CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEN-INTI

Materia de Articulación CEBI_E5:

Biología Molecular:

Clase 7

Docente a cargo:

Dra. Ana Paula Domínguez Rubio

¿Qué define el destino de las proteínas?

Misceláneas

El destino de las proteínas dentro de la

célula está codificado por su secuencia

aminoacídica

El destino de las proteínas dentro de la

célula está codificado en su secuencia

aminoacídica

¿Qué proteínas se extraen de la membrana por tratamiento con:

a) soluciones salinas?

b) detergentes?

c) tripsina sobre la célula intacta?

d) tripsina sobre preparaciones de membrana?

Misceláneas

La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces peptídicos de

las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos de menor tamaño y aminoácidos.

Misceláneas

PROBLEMA 9

La enzima X es una proteína de membrana mitocondrial interna y está formada por

dos polipéptidos (a de 40.000 Da y b de 22.000 Da) unidos por fuerzas no

covalentes. Se dispone de preparaciones de membranas mitocondriales abiertas y

de mitocondrias sometidas a diversos tratamientos, obteniéndose las siguientes

fracciones:

ADNmit,

rARNmit,

mARNmit Antibiótico

Puede concluirse que:

a) El polipéptido .............. es una proteína integral de membrana.

b) El polipéptido .............. es una proteína periférica.

c) La actividad enzimática de la proteína X depende de la presencia de:

i) a ii) b iii) a y b

d) El polipéptido que es periférico está ubicado en la membrana interna mitocondrial sobre la

cara:

i) de la matriz mitocondrial ii) del espacio intermembrana

e) ¿En qué compartimentos celulares se sintetizan los polipéptidos a y b?

f) ¿Qué le indica el hecho de que el tratamiento con tripsina de las vesículas de membrana

interna right side out (III) no afecte a la actividad de la enzima X?

g) Haga un esquema de un trozo de membrana mitocondrial y ubique, con su orientación

correcta, los polipéptidos a y b de acuerdo con lo respondido en las preguntas anteriores.

PROBLEMA 10 Además de los RNAs mensajeros (mRNAs), de transferencia (tRNAs) y ribosomales (rRNAs),

las células eucariotas producen otros tipos de RNAs que tienen diversas funciones

regulatorias. Éstos incluyen micro RNAs (miRNAs), RNAs largos no codificantes

(lncRNAs), RNAs pequeños interferentes (siRNAs), RNA de la telomerasa (TERC), RNA 7S

y RNAs circulares (circRNAs).

Los miRNAs son RNAs de doble cadena cortos (de 20 a 22 pares de bases de longitud)

producidos por la transcripción de ciertos genes nucleares que dan un transcripto largo que

adopta estructura secundaria por apareamiento interno y es luego procesado por diversas

ribonucleasas específicas hasta dar lugar al miRNA maduro en el citoplasma. Los miRNAs

se caracterizan porque sus dos hebras no son 100% complementarias sino que presentan

una o dos bases desapareadas (“mismatches”) en su interior. Su mecanismo de acción

comienza con la separación de las dos hebras en el citoplasma. Una de ellas, llamada

“pasajera” es

degradada, en tanto que la otra, llamada “guía”, se asocia a una proteína conocida como

argonauta (AGO). El complejo AGO-hebra guía del miRNA reconoce, por apareamiento de

bases con la guía, secuencias blanco localizadas en la región 3’ no traducida (3’UTR) de

mRNAs específicos, lo cual provoca la degradación de estos mRNAs o la inhibición de su

traducción. Cualquiera de los dos procesos hará que haya menos proteína traducida a partir

de ese mRNA. Por lo tanto, los miRNAs funcionan inhibiendo la fabricación de proteínas

específicas de la célula. Más recientemente se descubrieron RNA circulares (circRNAs)

covalentemente cerrados. Éstos son generados a partir de transcriptos por un mecanismo de

splicing no convencional, catalizado por spliceosoma. Los circRNAs llevan secuencias

“blanco” para los miRNAs, es decir, complementarias a las de las hebras guía. De este

modo, pueden secuestrar los miRNAs, impidiendo que actúen sobre los mRNAs. Este efecto

ha hecho que a los circRNAs se los conozca con el nombre de “esponjas”, porque se

“chupan” o absorben a los miRNAs.

PROBLEMA 10 La “cancigerina” es una proteína de membrana sobreexpresada en células cancerosas que

actúa como receptor de factores de crecimiento que estimulan la proliferación celular. Las

células normales expresan muy poca cancigerina en sus membranas y, por lo tanto, no

proliferan. El gen de la cancigerina tiene 4 exones, encontrándose el AUG en el primer exón

y el codón STOP de la traducción UAA en el cuarto exón, dejando una región 3’ no

traducida de 600 nucleótidos de longitud. Esta región 3’UTR tiene secuencias “blanco” para

un mircro RNA específico, el miRNA199. Además, el pre-mRNA de cancigerina sufre splicing

alternativo, dando 2 variantes de mRNA maduro, una que incluye y otra que excluye el

exón 3.

Se realizaron experimentos de Northern y de Western blot de distintas líneas celulares para

analizar la expresión de cancigerina a nivel del mRNA y de la proteína.

En todas las líneas analizadas los niveles de transcripción del gen de la cancigerina

son iguales. Las líneas A y C no expresan el miRNA199, en tanto que las líneas B y D

expresan grandes cantidades del miRNA199. Las líneas C y D expresan grandes cantidades

de un circRNA “esponja” para miRNA199, en tanto que la línea B no expresa nada de este

circRNA esponja.

a) Interprete los resultados de cada calle del Northern y del Western. No los describa,

describa el mecanismo por el cual se ven o no se ven bandas de cancigerina.

b) ¿Por qué se ven dos bandas de mRNA y dos de proteína para la cancigerina?

c) ¿Por qué en la línea celular B desaparecen las dos bandas, tanto en el Northern como en el

Western, y no sólo una de ellas?

d) ¿Para qué se detectaron el mRNA y la proteína de actina?

e) ¿Cuál/es de las 4 líneas celulares será/n cancerosa/s y cuál/es será/n normal/es?

f) Dibuje el Northern y el Western que habría obtenido si el miRNA199 provocara únicamente

la inhibición de la traducción del mRNA de cancigerina.

PROBLEMA 11 Se utilizó la construcción de la Figura 1 para obtener ratones transgénicos. En dicha

construcción se clonaron el gen de la alternatina (proteína de nombre imaginario) de ratón,

bajo las órdenes del promotor y región regulatoria del gen de la antitripsina y el cDNA de la

proteína SF2 de ratón, bajo las órdenes del promotor y región regulatoria del gen de la

metalotioneína. Ambas unidades transcripcionales fueron separadas por un segmento de

DNA "nexo" que no codifica para nada ni tiene actividad regulatoria de la transcripción..

PROBLEMA 11

Preguntas:

a) ¿Qué longitud (en nucleótidos) tienen el transcripto primario y los 2 mRNAs

maduros de "alternatina" que se producen por "splicing" alternativo del exón 2?

b) ¿Qué peso molecular tienen los 2 polipéptidos de "alternatina", sabiendo que

las regiones 5' y 3' no codificantes de su gen son de 100 y 70 pb respectivamente?

PM 1 aa = 110 Da.

c) ¿Qué peso molecular tiene la proteína SF2 sabiendo que las regiones 5' y 3' no

codificantes de su gen son de 50 y 110 pb respectivamente?

PROBLEMA 10

d) Para identificar cuáles de las crías eran transgénicas se preparó DNA genómico de las

colas de los ratoncitos, se lo digirió con la enzima de restricción Eco RI, y se lo sometió a la

técnica de Southern, usando como sondas de hibridación o bien al intrón 1, o bien al intrón 2

del gen de "alternatina".

i) ¿Qué resultados habría esperado (número de bandas y tamaño) sabiendo que río abajo

del gen endógeno de "alternatina" las secuencias del cromosoma de ratón no tienen nada

que ver con lo que se encuentra río abajo de dicho gen en la construcción de la figura?

ii) ¿Cuál de las 2 sondas es informativa para saber qué ratones son transgénicos y cuáles

no? Justifique.

e) En aquellas condiciones y tejidos del transgénico en que ambos promotores están

encendidos, la construcción de la Figura 1 produce 3 tipos de mRNAs: los 2 de "alternatina"

y el de SF2. ¿Cuantos tipos de mRNAs maduros se producirán en las mismas condiciones y

tejidos de una construcción idéntica a la de la Figura 1, pero que llevara una mutación que

altere la secuencia AATAAA del exón 3 del gen de "alternatina", anulando su función?

Justifique.

Mediante la técnica de Northern se estudió la expresión de los mRNAs de

"alternatina", SF2 y actina en preparaciones de RNA de cerebro e hígado de

ratones normales (no transgénicos), transgénicos para la construcción de la

Figura 1, y transgénicos para la misma construcción a los que se suministró agua

de beber con exceso del ión Zn desde el nacimiento. Los resultados se

encuentran en la Figura 2.

f) Interprete los resultados. Su interpretación debe justificar la ausencia, presencia e intensidad

de bandas detectadas por cada sonda en los 2 tejidos de cada tipo de ratón.

g) La proteína SF2 se localiza normalmente en el núcleo y es capaz de reconocer y unirse

específicamente a ciertas secuencias de los RNAs transcriptos primarios. En base a esta

información y a los resultados anteriores, ¿que función le parece a Ud. que tiene esta proteína?

h) ¿A qué se debe la transcripción tejido-específica del transgén de "alternatina"? ¿Y la

transcripción activable por Zn del transgén de SF2?