separadas Específico

Multifuncional simple

2subunidadesdiferentes

ATP, Mg" (SAM)

SAM (ATP, Mgi')

A-G-A-C-C

26 pb del sitio de unión

Simultáneas

Ekpecítico

u"!me ~od wvs ua aluauienanu asq.rahuoJ anb aua!) 'N(TV le ol!)aui odn~9 ni apaJ wvs la

Fig. 33.2. Reparación de bases alteradas. Cuando por acción de algún agente una basc resulta dañada se vrodu- ce una distorsión en la molécula del ADN que sirve de señal a los sistemas de revaración. Una enzima N-glicosidaaa hidraliza el enlace N-glicosidieo entre la base y la desoxirrihosa. creando un sitio AP (apurinico o apirimidínico). Las endonueleasas AP hidroliran el enlace fasfadiéstcr inmediato. La ADN polimerasa 1 comienza a incorporar nucleótidos al extremo 3 ' -OH, desplazando la hebra da- ñada. Una endonucleasa o la propia polimerasa 1 separan el segmento que estaba dañada y la ADN ligasa eicrra la brccha, dán- dole integridad a la hebra y dejando la niollcula reparada.

Las enzimas del tipo IIIconstan detsubunidades, una R y otra SM, con un tamaño de 106 a 110 kD para la R y de 73 a 80 kD para la SM, y para la unión al ADN se requiere de ATP. Una vez unida, las 2 actividades compiten entre sí, la metilación en el sitio de unión y la restricción unos 24 a 26 pb a uno de los lados.

Esta actividaddelas enzimasse está realizandodemanera constante lo que constituye un sistema de conhol de la integridad del ADN celular, pero cuando se pmdnce un daño sobre el ADN, se ponen en acción otros mecanismos enzimáticos que reciben el nombre genérico de sistemas de reparación. Se presentarán brevemente los principales tipos de daño que pueden ocurrirleal ADN y los mecanismos que permiten su reparación.

Daños al ADN

Existen 3 mecanismos fundamentales que pueden provocar alteraciones estructurales en el ADN y que son: la sustitución de bases durantela replicación, el cambio de bases como resultado de una inestabilidad química inherente a la estructura de la base o del enlace N-glicosídico y las alteraciones resultantes de la acción química o de otro tipo de agentes ambientales. Estos mecanismos provocan algunos defectos.

Bases mal apareadas

Una delas hebras contiene una base qoeno puede formar puentes de hidrógenos adecuados con la otra hebra. Este defecto puede ser el resultado de un error en la replicación que no haya sido rectificado por las polimerasas, lo cual es muy poco frecuente. Otro más común es la desaminación espontáneade citosina a uracilo seguido de la conversión de éste en timina, y menos frecuente,la desaminación de adenina a hipoxantina que forma pares de bases con la citosina y no con la timina.

Estos errores son corregidos por un sistema de N-glicosidasas que comprende las fases representadas en la figura 33.2.

En primer lugar se produce la desaminación, más tarde la Uracil N-glicosilasa (O Hipoxantina N-glicosilasa) hidroliza el enlace N-glicosídico de esos nucleótidos dañados, dejando la base de la hebra opuesta sin apareamiento. Un grupo de endonucleasas conocidas como AP (apurínicas o apirimidínicas) hidroliza el enlace fosfodiéster cuya base ha sido removida, y otros enlaces algunos nucleótidos más adelante,dejando una brecha en la banda dañada. La ADN polimerasa 1 Uena la brecha, pues dispone del extremo 3 ' - 0 H necesario y, por último, la ADN ligasa sella los extremos apareados por la polimerasa 1 y el ADN queda reparado.

Bases perdidas

El enlace N-glicosídico de los nucleótidos de purinas se rompe espontáneamente a temperahiraf~iológicaca con baja velocidad, en un proceso denominado despurinifica- ción. Se puede romper un enlace por cada 300 purinas por día a 37 'C y pH 7,10 que representa unos 1 000 enlaces en una célula animal. La velocidad aumenta al disminuir el pH o al aumentar la temperatura. Como se trató en el capítulo 32, los agentes alouilantes aceleran este oroceso.

Una vez roto en enlace N-glicosídico el proceso de reparación es igual al caso anterior, comenzando con la acción de las endonucleasa AP.

Alteraaones de bases

Las bases nitrogenadas pueden ser transformadas en una amplia variedad de compuestos químicos por la acción de numerosos agentes físicos y químicos, como por

ejemplo las radiaciones ionizantes (las partículas beta emitidas por radioisótopos naturales, o los rayos X) pueden cansar la rotura de los anillos de purinas y pirimidinas y originar diferentes tipos de sustituciones químicas. La base más susceptible es la timina, uno de sus cambios más frecuentes es su conversión en 5,6,dihidroxidihidrotimina (Fig. 33.3 a)). Los radicales libres que se producen durante el desarrollo de diferentes reacciones metabólicas también pueden originar múltiples cambios.

Una de las alteraciones de bases mejor estudiada es la formación de dímeros de pirimidinas, especialmente de timina, provocada por la luz ultravioleta (Fig. 33.3 b)). La formación de estos dímeros por una parte distorsiona la hélice, pues las bases se aproximan una a la otra, y por otra parte debilitan los puentes de hidrógeno con el par correspondiente de la otra banda, esta situación causa la inhibición de la replicación y de la transcripción.

Rohuas de una hebra

Muchos son los agentes que pueden provocar la rotura del enlace fosfodiéster entre ellos los peróxidos, los compuestos que contienen grupos sulfihidrilos (como la cisteína) y metales, como el Fe" y el Cu"'. También se puede originar por radiaciones ionizantes. Lai desoxinibonncleasas que siempre están cerca del ADN pueden accidentalmente provocar tales roturas.

Roturas en las 2 hebras

Se producen cuando se utilizan radiaciones ionizantes muy intensas que al provocar rotura al azar en el ADN, puede suceder que 2 de ellas se produzcan en sitios muy cercanos pero en bandas opuestas. Generalmentese dañan las bases adyacentes y estas lesiones casi nunca pueden ser reparadas (Fig. 33.4).

Enlaces entrecruzados

Algunos antibióticos (mitomicina C) o reactivos químicos (ion nitrito) pueden dar lugar a la formación de enlaces covalentes entre las bases de la misma

Fig. 33.3. Alteraciones de la timina. La timina es la base más sensible a los daños. (a) La formación de 5.6, -dihidruxidihidratimina. (b) La formación del dímcro de timiiia por la acción d e los rayos ultravioleta.

Fig. 33.4. Roturas dc bandas. Las radiaciu- nes ionizanles pueden provocar las roturas de bandas. Cuando la ra- diación no es muy intensa s i producen roturas dc una sola handa, pero cuando son muy intensas provocan roturas múltiples que dc ocurrir en sitios muy Cercanos, y en hehras apuestas, pueden dar lugar a la fragmentación de la molécula del ADN.

Fig. 33.5. Agentes dc entrecruzamiento. Les agentes que producen enlaces covalentes entre las bascs del ADN pueden hacerlo uniendo bases de la misma hebra o bases de las hebras complementarias. Estos agentes son fuertes inhibidores de la replieaeión y de la transeripei6n.

I I I I

I I I I

Fig. 33.6. Reparación por fotorreaetivación. Cuando Is luz ultraviolela prova ca la formación de dimeros de timina y se produce la distorsión de la doble hélice, ésta inferaetús ion el producto de los genea uvr. Si la bacleria se expone a la luz, el sistema se activa y repara el daño al eliminar los enlaces que provo. earm la formación del dimero.

1 1 1 1

1 1 1 1

hebra o de las 2; esto impide la separación de las hebras durante la replicación o la transcripción (Fig. 33.5).

Sistemas de reparaaón

Los sistemas de reparación son de 2 tipos fundamentales: los que dependen de la luz (fotorreactivación) y los que nodependen de ésta (reparación oscura). El segundo tipo incluye 3 niecanismos fundamentales: reparación por escisión, reparación por recombinación y la respuesta SOS.

En todas las células, desde las bacterianas hasta las humanas, ha sido aislada una enzima que interviene en la reparación del daño causado por la irradiación con la luz ultravioleta; eUa cataliza la ruptura de los dúneros de timina (los dúneros de citosina y de citosina-timinase forman en menor proporción y también son reparados por esta enzima) siempre quese produzca una fuerte irradiación con luz visible (300-600 nm) preferiblemente luz solar (Fig. 33.6).

Reparaa6n por eseisi6n

A diferencia del anterior, este mecanismo comprende vanas etapas catalizadas mediante enzimas que aparecen representadasenla figura 33.7. En el primer caso una endonucleasa reconoce la distorsión provocada por el dímero de timina y produce la hidrólisis del enlace fosfodiéster hacia el lado 5' del dímero.

La ADN pol 1 comienza a anadir desoxinucleótidos al extremo 3' y produce el desplazamiento de la banda que contiene al dímero unos 20 nucleótidos. El segmento es hidrolizado por la ADN pol 1 o por otras endonncleasas. El segmento separado es hidrolizado hasta desoxinucleótidos simples más el dímero de timina que es expnlsa- do de la célula y puede recuperarse en el medio de cultivo. El paso final consiste en unir el nuevo fragmento a la hebra que se realiza por acción de la ADN ligasa.

La actividad de escisión en la E. colidepende del producto de 3 genes, uvrA, nvrB y uvrC. Los productos deuvrA y uvrB constituyensubunidadesde una proteína compleja con actividad de endonucleasa, el producto de uvrC es necesario para la máxima actividad in vivo, pero su función exacta se desconoce.

El sistema uvr es capaz de reparar lesiones distintas a los dímeros de timina siempre que éstas produzcan una distorsión de la hélice.

Reparación por remmbinaah

El estudio con mutantes descubrió que la E. coliposee otro sistema de reparación diferente al nvren el cual está implicada la proteína RecA ya estudiada en el capítulo 31.

Fig. 33.7. Reparación por esiisióii. Eii ausencia de la luz, los dimcros de timina son eliminados por la ac- ción combinada de las endonurlea- sas qiie cortan la hebra de ADN cn un sitio próximo a la lesión, la ADN polimerasa que rellena el espacio que dejó el dimero y la lignsa que le da integridad a la hebra reparada.

Componentes celulares y Genética moleailar 567

Fip. 33.8. Reparación por reronibinación. Cuando en el momento d e la replicación las ADN polimerasas encuentran un dimero de timina, reinician la rcplicaeión soslaysn- do el dímero. Posteriormente, por un mecanismo de recombinación se utiliza el sector no dañado de la otra molécula vsecampleta la ban-

Cuando en la replicación la ADN pol 111 encuentra un dímero de timina, se detiene unos segundos y después reinicia la replicación soslayando la existencia del dímero y dejando brechas en la hebra hija. De esta forma no pueden producirse células hijas viables, pues las moléculas de ADN contendrían largas brechas dondequiera que se encontrara un d'únero de timina; sin embargo, es posible obtener moléculas hijas ade- cuadas mediante un mecanismo conocido como intercambio de hebras hermanas.

La idea esencial consiste en que las brechas se llenan con una banda buena de la otra molécula por un mecanismo similar a la recombinación (Fig. 33.8).

Si al replicarse una molécula de ADN, la polimerasa se encuentra con un dímero de timina en una hebra, la enzima reinicia la replicación más allá del dímero, dejando una brecha en la hebra hija; se produce entonces la invasión de la molécula por una hebra en buen estado de la otra molécula. En este paso es donde probablemente participa RecA. La banda invasora es cortada y por la acción combinada de la ADN pol 1 y la

da neoformada; este mecanismo l l l I I aunque no elimina el daño, per-

l l 1 l l l l L L l A ' ! ! l I ! , ,

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mite que la molécula se replique y, que al producirse la división celular, ambas células hijas reeihan una molécula viable de ADN. 1 l / l I l I l 1 I I l

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ADN ligasa queda incorporada a la molécula, esto hace que aparezca una brecha en la otra molécula quees reparada por la acción combinada dela ADN polimerasa 1 y la ADN ligasa.

La reparación por recombinación ha sido demostrada en numerosas bacterias, pero no se conoce si existe en las células animales.

Sistema SOS

En este mecanismo se produce la síntesis del ADN de forma continua sobre los dímeros de timina, por lo cual se obtiene un producto que contiene numerosos errores. Este sistema no está perfectamente esclarecido, pero al parecer determina una pérdida de la actividad correctora de la ADN pol 111. Muchos genes bacterianos están involucrados en la respuesta SOS, de ellos los que mejor se han estudiado son el recA y el lexA. El gen lexA codifica una proteína que actúa como regulador de la síntesis de numerosas proteínas, entre ellas de RecA y LexA. Cuando esta proteha está presente (y normalmente lo está), los genes que intervienen en el sistema SOS están inactivos, o sea, muy poco ARNm es transcrito a partir de ellos. En estas condiciones RecA no presenta actividad proteolítica, sin embargo, cuando la replicación es bloqueada, la pequeiía cantidad de RecA presente es activada ensu formaproteolítica,para lo cual es necesario la presencia de segmentos de ADN de una sola banda. Esta actividad proteulítica funciona sólo sobre determinadas proteínas, una de ellas es LexA que es hidrolizada en 2 fragmentos que noson capacesdeinhihir lasíntesis delos ARNm, por lo que las proteínas del sistema SOS son sintetizadas. Estudios recientes parecen demostrar que LexA sufre un proceso de autoproteólisiis que es estimulado cuando está asociada con RecA. Fenómenos similares ya han sido descritos para otras proteínas.

Cuando la reparación se ha completado RecA pasa a su forma inactiva y LexA vuelve a desconectar el sistema rápidamente.

Reparación de otros daños

El dañocausado por los agentes que provocan la aparición de enlaces entrecnizados es reparado con la participación de los productos de los genes uvr y rec, pero se desconoce su mecanismo.

La reparación de las roturas de una banda requiere el concurso de la ADN pol 1 y la ADN ligasa. Estas roturas generalmente se acompañan de alteraciones de las hases adyacentes con la frecuente formación de la 5,6,dihidroxidihidrotimina y su separa- ción requiere dela actividadde una endonucleasa específica diferente a la utilizada en la eliminación de los dímeros de timina. aunaue el mecanismo es similar. cuva existencia ha sido demostrada en casi todos los organismos incluyendo al hombre.

Los mecanismos de reparación de las roturas en las 2 hebras del ADN han comenzado a dilucidarse recientemente y no existe aún una visión muy completa del proceso, de todas formas es bueno señalar que se trata del tipo de daño más dificil de reparar.

Alteraciones de la reparación

En los últimos años el estudio de varias enfermedades genéticas han llevado a la conclusión de que en algunas de ellas existen alteraciones del sistema de reparación del ADN. En algunos casos parece ser la causa primaria, mientras que en otros se trata sólo de una deficiencia secundaria, por ejemplo, el Xerodermapigmentosum, la ataxia telangiectásica, el síndrome de Fanconi y el síndrome de Bloom.

El Xerodermapigmentosum es una enfermedad que afecta la piel y el sistema nervioso. La exposición a la luz solar en los primeros meses produce eritemas, que

duran varios días, y bronceamiento acentuado. Las lesiones son más intensas y más tempranas en las regiones del cuerpo expuestas al sol: cara, cuello, dorso de las manos, etcétera. La esclerosis dérmica progresiva y las contracturas conducen a la deforma- ción dela boca,los ojos y la nariz. Comúnmenteexiste fotofobia con blefaritis,quera- titis,opacidades y úlceras. Muchos pacientes mueren antes de los 20 años por neoplasma cutáneo metastásicn. En cultivo de células obtenidas de estos pacientes se ha observado una actividad deficiente en cuanto a la reparación del ADN debido a los daños causados por la luz ultravioleta. La enfermedad se trasmite como un rasgo autosómico recesivo.

El estudio de células en cultivo procedentes de pacientes con esta enfermedad ha demostrado que existen al menos 7 grupos de complementación, lo que equivale a decir que al menos existen 7 genes involucrados en la cansa de la enfermedad; estos genes han sido designados XP-A a XP-G y se ha podido determinar que todos los productos de estos genes participan en los mecanismos de reparación por escisión de nucleótidos.

En el cáncer de colon de tipo hereditario y no polipósico se ha determinado que su cansa esencial radica en deficiencia del proceso de reparación del malapareamientos. La mayoríade los casos puedeser ahibuida a mutaciones en los geneshMSH2, hMLH1, hPMSl o hPMS2, los cuales codifican proteínas que intervienen en el proceso de reparación.

La ataxia telangiectásica comienza en edad temprana y a los 10 años los signos de ataxia son de una inestabilidad total, con hipotonía muscular y abolición de reflejos tendinosos, también hay un bajo coeficiente de inteligencia.

La telangiectasia comienza entre los 3 y 4 años de edad, en conjuntiva, orejas y parte expuesta del cuello. Se constata una disminución de los niveles de inmnnoglobulina A. En el cariotipo pueden aparecer variadas aberraciones cromosómicas. Hay tendencia al desarrollode linfomas, la muertellega en edad temprana del paciente. Los fibroblastos de estos pacientes muestran una evidente dismi- nución de la actividad reparadora del ADN,especialmente frente a radiaciones gamma. Se trasmite como un rasgo autosómico recesivo. Parece ser que las alteraciones de la reparación son secundarias y que el defecto principal radica en la mutación de un gen supresor tumoral, al que se ha denominado ATM (siglas del inglés que significan mutado en la ataxia telangiectásica).

El síndrome de Fanconi tiene como signo más sobresaliente la hiperpigmentación y una disminución general del número de células sanguíneas (pancitopenia). Los pacientes presentan baja estatura, tendencia a desarrollar leuceinia. Presentan una actividad de reparación del ADN disminuido sobre todo a la acción de agentes que provocan entrecruzamiento de las hebras. Se trasmite como un rasgo autosómico recesivo. En este caso también parece tratarse de un defecto secundario y el primario está asociado a mutaciones en varios genes supresores tumorales.

El síndrome de Bloom se presenta más en los varones que en las hembras. Existe una evidente fotosensibilidad con aparición de eritemas persistentes desde el primer mes de vida. Después aparecen las telangiectasias principalmente en la cara y el dorso de las manos. Los pacientes poseen baja estatura, pero no existe retraso mental y son individuos sexualmente normales. Existe una disminución de la actividad de repara- ción del ADN, los linfocitos son particularmente sensibles al sulfonato de etilmetano. Tienden a desarrollar leucemias. Se trasmite como un rasgo autosómico recesivo. Se ha reportado recientemente que este síndrome está ligado a mutaciones en el gen de la ADN ligasa.

Otras enfermedades relacionadas directamente con alteraciones en los procesos de reparación son el síndrome Cockaine,la tricotiodistrofia y el síndrome de hipersensi- bilidad a la luz ultravioleta (UV').

Por Último, se ha invocado que una marcada disminución de la actividad de los sistemas de reparación del ADN, pudiera ser la causa principal de las modificaciones que se observan en los individuos durante el periodo de envejecimiento; esto se tratará con mayor detalle en el capítulo SS.

Resumen

No existe otra macromolécnia niyaintegridad estructural tenga parala d u l a el significado vital que tiene el ADN; su conservación constituye por lo tanto una actividad principal de la célula, tanto para evitar la contaminación con ADN forá- neo como para reparar cualquier daño producido en las propias molknlas.

Unas de las primeras características que contribuyen a la conservación del material gen6tico son la propia estmdura del ADN, su asociación con proteínas y su ubicación, que en los eueariontes esta separado del resto de la célula por una doble membrana.

Otro mecanismo lo constituye el sistema de modificación-restricción, pues por una parte permite la idenüíiraeióu del propio ADN y por otra, la degradación de los ADN extraños evitando la contaminación.

No obstante, el ADN es una molécula que está expuesta a daños como son: bases mal apareadas, bases perdidas, alteraciones de bases, rotura de una o de las 2 bandas, formación de enlaces entrecruzados, etc6tera. Para casi todos estos daños existen sistemas de reparación que pueden requerir de la exposición a la luz o no. La fotorreactivación, la reparación por esfisión o por recombinación son mecanismos con los cuales la célula cuenta para enfrentar los daños. El sistema SOS proporciona un mecanismo de emergencia que sólo funciona en caso de daños graves y aunque permite la sobrevivencia del organismo, da lugar a la aparición de múltiples mutaciones.

Algunas de las enfermedades de los seres humanos se deben o se acompañan de trastornos en los mecanismos de renaración. entre otras. el Xeroderma pigmeoúasum, la ataxia telangieet&sica, el sindrome de Bloom, y el síndrome de Fanconi. ÚItimamente se ha planteado la posibilidad de que el proceso de envejecimiento esté tambih relacionado con una especie de agotamiento de los mecanismos de reparación del ADN.

Ejercicios

1. A veces durante la replicación se produce un mal apareamiento de bases que noes detectado por el sistema corrector de la ADN polimerasa 1. Estos defectos pueden ser reparados ¿Cómo pueden las enzimas distinguir cuál es la base mal colocada y cual es la correcta?

2. Si a una bacteria sele introduce un fragmentode ADN deotra bacteriade la misma línea celular jactuará sobre ella el sistema de modificación-restricción?

3. ¿Cuáles son las principales analogías y diferencias estructurales y funcionales entre los 3 tipos de endonucleasas de restricción?

4. ;Por qué cree usted que los daños por rotura en las 2 bandas del ADN casi nunca pueden ser separados?

5. ¿Qué repercusión tendrá sobre la replicación del ADN el tratamiento de las células con mitomicina C?

6. &Qué importancia tiene para el médico el conocimiento de los diferentes mecanismos de reparación del ADN?

Los seres vivos están en constante intercambio de materia, energía e información con el medio, ésta es una característica esencial de la vida, peroesteintercambio no se produce de igual manera en todos los organismos.

Las bacterias, por la forma en que viven, están sometidas a cambios pronunciados del medio, del cual extraen sus fuentes de sobrevivencia. Los eucariontes monocelulares, aunque poseen una estructura más compleja, están en iguales condiciones.

En los organisnios pluricelulares más desarrollados no todas las células se encuentran expuestas a grandes cambios en la composición del medio; en el hombre,sólo las células del tubo digestivo y el hígado experimentan grandes variaciones en la compo- sición del medio; el resto de las células del organismo se desarrollan en un niedio de composicibn prácticamente constante.

Estas condiciones de vida influyen significativaniente en los iiiecanisnios utilizados por cada tipo de organismo, que le permite adaptarse a los cambios anibientales. Los organismos monocelulares deben poseer mecanismos que funcionen de manera rápida, tanto, como cambia el medio; mientras los organismos superiores pueden emplear mecanismos de respuesta más lenta.

La presencia de nutrientes,su tipo y cantidad son algunos de los factores que más influyen en la sobrevivencia de un organismo; si éste no dispone de mecanismos capaces de adaptar su metabolismo,cuando se producen cambios negativos denutrientes en el medio, perecerá en un tiempo más bien corto.

En este capítulo se estudiarán los mecanismos generales de regulación de expre- sión de la información genética en los diferentes niveles, que permiten a los organismos adaptarse a las condiciones cambiantes del medio. Se comienza por presentarlos en procariontes, donde han sido mejor estudiados y posteriormente se hacen algunas consideraciones acerca de los conocimientos actuales sobre la situación en los organismos pluricelulares.

Aspectos generales

Los iiiecanisinos de selección natural han idoconservando las formas de vida que presentan mayor eficiencia. Entre los organismos monocelulares, cualesquiera cambios pernianente ! hereditario que aumenten la eficiencia global del metabolismo celular, hacen que estos tipos crezcan algo más rápido que el tipo silvestre. Si se deja pasar un tiempo prolongado la nueva línea celular, desplazará totalmente al tipo silvestre.

Por ejemplo, si en una población de 10' bacterias que duplican su número en 30 minutos, una bacteria es alterada de forma quesedupliquecada2YJminutos,cii aproximadamente 80 días de crecimiento continuo, el Y9,9 % de la población será del nuevo tipo; este tiempoes quizás muy largoen términosde trabajode laboratorio, pero es insignificante en cuanto a tiempo evolutivo se refiere, por lo tanto, sobre esta base es razonable pensar que los sistemas de regulación surgieron y se desarrollaron en el sentido de ganar mayor eficiencia, como consecuencia del proceso de evolución.

Existen algunas características más o menos generales de la regulación intracelular que pueden resumirse en las siguientes:

1. Las moléculas que ocasionalmente se utilizan, son sintetizadas sólo en el momento para ser empleadas.

2. Una actividad enzimática que consume energía de manera inútil en un momento dado,o utiliza una sustancia que essustrato de otra reacción de mayor prioridad, está frecuentemente inhibida.

3. Cuando existen varias vías posibles de producción de energía, la célula utiliza la que produce mayor cantidad por unidad de tiempo.

4. Una alteración de una vía hiosintética, que reducc la producción de moléculas deficientes, resulta eficaz y tiende a conservarse.

La característica esencial de estos mecanismos de regulación es que ellos se co- nectan y desconectan según la necesidad. No existen ejemplos de mecanismos que estén completamente desconectados y siempre existe un nivel basal de fnncionamien- to. Por comodidad para hacer referencia a un sistema que funciona a su nivel basal, se dice que está desconectado.

En los sistemas hacterianos, donde varias enzimas actúan deforma sucesiva en una ruta metabólica,esfrecuenteel hecho de que, todasestán presentes o todas están ausentes; este fenómeno recibe el nombre de regulación coordinada.

La regulación de la expresión de la información genética, puede realizarse al nivel pretranscripcional, transcripcional y postranscripcional; el segundo caso es el más frecuente y el más económico.

Regulación transcripcional

Los mecanismos inoleculares para cada sistema de regulación pueden variar mucho, pero frecuentementese clasifican en 2 grandes tipos: positivos y negativos.

En la regulación negativa, la célula presenta un inhibidur, cuya acción determina que la transcripción se encuentre desconectada. En la positiva, hay moléculas que provocan una activación del promotor. Las regulaciones positiva y negativa no son excluyentes, y de hecho existen sistemas que están regulados por las 2 formas.

En estos casos se hace necesaria la existencia de 2 efectores. Para evitar confnsio- nes en lo sucesivo, debe tenerse presente la diferencia fundamental entre las 2 formas mencionadas. En la regulación negativa la unión del efector (que suele ser una proteí- na) al ADN provoca la inhibición de la transcripción, en tanto, que en la positiva, la unión determina una activación de la transcripción.

A continuación se presenta un estudio más o menos detallado de los principales mecanismos de regulación transcripcional.

Desde principios de este siglo se conoce que la E. colicuando crece, en un medio que contiene glucosa, no utiliza la lactosa que se añade al medio de cultivo. Si se trasladan las células a un medio carente de glucosa, pero que contiene lactosa como

fuente de carbono, a los pocos minutos las células utilizan la lactosa de manera eficiente. Si al medio anterior se añade glucosa, a los pocos minutos las células dejan de utilizar la lactosa y continúan utilizando sólo glucosa.

Si se añaden al mediosimultáneamente la glucosa y la lactosa, las células utilizan la glucosa y una vez agotada ésta, comienzan a utilizar la lactosa. La primera explica- ción quese dio a este fenómeno,conocido entonces como adaptación enzimática, fue la existencia en las células de precursores inactivos de las enzimas que utilizaban la lactosa y que ésta activaba.

Para investigar la certeza de esta hipótesis se realizó una experiencia que, por su sencillez y claridad, se expone a modo de ilustración.

Se tomó una colonia de E. coli, se puso a crecer en un medio que contenía ["SI-Metionina, al cual no se añadía lactosa; después de algún tiempo las células fueron lavadas y pasadas a un medio con metionina normal, a los pocos minutos se añadió lactosa; se midió la aparición de las enzimas activas y cuando alcanzaron un valor elevado, se homogeneizó el cultivo y se aislaron las enzimas; se midió la radiactividad y se comprobó que no contenían azufre radiactivo.

Se repite la experiencia pero incorporando la metionina radiactiva junto con la lactosa y después de un procesamiento similar se detecta el azufre radiactivo en las enzimas. Como se deduce de este experimento, las enzimas no existen como precnrso- res inactivos en ausencia de lactosa, sino que son sintetizadas totalmente a partir del momento en que la lactosa es añadida, siempre que el medio no contenga glucosa.

Luego pudo comprobarse que además de la enzima b- galactosidasa, que hidroliza el enlace 0-glicosídico de la lactosa produciendo galactosa y glucosa, se producía la inducción de una proteína que llamaron galactopermeasa, pues ésta forma parte del sistema transportador de membrana para los galactósidos. De manera coordinada se regula la síntesis de las proteínas que favorecen el transportedel azúcar hacia el interior de la célula y las que comienzan su degradación.

Hoy se sabe que hay una tercera enzima implicada en la inducción, la denominada galactosa transacetilasa,cuya función en el metabolismo de la galactosa no está totalmente esclarecido.

A este fenómeno mediante el cual la presencia deuna sustancia en el medio provoca la síntesis de una determinada enzima, o grupo de enzimas, se le da actualmente el nombre de inducción de la síntesis de enzimas o inducción enzimática (Fig. 34.1).

El estudio de distintos microorganismos con medios selectivos ha puesto de manifiesto que la inducción endmática no es exclusiva de las enzimas del metabolismo dela lactosa,sino que está presente o relacionada con las endmas que intervienen en el catabolismo de otros azúcares.

Las sustancias capaces de provocar la inducción reciben el nombre de inductores, éstos son metabolizados por la enzima y sus concentraciones disminuyen con el tiempo. Existen sustancias, relacionadas estructuralmente con los inductores naturales, que tienen un poderoso efecto inductor, pero no son metabolizadas por las enzimas, denominadas inductores gratuito$, cuyo empleo ha contribuido de manera eficaz al esclarecimiento de estos mecanismo$. La estructura de la lactosa que es el inductor del operón lac y del isopropiltiogalactósido, que es un inductor gratuito son similares (Fig. 34.2).

Modelo del operón

En 1961, después de casi 20 años de trabajo, Francois Jacob y Jacques Monod del Instiiuto Pasteur propusieron un modelo para explicar el mecanismo molecular por el cual se realiza la inducción de lasíntesis de proteínas. En las páginas siguientes se ofrece la visión actual del modelo, que lógicamente ha sido enriquecido con nuevos aportes desde el monieiito en que fue propuesto.

En el ADN bacteriano se distinguen varios sectores desde el punto de vista funcional; aquellos sectores que codifican la síntesis de polipéptidos específicos, reciben el

Fig. 34.1. Inducción enzimática. La figurii representa los resultados de una experiencia típica de induceiúii de las enrimas del apcrbn lar. Conio se ohserva a los pocos minutas de sir añadida la lactosa (1) coriiien- za la síntesis del ARNm y pustc- riormentr de las encimas correspondientes. Al retirarse la laitosa 12) eonienzará el descenso de la concentración del ARNm que scr6 seguido par una disminución de la concentración de las eniimas.

Fig. 34.2. lnductores del oeerón lae. En la parte supcrier de la tigura se muestra la estructura de la laetusa, que es el inductor natural del operón bc. y en la parte inferior, la de un inductor gratiiito,el isopropiltioga- lactúsido.

Componentes celularts y Guietica molecuiar 575

nombre de genes estructurales, además por la forma en que fueron identificados y localizados originalmente, como consecuencia de una experiencia denominada cis trans, se les da tambiénelnombre decistrones; deahísurgen lasdenominaciones de los ARNm monocistrónicos y policistrónicos (capítulo 27).

Adyacente a los cistrones se encuentra otro sector que controla o regula la expre- sión de los cistrones y recibe el nombre de operador. Como el operador no codifica ningún polipéptid0,ni tampoco un ARN,nose trata de un gen, y para referirse a él se dice el lociis (sitio) operador. El conjunto de segmentos de ADN compuesto por el operador y los cistrones que están bajo su control recibe el nombre de operón; este término también proviene de la informática y se emplea aquí por ser la unidad de operación, lo cual significa que cuando el operón se conecta funcionan todas sus partes como si fueran una sola, igual sucede cuando se desconecta.

Un tercer sector es el promotor, al cual se une la ARN polimerasa. Por último, se distingue un sector que codifica la síntesis de una proteína

especifica, cuya actividad determina el funcionamiento de los cistrones; este sector recibe el nombre de gen regulador y la proteina por él codificada se denomina proteína represora o represor. El gen regulador puede encontrarse adyacente a los cistrones o alejado de ellos.

El funcionamiento del modelo consiste en: la proteína represora es de tipo alostérico y tiene un sitio de elevada afinidad por el ADN del operador en una de sus 2 conformaciones (la R), mientras que en la otra conformación (la T) tiene muy poca afinidad. La unión del represor al operador se produce mediante el reconocimiento de una secuencia específica de bases de estesector, que forma un coniplejo de elevada estabilidad e impide de esta forma el desenrollamiento del ADN, que es imprescindible para la transcripción. Los inductores provocan el desplazamiento del equilibrio conformacional del estado R al T.

Como la unión del represor al operador determina la inhibición de la transcrip- ción, estamos en presencia de un sistema de regulación negativa (Fig. 34.3).

Fig. 34.3. hlodela general del operó". En el ADN se encuentran seriicneias ron diferrntcs fuiirioiics: el gen regulador que codifica a la proteína represara; la zona del opcrador-proiiii,tc>r 10-PI donde se cine el represor y la R N polinierasa, así romo los genes cstrurliirales a ristruiies que codifican la síntesis de proteínm específicas (genernliiiciite cnliiiiasl. Cada oper6ii posee un número caraiteristicu de risfrones.

Se han estudiado numerosos operones inducibles, casi todos relacionados con la utilización celular de monosacáridos, aunque no exclusivamente. Si hien es cierto que cada unoen sus líneas generales se corresponde con la situación descrita anteriormente, se tieneencuenta que cada uno tienesus particularidades. Para los objetivos deeste texto se ha seleccionado aquél que, por ser el primero y más estndiado, ofrece una visión más completa de su mecanismo.

Operón lac

La estructura y el funcionamiento del operón lae han llamado el interés de muchos científicos en los arios posteriores a la proposición del modelo del operón. En estos momentos se tiene una visión completa de todo este complejo sistema (Fig. 34.4).

Pares de bases 1111 -70 3 060 800 800

Polipéptida Reprsmr - Pgalacrusidasa Perrneaa Acetilasti

Peso rnolecular 38 000 - 125 000 30 000 30 O00

Número de arninoScidos 360 1021 -275 - 275

Forma activa Tctrániero Tetrárnero Mcinbriinii Díinrio

Y SU peso 152 000 500 000 30 000 60 1100

Fig. 34.4. Estructura del operón lac. Se muestran las principales características estructurales del operó" lae y de sus productos.

La proteína represora üene características similares a todos los represores conocidos+ trata de un tetrámero formado por subunidades idénticas que presenta una clara simetría molecular (Fig. 34.5).

En el promotor se encuentran las secuencias estudiadas en -35 y en la zona de -4 a -10. El operador, comoera de esperar, presentaunasecuencia repetida invertida con un centro de simetría, lo que concuerda con la estructura del represor (Fig. 34.5).

El represor lac contiene al menos 2 sitios, uno de ellos le permite la unión al ADN y el otro, tiene como ligandos pequeñas moléculas de galactósidos que actúan como inductores. La unión del inductor al represor provoca un cambio de conformación que se trasmite a todas las subunidades, haciendo que todas adopten el estado T, cuya afinidad por el ADN del operador es muy baja. En estas condiciones el represor se disocia del operador, lo que permite la unión de la ARN polimerasa en el locus promotor y da inicio a la transcripción. La traducción del ARNm correspondiente da origen a las enzimas que degradan la lactosa, con lo cual la concentración del disacárido disminuye, provocando la separación del inductor. Esta separación hace que la proteí- na adquiera de nuevo el estado R y en esta forma se une al operador, lo que impide la unión de la ARN polimerasa (Fig. 34.6).

Fig. 34.5. Unión represor aperador en el operóii lac. Eii la parte superior se muestra la estructura primaria dc la zona del aperador lae con sus ranas de simetría a color. En la parte inferior se observan diferentes vistas del complejo formado entre el operador y el represor del aper6n lar.

Componentes celulares y Genetica molecuiar 577

AOd NXV

. . . .. . . . .. . uqaado lap o)uapeuo!aunj [ap ope[Iir)ap o!pw 1s jesor~el el ap uqpeqgn e1 aanpoad as ou aluasard nsa esoanl8 el !S anb loa? :a>ue8oaaa)ir! eun epanb osad :qaauoasap

El sistema AMPc-CAP sirve como regulador positivo de muchos operones relacionados con la utilización de distintos monosacáridos, cuando falta la glucosa todos estos operones están en condiciones de conectarse, pero sólo lo hará el que tenga su inductor presente, debido a que el sistema de transporte de la glucosa y el productor de AMPc están acoplados de tal manera que,cuando se transporta la glucosa, no puede producirse el AMPc y viceversa. Deesta forma los niveles intracelulares del nucleótido cíclico son una señal, que indica la ausencia del transporte de glucosa a través de la membrana y por lo tanto, la célula debe estar preparada para la utilización de otro monosacárido como fuente de energía.

En resumen cuando existe glucosa en el medio, la célula la usa como fuente de energía y de carbono, lo que disminuye los niveles celulares de AMPc; si se añade lactosa (o algún otro monosacárido) no puede utilizarse, pues faltaría el complejo AMPc-CAP, y si se retira la glucosa del medio o se coiisunie toda la existente, los niveles de AMPc aumentan favoreciendo la formación del AMPc-CAP de manera que al añadir la lactosa (u otro azúcar) se inactiva el represor y comienza la tranwripción de los cistrones.

Como el represor al unirse al ADN inhibe la transcripción, se trata de un regulador negativo, pero el AMPc-CAP lo que hace es activar la transcripción, luego es un regulador positivo, por lo tanto, en el operón lac (y en otros muchos) existe simultá- neamente un sistema de regulación que es al mismo tienipo positivo y negativo.

Otro fenómeno relacionado con la regulación de la expresión genética surgió con el estudio de las vías biosintéticas en algunas bacterias, especialmente en la E. coli. Esta bacteria contiene un equipo enzimático que le permite la síntesis de todos los aminoácidos, para formar sus proteínas a partir de una fuente de carbono (puede ser la glucosa) y una fuente de nitrógeno (cloruro de amonio).

Las rutas biosintéticas de algunos aminoácidos son comple,jas y requieren de numerosas enzimas; cuando algunos de estos aminoácidos son añadidos al medio de cultivo se produce un rápido descenso de las concentraciones intracelulares de las enzima5 relacionadas con la ruta biosintética correspondiente. Como en el caso anterior, esta disminución afecta a todas las enziinas involucradas en la ruta, luego se trata de una regulación coordinada. Cuando el aminoácido es retirado del medio se produce un incremento de la concentración de las enzimas; igual que en el caso de la induc- ción, estas variaciones se deben a cambios en la velocidad de síntesis de las endmas y no de su actividad.

Este fenómeno, en el cual la presencia de una sustancia en el medio es capaz de provocar la inhibición de la síntesis de una enzima o grupos de enzimas, recibe el nombrede represión de la síntesis deenzimaso represión enzimática. (Fig. 34.8). A la sustancia que provoca la represión se le da el nombre de correpresor.

Para explicar el mecanismo de la represión enzimática se utilizará el mismo niode- lodel operón descrito antes; se tomará comoejemplo el operóu que controla lasíntesis del triptófano en la E. coli, por ser el mejor conocido.

La figura 34.9 representa la estructura del operón t1.p. El gen regulador codifica la síntesis de la proteína represora, que es también una

proteína alostérica con sitios específicos de u n i h al ADN del operador. Su unión determina la inhibición de la transcripción y con ello sesuprime la síntesisde enzimas, luego se trata de un sistema de regulación negativa.

Fig. 34.8. La represiúil eiiriiiittiea. La figura 111ucs11.a 10s resultados dr una esperiencia tipica dc represióli eiicim6lira. donde al añsdii- el coreprcsor (4) comienza a disini- nuir la cuneentrari<in inti.arelinlar de la enzima, qinc sólo ruelrf a auiiieiitar al retirar el corcprcsor. Estos cambios de eancetitracióii ohedcecn a variaciones eii la sintesis de la enzinia.

Componentes celulares y Genttica moleculm 579

Pares de bases

Polipéptida

Peso molecular

\ / \ Guia Atranilato Indol-glicerol-P T"ptófano

/

sintetasa sinletasa sintetasa

60 000 60000 45 O 0 0 50 000 29000

Fig. 34.9. Eslruetura del operón trp. En la figura se muestran las principales características estructurales del o ~ e r ó n IrD Y de sus oroduetos. La zona o~erador-promotor (PIO) no está bien

A y B las subunidades de la triptófano sintetasa. Los sitios t son terminadores de los cuales existen 2 al final del aperón.

La diferencia con el sistema del operón lac estriba en que en este caso el represor se sintetiza en forma inactiva (conformación T), que presenta muy poca afinidad por el ADN.

La unión del correpresor provoca un cambio de conformación que aumenta extraordinariamente la afinidad por el ADN y favorece la unión con el operador; este correpresor resultó ser el propio triptófano.

Cuando la célula no dispone de triptófano exógeno, su concentración intracelular es tan baja que no hay posibilidades de unión con el represor y,por lo tanto, los genes son transcriutos de forma continua. La adición de triutófano al medio aumenta brusca- mente su concentración intracelular, favoreciendo su unión al represor y con ello la inhibición de la transcripción. La utilización intracelular del triptófano disminuye su concentración, volviéndose a la situación inicial (Fig. 34.10).

Existen varios operones represibles bien estudiados y en líneas generales con- cuerdan con el presentado en este texto, aunque como era de esperar tienen algunas características específicas.

Fig. 34.10. Funcionamiento del operón frp. El apcrón frp funciona de acuerdo con la disponibilidad del triptbfano. Cuando no existe triptófano en el medio celular (A), el represor es inactivo v no ~ u e d f unirse al ooerador. lo cual ocrmitc aue se realice la transcripción de los zenes del

del ARNm correspondiente

l e[ UOJ epeuS!sap euoz a enrasqo as ouio3

ua uimv pp alq!anper] ou euoz el UOJ apuodsauo~ anb'? eqaem alspra u?rl. rauqd la h ropeiado la arlua '6.b~ ei&g el u

El ARNm del operón trp comienza aser leído por el ribosoma, al llegar al péptido guía, como la concentración de triptófano es elevada, estos codones son leídos sin dificultad y el ribosoma avanza a su velocidad normal, sobrepasando las zonas 1 y 2 del ARNm conductor; como la zona 2 no puede formar pares de bases con la 3, ésta h rma apareamiento con la zona 4 y se constituye la estructura necesaria para la termi- nación de la transcripción.

Por lo tanto, a elevadas concentraciones intracelulares de triptófano, en caso de que la transcripción se inicie,ésta termina antes de que comience la transcripción de los cistrones.

A bajas concentraciones intracelulares de triptófano, cuando el ribosoma llega a la síntesis del péptido guía, su movimiento se "atasca", pues no hay trp-ARNt disponible. Esta evidente reducción en la velocidad del ribosoma produceun secuestrode lazona 1, pero deja libre la 2 que forma pares de bases con la zona 3. La formación del brazo 2-3 impide la formación del apareamiento 3-4 y, al no producirse esta estructura, la transcripción continúa (Fig. 34.1 1). A la secuencia de bases que origina la estructura de terminación en la zona conductora se le conoce como secuencia atenuadora y es por ello que el mecanismo en general recibe el nombre de atenuación.

En el caso de estas enzimas hay un doble mecanismo de control, al nivel del represor y al nivel del atennador; es posible que en determinados momentos uno de ellos no funcione, pero siempre existe la seguridad del fiincionamiento del otro. El sistema del atenuador ha resultado ser más general de lo que se pensaba, ya han aparecido varios estudios de secuencias de péptidos guías para diferentes sistemas, incluso, el sistema genético que controla la síntesis de las enzimas relacionadas con la síntesis del aminoácido histidina se controla sólo por el mecanismo de atenuación.

Eficiencia del promotor

Las enzimas que no son inducibles ni reprimibles y por tanto su concentración celular es prácticamente constante, a lo largo de todo el ciclo celular, reciben el nombre de enzimas constitutivas. El hecho de que su concentración intracelular no varíe con el tiempo es un índice de que su síntesis se produce de forma continua; en estos casos, la transcripción es ininterrumpida, pues la vida media de los ARNm es muy corta, es de esperar entonces, que todas las enzimas constitutivas estuviesen a la misma concentración; pero esto noocnrre realmente, lo que se mantiene constante a lo largo del tiempo es la proporción entre las distintas enzimas constitutivas, aunque cada una de ellas presenta su concentración característica.

La clave del problema está en que no todos los promotores funcionan con igual eficiencia. Existen los llamados promotores fuertes, que se transcriben con mayor facilidad un número mayor de veces durante el ciclo celular. Debido a los factores relacionados con su estructura existe una elevada afinidad entre la ARN polimerasa y las secuencias específicas del promotor. La unión de la enzima con el ADN origina rápidamente un promotor abierto de elevada estabilidad, y la transcripción es inmedia- ta. En otros casos los promotores son débiles, se transcriben muy poco. La afinidad de la ARN polimerasa es muy baja por el promotor, y la formación de un promotor abierto estable es un evento poco frecuente, sólo en los casos en que esto ocurre se logra la transcripción.

Por supuesto, pueden darse todas las situaciones intermedias; como cada prorno- tor funciona como promedio un número fijo de veces por unidad de tiempo - caracte- rística de cada uno de ellos- la concentración de cada enzima dependerá de ésta, sin embargo la relación de concentraciones se mantiene invariable.

Este tipo de regulación, aun cuando es posible, es al parecer mucho menos frecuente. Hay pocos casos esclarecidos donde la regulación se exprese por variaciones en el mecanismo de la traducción, una vez formado el ARNm correspondiente.

El caso más esclarecido es la regulación de la síntesis de las proteínas que forma parte de los ribosomas en los procariontes, que como se vio en el capítulo 29 se encuentran organizados en 7 operones.

Es necesario recordar que estos organismos carecen de envoltura nuclear y por ello la transcripción y la traducción están vinculadas directamente. Para formar los ribosomas son necesarias las síntesis de los ARNr y de las diferentes proteínas, por lo que deben ocurrir la transcripción de los ARNm correspondientes a cada uno de los operones y su posterior traducción.

Como cada tipo de ARNr se une a un grupo específico de proteínas durante el proceso de "autoensamblaje" del ribosoma, debe existir una adecuada proporción entm el número de ambos íipm de molénilas. Cuando se "ensamblan" muchos r ihmas, el número de ARNr empieza a disminuir y puede existir una superproducción de proteinas ribosomales, las proteínas que controlan la expresión de cada uno de los operones se unen al ARNm correspondiente impidiendo la traducción. Sólo si aparecen más moléculas de ARNr, puede continuar la traducción, de lo contrario ésta se mantiene inhibida (Fig. 34.12).

Fig. 34.12. Regulaeián de la síntesis de proteínas ribosomales. Para la formación de los "bosomas se requierc de la sintesis de los ARNr y las proteínas en la proporción adecuada. Si se produce un exceso de proteínas, éstas se combinan con su propio ARNm e inhiben la traducción.

Regulaaón en eucariontes

Los sistemas reguladores eucariontes pluricelulares son algo diferentes a los procariontes. La existencia de la membrana nuclear hace al ADN menos sensible a los cambios que se producen en el citoplasma y en el medio. Los requerimientos de las células en organismos pluricelulares son muy diferentes de los procariontes. Las célu- las embrionarias por ejemplo, se multiplican rápidamente, en tanto las células del organismo adulto en ocasiones sólo requieren nutrientes para su mantenimiento, pues se dividen en casos excepcionales o nose dividen en absoluto.

Los estudios en eucariontes se dificultan por no existir técnicas que produzcan y aíslen mutantes,separen y manipulen genes, así como extraer y purificar moléculas de ARNm específicas. En estos aspectos se ha avanzado mucho en la última década, gracias a la introducción de los procedimientos de la tecnología del ADN recombinante.

Por otra parte, la dilucidación de algunos mecanismos reguladores de la expresión genética en eucariontes indica que son numerosas la5 formas en que este fenómenose realiza.

Las características de la organización del genoma de los eucariontes, la existencia de la cromatina, la elevada proporción de secuencias no codificantes, la existencia de mecanismos que permiten el reordenamiento de los genes eucariontes y la misma estructura del gen contribuyen a aumentar las dificultades en el estudio de sus mecanismos de regulación.

A diferencia de los procariontes, existen varios nivelesde regulación en los organismos pluricelulares que se expresan de forma diferente en los distintos tipos de células, y que están relacionados con las distintas etapas del proceso de expresión de la información genética.

Un primer nivel de regulación viene dado por la selección de los genes que deben transcribirse en un momento dado en cada célula. Durante mucho tiempo se pensó que la diferencia entre la eucromatina y la heterocromatina no era sólo un aspecto de apariencia tintorial; hoy sesabeque en la eucromatina están contenidos los genes que se transcriben de forma activa, mientras la heterocromatina presenta los genes que están silenciados. El ejemplo más sobresaliente se da en el par de cromosomas sexuales de la hembra; sólo uno de los cromosomas X es activo, mientras el otro aparece fuertemente "empaquetado" y puede observarse como un corpúsculo que recibe el nombre decuerpo de Barr, en lascélulasde las hembras.

Regulación preir~oscripcional

Los genes que se encuentran en copia única pueden ser suficientes para producir una lenta acumulación de proteínas; por el contrario, una acumulación más rápida de proteínas se logra en el caso de genes de copias múltiples, hecho éste que es habitual en el genoma. Sin embargo, en algunos casos ocurre la amplificación de un gen o conjunto de genes, como sucede en algunas células germinales o en las que desarrollan resistencia a determinados fármacos.

El ejemplo mejor conocido se produce en los ovocitos del Xenopuslaevis, donde los genes para los ARNr se incrementan unas 4 000 veces. La célula precursora del ovocito contiene aproximadamente S00 genes para los ARNr, que después de la ampli- ficación llegan hasta cerca de un millón, lo cual representa e1 75 % del ADN nuclear; esto permite al ovocito sintetizar 10" ribosomas necesarios para la gran cantidad de proteínas que debe formar durante el período inmediato después de la fertilización, en este tiempo de apenas 3 semanas el número de nucléolos se incrementa de uno a varios centenares.

Este ADN aparece como pequeñas estructuras circulares que se replican mediante círculos rodantes, aunque el mecanismo exacto no está totalmente esclarecido; cada círculo puede contener varias copias de los genes de los ARNr.

Una vez queel ovocito ha madurado, el ADN circular esdegradado lentamente. Después de la fertilización el ADN cromosómico se replica y ocurre la mitosis repetidamente, mientras el embrión se desarrolla; sin embargo, el ADN extracromosómico no se replica y este factor unido a su lenta degradación hacen que al alcanzarse el número de algunos cientos de células, este ADN amplificado ya no exista.

La amplificación de los genes para los ARNr se ha observado en gran número de organismos entre ellos insectos, anfibios y peces. En los mamíferos este mecanismo está muy asociado con el fenómeno de resistencia a determinadas drogas; éstas actúan habitualmente como inhibidores enzimáticos. Se han reportado cerca de 10 enzimas cuyas concentraciones intracelulares aumentan mucho, debido a la amplificación de sus genes y de esta forma pueden soslayar la inhibición, haciendo que la célula sea resistente a la acción de la droga; un caso típico de esta situación se discute en el capítulo 84. Por último, es interesante señalar que el mecanismo de amplificación

génica parece ser el responsable de la aparición de algunos tumores malignos cuando el gen amplificado es precisamente un oncogén.

Sin embargo el nivel más estudiado es el transcripcional, especialmente el de la ARN polimerasa 11 que sintetiza los ARNm. El promotor de estos genes es complejo y presenta una estructura modular con 2 tipos de elementos principales. Cerca del sitio de iniciación de la transcripción se encuentra el elemento central del promotor, que en muchos casos contiene la secuencia consenso TATAAT y es el sitio de unión de los factores generales de transcripción (capítulo 27). Más hacia la izquierda estos promotores contienen varias secuencias denominadas elementos distales del promotor, que también son sitio de unión de proteínas y son diferentes para los distintos genes transcnptos por la ARN polimerasa 11. La unión a estos sitios de proteínas específicas en unos casos produce un incremento de la transcripción, o sea, se produce el fenóme- no de la inducción, mientras que en otros casos hay un decremento de la intensidad del proceso, que implica represión. A diferencia de los procariontes, donde los nutrientes son esenciales en la regulación, en los organismos superiores las sustancias determinantes son mensaieros auímicos como las hormonas. aue oor variados mecanismos e ,. . favorecen la unión de esos factores de transcripción géuico-específicos a sus sitios correspondientes; así, la insulina favorece la unión de una proteína especifica en el gen de la glucoquinasa en el hígado y en las células P del páncreas, lo que induce la síntesis deesta enzima.

La complejidad del promotor permite que a éste se unan proteínas que pueden tener efectos contrarios sobre la transcrinción. cuando esto sucede una de ellas es dominante sobre la otra; por e,jemplo, el gen de la fosfoenolpirúvico carboxiquinasa del hígado contiene 2 sitios de unión para el receptor del cortisol, que actúa como un factor génico específico y estimula la transcripción del gen. Más hacia la izquierda, también presenta un sitio de unión para la proteína activada por la insulina, esta unión inhibe la transcripción. Cuando las 2 proteínas se encuentran unidas se produce la inhibición del proceso, lo cual significa que la acción de la insulina es dominante sobre la del cortisol.

También el procesamiento del ARN es un punto de control. El caso mejor conocido se da durante la diferenciación sexual en la Drosophila melanogaster, pero por su complejidad no será estudiado en este texto. También se ha señalado que puede ser un punto de regulación el transporte del ARNm del núcleo al citoplasma, pero losmecanismos involucrados en el proceso no están perfectamente esclarecidos.

Una vez en el citonlasma. el ARNm se une a oroteínas v se mantiene almacenado hasta el momento de la traducción. Algunos ARNm presentan secuencias específicas a las cuales se unen proteínas reguladoras que estimulan o inhiben la traducción, según sea el caso; el ejemplo más conocido es los ARNm de proteínas que están relacionadas con el metabolismo del hierro. Por otra parte, son numerosos los factores de traducción que sufren ciclos de fosforilación- desfosforilación durante la vida celular y esto puede indicar aue están sometidos a mecanismos de re!zulación.

Por último, existen mecanismos que regulan el destino final de las proteínas sintetizadas. Todos los estudios realizados señalan que las proteínas contienen secuencias específicas de aminoácidos o estructuras tridimensionales típicas que indican su lugar de destino: el citosol, el núcleo, los organitos citoplasmáticos o el espacio extracelular.

Todos estos mecanismos están bajo intensas investigaciones, y es de esperar que en los próximos arios se pueda contar con una visión mucho más aproximada de los

mecanismos que regulan la expresión de la información genética en los organismos superiores, especialmente en el hombre.

Resumen

La dependencia manifiesta que existe entre los organismos vivos y el medio donde se desarrollan trae aparejada la neeesidad de la existencia de meeanismos de regulación de la expresión de la información genética, que permite la adapta- ción del complejo metabóiieo celular a los cambios constantes del medio. Estos mecanismos difieren de acnerdo con el tipo de organismo que se irate, ya que estos pueden estar expuestos a mayores o meuom variaciones de las características del medio, sobre todo con respecto a la obtención de nntrieutes.

En general estos mecanismos de regulación se caracterizan por la síntesis de una proteína específica, sólo cuando es u&, la inhibición de actividades enzimeticas que representan un mayor gasto de energía o una mayor producción de deshechos y vías productoras de mayor cantidad de energía metabólica en tiem- pos menores. Otra caracterísUca relevante es la existenda de la regulación eoordi- nada que permite ejercer de manera simuliánea el mecanismo sobrevarias enzimas que intervienen en la mirmia secuencia metabólica.

La regulación de la expresión genética puede rralizarse en 3 niveles fundamentales: pretranseripcional, transcripcional y posbanscripcional. El primero está poco eshidiado y su ejemplo más fehaciente es el mecanismo de ampliñcación génica que tiene lugar en algunas células de organismos superiores.

El nivel transcripcionai se refiere a los mecanismos que actúan directamente estimulando (positivo) o inhibiendo (negativo) la síntesis de los ARNm. En proeariontes existen 2 variantes: las inducción y represión enzimáticas y la atenua- ción.

La inducción enzimática se caracteriza porque la presencia de una sustancia (inductor) estimula la síntesis de proteínas esflcas; en la represión la presencia de determinada susiancia (compresor) provoca la inhibición de la síntesis de pro- teínas también espeeiscas. Estas 2 situaciones recibieron una explicación mole& con la aparición del modelo del operóu, según el cual en el ADN celular pueden disünguirse diferentes sectores funcionales: el gen regulador, el promotor, el operador y los genes estnichuaies (cishones).

El gen regulador codifica la proteína represora que se une al operador y bloquea la síntesis de los ARNm. La interacción del represor con molécuias peque- ñas puedehacer que éste se separe del operador (inducción) y, con ello, se comience la síntesis de ARNm, o por el contrario puede ser n d a esa interacción para que el represor pueda unirse al operador (represión), con lo cual la síntesis de ARNm se inhibe.

La atenuación se caracteriza por la existencia de una zona del ARNm Uamada guía (leader) que contiene varios d o n e s para un aminodcido determinado; si al traducirse esa zona el amino6cido está abundante en la célula, la transcripción se inhibe, en caso contrario conümía.

Muchos operones de inducción requieren además la participación del complejo CAP-AMPc para poder funcionar aún en presencia del inductor.

El ejemplomás sobresaliente en proeariontes de regulación postranscripcional es la síntesis de proteínas nbosomales, las cuales actúan como inhibidores de su propia formación.

La regulación de la expresión genética en los eucariontes plnriceluiares resulta mucho más compleja que en los unicelulares. La zona de transcripción está relacionada con la eummatina, la cual se transerihe de forma activa, mientras la betero~~umaüna apenas lo hace. Los genes tranSrritos por la ARN polimerasa 11 presentan promotores complejos que permiten la unión no sólo de los factores

generales de transcripción, sino, además, de fadores génico espe&cos que unas veces estimulan el proceso y otras veees lo inhiben. De esta forma se reaüzan en estos organismos los fenómenos de inducción y represión de la síntesis de proteínas. En ocasiones, un mismo gen puede estar bajo el efecto de los 2 tipos de factores (setivadores e inhibidores) y en esos ess<w el efecto de uno de ellos predomina sobre el otro.

También parreen ser puntos de control el procesamiento del ARNm y su transporte hacia el citoplasma También exisien indicios de repuiación al nivel de la traducción y del m&mu por el cual las proteínas sintetizadas alcanzan su desüno final. Los estudios que se realizan en estos momentos auguran que en los próximos años se tendrá una información más detallada de los mecanismos de regulación de la exprrsi6n genética en los organismos superiores, especialmente en el hombre, tal vez eUo pueda contribuir a su bienestar y felicidad.

1. ;Qué repercusión podría tener sobre el mecanismo de regulación del operón lac, una mutación en el gen regulador que produjera una modificación en la conforma- ción de la proteína represora? Discuta por lo menos 2 alternativas.

2. ;Cómo podría afectarse el funcionamientodel operón lac,si ocurriera una muta- ción en la zona del operador-promotor? Discuta al menos 3 posibilidades.

3. ¿Cómo repercutiría sobre el funcionamiento del operón lac una mutación que diera origen a la aparición de un codun de terminación en la zona central del cistrón de la p- galactosidasa?

4. ;Qué características debe poseer una sustancia para poder actuar como inductor gratuito de un operón determinado?

5. Si en la zona guía del ARNm del operón trp ocurriera una niutación, que diera lugar a la aparición de un tercer codon para el triptófano, ;influiría esto en la sensibilidad del mecanismo de atenuación a los cambios de concentración del aminoácido en la célula?

6. ;Cómo puede el mecanismo de amplificación génica regular la síntesis de proteí- nas específicas?

7. ¿Cree usted que el mecanismo de regulación postranscripcional utilizado en la síntesis de proteínas ribosomales pudiera ser igualmente efectivo en otras proteínas conjugadas?

Entre las ciencias teórica y técnica existe una relación dialéctica. La teoría busca el conocimiento de las leyes generales de la naturaleza a partir del estudio detallado de numerosos fenómenos, en tanto, la técnica persigue el objetivo de convertir esos conocimientos en instrumentos prácticos vinculados directa o indirectamente a la producción material.

Esta interacción se ha hecho tan evidente en las últimas décadas, con la aparición de la revolución científicotécnica, que ha llevado a formular la tesis de la conversión de la ciencia en una fuerza productiva; pero existe también la relación inversa, o sea, los avances tecnológicos también contribuyen, de forma considerable, al desarrollo de la ciencia teórica con la producción de instrumentos que alcanzan cada vez un grado más elevado de perfección y que sirven para profundizar aún más en el conocimiento de la naturaleza. A esta situación no escapan algunos campos, al parecer tan alejados, de la vida práctica como la genética molecular.

Existen muchos ejemplos de como en los últimos 40 años, el desarrollo tecnológico ha conducido a gigantescos pasos de avance en el conocimiento de la biología molecular. La difracción de rayos X permitió a los investigadores tener una visión detallada de la estmctura de las macromoléculas, asícomo la técnica de centrifugación en gradientes de densidad de CsCl abrió las puertas al conocimiento del mecanismo de replicación del ADN. La adquisición más reciente lo constituye la técnica para unir moléculas de ADN in vitro,denominada tecnolw'a del ADN recombinante. Esta técnica básica y sus múltiples variantes han revolucionado el estudio de la genética de los eucariontes y ha proporcionado fuentes de proteínas específicas en cantidades consideradas anteriormente casi imposible.

En este capítulo se estudiarán los procedimientos generales de esta tecnología y algunas implicaciones de sus procedimientos, en especial aquéllos que más vinculados están con la práctica médica. No se pretende, ni mucho menos, hacer un análisis pormenorizado de este tema,qne por lodemás estáen constante crecimiento,ni siquiera dar una descripción de sus múltiples procedimientos. El objetivo principal es dar a los lectores una idea de cómo estos conocimientos del nivel molecular de la biología pueden ser utiluados en la práctica.

Piocedimiento general

Existen numerosos procedimientos para la manipulación de los genes, de acuerdo con los objetivos que se persigan. Un procedimiento general para la

Obtención de genes específicos

El mayor impacto de esta tecnolg'a fue sobre los mecanismos de las células eucariotas, por eso sólo se hará referencia a la obtención de genes eucariontes en forma simplificada, pues en ocasiones, la complejidad del proceso rebasa los límites de este texto.

El primer intentodeobtención de ungen eucariontefue directamente de lacélula; se extraían las moléculas de ADN y seexponían a la acción de una enzima de restricción; los fragmentos quese obtenían solíanser muy grandes y eranecesario volver afragmentarlos medianteunaendonucleasa con especificidad diferente a la primera; esto podía repetke varias veces basta obtener fragmentos de tamaño adecuado para su manipulación. El estudio de los puntos de corte de varias enzimas sobre una molécula de ADN origina los h d o s m a p a s de restricción, queconsisten en la representación dela molécula de ADN, señalando los puntos donde es cortada por cada una de las endonucleasas ensayadas; cuando se tem'a el fragmento deseado se procedía a su inserción en un vector. Pero este procedimiento no dio los resultados esperados; a partir de experiencias de este tipo fue que quedaron establecidos el carácter disconünuo de los genes eucariontes y la existencia de los intrones; estas características entorpecían la expresión de los genes eucariontes en bacterias.

El segundo procedimiento consistió en aislar no al geu,sino al ARNm transcrito a partir de él, para ello generalmente se seleccionaba una célula especializada en la síntesis de determinada proteína, de manera que la concentración del ARNm fuera lo más elevada posible, por ejemplo, los reticulocitos para el ARNm de la globina, las células P del páncreas para ARNm de insulina, etcétera. Este proceder tiene la ventaja de que ya han sido eliminados los intrones. Para la obtención del gen se incuban el ARNm con los 4 dNTP y una enzima que se obtiene de retrovirns, que es capaz de formar una molécula de ADN tomando como molde una de ARN, por lo cual se le ha denominado

ADN comolementario (ADNcL en el cual se conserva la información necesaria Dara la . , síntesis de proteínas, pero se han eliminado los intrones y, por lo tanto, no se requiere del procesamiento del transerito primario.

El tercer procedimiento consiste en hacer la síntesis artificial del gen; en estos casos se parte de la kuencia de aminoácidos del péptido, pues la síntesis de ADN muy largos no ha sido posible aún, y se deduce la secuencia de bases del ADN mediante el código genético.

Esta secuencia no necesariamente es igual a la del gen natural debido al carácter degenerado del código. Por procedimientos complicados de síntesis artificial se logra una copia del gen con la secuencia de bases específicas.

Para el proceso de recombinación Ni vitroson necesarias las enzimasde restricción, que ya fueron estudiadas en el capítulo 33. A los efectos de este procedimiento se tendrán en cuenta sólo 2 tipos de enzimas, aquéllas que al producir el corte sobre las 2 hebras del ADN lo hacen de forma que originan pequeños fragmentos monofíbrilares, y las que cortan en el mismositio las2 hebras sin dejar en el producto este tipo de fragmento; esta distinción se hace porque, de acuerdo con el tipo de enzima empleada, el procedimiento que se debe seguir será diferente.

En el primer caso se opera de la forma siguiente: se extrae el ADN de la célula y se digierecon una enzima de reshicción,sea laEcoR1,deesta formase obtienen numemros fragmentos. El vector que se va a emplear se digiere igualmente con la misma enzima; se trata de que el vector empleado sólo tenga un sitio sensible a la acción de la endonucleasaempleada; despnésse incuban juntas las 2mnestras de ADN para permitir su recombinación y se añade ADN ligasa para sellar las brechas y dejar la molécula insertada en el vector (Fig. 35.2).

En el segundo caso se requiere de una enzima que es algo excepcional y que se obtiene de algunos tejidos animales, se trata de la nuclwtidil transferasa terminal, la cual es una ADN polimerasa que aiiadedesoxinucleótidos (a partir de WTP) al exiremo 3 ' - 0 H de un fragmento de ADN de cadena simple, con el hecho sobresaliente de que no requiere un molde para su acción.

Componentes celulares y Genetica moiacuiar 591

La recombinación in vitrotambién ha permitido un modo relativamente fácil para la obtención de genes. En ocasiones es más sencillo trabajar con el genomacompleto que con un gen particular, sobre todo si este Último es desconocido; eso se logra de la forma siguiente: se extrae el ADN celular y se corta en fragmentos, utilizando enzimas de restricción en fases sucesivas hasta que los fragmentos tengan un tamaño de fácil manipulación, estos fragmentos se aíslan unos de otros y cada uno es recombinado con un ADN viral, generalmente de fagos. Las colonias de fagos bien identificadas se conservan, y pueden servir para la identificación de genes específicos; a esta colección del genoma de una célulaen fragmentos guardados en vectores específicos, casi siempre en virus, se le da el nombre de genoteca.

¿Cómo buscar un gen en una genoteca? Existen varios procedimientos pero sólo se hará referencia a uno de ellos, un ejemplo hipotético será más ilustrativo. Suponga que un tipo de bacterias sintetizaunasustancia P& que es necesaria para so crecimiento y reproducción, se obtiene un mutante de fenotipo Pq, que no sintetiza esa sustancia; si se tiene una genoteca de la bacteria Pq+ se puede aislar el gen mutado, para ello haga crecer las bacterias Pq-en varias colonias añadiendo al medio de cultivo la sustancia Pq, luego infecte cada una de las colonias con un virus de la genoteca portador de un fragmento del ADN. Si se elimina la sustancia Pq del medio de cultivo, sólo podrán crecer aquellas bacterias que han incorporado de la genoteca el gen mutado. Como el fragmento está identificado puede fragmentarse con enzimas de restricción y hacer una suhgenoteca, que vuelve a probarse en otros cultivos, y así sucesivamente hasta obtener el gen que se busca. Por un procedimiento similar a éste se pudo descubrir y aislar el oncogen ras.

Otros procedimientos de recombinación in vitro no serán discutidos.

En el acápite anterior se him referencia a los vectores; se entiende por vector a una molécula de ADN que se emplea para introducir el gen deseado en una célula. Para que un vector sea útil debe reunir las condiciones siguientes:

1. Debe ser cauaz de reolicarse. 2. Debe existir algún procedimiento para detectar su presencia. 3. Debe haber alguna forma de introducir el vector en una célula.

Los 3 tipos fundamentales de vectores empleados en estos procedimientos y que, por lo tanto, cumplen estos requisitos son los plásmidos, algunos virus- especialmente los hacteriófagos- y los llamados cromosomas artificiales de levadura.

Los plásmidos son moléculas circulares de ADN extracromosómico encontradas en muchas bacterias y en algunas especies de eucariontes. Muchos plásmidos contienen genes que son esenciales en determinados medios; por ejemplo, los plasmidos del tipo R contienen genes que aportan a la célula la resistencia a determinadosantibióticos, que pueden aparecer en el medio por acción humana o por la presencia de otros microorganismos que los producen. Los pIásmidos de éste y otros tipos son generalmente identificados por los genes que portan, sin embargo, en ocasiones, el plásmido es encontrado de manera accidental como una peqneña molécula circular de ADN presente en una muestra aislada de un extracto celular.

Los plásmidos tienen por lo regular una sola moléculade ADN, cuyopesomolecular está entre lo6 para los menores y 108 para los mayores.

Los plásmidos sólo pueden replicarse dentro de su propia célula, pero la forma en que lo hacen no es necesariamente igual a la que se utiliza en los cromosomas, incluso 2 plásmidos de una misma célula pueden tener formas distintas de replicación. Se pueden distinguir 2 tipos de plásmidos de acuerdo con el control de su replicación: los de control estricto y los de control relajado; los del primer tipo existen en muy pocas copias por célula y su replicación se realiza junto con el ADN cromosómico, y al dividirse la célula se reparten de forma equitativa entre las 2 células hijas, y los del segundo tipo existen en un número mayor y su replicación es independientede la del

Componenees celulares y Gen6tica molecuiar 593

Fig. 35.4. Mecanismo de la penetración de un virus. Los virus se fijan a la pared de las células bacterianas e inyectan su material genético al interior de la célula. en tanto, las proteínas que forman la cubierta de virus se quedan en el exterior; esta hace que los virus puedan ser utilizados dicientemente como veetores en las experiencias de ADN recombinante.

ADN cromosómico. Si se inhibe la síntesis de proteínas, estos plásmidos se multiplican rápidamente y pueden llegar a haber cientos por célula por lo que son preferidos para ser empleados como vectores.

Muchos plásmidos pueden transferir una réplicade ellos desde una célula donante a una receptora; por ejemplo, si una sola célula de E. coü que contiene el plásmidoF se añade a un cultivo de células tipo F- que no contengan el plásmido, después de varias generaciones una gran proporción de células contendrá el plásmido F, o sea, se ha realizado la transferencia de una réplica del plásmido F, de una célula F' a una célula F-,sin que la célula inicial haya perdido el suyo. Como después de la transferencia,F se replica, con cada transferencia aparecen más células donantes y como el fenómeno ocurre 1 a 2 veces por generación, el plásmido se propaga rápidamente en el cultivo. Estas características de los plásmidos, así como su posibilidad de conjugación (capítulo 31) hacen de ellos unos magníficos portadores de genes para la tecnología del ADN recombinante.

Los demás vectores más empleados son los virus, éstos se encuentran formados por una molécula de ADN y una cubierta de proteína$. Cuando un virus se añade a un cultivo bacteriano, éste se fija a la pared celular e inyecta su ADN al interior, en tanto, las proteínas de la cubierta quedan fuera, como se muestra en la figura 35.4.

Dentro de la célula el virus utiliza el aparato metabólico de ésta para la replicación de su ADN y la síntesis de las proteínas virales, de manera que con un solo virus que penetre en una célula pueden obtenerse cientos de copias del ADN viral, que después puede recuperarse con relativa facilidad.

Los cromosomas artificiales de levadura son grandes moléculas de ADN, que se construyen con los centrómeros y los telómeros de cromosomas de levaduras y segmentos de ADN extraño; también contienen las secuencias necesarias para la replicación. El criterio de selección del vector está determinado esencialmente por el tamaño del gen deseado. Los plásmidos son capaces de acomodar los genes más pequeños, en tanto los cromosomas artificiales de levadura acomodan los de gran tamaño y los virus,los de tamaño intermedio.

Una vez que el gen deseado ha quedado incorporado al vector, éste debe ser transferido al interior de unacélula, locual en el caso de los plásmidos puede hacerse mediante sales de calcio que aumenten la permeabilidad de las membranas de Las células hacterianas.

En el interior de la célula el ADN se replica muchas veces, por lo que se originan numerosas copias del gen deseado, o sea, el gen ha sido clonado.

Si el gen no es muy grande puede realizarse la clonación in vitro mediante el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa; para ello es necesario contar con 2 pequeños oligonucleótidos que sean complementarios a los extremos 5 ' del gen, los cuales tendrán la función de servir de iniciadores; se procede de la forma siguiente: el ADN se calienta a una temperatura de aproximadamente 94 T para provocar su desnaturalización, después se añaden los oligonucleótidos j se enfría lentamente hastaunas56 "C,para permitir la hibridación de los oligonucleótidos a los extremos 5 ' de las 2 hebras del ADN desnaturalizado; entonces se añade una A D S polimerasay la temperaturaseeleva a 72 'C para realizar la elongación del iniciador.

En la actuaüdad todos los componentes del sistema, incluyendo los 4 desoxinucleósidos M&tad~se~Smiultáneamente,pne~seublizalaenzimaTaq,e>maídadel Temwphü~~ aquaticus, que es resistente a los cambios de temperatura. Existen equipos que hacen todo el procedimiento de manera automática. El primer ciclo demora casi 90 segundos, pero para los siguientes pueden utilizarse entre 50 y 60 segundos; se debe tener presente que en cada ciclo, el número de moléculas de ADN presentes se duplica, por lo cual existe un crecimiento exponencial del tipo 2", donde n es el número de ciclos. Por este procedimiento pueden obtenerse numerosas copias del gen en escasos minutos.

Identiñcaeión del gen pec0mbinado

El plásmido más empleado para la clonación es el pBR322 de E. coli, que tiene un peso molecular de 2,9 x lo6 y porta los genes para la resistencia a la tetraciclina (tet) y a la ampicilina (amp), por lo que las bacterias que contienen el plásmido pueden ser detectadas al ponerlas acrecer en un medio que contenga esos antibióticos. Además, este plásmido presenta 7 sitios de restricción para otro tanto número de enzimas.

El método más empleado para detectar el plásmido recombinante es el llamado inactivación por inserción. Los sitios para las enzima. BamHI y Sal1 están dentro del gen tet, luego si se produce la recombinación utilizando cualquierade estaF enzimas, el plásmido se torna amp' y tet-, o sea, ha ocurrido una inactivación del gen tet por la inserción del ADN que queremos donar.

El procedimiento en líneas generales es como sigue: el gen deseado se inserta en el gen tet del plásmido pBR322 y éste se añade a un cultivo de E. colique sea amp- tet. Después de esperar un tiempo adecuado para permitir la penetración del plásmido, las células se transfieren a un medio que contiene cicloserina y tetraciclina. La cicloserina mata a las células que crecen, se multiplican y que son resistentes a la tetraciclina. Las quecontienen el plásmido recombinado no pueden crecer por la presencia de tetraciclina en el medio; después de un tiempo prudencial las células se lavan y se cambian a un medio que contiene ampbilina, antibiótico al cual las células son resistentes.

Por este procedimiento sobreviven las células amp' tet-, que son precisamente las que contienen el plásmido recombinado (Fig. 35.5)

+ + amp tet

am; tet ?, m p - tet

+ * amp tet amp te1

+ amp tet

smp tct

Fig. 35.5. Ideiitiiiiarión del plásniido ~.ecombinado. Si empleamos un plásmido que tiene los genes ,>ara la resistencia a la tetraciclina (tet) y a la ampicilina (amp), o sea, es de tipo tet'amp; Y el D S de iiuestro interés se incorpora en la zona del gen tet, se origina un plásmido que es tet aiiip-. Si este plásmido rciombinndo sc introduce en una bacteria que sea te t amp, la Iiiirtci.ia re torna ter amp*. Estas baeteriasse exponen a la acciónsimultáneadela tetraciclina ! la cicloseriiia. Como las bacterias que sean tet* crecen y se multiplican, la cicloserina las iiiata. en tanto. las ter, como presentan una inhibición de su crecimiento, na son afectadas por la cicloserina. Si después las bacterias sobrevivientes se pasan a un medio que contiene ampicilina, sólo quedarán aquéllas que sean resistentes y, par lo tanto, sean ter amp*, que son las que han incorporado el plásmido recombinada.

Problemas en la producción de proteínas eucariontes

La utilización de bacterias para la producción de proteínas de eucariontes origina los problemas siguientes:

1. Las ARN polimerasas bacterianas no reconocen los promotores de eucariontes. 2. Los ARNm transcritos de genes eucariontes no contienen en el extremo conduc-

tor la secuencia rica en purinas, que permite a los ARNm de procariontes unirse específicamente al ribosoma.

3. Las proteínas eucariontes sufren modificaciones postraduccionales específicas. 4. Las bacterias contienen proteasas que reconocen como extrañas las proteínas

eucariontes y las bidrolizan.

Los problemas 1 y 2 pueden eliminarse si el gen se une previamente a un promotor bacteriano, por ejemplo, el promotor del operón lac.

El procesamiento de las proteínas en general se realiza in vitro. La protección contra las proteasas se logra en ocasiones por la obtención de bacterias mutantes, que carecen de esa actividad especíñca, o por el empleo de inhibidores. Aun así, no es fácil lograr todas las condiciones requeridas para un caso específico, de ahí que el número de experiencias exitosas no sea aun muy elevado.

Expresión de genea donados

Para la expresión de los genes clonados es necesario que éstos sean transcritos y traducidos, para eso debe constmirse el llamado vector de expresión.

Si el vector utilizado en la clonación contiene un promotor cerca del sitio de inserción, este promotor puede ser usado, pero en muchos casos el vector carece del promotor adecuado, entonces es necesario reconstruirlo de forma que contenga, además del gen deinte&,el promotor adecuado. En estos casos se trata de emplear un promotor fuerte para hacer máxima la transcripción, o un promotor que presente alguna característica especial.

El procedimiento comúnmente ualizado es rediseñar un plásmido, de manera que contenga la región promotor operador del operón lac y hasta un pequeño sector del gen de la p- galactosidasa seguido del gen deseado. En estas condiciones la adición del inductor conectará el sistema que producirá la proteína deseada, y la adición de glucosa desconectará el sistema al aumentar la concentración intracelular del AMPc.

El trabajo más difieil consiste en la purificación de la proteína producida, pues es una tarea muy labo-riosa que requiere una gran destreza y en la mayoría de los casos no poca imaginación.

A pesar de todos estos recursos no siempre se logra la expresión del gen; sólo una de las 2 hebras del ADN es utilizada como molde en la transcripción, y en el proceso de recombinación artificial se introduce ADN de doble hebra. Como los 2 extremos son iguales, por la simetría dela secuencia,existe la posibilidad de que el apareamientose produzca de forma que coincida la cadena codificadora del promotor con la no codificadora del gen insertado, en este caso la expresión es imposible.

Basta quema o varias célulaslogren la incorporacióndel gen enla forma adecuada, para que al cabo de algunas horas se tengan tantas copias como se quiera; la E. coli tiene un tiempo de duplicación de sólo 30 minutos.

Experiencia típica

Una vez conocidos todos los elementos de trabajo, así como las dificultades que encierran estos experimentos, se describirá una experiencia exitosa de síntesis de un producto eucarionte por medio del aparato metabólico de la E. Coli, se trata de la

somatostatina, una hormona polipeptídica de 14 aminoácidos que se sintetiza normalmente en el hipotálamo y el páncreas.

Como el número de aminoácidos es pequeño, se procedió a la síntesis artificial del gen que contiene51 pb, cuya secuencia en la banda codificadora sería:

T A C-( las 42 bases que codifican la somatostatina)-A C T A C T

la secuencia de bases en el ARNm sería

A U G-( las42 bases de lasomatostatina)-U G A U G A.

Así, este ARNm tiene un codon para la metionina (que no se emplea en la iniciación), la secuencia codificadora y 2 codones de terminación consecutivos.

Se uolizó como vector un plásmido de E. d i q u e fue reconstruidocon un segmento del operón lac y que contenía la zona del promotor operador, así como un pequeño sector del extremo N-terminal de la P galactosidasa. El vector fue cortado mediante una enzima de restricción y recombinado con el ADN sintetizado.

Una vez lograda la incorporación del pl&mido a la bacteria, éstasfueron colocadas en un medio de cultivo carente de glucosa al que se adicionó isopropiltiogalactósido (IFTG), un inductorgratuitodel operón lac.

Cuando se produce la inducción se obtiene una proteína que contiene un segmento del extremo N-terminal de la p- galactosidasa, unido a la somatostatina mediante la metionina, y que termina gracias a la doble señal de terminación del ADN sintetizado. Esta proteína es purificada y tratada con bromuro de cianógeno, un agente que provoca la ruptura de enlaces peptídicos del lado carboxíiico de la metionina,de esta forma la metionina ligante queda unida al extremo de la galactosidasa y se libera la somatostatina (Fig. 35.6).

H>N Met A l a -Gly X y s -Lys -AsN P h r -Phc , TI,,

O=C - Cys - Ser - TE - Phr - Tic - Lys ' HO'

Met H,N-Ala-Gly Ser-Cys-C=O

'OH

El uso de la metionina como ligante puede ser útil en la síntesis de péptidos pequeiios, a menos que la metionina forme parte de la estructura del péptido.

En la actnalidad se han logradosintetizar otras proteínas de eucariontesmediante procedimientos similares al descrito como son: la insnlina, hormona pancreática de gran importancia en el tratamiento de la diabetes mellitus, la ovoalbúmina y especialmente el interferón humano, un potente agente antiviral y posiblemente antitumoral. Esta proteína es producida actualmente en nuestro país por diferentes - - prncedimientos como ingenie& genética y fue utilizada en el tratamiento de la epidemia de dengue hemorrágico, introducida de manera criminal en Coba y que costó la vida a

Fig. 35.6. Síntesis de la somatostatina. El plimiido hir ~ ~ o n s t n i i d o con el gcii de la somatostatina, sintetizado artificialmente, y el promotor del opedn lac El d o n pana la metioninn pemiitiúqueal tratarel prndueto ron bromuro de iianógexio se liliernrn la sonratostatina del segniento de B.gdalact<sida% qiic tenía unido.

más del00 personas entre ellas a muchos niños.

En principio cualquier proteína eucarionte puede ser producida mediante esta tecnología con un sistema apropiado.

Fig. 35.7. Alelos que difieren en sus sitios de restricción. Los genes A l y A2 son aleles que se difereiirian porque en unos de ellos la iiiiitnción ha originatlo un nuew sitio de res- tricción. Así, cuando el ADN es tratado con esa enzinia, el alelo Al originará un solo fragmento de restricción de 20 kh, en tanto, que A2 origina un frazrnenta de 8 kb

Empleo diagnóstico

La presencia de formas alélicas de un gen en un individuo, que en algunos casos pudiera ser patológica, es detectada habitualmente por electroforesis o métodos antigénicos de las variantes de proteínas, aun cuando se sabe que ello se debe en última instancia a variaciones en la secuencia de bases del ADN en los loci cromosómicos correspondientes. Recientemente métodos derivados de la tecnología del ADN recombinante han permitido el análisis directo de las secuencias del gen, así como determinar sus alteraciones específicas que provocan cambios estmctnrales de una proteína particular. La utilidad de esta técnica es que permite la distinción entre 2 copias de un locnsparticular del genoma humano.

El método más utilizado en la práctica para el estudio de las variaciones génicas es el uso de las enzimas de restricción; como estas enzimas realizan su acción en sitios específicos del ADN, un cambio en la secuencia puede conducir a la aparición o desaparición de un sitio particular y, por lo tanto, se altera el tamaño de los fragmentos que se obtienen cuando el ADN es digeridoutilizando esa enzima; lo mismo ocurre si existen deleciones o inserciones.

La diferencia en los tamaños de los fragmentos de una región determinada de cromosomas homólogos puede ser detectada, con lo que se determina la existencia de los alelos.

Suponga que un gen presenta 2 alelos Al y A2, en el Al existen 2 sitios reconncidos por una enzima de restricción separados por una distancia de 20 kb; pero en A2, producto de las mutaciones, ha aparecido un nuevo sitio de restricción para la misma enzima entre los 2 anteriores, de manera que la acción de la enzima dará lugar a 2 fragmentos de 8 kb y 12 kb, respectivamente (Fig. 35.7).

Si el ADN de una célula se extrae y fragmenta con la enzima de restricción, se obtendrán numerosos fragmentos que deben ser sometidos a electroforesis en gel de agarosa para separarlos de acuerdo con su tamaño.

-

Se prepara un polinucleótido que contenga una secuencia de bases similar a la del fragmento con tamañode8 kh, utilizando dNTPmarcado con fósforo radiactivo, que recibe el nombre genérico de sonda.

Una vez terminada la electroforesis, la placa de agarosa se transfiere a un soporte sólido embebido en una solución que contiene la sonda y se da el tiempo suficiente para permitir la hibridación entre la sonda y el ADN fragmentado. El soporte se separa delasolución y se cubrecon una placa fotográfica (autorradiografia) qne,al ser revelada, muestra la posición de los fragmentos de interés. Como la sonda sólo puede hibridarse en la zona del fragmento de 8 kb, aparecerá unida tanto al alelo Al como al fragmento pequeño del alelo A2, que por ser de diferentes tamaños aparecen en sitios diferentes en la autorradiografia (Fig. 35.8).

Si una familia es portadora de una enfermedad genética producida por genes de este tipo, puede hacerse el diagnóstico prenatal mediante la obtención de células del líquido amniótico y procesándolas de esta manera. En nuestro país ha sido introducido, hace algunos años, un procedimiento similar para el diagnóstico prenatal de la sicklemia. Procedimientos de este tipo pueden ser utilizados en los departamentos de

realizar una caracterización más profunda de la trasplante de órganos para compatibüidad entre los donante y los receptores. También este proc~dimiento puede ser utilizado en medicina legal, siempre que en un hecho delictivo queden como huellas células de los delincuentm, como en el caso de homicidios, violaciones, etcétera.

Perspectivas

Muchos son los campos del quehacer humano donde la tecnología del ADN recombinante puede dar grandes resultados. La introducción de genes específicos en bacterias puede ser de gran utilidad, si estos organismos con su actividad provocan un mejoramiento del suelo, un incremento en la fijación de nitrógeno u otras

Fig. 35.8. Identificación de fragmentos de restricción. El ADN genómieo de 3 individuos es fragmentado mediante una enzima de restricción. Los fragmentos se someten a una electroforeais en gel de agarosa que los separa de acuerdo con su longitud. Se transfieren a un soporte sólida y se embeben en una solu- ción que contiene la sonda radiactiva durante el tiempo ne- ce5arbpara permitir la hibridación; después se somete a un iiroceso de

se observa en las resultados, el sujeto A es homocigótico para el alelo A l (de 20 kb), el sujeto C es homocigótico para el alelo A2 y el B es heterocigótiea, pues presenta tanto el alelo A l de 20 kb cona el A2 que origina el fragmento de 8 kb.

Componentes celulares y Genttica molecular sss

modificaciones que hagan que se obtengan cosechas más productivas, tanto cualitativa como cuantitativamente.

La producción de agentes biológicos, que ayudan al hombre a combatir las enfermedades en formas inocna y económica, es también una de las posibilidades de estas técnicas.

La producción de microorganismos, que ayudan a combatir la contaminación ambiental tanto de la atmósferacomo de los mares y nos, propiciaría que el hombre pueda vivir en un planeta con ambiente menos agresivo; ésta entre otras producciones constituyen posibilidades casi inmediatas de la tecnología del ADN recombinante.

Aun cuando en estos momentos no se vislumbra. ouede. oue en un futuro no , & , . lejano,esta técnica sea capaz deenfrentar el hatamiento de enfermedades hereditarias, al producir rectificaciones de los genes alterados mediantesnsustitucióo por los normales.

Se requieren muchos ;úio?.de investigación y trabajo para que la humanidad agote las posibilidades de esta nueva conquista de la ciencia.

Es lamentable que la ingeniería geoética también puede ser utilizada en contra de los hombres. La creación de organismos productores de enfermedades con elevada capacidad inefectiva, contra los cuales no existen tratamiento y la contaminación del ambiente con productos residuales del metabolismo de bacterias alteradas son ejemplos menores de cómo pueden utilizarse las manipulaciones genéticas contra sus propios descubridores.

Esto no debe Uevar a suspender las investigaciones en este campo, pues el empleo que se dé a sus resultados no depende de los procedimientos empleados, sino de las concepciones ético-políticas de los gobernantes de los países donde se desarrolle esta importante tecnología.

La explosión de la bomha atómica en Hiroshima y Nagasaki, con toda su secuela de muerte s destrucción aue se extiende basta nuestros días. nor una narte. v las . . ," grandes centrales átomo eléctricas que existen en numerosos países que han llevado la comodidad y el desarrollo a grandes núcleos de población, por otra, ejemplifican de forma clara que el peligro no está en las fuerzas de la naturaleza que el hombre descn- bre, sino en el empleo que el propio hombre hace de ellas.

En todo caso nuestra posición, desde el punto de vista ético, lleva a condenar el uso de estas -y de cualquier otra- conquistas de la ciencia como instrumento para provocar la destrucción de la humanidad, en vez de hacerlo parasu bienestar y desarrollo.

Resumen

Uno de los éxitos más sobresaüentes de la genética moleeular ha sido la intm- ducei6n de la tecnología del ADN reeombinante, que ha permitido obtener protef- nas eueariontes en cantidades antes insospechadas y al mismo tiempo un análisis del gen al nivel molenilar.

El procedimiento general consiste en la obtenei6n de un gen particular, su incorporaci6n a un vector y su propagaci6n. Los genes pueden obtenerse por frag- mentari6ndelADN,por aislamiento del ARNm y slntesisdel een wr laúmswi~tasa inversa o por sinte& artificial del gen. LO; vectorea & empleados son los plásmidos, los Virus y los mmosomas artiñeiales de levadura. La uni6n del gen al vector puede ocurrir de 2 formas, según el tipo de enzima de resMed6n empleada en el proceso. Cuando la enzima no da fragmentos monofibrilares se requiere el c o n m de la nudeotidil t r a n s f e m terminal.

La producci6n de proteínas eucariontes en bacterias presenta varias dificultades, pero basta con obtener algunas células recombinantes que, proporcionándoles el medio adecuado, en pocas horas se tendrán tantas como se quiera.

Mediante estos pmcedimientos se han obtenido nume- proteínas, entre ellas la somatostatina, la insulina y el interferón, el eual se obtiene con éxito en nuestro país desde hace algunos dos.

La tecnología del ADN recombinante puede ser 6oI en el análisis del gennma y proporciona un pmcedimiento preciso para el diagn6soco prenatal de algunas enfermedades genéticas; también puede ser utilizada en Jas departamentos de trasplante y en medicina le@

Amplias son las perspectivas de esta tecnologfa para la agricultura, el saneamiento ambiental y ia medieina No obstante, también puede ser empleada en perjuido del hombre, dependiendo de quienes sean los que la empleen y no de los pmcedimientos técnicos. La humanidad debe condenar enérgicamente el empleo criminal de estos procedimientos.

Ejercicios

1. ;Cuáles cree usted que son las características que presentan los plásmidos que les permite servir de vectores en los procedimientos del ADN recombinante?

2. Haga un diseñode unexperimento para recombinar U> vitmun gen con un plásmido, utilizando alguna de las enzimas de restricción que aparecen relacionadas en el capítulo 33.

3. ;Cuál fue el principal inconveniente encontrado al utilizar directamente los genes eucariontes para la recombinación in vitro? ¿Cómo pueden eliminarse esos incon- venientes?

4. ¿Por qué no siempre se logra la expresión de los genes aún cuando han sido incorporados al vector y éste se multiplica en la célula receptora?

5. ;Qué ventaja representa la incorporación del promotor lac en los vectores? 6. ;Cómo puede la tecnología del ADN recombinante favorecer el desarrollo de un

departamento de trasplante de órganos? 7. ;El hecho de que los procedimientos del ADN recombinante puedan ser utilizados

para causar daño a la humanidad, debe indicarnos que hay que concluir las investigaciones en este campo?

8. ;Qué perspectivas representa la tecnología del ADN recombinante para los países subdesarrouados?

Resumen de la sección

Esta sección se ha dedicado al estudio de los principales aspectos relacionados con la información genética interpretándolos desde el punto de vista de la estructura, las propiedades y las funciones de las macromoléculas.

La información genética es una de las formas de expresión de la información molecnlar que puede ser de tipo secuencial y conformacional; por lo que no se trata de un nuevo tipo de información, que distinguirla cualitativamente sólo pretende realzar su significado para la vida de las células. No obstante las diversidades de procesos y mecanismos, se pueden encontrar algunas generalidades que a manera de resumen general se exponen a continuación.

Toda la información genética que determina la identidad de cada organismo está codificada en la secuencia de bases nitrogenadas del ADN y por lo tanto es esencialmente de tipo secuencial. Pero el ADN contiene además en su estructura las inshuccio- nes para su lectura, dadas por las irregularidades estrnctnrales que surgen a lo largode la molécula, de acuerdo con la secuencia de bases en sectores específicos. Todo el proceso de surgimiento y transformación de los seres vivos durante el período evolutivo alcanzan su última expresión en la lucha entre la estabilidad y la mutabilidad de esa secuencia de bases.

Conservar la información genética de un organismo y garantizar que éste origine siempre descendientes iguales a sí implica conservar inalterada la secuencia de bases desn ADN. Por el contrario, la aparición de variedadesen la formao las funciones de los organismos significa la alteración de la secuencia de bases de su ADN con respecto a lade sus progenitores. La existencia de secuencias no codificantes, de genes repetidos y los mecanismos de modificación-restricción por una parte y el complejo mecanismo de replicación del ADN, que implica una elevada fidelidad de copia, así como los de reparación aseguran a la estabilidad del material genético; mientras que las mutaciones y la recombinación genética contribuyen a la mutabilidad del mismo. Es evidente que aquí sólo se hace referencia a lo que sucede en el organismo, pues las condiciones del medio influirán decisivamente en determinar cuáles serán los organismos que permanecerán y cuáles no. De esta forma a la lucha entre la estabilidad y la mutabilidad del material genético se suma la lncha permanente entre el genoma y el ambiente; ambas han contribuido de forma decisiva al desarrollo histórico natural de losseres vivos, desde las formas más simples hasta las más complejas.

A pesar de lasdiferencias evidentes que existen entre todos los procesos de transferencia de información genética, hay en ellos una uniformidad fundamental. El mecanismo básico que se pone en juego en los diferentes fenómenos relacionados con la

información genética es el apareamiento de bases que es muy estricto en el ADN y menos en el ARN. Este mecanismo es el que sirve de base a la replicación, la transcrip- ción, la recombinación y la reparación, también está presente en la traducción, pues la colocación de los aminoácidos en la cadena polipeptídica depende del apareamiento de bases entre el codon y el anticodon. Es por ello que en todos estos procesos siempre se utiliza una secuencia de bases que dirige el orden en que los diferentes componentes deben ser organizados.

La parte activa de todos los mecanismos la representan proteínas, un grupo de éstas tiene la característica de reconocer secuencia de bases específicas y proceder de acuerdo con ellas. El origen de replicación, el promotor, el operador, el terminador, las secuencias iniciales y finales de los intrones son algunos de estos ejemplos donde secuencias específicas de bases son reconocidas por proteinas específicas y ese reconocimiento es indispensable para su actividad. Otras tienen actividades enzimáticas especiales que se ajustan perfectamente a las características estmcturales de los ácidos nucleicos y que no son posible encontrar en enzima que actúen con otros sustratos. En casi todos los casos estas proteinas se asocian formando grandes complejos multiproteínicos que por sus diferentes actividades y su organización supramacromolecular constituyen verdaderos organitos subcelulares.

Por la importancia que tienen para la vida y por su elevado grado de complejidad, todos estos procesos necesariamente tienen que estar sometidos a finos mecanismos de regulación que permitan que ellos se realicen en el momento y en el lugar adecuados; este control seejerce a varios niveles y responde a numerosas señales que forman vías de transferencia de información que van desde el entorno hasta el núcleo celular. Por los conocimientos actuales se sabe que esas vías forman verdaderas redes que conver- gen o divergen de nudos de acumnlación de información y que muchas veces tienen carácter redundante. En estos momentos los mecanismos mejor conocidos son los de control transcripcional.

A pesar del avance alcanzado en los últimos años, el conocimiento actual que se tiene de estos fenómenos no permite arribar a otras conclusiones, pues en todos los mecanismos quedan aún aspectos importantes por dilucidar, sobre todo en lo referente a las propiedades de las proteinas que participan en ellos y a sus mecanismos de regulación.

Se espera que con la introducción de los procedimientos de la tecnología del ADN recombinante en los próximos años, muchos de estos aspectos queden esclarecidos, aunque de seguro el carácter inagotable del conocimiento de la naturaleza planteará problemas que hoy son totalmente desconocidos.

Cardellá Hernandez · Modificación del ADN (posterminación) 453 Replicación en eucariontes 453...

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