Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A · de diámetro, con 30 camarones de la...
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Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. EVALUACIÓN DE OXITETRACICLINA Y UN BIOCIDA COMERCIAL A BASE DE SALES CUATERNARIAS DE AMONIO EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES BACTERIANAS QUE AFECTAN AL CAMARÓN DE CULTIVO Litopenaeus vannamei. POR: CARLOS JOEL BARAJAS BORGO TESIS APROBADA POR LA: COORDINACION DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN CIENCIAS HERMOSILLO, SONORA SEPTIEMBRE DE 2011
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Centro de Investigación en Alimentación y
Desarrollo, A.C.
EVALUACIÓN DE OXITETRACICLINA Y UN BIOCIDA
COMERCIAL A BASE DE SALES CUATERNARIAS DE
AMONIO EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES
BACTERIANAS QUE AFECTAN AL CAMARÓN DE
CULTIVO Litopenaeus vannamei.
POR:
CARLOS JOEL BARAJAS BORGO
TESIS APROBADA POR LA:
COORDINACION DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRIA EN CIENCIAS
HERMOSILLO, SONORA SEPTIEMBRE DE 2011
i
ii
iii
Agradecimientos
Al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. por
brindarme la oportunidad de realizar mis estudios de posgrado que me han
permitido crecer en el ámbito profesional y humano.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por el apoyo económico
otorgado para llevar a cabo mis estudios de posgrado.
A la M.C. María del Carmen Bermúdez Almada, por dirigir este
proyecto y proporcionarme su total apoyo y disponibilidad.
A la M.C. Angelica Espinosa Plascencia, por la dedicación brindada en
todo momento para la realización de esta investigación y aún más por su
amistad.
A la M.C. Haydé Hayamaí González Carrillo, por su gran apoyo
técnico, enseñanzas, tolerancia y sobre todo por su gran amistad.
Al personal de la Granja Acuícola la Borbolla, en especial a los
Ingenieros Roberto Federico Aguayo Valenzuela y César Eduardo Patiño
Patiño, por abrirme las puertas de la granja y proporcionarme todo lo
necesario para llevar a cabo esta investigación. Especialmente al Biol. Adolfo
Pérez Álvarez y al Tecn. Juan Carlos Gastélum Domínguez, por compartir
conmigo todos sus conocimientos y experiencias, los cuales fueron muy útiles
para cumplir con los objetivos del proyecto. Además, les agradezco la ayuda
incondicional que en todo momento me brindaron durante mi estancia en la
granja.
Al Dr. Julián Esparza Romero, por dedicarme el tiempo, para mis
constantes asesorías en la parte estadística de la tesis.
A la M.C. María Elena Lugo Sánchez, por introducirme al mundo de la
investigación y a todo lo que conlleva realizar un estudio y más aún, gracias
por ser mi confidente y amiga a lo largo de todos estos años.
iv
Al Laboratorio de Residuos Tóxicos, por permitirme compartir sus
instalaciones para el desarrollo de una parte de mi trabajo de tesis.
Especialmente a la Q.B. Leticia Miranda Vásquez, Q.B. Rosa Idalia Armenta
Corral y la Q.B. Diana Erika Fierros Bujanda, por brindarme siempre su
amistad.
v
Dedicatorias
A Dios, por haberme dado la fuerza necesaria para culminar otro objetivo en
mi vida y haber colocado en mí camino personas buenas que me han
ayudado a tomar decisiones.
A mis padres Joel Barajas Bugarín y Rosaura Borgo Prandini, por ser
para mí un gran ejemplo a seguir y darme todo su cariño, confianza y
palabras sabias en momentos de incertidumbre en mi vida.
A mis hermanas, Tania, Karla y Melina que a pesar de la distancia en todo
este tiempo, siempre sentí su apoyo, comprensión y gran cariño.
A mis muy buenos amigos Rafael Vladimir Ruíz Cruz y Jorge Alonso
Bravo Hernández, por ser parte de mi vida y siempre creer en mí.
A mis amigas y amigos del CIAD, gracias por haber hecho mi estancia más
grata, nunca olvidaré los buenos momentos que pasamos juntos.
vi
ÍNDICE
Página
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................ix
LISTA DE TABLAS .......................................................................................... x
RESUMEN.......................................................................................................xi
INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1
ANTECEDENTES ........................................................................................... 2
Problemas en las Granjas Acuícolas............................................................ 2
Patógenos Causantes de Enfermedades en los Cultivos de Camarón ........ 3
Uso de los Antibióticos en la Acuicultura ...................................................... 5
Desarrollo de Resistencia Bacteriana .......................................................... 9
Desinfectantes Comerciales Utilizados en los Cultivos de Camarón ......... 11
Persistencia de los Antibióticos y Otros Compuestos Químicos en el
Ambiente .................................................................................................... 17
Alternativas al Uso de Antibióticos ............................................................. 19
Enfermedades Diagnosticadas en Camarón Litopenaeus vannamei
Mediante Preparaciones en Fresco y Microscopía..................................... 21
Necrosis en Branquias de Camarón ....................................................... 22
Ectoparásitos en Branquias de Camarón................................................ 23
Bacterias Filamentosas en Branquias ..................................................... 24
Túbulos en Hepatopáncreas ................................................................... 24
Importancia de la Determinación de Lípidos en el Hepatopáncreas del
Camarón ................................................................................................. 25
Gregarinas Presentes en el Intestino del Camarón ................................ 25
Presencia de Gametocitos en el Intestino del Camarón ......................... 27
JUSTIFICACIÓN ........................................................................................... 29
HIPÓTESIS ................................................................................................... 29
OBJETIVOS .................................................................................................. 30
vii
Objetivo General ........................................................................................ 30
Objetivos Específicos ................................................................................. 30
MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 31
Características de los Organismos de Estudio ........................................... 31
Sistema de Agua ........................................................................................ 31
Tratamiento del Agua de los Estanques con el Biocida .......................... 31
Diseño Experimental para la Evaluación del Biocida a Base de Sales
Cuaternarias de Amonio ............................................................................. 32
Evaluación de Ganancia de Peso y Talla en los Camarones Expuestos al
Biocida .................................................................................................... 32
Determinación de la Sobrevivencia en Camarón Expuesto al Biocida .... 33
Determinación de Lesiones en Órganos del Camarón Expuesto al Biocida
y a Oxitetraciclina .................................................................................... 33
Evaluación Bacteriológica de Agua, Sedimento y Hepatopáncreas de
Camarón de Cultivo ................................................................................ 34
Diseño Experimental para la Evaluación del Tratamiento con Oxitetraciclina
................................................................................................................... 35
Composición de las Dietas para Camarón .............................................. 35
Análisis de Alimento y Régimen de Alimentación ................................... 37
Análisis de Oxitetraciclina en Alimento para Camarón ........................... 37
Determinación de Oxitetraciclina en Músculo y Hepatopáncreas de
Camarón por Cromatografía Líquida de Alta Resolución. ....................... 38
Activación de sílica gel octadecil-silil derivatizada (C18) ...................... 38
Reactivos ............................................................................................. 39
Procedimiento de extracción y cuantificación de OTC ......................... 39
Parámetros Fisicoquímicos del Agua ...................................................... 40
Análisis Estadístico .................................................................................... 41
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................... 42
Evaluación del Incremento en Talla, Peso y Conversión Alimenticia en
Camarón de Cultivo.................................................................................... 42
Evaluación de la Sobrevivencia de Camarones ......................................... 42
Determinación del Daño en los Órganos de Camarón ............................... 43
viii
Evaluación Bacteriológica de Agua, Sedimento y Hepatopáncreas de
Camarón Expuesto al Biocida .................................................................... 46
Análisis de Oxitetraciclina en Alimento para Camarón ............................... 47
Acumulación de OTC en Músculo y Hepatopáncreas de Camarón ........... 48
Relación del Daño en Órganos de Camarón y la Aplicación de Terapias con
Oxitetraciclina ............................................................................................. 55
Relación de Bacterias en Agua de los Estanques y Hepatopáncreas de
Camarón con el Tratamiento de Oxitetraciclina ......................................... 59
Parámetros Físico-Químicos del Agua ....................................................... 62
CONCLUSIONES .......................................................................................... 64
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 66
ix
LISTA DE FIGURAS
Paginas
Figura 1. Estructura molecular general de las Sales Cuaternarias
de Amonio (QAC)……………………………………………
12
Figura 2. Ciclo de vida de una gregarina en camarón. ……………... 28
Figura 3. Concentración máxima de OTC alcanzada en músculo
de camarón blanco Litopenaeus vannamei………………..
50
Figura 4. Cromatograma de un estándar de OTC a una
concentración de 1.5 µg/mL…………………………………
51
Figura 5. Cromatograma de una muestra de músculo de camarón
correspondiente a la etapa de
tratamiento……………………………………………………..
52
Figura 6. Concentración máxima de OTC alcanzada en
hepatopáncreas de camarón blanco Litopenaeus
vannamei…………………………………………………….
53
Figura 7. Cromatograma de una muestra de hepatopáncreas de
camarón correspondiente a la etapa de
tratamiento……………………………………………………..
54
x
LISTA DE TABLAS
Paginas
Tabla 1. Enfermedades bacterianas presentes en la etapa larvaria y de desarrollo de camarones peneidos……………………………………
4 Tabla 2. Estructura general de los grupos que conforman las sales
cuaternarias de amonio (QAC)………………………………………...
14
Tabla 3. Composición del alimento para camarón…………………………….. 36
Tabla 4. Porcentaje de daño en órganos del camarón de cultivo Litopenaeus vannamei antes y durante el tratamiento con biocida..
44
Tabla 5. Porcentaje del daño en órganos del camarón de cultivo Litopenaeus vannamei tratado con un biocida (T) y sin tratar (C)…
45 Tabla 6. Porcentaje del daño en órganos del camarón de cultivo
Litopenaeus vannamei antes y después del tratamiento con Oxitetraciclina……………………………………………………………
58 Tabla 7. Evaluación bacteriológica de Vibrio en hepatopáncreas de
camarón durante y después de las terapias con OTC………………
60 Tabla 8. Evaluación bacteriológica de Vibrio en el agua del estanque
durante y después de las terapias con OTC…………………………
61
xi
RESUMEN
La producción de camarón cultivado en la región Noroeste de México, es considerada de las más importantes en Latinoamérica. Sin embargo, han ocurrido grandes pérdidas económicas en este sector, debido a las enfermedades que se presentan durante el cultivo de estos crustáceos. Para controlar esta problemática, se utilizan antibióticos como la oxitetraciclina (OTC) y algunos biocidas a base de sales cuaternarias de amonio (QAC). Por ello, el objetivo de este estudio fue evaluar la efectividad de OTC y de un biocida comercial en el control de las enfermedades bacterianas que afectan al camarón blanco Litopenaeus vannamei en una granja de producción semi-intensiva del estado de Sonora. El diseño experimental consistió en utilizar nueve estanques con una dimensión de 7 Ha y una profundidad de 1.5 m. En cuatro estanques se aplicó un tratamiento con QAC (185 g/Ha) y otros cuatro se utilizaron como control (sin QAC). En los estanques tratados con las QAC y en los empleados como control, se colocaron jaulas cilíndricas de 1.35 m de altura y 60 cm de diámetro, con 30 camarones de la especie Litopenaeus vannamei en cada una,
llevando a cabo evaluaciones de ganancia de talla y peso, sobrevivencia y Tasa de Conversión Alimenticia (TCA). Se determinó la relación del daño en órganos (branquias, hepatopáncreas e intestino) antes y después del tratamiento con el biocida. Además, se efectuó el análisis bacteriológico en agua, sedimento y hepatopáncreas de camarón para establecer la efectividad del biocida en el control de bacterias de Vibrio. Otro de los estanques se utilizó para determinar la
acumulación de OTC mediante la administración de dos terapias con alimento medicado, a una concentración teórica de 5000 mg/kg de OTC por 11 días. En los organismos tratados con OTC se determinó la Concentración Máxima (Cmax) acumulada en músculo y hepatopáncreas de camarón, así como una relación del
daño en órganos antes y después de las terapias con OTC y una evaluación bacteriológica de Vibrio durante y después de la medicación con el antibiótico en
hepatopáncreas y agua de los estanques. Los resultados obtenidos mostraron que la aplicación del biocida en el agua de los estanques, no causó un efecto significativo (P<0.05) en los organismos expuestos, en alguno de los parámetros evaluados, comparados con el grupo control, lo que indicó que la utilización de este producto podría solamente estar generando una contaminación al medio ambiente. La mayor acumulación del antibiótico se logró ocho días después de iniciada la segunda medicación, con niveles de 37.7±4.0 µg/g en músculo y de 111.9±5.8 µg/g en hepatopáncreas. La acumulación alcanzada en la segunda terapia con OTC podría ser adecuada para inhibir a bacterias del género Vibrio, que son las principales causantes de enfermedades en estos crustáceos. No se encontró una diferencia estadísticamente significativa (P<0.05) en la evaluación del daño en órganos y pruebas bacteriológicas durante y después de la administración de OTC. Por lo que se concluye que el uso de biocidas a base de QAC y de antibióticos en la camaronicultura, debe realizarse con precaución, debido a que ambos compuestos son persistentes en los sedimentos y podrían tener un efecto negativo en el
ecosistema, y en la generación de resistencia de las bacterias a los antibióticos.
1
INTRODUCCIÓN
En México existe una problemática de tipo social y ambiental derivada de la
sobreexplotación de la captura del camarón silvestre. Una alternativa para cubrir
la demanda de este producto, ha sido su cultivo en granjas acuícolas.
El cultivo de camarón en México, inició principalmente a lo largo de la costa
Noroeste del Pacífico, durante los años 80´s utilizando la especie Litopenaeus
stylirostris (Roque et al., 2001). Actualmente, el 96% de las 135,458 Ton
producidas en el año 2009 por acuacultura, provino de los estados de Sonora,
Baja California Sur, Baja California Norte, Sinaloa y Nayarit (CONAPESCA, 2009).
La especie de mayor importancia comercial en nuestro país es el camarón blanco
L. vannamei, tanto por su valor económico, como por la infraestructura empleada
en su cultivo (Anónimo, 2008).
Sin embargo, se han presentado grandes pérdidas económicas en la
camaronicultura, ocasionadas por las enfermedades virales como, el Virus del
Síndrome de la Mancha Blanca (WSS), el Virus del Síndrome de Taura (VTS),
entre otras (Thakur et al., 2002). Otros parásitos, hongos y bacterias
pertenecientes al género Vibrio también afectan estos cultivos. De ahí que se
busquen alternativas por parte del sector productivo, que ayuden a contrarrestar
las infecciones bacterianas que afectan la producción de camarón, ya sea
mediante el empleo de antibióticos como es la oxitetraciclina ó el uso de biocidas.
Por lo que es de suma importancia evaluar el efecto que tienen estos compuestos
en el control de enfermedades bacterianas, por los problemas que pueden
ocasionar dichos productos en la salud de los consumidores y su impacto al
medio ambiente.
2
ANTECEDENTES
Problemas en las Granjas Acuícolas
Un estanque de cultivo de camarón es un sistema muy dinámico, donde
influyen predominantemente factores como la salinidad, pH, temperatura, oxígeno
disuelto y nutrientes orgánicos e inorgánicos, ocasionando modificaciones en las
comunidades microbianas. Cambios en las condiciones fisicoquímicas del sistema
de cultivo, ocasionan estrés en los camarones, debilitándolos y provocando una
mayor susceptibilidad a enfermedades ocasionadas por bacterias y virus (Gómez
et al., 2001). La aparición de brotes infecciosos en los estanques de cultivo de
camarón, ha sido una de las principales limitantes en el desarrollo de la industria
camaronícola del país (Páez-Osuna et al., 2003).
Dentro de las especies de camarón mayormente cultivadas en México se
encuentra el camarón blanco Litopenaeus vannamei, éste es un organismo
omnívoro epibentónico que desempeña una importante función ecológica a lo
largo de la costa del Pacífico mexicano, Centro y Sudamérica. Esta especie es la
de mayor cultivo en el Norte, Centro y Sudamérica ya que presenta una mayor
tasa de crecimiento en comparación con otras especies de camarón (Bentancourt
y García, 2011).
Taxonómicamente el camarón blanco Litopenaeus vannamei pertenece al:
Phylum: Arthropoda
Clase: Malacostracea
Orden: Decapoda
Suborden: Dendobranchiata
Superfamilia: Penaeoidea
Familia: Penaeidae
Género: Litopenaeus
Especie: vannamei (Pérez-Farfante y Kensley, 1997)
3
Patógenos Causantes de Enfermedades en los Cultivos de Camarón
Las enfermedades virales y bacterianas son las principales causas de
mortalidad en los camarones cultivados. El virus de la mancha blanca puede
provocar una mortalidad hasta del 100% de los organismos (Sánchez-Martínez et
al., 2007). Referente a las enfermedades bacterianas, la Hepatopancreatitis
Necrotizante (NHP) y la Vibriosis, son las infecciones más frecuentes que afectan
a los camarones. Las bacterias del género Vibrio son clasificadas como halófilas y
no halófilas, dependiendo de sus requerimientos de sal (NaCl), para su óptimo
crecimiento. Algunas de estas especies, toleran un amplio intervalo de salinidad.
Estas bacterias son de vida libre en el medio acuático de todo el mundo,
encontrándose comúnmente en aguas cálidas, a temperaturas mayores a los
17°C. (Pruzzo et al., 2005).
Prácticamente todas las especies del género Vibrio han sido aisladas de
camarones enfermos, pero esto no implica que sean las responsables de la
infección. Esto es debido a que son microorganismos oportunistas con una rápida
proliferación, que causan la infección cuando el camarón se encuentra debilitado
en su sistema inmunológico (Gómez-Gil et al., 2001).
Históricamente, Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus y V.
damselae, han causado serios problemas en estanques con camarones en etapa
juvenil, mientras que V. harveyi ha afectado más frecuentemente a organismos en
etapa larvaria, especialmente en los primeros 45 días de cultivo (Tabla 1). Muchas
de las especies de Vibrio han sido aisladas de hemolinfa y del hepatopáncreas de
camarones de la especie L. vannamei aparentemente sanos (Gómez-Gil et al.,
2001).
4
Tabla 1. Enfermedades bacterianas presentes en la etapa larvaria y de
desarrollo de camarones peneidos
ETAPA LARVARIA ETAPA DE DESARROLLO
Bacterias luminiscentes Camarón manchado
Bolitas blancas Vibriosis sistémica
Síndrome Zoea II
Epibiontes bacterianos
Vibriosis luminiscente
Epibiontes bacterianos
Hepatopancreatitis Necrotizante
(Gómez-Gil et al., 2001)
5
La bacteria causante de la NHP, es un patógeno intracelular Gram (-) y
polimórfico, cuya reproducción se lleva a cabo dentro de la célula huésped. Posee
un 83.5 % de similitud con el grupo de las Rickettsias. Actualmente, se ha
demostrado que posee una mayor semejanza con dos diferentes bacterias,
Caedibacter caryophila (87.4%) y Holospora obtusa (84.1%). Infecciones de NHP
se han encontrado en camarones de las especies Litopenaeus vannamei, L.
setiferus, L. stylirostris, Farfantepenaeus aztecus y F. californiensis, en las cuales
el daño del hepatopáncreas ha sido severo, ocasionando la muerte de los
organismos en poco tiempo y cuantiosas pérdidas económicas (Vincent y Lotz,
2007).
La aparición de NHP en los estanques es inminente, a menos que se
adopten medidas preventivas. Algunas de ellas consisten en disminuir la densidad
de siembra de organismos por m2, la aplicación de terapias con alimento
medicado, la remoción de materia fecal y el retiro de los camarones muertos por
esta bacteria, ya que el canibalismo es el principal medio de propagación de la
enfermedad (Vincent y Lotz, 2007).
Algunos factores que contribuyen a aumentar las infecciones bacterianas
son, la mala calidad del agua, el incremento de la temperatura, las bajas
concentraciones de oxígeno disuelto y la elevada densidad de siembra en los
estanques de cultivo. Lo que provoca una mayor susceptibilidad en los camarones
a enfermedades o incluso la muerte (Brock y Lightner, 1990).
Uso de los Antibióticos en la Acuicultura
Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura (FAO), la Red de Centros de Acuicultura del Pacífico Asiático (NACA)
y la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Acuicultura se define como
“el cultivo de organismos acuáticos, incluyendo peces, moluscos, crustáceos y
plantas acuáticas”. Durante el cultivo de estas especies, la intervención del
6
hombre es relevante en el proceso de siembra, alimentación y de
protección contra los depredadores, con la finalidad de incrementar la producción
(Hernández, 2005). Como cualquier práctica de producción animal, esta actividad
es afectada por diversas infecciones de origen microbiano ocasionando
enfermedades en los organismos acuáticos, lo que genera grandes pérdidas
económicas a los productores. Una forma de controlar las enfermedades de
origen bacteriano en los cultivos acuáticos, es mediante la utilización de
antibióticos (Hernández, 2005).
Se define como antibiótico a aquella sustancia química producida por
microorganismos que posee la capacidad de matar o inhibir el desarrollo de otros
microorganismos, y puede ser aplicada de manera parenteral, oral y tópica, entre
otras vías (Santiago et al., 2009; Kemper, 2008).
El desarrollo creciente de la acuicultura, ha dado lugar a un mayor uso de
medicamentos, específicamente antibióticos y productos químicos para la
prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas. La aplicación de dosis
subterapéuticas de antibióticos adicionadas en los alimentos, han sido utilizadas
como promotores de crecimiento, haciendo el uso de estos fármacos constante, lo
cual ha contribuido a la generación de bacterias resistentes (Hernández, 2005).
Entre los principales antibióticos utilizados en acuacultura, se encuentran,
enrofloxacina (ENRO) florfenicol (FFC) y oxitetraciclina (OTC). Enrofloxacina
(ENRO) es un antimicrobiano con actividad bactericida contra patógenos Gram (+)
y Gram (-) (Scheer, 1987). La Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) y la
Comunidad Económica Europea (CE) regulan su uso en animales destinados al
consumo humano (Linnehan et al., 1999; Reglamento CEE N° 1181., 2002). En el
resto del mundo no está normalizado su uso, convirtiéndolo en un antibiótico
frecuentemente utilizado en la acuicultura (Tu et al., 2008).
ENRO es un derivado del ácido nalidíxico, el cual contiene un núcleo
químico básico denominado “dihidroquinolona” o anillo 4-quinolónico y un grupo
etilo en la posición 4, lo que favorece su absorción y biodisponibilidad. Es un
antibiótico lipofílico, con bajo peso molecular lo que facilita su penetración tisular
(Jun et al., 2006). El mecanismo de acción de ENRO es a nivel del núcleo celular,
inhibiendo la síntesis del DNA de las bacterias. El DNA se pliega y se despliega
7
en forma alternada, debido a la enzima DNA-girasa, la cual es inhibida por ENRO,
evitando que la información genética pueda ser copiada, causando el efecto
bactericida (Weihai et al., 2006).
Ciprofloxacina (CIPRO) es un metabolito de Enrofloxacina, empleado en el
tratamiento terapéutico de humanos y animales. Presenta actividad contra un
amplio espectro de bacterias Gram (-) aeróbicas y contra patógenos Gram (+). Su
mecanismo de acción, es a través de la inhibición de la topoisomerasa IV y la
DNA girasa bacteriana, las cuales actúan rompiendo las cadenas del cromosoma
bacteriano y luego uniéndolas una vez que se ha formado la superhélice. Al haber
inhibición de estas enzimas, no se lleva a cabo dicho proceso y por tanto no
ocurre la multiplicación celular (Banerjee et al., 2007).
Otro de los antibióticos utilizado en acuicultura es Florfenicol, éste
pertenece a la familia de los anfenicoles, al igual que el cloranfenicol. Es un
antibiótico de amplio espectro para uso veterinario (Neu y Fu, 1980). Su función
principal es como bacteriostático y su mecanismo de acción se lleva a cabo
cuando se une a la subunidad 50s del ribosoma, impidiendo la síntesis de
proteínas (Singer et al., 2004).
Florfenicol ha sido eficaz en el tratamiento de infecciones ocasionadas por
Pasteurella piscicida, Aeromonas salmonicida y Vibrio anguillarum. Se ha
reportado su farmacocinética en salmón del atlántico, mostrando una buena
distribución en todos los tejidos y una vida media de eliminación menor a 15 h. Sin
embargo, en camarón no existe información que permita conocer cuál es el
comportamiento cinético que tiene este compuesto en dicho crustáceo (Yanong y
Curtis, 2005).
OTC es un antibiótico de amplio espectro utilizado en la acuacultura de
todo el mundo, por su baja residualidad en los tejidos comestibles y su corto
tiempo de eliminación (Lunestad y Goksoyr, 1990). Su uso se aprobó desde 1970
por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA por sus siglas en inglés), de
los Estados Unidos de Norteamérica, para ser empleado en el cultivo de peces
(Park et al., 1995). Este antibiótico ha demostrado ser efectivo en las granjas
camaronícolas en el tratamiento de enfermedades bacterianas como Vibriosis,
NHP y Furunculosis (Prescott et al., 2000).
8
OTC actúa como bacteriostático contra bacterias Gram (+) y (-) (Gómez et
al., 2001). Su mecanismo de acción es a través de la inhibición de la síntesis de
proteínas, a nivel ribosomal, manteniendo una difusión pasiva por los poros
hidrofílicos de la membrana celular exterior. Una vez en el interior de la bacteria,
se une a la subunidad 30s del ribosoma, impidiendo el acceso del aminoacil ARNt
al sitio receptor del complejo ribosomal. Esto afecta la adición de aminoácidos a la
cadena peptídica en crecimiento, indispensable para la multiplicación bacteriana
(Prescott et al., 2000).
Para determinar la cinética que presenta OTC en camarón de cultivo, se
han realizado diversos estudios. Siendo los más representativos el publicado por
Nogueira-Lima et al. (2006) y por Gómez-Jiménez et al. (2008), en los cuales se
utilizaron camarones de la especie Litopenaeus vannamei. Ambos estudios se
llevaron a cabo en condiciones de laboratorio. En el estudio de Nogueira-Lima et
al. (2006), se administró una dieta con 4 g/kg de OTC en alimento. Gómez-
Jiménez et al. (2008), aplicaron un tratamiento de 5 g/kg. En ambos estudios se
midió la Concentración Máxima (Cmax) alcanzada del antibiótico en el músculo,
siendo la Cmax obtenida por Nogueira-Lima et al. (2006) de 17.21 µg/g de OTC al
día siete de administrada la terapia, mientras que la Cmax reportada por Gómez-
Jiménez et al., (2008), fue de 33.54 µg/g al octavo día de iniciado el tratamiento.
En ambos estudios, los niveles en los parámetros fisicoquímicos como,
temperatura, salinidad y oxígeno disuelto, no presentaron diferencias
significativas, durante el desarrollo de estas investigaciones. El tiempo de retiro
establecido para eliminar los residuos de OTC del músculo de camarón fue de 16
días para el primer estudio y de 10 días en el segundo, cumpliendo con los
Límites Máximos de Residuos para OTC, establecidos en la normatividad de los
Estados Unidos de Norteamérica, Unión Europea y Japón; donde los valores
permitidos, son de 0.2, 0.1 y 0.1 µg/g, respectivamente.
Al momento de aplicar una terapia con OTC, se debe considerar que su
efectividad antimicrobiana puede verse afectada por factores como, la especie del
microorganismo, el tipo de agua, la concentración de iones de Mg++ y Ca++, la
temperatura, salinidad y ruta de administración, así como las condiciones
ambientales (Nogueira-Lima et al., 2006; Gómez-Jiménez et al., 2008).
9
El uso inadecuado de grandes cantidades de antibióticos como tratamiento
preventivo en la industria acuícola puede traer consigo efectos potencialmente
dañinos para la salud humana y animal. Debido a que el alimento medicado no
consumido por los organismos o los residuos de antibiótico que se encuentran
presente en las heces, se acumulan en el sedimento de los estanques,
provocando que el antibiótico residual sea arrastrado por las corrientes de agua a
lugares distantes, causando alteraciones en la flora microbiana de otros sitios
(Cabello, 2006).
Otro problema importante que surge por la utilización de antibióticos en la
acuicultura, ocurre cuando no son respetados los tiempos de retiro del
medicamento y residuos de estos compuestos permanecen en los tejidos
comestibles, llegando a ser ingeridos por los consumidores, ocasionando una
alteración en la flora intestinal normal e incrementando la aparición de bacterias
resistentes a antibióticos. Por otro lado, el consumo de alimentos con residuos de
antibióticos puede ocasionar problemas de hipersensibilidad y toxicidad, los
cuales son difíciles de diagnosticar debido a la falta de información previa sobre la
ingesta del antibiótico (Cabello, 2006).
La probabilidad de producir una toxicidad directa por el consumo de
alimentos con residuos de antibióticos o sus metabolitos es muy baja. Sin
embargo, una excepción es cloranfenicol, el cual causa anemia aplásica, que ha
generado la muerte de algunas personas (Hernández, 2005). Otros compuestos
de interés son las sulfonamidas, las cuales han sido utilizadas en dosis sub-
terapéuticas y terapéuticas en la producción animal y son consideradas tóxicas
debido a su potencial efecto cancerígeno y mutagénico (Hernández, 2005).
Desarrollo de Resistencia Bacteriana
El empleo prolongado de dietas adicionadas con antibióticos y la cantidad
de éstas que no son consumidas por los organismos y permanecen en el
sedimento y en el agua del estanque, incrementan el desarrollo de bacterias
10
resistentes. Los plásmidos con los genes de resistencia, pueden ser transmitidos
entre las bacterias de diferentes géneros y especies (Samuelsen et al., 1992).
La resistencia bacteriana se define como la incapacidad de un antibiótico
para llegar al punto diana. Se presenta de dos formas: natural ó intrínseca y
adquirida. La resistencia natural se define como aquella que es característica de
todos los miembros de una especie ó género dado. Este tipo de resistencia no
está relacionada con el uso de antibióticos.
La resistencia adquirida es debida a modificaciones en el material genético
de la bacteria, que puede aparecer como resultado de una mutación al azar de
genes localizados en los cromosomas ó en sitios extracromosómicos, ó por
transferencia de este material. Este tipo de resistencia está relacionada con el uso
de compuestos como antibióticos (Woodford y Ellington., 2007; Fernández et al.,
2003).
Existen al menos cinco mecanismos básicos por los cuales las bacterias
pueden generar resistencia a un antibiótico ó a un grupo de antibióticos.
Estos mecanismos incluyen (Sahm et al., 1989):
1) Una inactivación enzimática ó modificación de los antibióticos
2) Una disminución del ingreso ó acumulación de la droga
3) Una alteración ó falta de un sitio diana del antimicrobiano
4) Evasión del efecto del fármaco
5) Falta de reconocimiento del sitio de acción del antibiótico, para llevar a
cabo procesos vitales para la célula, ocasionándole la muerte
Las bacterias Gram (+) y Gram (-) han desarrollado un mecanismo
mediante el cual disminuyen la recepción ó acumulación del antibiótico, tal es el
caso de OTC. Este mecanismo consiste en un bombeo del antibiótico hacia el
exterior de la célula, denominando a este proceso “bomba de eflujo”, en el que
intervienen proteínas localizadas en la membrana interna de la bacteria. Estas
proteínas actúan expulsando el antibiótico al exterior, con una mayor velocidad de
la que entra. Como resultado de este proceso, las moléculas del antibiótico no se
unen de manera eficiente con la subunidad ribosomal de la bacteria, generando la
resistencia al compuesto (Sahm et al., 1989; Cooksey., 1997).
11
Desinfectantes Comerciales Utilizados en los Cultivos de Camarón
Se denomina desinfectante químico a aquella sustancia capaz de eliminar
plagas y patógenos. Son utilizados comúnmente en la eliminación de hongos y
fitoplancton en los criaderos y estanques de crecimiento de camarón. También,
ayudan en el control de la oxidación de los sedimentos en el fondo de los
estanques y como sanitizante de lugares, equipos de trabajo y en ocasiones para
tratar alguna enfermedad (Gräslund y Bengtsson, 2001).
La aplicación de hidróxido de calcio ó Cal, es un procedimiento común en
la preparación de los sedimentos de los estanques, antes de la siembra del
camarón. En México, el procedimiento consiste en drenar los estanques y dejarlos
secar de 30 a 210 días después de la cosecha. Posteriormente, se remueven los
sedimentos con la ayuda de un arado y por último, se realiza la aplicación de cal a
una profundidad de hasta 20 cm (Lyle-Fritch et al., 2006). En Asia, después de
drenar los estanques se les adiciona la cal de dos a cuatro semanas, con la
finalidad de mejorar la descomposición de la materia orgánica (Gräslund y
Bengtsson, 2001).
La cal neutraliza la acidez del suelo cuando el pH de los sedimentos es
bajo (pH <6) (Lyle-Fritch et al., 2006). El encalado, también aumenta la actividad
microbiana en el sedimento, acelerando la descomposición de la materia orgánica
llevada a cabo a un pH óptimo de 7.5-8.5. (Gräslund y Bengtsson, 2001). El
utilizar cal previene infecciones, como las causadas por el virus de la mancha
blanca (WSSV), debido al cambio en el pH óptimo requerido por el virus (Lyle-
Fritch et al., 2006).
Las sales cuaternarias de amonio (QAC) son compuestos orgánicos cuyos
pesos moleculares oscilan entre los 300 y 400 g/mol. Estos compuestos contienen
cuatro grupos funcionales unidos covalentemente a un átomo de nitrógeno central
(R4N+). Los grupos funcionales (R) que componen las QAC incluyen al menos un
grupo alquilo de cadena larga y el resto son grupos metilo o bencilo, como se
representa en la Figura 1 (Tezel, 2009).
12
Figura 1. Estructura molecular general de las Sales Cuaternarias de Amonio
(QAC)
R= grupo funcional
X=iones como Cl-, Br - ó NO3-
Las QAC están compuestas de dos unidades diferentes, la primera unidad
es un grupo alquilo hidrofóbico y la segunda un grupo alquilo hidrofílico, cargado
positivamente a un átomo central de N, el cual hace posible conservar su carácter
catiónico (Tezel, 2009).
La longitud de la cadena alquilo le confiere a las QAC distintas propiedades
fisicoquímicas. Si la cadena de alquilo es de longitud corta, es más soluble en
agua y tiene una mayor absorción en superficies iónicas, como los minerales
presentes en la arcilla. Por el contrario, si la longitud de la cadena es más larga la
absorción en superficies orgánicas aumenta, disminuyendo su toxicidad debido a
una baja biodisponibilidad y una alta partición en superficies orgánicas ó en
aquellas cargadas negativamente (Tezel, 2009).
Las QAC como detergentes catiónicos, tienen funciones antimicrobianas y
se ha observado una baja toxicidad en tejidos de mamíferos. Estudios publicados
han demostrado que estos compuestos son eficaces contra diversas bacterias,
virus y hongos (Hung-Hung et al., 2003). En la acuacultura, las QAC cumplen la
función de bactericidas y fungicidas (Gräslund y Bengtsson, 2001), variando su
actividad dependiendo de la longitud de la cadena de carbonos que componen su
estructura química. Las QAC son tóxicas a concentraciones de µg/mL (ppm) ó
menos para organismos acuáticos como algas, peces, moluscos, percebes,
rotíferos, estrellas de mar y camarones, variando, la DL50 entre las diferentes
especies de crustáceos (Hung-Hung et al., 2003).
13
El modo de acción de las QAC en las bacterias Gram (-), se lleva a cabo
por la interacción de estos compuestos, con la bicapa lipídica de la membrana
citoplasmática y la membrana externa. Este proceso provoca una salida
progresiva de los componentes del citoplasma célular. Las QAC se unen en bajas
concentraciones a los sitios aniónicos que se encuentran en la superficie de la
membrana, causando en las células incapacidad para mantener la regulación
osmótica, lo que provoca la salida de iones de potasio y protones (Tezel, 2009).
La acción de las QAC se lleva a cabo a nivel molecular por una asociación
entre las interacciones iónicas del nitrógeno cuaternario cargado positivamente
con los fosfolípidos de la membrana cargados negativamente. Estas interacciones
aumentan la presión en la superficie de la membrana celular disminuyendo su
fluidez y produciendo una etapa de transición de su estado natural liquido a
liquido cristalino, perdiendo así su función osmoreguladora y fisiológica. Como
resultado, la QAC penetra en la célula y llega a su sitio de acción, donde ocasiona
una inhibición de las enzimas que participan en la cadena respiratoria,
fosforilación oxidativa y la síntesis de ATP de las bacterias (Tezel, 2009).
Concentraciones moderadas de QAC inhiben las funciones de la
membrana celular, como es la respiración, el transporte de solutos, y la
biosíntesis de la pared celular. Altas concentraciones de estos compuestos,
matan a la célula ya que les ocasiona una desintegración de las membranas, la
liberación total del contenido citoplasmático y la coagulación de las proteínas y
ácidos nucleicos (Tezel, 2009).
Las QAC son clasificadas en tres grupos dependiendo del grupo funcional
que las compone, éstos son: halogenuros monoalconio, dialconio y benzalconio
(Tabla 2) siendo este último de los más utilizados, solo ó en combinación con
otras QAC, como fungicidas, bactericidas ó insecticidas (Tezel, 2009).
14
Tabla 2. Estructura general de los grupos que conforman las sales
cuaternarias de amonio (QAC)
NOMBRE ESTRUCTURA
Halogenuros de monoalconio
Halogenuros de dialconio
Halogenuros de benzalconio
X= ión halogenuro
(Tezel, 2009)
15
El cloruro de benzalconio (BAC) es una sal cuaternaria de amonio de
tercera generación (Marchetti et al., 2006), que fue sintetizada por primera vez en
1953, caracterizándose por ser una mezcla de cloruros de n-alquil-dimetil-bencil-
amonio, con cadenas alquílicas de diversas longitudes. Generalmente están
compuestas de cadenas de carbonos C12, C14, C16 y C18 (Pérez et al., 2009).
Cada homólogo de BAC es efectivo contra diferentes microorganismos
dependiendo de la longitud de la cadena de alquilos que la constituyen, en el caso
del BAC-C12 se ha demostrado su efectividad contra levaduras y hongos, BAC-C14
es efectivo contra bacterias Gram (+) y BAC-C16 contra Gram (-) (Nuñez et al.,
2004). El BAC es considerado un agente antimicrobiano que actúa como
detergente catiónico, ya que en solución acuosa presenta una baja tensión
superficial y gran poder tenso activo, lo que le permite actuar como detergente
(Hitosugi et al., 1998; Marchetti et al., 2006).
Entre los usos otorgados al BAC, se encuentra su acción como suavizante
de ropa, agente humectante, conservador, antiséptico en medicamentos y
también como fungicida, espermicida y virucida. En la última década, el BAC se
ha introducido en las formulaciones de la mayoría de los algicidas para piscinas y
en los tratamientos industriales en las torres de enfriamiento de agua. Debido a su
amplio uso, la presencia de residuos de BAC han sido determinados mediante el
análisis químico de aguas residuales (Pérez et al., 2009).
En la acuacultura el uso de BAC es frecuente como desinfectante y se
emplea en el tratamiento de hongos y especies microbianas que infectan a los
organismos en cultivo. El BAC inhibe el crecimiento de algunas especies de
microalgas, como las del género Chlorella, Tetraselmis, Chaetoceros e Isochrysis.
Sánchez-Martínez et al., (2007), demostraron que el BAC es altamente tóxico
para Artemia franciscana con diferencias significativas en los valores de DL50
obtenidos en las diferentes etapas larvarias (Bartolomé y Sánchez-Fortúm, 2005).
Algunos autores sugieren que una concentración de 1.5 mg/L de BAC
puede ser suficiente en el control de algas en acuacultura. Pero es importante
considerar que la concentración de BAC en los sedimentos ha ido en aumento,
16
por lo que es importante su cuantificación ya que este compuesto es persistente
en el ambiente y es poco degradable (Pérez et al., 2009).
El Centro Europeo de Ecotoxicología y Toxicología de las Sustancias
Químicas (ECETOC) y la Agencia de Protección Ambiental (EPA) de los Estados
Unidos de Norteamérica, informaron que los halogenuros monoalconio, dialconio
y cloruros de benzalconio, son tóxicos para organismos acuáticos como bacterias,
algas, peces e invertebrados. Siendo los valores promedio para la Mínima y
Máxima Concentración Efectiva (EC50) dada por estas instituciones de 37 pg / L y
58 mg / L, respectivamente (Tezel, 2009).
En un estudio realizado por Hung-Hung et al., (2003), se evaluó el efecto
antibacteriano de cloruro de benzalconio en agua y hepatopáncreas de camarón
Penaeus monodon, concluyendo que el BAC, tuvo un efecto en la inmunidad del
camarón mejorando la actividad de los fagocitos, pero, también se indujo
apoptosis de los hemocitos. Además, se observó que la aplicación de BAC
disminuyó la cantidad de bacterias del género Vibrio presentes.
En el estudio realizado por Intorre et al., (2007) en peces de agua dulce
como el pez dorado (Carassius auratus) y en pez zebra (Danio rerio) a diferentes
concentraciones de BAC (0.5, 1, 2, 6 y 10 µg/mL) y tiempos de exposición (1, 24,
48 h y 14 días), se demostró que una Dosis Letal100 (DL100) de 10 µg/mL en todos
los tiempos, provocó síntomas de toxicidad en los peces, manifestándose como
cambios en la actividad y pérdida del equilibrio antes de morir. Estableciéndose
una DL50 de BAC en el pez zebra de 6.28 µg/mL y para el pez dorado de 5.80
µg/mL, después de una hora de exposición.
Además, se ha reportado que el BAC puede generar dermatitis y tener un
efecto broncoconstrictor en personas asmáticas. En humanos, las intoxicaciones
con este compuesto pueden provocar la muerte si se ingieren concentraciones
mayores de 100 mg/Kg (Hitosugi et al., 1998). Algunos trabajadores de las
granjas acuícolas desconocen el daño a la salud que puede provocar el uso de
BAC, por tanto es recomendable hacer uso de guantes y cubre bocas para su
protección al manipularlas (Holmström et al., 2003).
17
Persistencia de los Antibióticos y Otros Compuestos Químicos en el Ambiente
Existen tres grupos principales de compuestos utilizados en la
camaronicultura que pueden afectar el medio ambiente. Estos son, los químicos
tóxicos, los antibióticos y los nutrientes. La acumulación de químicos en el
ambiente, es el resultado del uso inadecuado de estos compuestos en algunas
actividades productivas como la acuicultura, ya que pueden ocasionar efectos
tóxicos, o mutagénicos en la flora y fauna silvestre (Gräslund y Bengtsson, 2001).
La persistencia de residuos químicos tóxicos, antibióticos y los nutrientes
depende fuertemente de las condiciones del ambiente como son, temperatura,
pH, niveles de oxígeno disuelto, intensidad de luz y la presencia de
microorganismos (Gräslund y Bengtsson, 2001). La persistencia de un químico o
de un subproducto, puede influir en los organismos en cultivo y en especies de
otros ecosistemas, debido a la bioacumulación, biomagnificación o transporte
físico de estos compuestos tóxicos a través del aire, agua y suelo (Gräslund y
Bengtsson, 2001).
En relación a los antibióticos, una vez que éstos se encuentran en el
ambiente, pueden degradarse por las altas temperaturas y la intensidad de la luz,
siendo la mayoría de las reacciones por fotodegradación. También, existe
degradación de los antibióticos por la actividad microbiana, llevándose a cabo
reacciones enzimáticas de hidroxilación y descarboxilación oxidativa (Kemper,
2008).
En un estudio realizado con oxitetraciclina se demostró que solamente de
un 20 a 30% de este fármaco es consumido por los peces y que el 70-80%
restante es adherido a partículas suspendidas de iones de Ca++ o Mg++,
acumulándose en el sedimento de los estanques, lo que favorece el desarrollo de
resistencia bacteriana (Samuelsen,1989).
Samuelsen (1989), demostró que oxitetraciclina podía presentar actividad
antimicrobiana en los sedimentos 12 semanas después de su administración,
comprobando que la descomposición de este antibiótico en los sedimentos es
mínima y que una disminución en su concentración podría ser causada por el
arrastre del antibiótico en el agua y no por un efecto de degradación.
18
La formación de productos tóxicos como sulfitos y amonio está relacionado
con el efecto negativo que ocasiona la presencia de antibióticos en los
sedimentos, ya que alteran la actividad de las bacterias benéficas, provocando
una reducción en la degradación de la materia orgánica (Gräslund y Bengtsson,
2001).
Por otro lado, desde los años 30´s se ha hecho uso de las sales
cuaternarias de amonio (QAC) en grandes cantidades en aplicaciones clínicas,
industriales y domésticas, sin una evaluación de la cantidad de estos compuestos
que van en las descargas de agua que son vertidas al medioambiente,
provocando un efecto negativo en los ecosistemas debido a su acumulación
(Tezel, 2009).
Un estudio realizado para establecer el efecto de las sales cuaternarias de
amonio en las comunidades microbianas de un ecosistema acuático, mostró que
estos compuestos causan una respuesta ecológica importante en
concentraciones inferiores a 1 mg/L, afectando la actividad heterotrófica
bacteriana del ambiente (Tezel, 2009).
Las bacterias resistentes a las QAC se han convertido en un problema
grave. Muchas especies de microorganismos aerobios y facultativos que
adquirieron resistencia a las QAC y co-resistencia a muchos otros desinfectantes,
antibióticos, solventes y metales se han aislado no sólo en hospitales y centros de
procesamiento de alimentos, sino también en ambientes contaminados con estos
compuestos. El mecanismo mediante el cual las bacterias desarrollan resistencia
a las QAC es una bomba de eflujo. Este mecanismo de resistencia, tiene un
origen genético y puede ser transferido entre distintas especies microbianas
(Tezel, 2009).
Otro problema que puede ocurrir en el medio acuático está relacionado con
la eutroficación, este fenómeno ocurre cuando existe un exceso de alimento ó
fertilizantes orgánicos en el agua, debido al uso de estos productos en la
camaronicultura, ocasionando un incremento en la concentración de nitrógeno y
fósforo en el agua de los estanques, que al ser drenada al ambiente produce un
efecto negativo (Gräslund y Bengtsson, 2001).
19
Alternativas al Uso de Antibióticos
Algunas medidas de seguridad para antibióticos fueron establecidas por la
Comunidad Económica Europea (CEE) mediante el documento 52 publicado en el
año 2003, donde se incluye el Reglamento del Parlamento Europeo y del Consejo
Sobre los Controles Oficiales de Piensos y Alimentos. Estableciéndose la
prohibición o reducción gradual del uso de los antibióticos como promotores del
crecimiento, en la Unión Europea, para tener un mejor control y evitar un gasto
innecesario de antibióticos y de esta forma disminuir la generación de bacterias
resistentes (Hernández, 2005).
Entre las alternativas que han surgido al uso de antibióticos para prevenir
las infecciones por microorganismos en los cultivos, está la utilización de enzimas
y probióticos, los cuales provocan una mejora en la absorción de los nutrientes del
alimento suministrado. Los ácidos orgánicos, derivados de productos fermentados
y sus sales, logran bajar el pH en el sistema digestivo de los organismos,
mejorando la digestión de proteínas e incrementando la población de bacterias
benéficas propias del organismo.
Por otro lado, en el cultivo de peces han sido utilizadas las vacunas para
estimular la respuesta inmune y producir anticuerpos que ayuden a proteger a los
organismos de enfermedades. En un estudio realizado por Xu y Lee (2001), se ha
planteado como una alternativa en la acuicultura, la utilización de extractos
vegetales que contengan flavonoides, a los cuales se les ha atribuido una fuerte
actividad antimicrobiana en bacterias resistentes a antibióticos.
La implementación de buenas prácticas en la acuicultura son esenciales
para mantener un ambiente y organismos saludables tanto peces como
crustáceos. Debe ser prioritario una higiene estricta y otras medidas de
prevención para lograr un control en las infecciones causadas por bacterias
resistentes (Hernández, 2005).
El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) estableció
algunos procedimientos útiles sobre el uso de los antibióticos:
1. Obtener un diagnóstico adecuado del problema antes de la aplicación de
cualquier tratamiento con antibiótico.
20
2. Buscar ayuda profesional si existe la duda sobre el uso de un producto
regulado.
3. Utilizar el fármaco específicamente para las especies señaladas y bajo
las indicaciones establecidas en la etiqueta. Si no esta indicado claramente
su empleo, deberá ser prescrito por un médico veterinario.
4. Leer la etiqueta del producto cuidadosamente.
5. Emplear la dosis adecuada para la especie, el área y las condiciones
específicas de cultivo.
6. Seleccionar adecuadamente la vía de administración del fármaco.
7. Calcular y respetar los tiempos de retiro del fármaco administrado.
8. Identificar adecuadamente las poblaciones de organismos en cultivo
tratados con fármacos mediante marcas claras.
9. No usar medicamentos con fines profilácticos a menos que
específicamente esté aprobado el fármaco para ese propósito.
10. No sustituir el nombre comercial de los productos que están
etiquetados y aprobados para la acuicultura por productos sin etiqueta o
genéricos.
11. Mantener los registros precisos de las terapias aplicadas y las dosis.
12. Considerar el impacto ambiental de la descarga de agua con el
fármaco, e incluir los posibles efectos sobre los organismos no tratados.
13. Aplicar un programa de garantía de calidad o un programa de Análisis
de Riesgos y Control de Puntos Críticos (HACCP), para evitar residuos de
antibióticos en los tejidos y de esta forma garantizar productos de alta
calidad, que sean sanos para los consumidores.
14. Tomar en cuenta las medidas de seguridad personal y los
procedimientos adecuados para los trabajadores acuícolas que manipulan
o aplican los antibióticos.
15. Determinar las consecuencias económicas a corto y largo plazo por la
utilización de fármacos en la producción de organismos acuáticos (USDA,
1994).
21
Enfermedades Diagnosticadas en Camarón Litopenaeus vannamei Mediante
Preparaciones en Fresco y Microscopía.
Realizar un diagnóstico adecuado de una patología es importante para
encontrar la solución al problema que se presenta (Gutiérrez et al., 2001). Un
diagnóstico completo puede incluir la demostración de una anormalidad
ocasionada por un agente etiológico específico (Gutiérrez et al., 2001). El
diagnóstico puede realizarse mediante una examinación al microscopio de tejidos
en fresco de branquias, apéndices orales, hemolinfa y órganos de camarón. El
análisis de tejidos en fresco utilizando microscopía puede provee información
rápida y confiable del daño que se pudiera estar generando por bacterias, hongos
ó parásitos en el camarón (Brock y LeaMaster, 1992).
Las enfermedades que afectan a los organismos acuáticos se pueden
clasificar en a) Enfermedades certificables: son aquéllas en las que actualmente
no se cuenta con algún tratamiento para su control. b) Enfermedades notificables:
en estos casos los patógenos causantes de la enfermedad, son susceptibles de
ser controlados mediante la aplicación de algún medicamento ó sustancia
química. Pero aún así, se pueden causar mortalidades de hasta el 100% de los
organismos y el control de la patología requiere de tiempo y tratamientos
costosos. c) Enfermedades comunes: son aquellas causadas por parásitos que
pueden ser controladas a través de monitoreos continuos de la calidad del agua, ó
con algún tratamiento. Es importante identificar plenamente al agente causal de la
enfermedad, para evitar problemas futuros como la generación de resistencia en
microorganismos que pueda complicar los tratamientos (Gutiérrez et al., 2001).
22
Necrosis en Branquias de Camarón
La necrosis en branquias puede ser ocasionada por diferentes patógenos y
ser diagnosticada en distintas etapas del desarrollo del camarón y bajo
condiciones ambientales variables. En la etapa larvaria del camarón, se puede
encontrar una melanización en las branquias, debido a una infección por bacterias
del género Vibrio, esta melanización puede ser diagnosticada mediante
observaciones al microscopio (Brock y LeaMaster, 1992).
La Fusariosis ó “enfermedad de las branquias negras”, es una enfermedad
que afecta a todas las especies de peneidos causando mortalidades en los
estadios larvarios, esta infección es causada por el hongo Fusarium solani
(Gutiérrez et al., 2001). En organismos juveniles y adultos se han detectado
lesiones en las branquias y cutícula, muy parecidas a las causadas por Fusarium
sp. En camarón, las lesiones de melanización expansivas, de color rojo,
necróticas, son con frecuencia relacionadas a los ficomicetos Atkynsiella dubia y
Haliphthoros spp (Gutiérrez et al., 2001).
El surgimiento de “la enfermedad de las branquias negras” en los
estanques de cultivo de camarón, se ha relacionado con una reducción del
oxígeno disuelto (OD) y un incremento de H2S en el agua. También, la
contaminación del estanque con metales pesados como el cadmio (Cd++) y el
cobre (Cu++), pueden ocasionar deformaciones morfológicas, necrosis en los
tejidos de las branquias y la muerte de los camarones. Otra razón por la cual se
puede generar un obscurecimiento de las branquias, es la falta de nutrientes en la
dieta del camarón (Raj, 1995).
23
Ectoparásitos en Branquias de Camarón
Los camarones tanto de vida silvestre como de cultivo, conviven con
ectoparásitos presentes en el medio acuático. Éstos pueden ser epicomensales ó
también llamados epibiontes, que son considerados no patógenos para el
hospedero (Brock y LeaMaster, 1992). Los ectoparásitos tienden a fijarse en las
branquias y en la cutícula del camarón, y pueden ser fácilmente eliminados por el
camarón a través del proceso de muda. Cuando el camarón se encuentra en
condiciones de estrés, se genera una mayor susceptibilidad a una invasión
masiva de epibiontes, lo que provoca en el camarón, una reducción en la entrada
de oxígeno e impide el flujo de agua a través de las branquias, afectando el
intercambio de gases (CESASIN, 2003 y Gutiérrez et al., 2001). Algunos
organismos epicomensales pueden producir exotoxinas y dañar los tejidos e
incluso ocasionar la muerte del organismo (Gutiérrez et al., 2001).
Entre los principales parásitos, comensales y bio-adherentes se encuentran
las bacterias Leucothrix mucor, Flexibacter spp, algas azul-verdes filamentosas y
protozoarios como Zoothamnium sp., Epistylis sp., Acineta sp., Bodo sp.,
Ascophrys sp., Vorticella sp y Lagenophys sp. Todos estos parásitos tienen la
capacidad de invadir al camarón en cualquiera de las etapas de su desarrollo
(Lightner y Pantoja, 2001: Brock y LeaMaster, 1992).
Por tal motivo, es importante realizar un diagnóstico de las infecciones
epicomensales basándose en observaciones microscópicas utilizando la técnica
de fijación húmeda de órganos como branquias y apéndices de la boca del
camarón, buscando sintomatologías como decoloración de las branquias y
coloración rojiza de la superficie del cuerpo (CESASIN, 2003).
Mediante el muestreo de poblaciones de camarones, se puede estimar la
abundancia de protozoarios en branquias, apéndices y cutícula de los
organismos. Un diagnóstico adecuado puede determinar la severidad de la
infección por epicomensales y la necesidad de administrar una terapia (Brock y
LeaMaster, 1992).
24
Bacterias Filamentosas en Branquias
En los cultivos de camarón, la bacteria filamentosa denominada Leucothrix
mucor afecta las branquias de estos organismos, causando mortalidades
elevadas en los estanques. Otros géneros de bacterias filamentosas relacionadas
con camarón son Thiothrix sp., Flaviobacterium sp., Flexibacter sp. y Cytophaga
sp. (Brock y LeaMaster, 1992). Las infecciones en camarón ocasionadas por
bacterias filamentosas pueden ser identificadas microscópicamente mediante el
montaje en fresco de órganos como las branquias, piezas bucales ó apéndices
nadadoras (Brock y LeaMaster, 1992).
Factores como una baja concentración de oxigeno disuelto en el agua, la
muda del camarón, actividades en la captura y la transferencia de los organismos
producen estrés en ellos, condición propicia para que las bacterias filamentosas
puedan infectar severamente las branquias de los camarones comprometiendo
las funciones respiratorias, disminuyendo la tasa de crecimiento e inclusive
ocasionándoles la muerte (Brock y LeaMaster, 1992).
Túbulos en Hepatopáncreas
El daño en el hepatopáncreas de camarón se puede presentar debido a las
infecciones ocasionadas por bacterias y virus. Las bacterias, que ocasionan la
hepatopancreatitis necrotizante (NHP) y hepatopancreatitis séptica (SHPNS) son
parásitos intracelulares obligatorios que infectan las células epiteliales de los
túbulos del hepatopáncreas. Su diagnóstico se logra a través de observaciones
microscópicas utilizando un montaje en fresco del hepatopáncreas, donde se
pueden apreciar características como un centro “blanquecino” pálido, en lugar de
un color anaranjado normal. Un color pálido en el hepatopáncreas con vetas de
color obscuro (negras) es indicativo de túbulos melanizados acompañado de una
consistencia blanda y acuosa (edema) con fluído en el centro (Lightner y Pantoja,
2001).
25
Virus como el parvovirus hepatopancreático (HPV) puede afectar el
hepatopáncreas de camarón, ocasionándole síntomas como atrofia y decoloración
del hepatopáncreas. El diagnóstico de esta enfermedad se puede realizar por
medio de microscopía (CESASIN, 2003).
Importancia de la Determinación de Lípidos en el Hepatopáncreas del
Camarón
El hepatopáncreas tiene un papel central en la realización de las funciones
digestivas, pues ahí es donde se absorben y almacenan los nutrientes, por tanto,
cualquier disfunción en el hepatopáncreas altera severamente el desarrollo del
camarón (Gómez-Gil et al., 2001).
Mediante la utilización de una metodología de diagnóstico por microscopía
denominada “gota de lípido”, se determina la cantidad de éstos en el
hepatopáncreas del camarón. Esta técnica utiliza una escala numérica del 0 al 4
para su evaluación. Cuando la presencia de lípidos es muy escasa ó nula se
interpreta como un estado de salud pobre y posiblemente los organismos están
enfermos. Una infección como la hepatopancreatitis necrotizante (NHP), está
relacionada con la disminución de la cantidad de lípidos presentes en el
hepatopáncreas y con la presencia de túbulos melanizados en cantidades
variables. Estas modificaciones en el hepatopáncreas pueden ser confirmadas
mediante un análisis histológico (Lightner y Pantoja, 2001).
Gregarinas Presentes en el Intestino del Camarón
Las gregarinas son un grupo protistas de parásitos pertenecientes al filo
Apicomplexa. Estos parásitos se hospedan en el intestino de invertebrados como
anélidos, insectos, moluscos y crustáceos. Las gregarinas pueden habitar el tracto
26
digestivo de los camarones en la etapa larvaria ó adulta, llegando a ser
consideradas como inofensivas ó sub-letales para sus huéspedes (Brock y
LeaMaster, 1992; Shajahan et al., 2007).
La infección del camarón con gregarinas inicia con la ingesta de la forma
infectiva del parásito. Una vez en el intestino, el parásito se multiplica y
eventualmente forma grandes masas visibles de esporas. En los camarones
infectados con estos parásitos, se puede observar el músculo denso y opaco,
gónodas inflamadas con forma irregular y una pigmentación de color azul obscuro
ó negro (Brock y LeaMaster, 1992).
Un número pequeño de gregarinas parasitando al camarón no representa
consecuencias serias para el hospedero. Se considera una infección mayor en el
camarón, cuando se tienen más de 100 trofozoítos por cm en el intestino medio
del organismo (Bruck y LeaMaster, 1992). Esto puede llegar a producir una
alteración en la absorción de los nutrientes, afectar el sistema inmunológico del
camarón, dañar la pared celular, fomentar el ataque microbiano, reducir la tasa
de crecimiento, causar un efecto negativo en la fecundidad y la sobrevivencia e
inclusive, ocasionar la muerte rápida del camarón (Shajahan et al., 2007;
Gutiérrez et al., 2001).
Los principales géneros de gregarinas causantes de enfermedades en
camarón son Nemetopsis sp., Cephalolobus sp y Paraophioidina sp. Estos
parásitos pueden infectar al camarón en cualquier etapa de su desarrollo, ya sean
éstos silvestres ó cultivados y a lo largo de todo el Continente Americano (Brock y
LeaMaster, 1992; Gutiérrez et al., 2001).
El diagnóstico de las enfermedades producidas por gregarinas se puede
llevar a cabo a través de observaciones microscópicas, utilizando placas en fresco
con larvas ú órganos del camarón como el estómago, intestino medio y posterior
(Brock y LeaMaster, 1992; CESASIN, 2003), apreciándose en los tejidos una
coloración amarilla en el estómago y en el intestino medio, así como la
destrucción de los epitelios en dichos órganos (Brock y LeaMaster, 1992;
CESASIN, 2003).
27
Presencia de Gametocitos en el Intestino del Camarón
La infección con gregarinas ocurre cuando los camarones peneidos
ingieren moluscos bivalvos y poliquetos del género Polydora sp, que contienen
gimnosporas del parásito. Las gimnosporas germinan en el camarón, dando como
resultado la formación del esporozoito, éstos se adhieren al intestino medio o al
estómago hasta convertirse en trofozoitos. Los trofozoitos se desprenden del
epitelio y en forma libre se transforman en gamontes (Morales, 2004).
Los gamontes son las formas sexuales (haploides) idénticas
morfológicamente, de tal modo que al encontrarse dos de diferente signo o sexo,
se fusionan en asociaciones sicigias en el lumen del intestino posterior. En este
órgano y en el ciego hepático cada célula se convierte en gametocito dando
origen a los micro y macrogametocitos y éstos a su vez al cigoto o gimnospora, el
cual es liberado al exterior y se aloja en el hospedero intermediario (moluscos
bivalvos y poliquetos) los cuales son ingeridos por el camarón, concluyendo así el
desarrollo de la gregarina (Figura 2) (Morales, 2004; Reyes, 2004).
Las observaciones microscópicas del contenido intestinal del camarón,
permiten realizar una búsqueda de trofozoitos y gametocitos gregarínidos, esto se
puede hacer poniendo el contenido del intestino en un portaobjetos, al cual se le
agrega una gota de agua limpia, se homogeniza si es necesario y se coloca
encima un cubreobjetos para su posterior observación al microscopio (Lightner y
Pantoja, 2001).
28
Figura 2. Ciclo de vida de una gregarina en camarón
A. Ingesta de esporas de parásitos. B. Germinación de esporozoitos en el intestino del
camarón. C. Adición en la pared intestinal y formación de trofozoito. D. Desarrollo de
trofozoitos en el intestino (recto) y formación de gametocitos. E. Formación de
gimnosporas que son liberadas con la ruptura de los gametocitos. F. Ingestión de
gimnosporas por almeja. G. Desarrollo de esporas en la almeja. H. Liberación de esporas
(con esporozoitos dentro) mediante hebras de mucosa ó baba de la almeja.
(Johnson, 1995).
29
JUSTIFICACIÓN
El uso de compuestos químicos empleados en el control de enfermedades
bacterianas que afectan los cultivos de camarones cada vez es más frecuente.
Por ello, es indispensable realizar investigaciones científicas que sustenten la
efectividad de los antibióticos y biocidas utilizados en el control de dichas
enfermedades, para promover un uso racional de estos compuestos y lograr con
ello una reducción en la contaminación y generación de resistencia bacteriana
que impacta al medio ambiente y representa un riesgo a la salud humana.
HIPÓTESIS
La utilización de oxitetraciclina y un biocida a base de sales cuaternarias de
amonio, aplicados de manera independiente en camarón de cultivo Litopenaeus
vannamei, tienen un efecto significativo sobre el control de las enfermedades
bacterianas que afectan la producción de una granja camaronícola.
30
OBJETIVOS
Objetivo General
Evaluar la efectividad del antibiótico oxitetraciclina y de un biocida
comercial en el control de las enfermedades bacterianas que afectan al camarón
blanco Litopenaeus vannamei en una granja de cultivo de Bahía de Kino, Sonora.
Objetivos Específicos
1. Detectar el daño ocasionado por infecciones bacterianas en los órganos
(branquias, intestino y hepatopáncreas) de camarón blanco de cultivo,
mediante observaciones microscópicas en fresco.
2. Evaluar la ganancia de peso, talla y sobrevivencia de camarón blanco de
cultivo Litopenaeus vannamei sometido a un tratamiento con un biocida
comercial.
3. Determinar la Concentración Máxima (Cmax) de OTC alcanzada en músculo
y hepatopáncreas de camarón Litopenaeus vannamei en cultivo, al
administrar dos terapias con alimento medicado.
4. Relacionar los tratamientos aplicados (biocida y antibiótico de manera
independiente) con la presencia de lesiones en los distintos órganos
(branquias, intestino y hepatopáncreas) del camarón de cultivo.
31
MATERIALES Y MÉTODOS
Características de los Organismos de Estudio
La investigación se realizó en una Granja Acuícola ubicada en Bahía de
Kino, Sonora. Se emplearon camarones de la especie Litopenaeus vannamei en
etapa juvenil. Los organismos del estudio fueron sometidos al mismo protocolo de
manejo que se sigue en toda la granja camaronícola.
Sistema de Agua
Todos los estanques se llenaron con agua obtenida directamente del mar,
la cual fue dirigida a éstos por medio de canales. Se midieron los parámetros
físicoquímicos del agua una vez llenos los estanques. La aireación fue provista
mecánicamente con aireadores de paleta.
Tratamiento del Agua de los Estanques con el Biocida
Se aplicó en el agua de los estanques un biocida adquirido
comercialmente, cuyos componentes fueron cloruro de N-alquil-dimetil-bencil-
amonio (20%), cloruro de N-alquil dimetil etilbencil amonio (20%) y un ingrediente
inerte (60%), a una dosis inicial de 364 g/Ha. Al cuarto día de haberse aplicado la
dosis inicial, se administró una dosis de mantenimiento de 185 g/Ha
semanalmente, durante 2.5 meses. El biocida se aplicó inmediatamente después
de cada recambio de agua siguiendo las indicaciones de la casa comercial que lo
distribuye, permaneciendo el químico en contacto con el sedimento y los
organismos durante todo el experimento.
32
Diseño Experimental para la Evaluación del Biocida a Base de Sales Cuaternarias
de Amonio
Con la finalidad de evaluar la ganancia de peso, talla y sobrevivencia de los
camarones sometidos al tratamiento con el biocida, se utilizaron ocho jaulas con
una estructura cilíndrica de 1.35 m de altura y 60 cm de diámetro, cubiertas con
malla de alambre con tamaño de poro de 1000 µm. En cada jaula se colocaron al
azar 30 camarones de la especie Litopenaeus vannamei en etapa juvenil,
aparentemente sanos, con un peso promedio inicial de 6.44±0.02 g y una talla
promedio de 79.82±0.66 mm. Cada jaula se colocó dentro de un estanque con
dimensiones promedio de 7 Ha y 1.50 m de profundidad con fondo arcilloso. El
estudio se realizó con cuatro repeticiones, por un período de 30 días,
manteniendo un grupo control de cuatro estanques sin tratamiento.
Evaluación de Ganancia de Peso y Talla en los Camarones Expuestos al
Biocida
Para la determinación de estos parámetros, se llevó a cabo un registro de
peso y talla en el 100 % de los camarones al inicio y final del tratamiento con el
biocida, empleando para ello una balanza analítica digital marca OHAUS® (Mod.
Scout Pro SP202, Parsippany, NJ, E.U.A) y un vernier digital (MITUTOYO, Mod
551-311-10, Aurora, Illinois E.U.A). El valor real de ganancia de peso y talla de los
organismos estudiados, se obtuvo empleando la fórmula propuesta por
Kitabayashi et al. (1971) como sigue:
W´= W + (Wi + Wf)/2) X N
Donde:
W´= Peso o talla final total de los organismos sobrevivientes
Wi= Peso o talla promedio inicial de los camarones
Wf= Peso o talla promedio final de los camarones
N= número de camarones muertos
33
Determinación de la Sobrevivencia en Camarón Expuesto al Biocida
La sobrevivencia de los camarones fue monitoreada diariamente durante
30 días en cada una de las jaulas, contabilizando el número de camarones
muertos comparado con el número de organismos colocados inicialmente,
reportando este parámetro como porcentaje de sobrevivencia (Li et al., 2007).
Determinación de Lesiones en Órganos del Camarón Expuesto al Biocida y
a Oxitetraciclina
La evaluación de lesiones en los órganos de los camarones se realizó
antes y durante la exposición de los organismos al tratamiento con el biocida y
antes y después de la medicación con OTC, mediante observaciones
microscópicas a un grupo de camarones. Los organismos fueron obtenidos de los
estanques donde se colocaron las jaulas experimentales y del estanque donde se
administró la terapia con OTC, con el fin de establecer en lo posible el diagnóstico
presuntivo de alguna enfermedad. Los órganos examinados fueron,
hepatopáncreas, branquias e intestino (contenido intestinal).
Se sacrificaron semanalmente cinco camarones de cada estanque
(tratados y control) durante 3.5 meses (duración del ciclo de cultivo del camarón).
Se extrajo cuidadosamente cada uno de los órganos, haciendo una incisión por la
línea media con unas tijeras para disección y tomando los órganos con unas
pinzas. Éstos se colocaron sobre un portaobjetos y se adicionó una gota de
solución salina. Se colocó un cubreobjetos presionando cuidadosamente con una
pinza. Se observó la muestra bajo el microscopio (Labomed, Mod. CX, California
E.U.A.) utilizando los lentes de 4, 10, 40 y 100 X.
Para la interpretación de las observaciones microscópicas, se utilizaron los
criterios establecidos por Lightner (1996), empleando valores categóricos del cero
al cuatro, siendo el valor de cero cuando no existe una lesión en el órgano y el
cuatro cuando se presenta un daño muy severo. Se promediaron los valores
34
obtenidos de los cinco camarones en cada una de las observaciones, llegando a
un valor único de dicha población. Este procedimiento permitió determinar cuales
fueron los órganos más afectados que limitan el crecimiento de los organismos.
Evaluación Bacteriológica de Agua, Sedimento y Hepatopáncreas de
Camarón de Cultivo
El análisis bacteriológico del agua de los estanques se llevó a cabo
obteniendo una muestra de 1L de agua semanalmente, en cada uno de los
estanques, tanto los tratados con el biocida, como con OTC y en los utilizados
como control. Se pipeteó 0.1 mL de agua y se vació a cajas petri, previamente
preparadas con Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa (TCBS) (Difco™, Diagnostic
Systems, E.U.A) realizando la inoculación por extensión en superficie e
incubándolas a 37° C por 24 h (Elliot et al., 1992). Posteriormente, se realizó la
cuenta bacteriana identificando colonias del genero Vibrio de color amarillo y
verde.
Para el análisis de sedimento en los estanques tratados con el biocida, las
muestras (1 Kg) fueron colectadas en bolsas de plástico estériles semanalmente
en cada estanque. Posteriormente, se pesó 1 g de sedimento y se colocó en un
tubo de ensayo con 9 mL de diluyente (solución salina a 20 µg/mL), se agitó
vigorosamente y se inoculó 0.1 mL en cajas petri con agar TCBS. La incubación
de las cajas petri se realizó a 37° C durante 24 h, posteriormente, se realizó el
recuento de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC).
En hepatopáncreas para ambos tratamientos, el análisis bacteriológico se
realizó obteniendo este órgano de cinco camarones juveniles de cada uno de los
estanques teniendo cuidado de no tomar parte del intestino y así evitar una
contaminación cruzada. Los hepatopáncreas se homogeneizaron con una
espátula y se pesó 1g en un tubo con 9 mL de solución salina a 20 µg/mL.
Posteriormente, se agitó vigorosamente y se tomó 0.1 mL del diluyente, el cual se
colocó en cajas petri preparadas con agar TCBS, se inoculó por extensión en
35
superficie y se incubó a 37° C por 24 h para posteriormente realizar el conteo de
las UFC.
Diseño Experimental para la Evaluación del Tratamiento con Oxitetraciclina
Se utilizó un estanque ubicado en una sección de la granja distinta a la
seleccionada para la evaluación del biocida, para la administración de las terapias
con OTC a través del alimento. Este estanque fue sembrado con 32
organismos/m2. Los muestreos se realizaron diariamente tomando
aproximadamente 1 Kg de camarón, los cuales fueron colocados en bolsa de
plástico estériles debidamente etiquetadas. Las muestras se mantuvieron en
congelación hasta el análisis de los tejidos (músculo y hepatopáncreas) por
cromatografía de líquidos de alta resolución para establecer la Concentración
Máxima (Cmax) acumulada del antibiótico siguiendo la metodología propuesta por
Bermúdez-Almada et al., (1999).
Composición de las Dietas para Camarón
Se administraron por dos períodos dos dietas adicionadas con
oxitetraciclina (OTC) a una concentración teórica de 5000 µg/g durante 11 días
(etapa de tratamiento) cada vez. Posteriormente, se administró la dieta sin
antibiótico. Los alimentos medicados y sin medicar fueron adquiridos en una casa
comercial de la región y fueron preparados de acuerdo a los requerimientos
nutricionales específicos para camarón (Tabla 3).
36
Tabla 3. Composición del alimento para camarón
Ingredientes %
Harina de pescado 26.2
Harina de soya 25
Gluten de maíz (40.20) 6
Aceite de pescado 2.03
Lecitina de soya 2.03
Mezcla vitamínica 0.5
Vitamina C 0.05
Aglutinante 0.8
Fosfato monobásico 4.36
Metionina 0.02
Harina de camarón (32.79) 0.8
37
Análisis de Alimento y Régimen de Alimentación
Las dietas para los camarones en experimentación fueron analizadas antes
de ser administradas, para confirmar la concentración de OTC en el alimento
medicado y la ausencia de éste en el alimento sin antibiótico. Los camarones
fueron alimentados tres veces al día, a las 5:00, 11:00 y 17:00 h, considerando un
valor al 3 % de biomasa al día, administrando el 40 % del alimento en la mañana,
20 % en la tarde y 40 % en la noche.
Para verificar la cantidad de alimento consumido y que los camarones se
alimentaron a saciedad, se realizaron observaciones directas sobre los
organismos para confirmar que mantuvieran el intestino lleno y sobre las charolas
testigo (comederos), para determinar con precisión la cantidad de alimento
consumido.
La cantidad del alimento administrado fue ajustado durante los días del
ensayo dependiendo del consumo. Se cuantificó el alimento no consumido por los
organismos, removiéndolo de las charolas y llevando a cabo un registro de peso
para estimar la Tasa de Conversión Alimenticia (TCA), la cual se determinó
empleando la fórmula propuesta por Chim et al. (2008).
TCA= Cantidad de alimento administrado a los camarones / Peso ganado de los
organismos.
Análisis de Oxitetraciclina en Alimento para Camarón
El análisis del alimento se realizó siguiendo la metodología descrita por
Houglum et al. (1997). Ésta consistió en pesar 1 g de muestra en un tubo de
centrífuga de 40 mL. Se incluyó un control positivo el cual consistió en una
muestra de alimento libre de antibiótico al que se le adicionó 100 µL de una
solución estándar de OTC a una concentración de 1500 µg/mL, obteniendo una
concentración final en la muestra de 150 µg/g. En cada muestra se adicionaron 25
mL de metanol: ácido (25 mL de metanol + 0.5 mL de HCl) y se agitaron
38
mecánicamente durante 1 h a 250 rpm en un agitador marca IKA (KS501.
Wilmington, NC, E.U.A). Posteriormente, se centrifugaron los tubos a 2800 g por
15 min a 15° C en una centrífuga (Beckman Coulter TM, Allegra 6R, Brea CA.
E.U.A). El extracto se filtró empleando filtros de microfibra de vidrio GF/A de 90
mm (WhatmanTM, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK).
Una vez obtenido el extracto, se sometió a un proceso de limpieza el cual
consistió en preparar una jeringa de plástico de 5 mL (Plastipack, Becton
Dickinson, México) con fibra de vidrio en el fondo y 1 g de C18 previamente
activado. La columna se acondicionó haciendo un lavado con 2 mL de metanol
ácido. Posteriormente, se pasaron por la columna 2 mL del extracto obtenido y el
eluato fue recogido en un vial ámbar de 4 mL, los residuos del antibiótico que
quedaron retenidos en la columna fueron eluidos adicionando otros 2 mL de
metanol ácido, teniendo un volumen final en el vial de 4 mL, los cuales fueron
filtrados empleando una jeringa de plástico acoplada con un filtro acrodisc con
tamaño de poro de 2 µm. Posteriormente, se realizó la cuantificación por
Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC por sus siglas en ingles) con
detección ultravioleta a una longitud de onda de 365 nm, empleando las
condiciones cromatográficas establecidas para la determinación de OTC, del
método citado anteriormente.
Determinación de Oxitetraciclina en Músculo y Hepatopáncreas de Camarón
por Cromatografía Líquida de Alta Resolución.
Activación de sílica gel octadecil-silil derivatizada (C18)
Para la extracción de OTC de las muestras de músculo y hepatopáncreas
de camarón, se empleó el adsorbente Octadecil-silil (C18) (JT Baker), el cual fue
activado previo a su utilización en la extracción del antibiótico. El procedimiento
de activación consistió en pesar 22 g de C18, los cuales fueron colocados en una
columna de vidrio de 13.2 cm de largo por 2.7 cm de diámetro, con un filtro de
fibra de vidrio Whatman GF/A (Whatman Internacional, England) en la parte
39
inferior de la columna y otro en la parte superior, una vez que se ha puesto el
adsorbente. Posteriormente, se añadieron 50 mL de los solventes hexano,
diclorometano y metanol, todos ellos grado reactivo. El remanente de los
solventes fue removido aplicando vacío hasta obtener el adsorbente totalmente
seco, el cual fue colocado en un frasco de plástico con tapa hermética hasta su
utilización.
Reactivos
Todos los solventes empleados en la extracción de oxitetraciclina, fueron
grado reactivo (Omnisolv, Assoc. of Merck, Darmstad, Alemania). El ácido oxálico,
ácido etilén-diamino-tetra-acético (EDTA), butilhidroxianisol (BHA) y
butilhidroxitolueno (BHT), fueron adquiridos de Sigma (St, Louis, MO, E.U.A). Los
solventes que conformaron la fase móvil y el estándar de hidrocloruro de
oxitetraciclina fueron grado cromatográfico adquiridos de la casa comercial Sigma
Aldrich Chemical Co. (Milwakee, WI, E.U.A).
Procedimiento de extracción y cuantificación de OTC
Para extraer OTC de los tejidos del camarón se utilizó la técnica analítica
propuesta por Long et al. (1990), modificada por Bermúdez-Almada et al. (1999).
El material de cristalería utilizado fue cubierto con papel aluminio, para evitar la
degradación del analito debido a la luz ya que es un antibiótico fotosensible.
En esta técnica analítica se emplea el principio de dispersión de matriz en
fase sólida, que consiste en romper las membranas celulares por medio de
fuerzas hidrofóbicas y mecánicas para dejar al descubierto los componentes
hidrofílicos, como los residuos de OTC. Esto se llevó a cabo colocando 0.5 g de
músculo ó hepatopáncreas de camarón en contacto con 2 g del adsorbente C18, el
cual se asocia con los lípidos de la membrana celular. Posteriormente, se
eliminaron los compuestos cromóforos que causan interferencia adicionando 10
mL de hexano en las muestras de músculo y 20 mL en las de hepatopáncreas. La
elusión de OTC se llevó a cabo utilizando 15 mL de una mezcla compuesta de
40
Acetonitrilo:Metanol, 1:1, v/v con 0.06% de butilhidroxianisol (BHA) y
butilhidroxitolueno (BHT). El extracto se llevó a sequedad total utilizando un baño
de agua (VWR Scientific Products, mod. 1202, E.U.A.) a una temperatura de 40°C
con un flujo de aire constante.
Posteriormente, las muestras se resuspendieron con 1 mL de fase móvil,
que consistió en ácido oxálico 0.02 M:acetonitrilo:metanol (70:27:3, v/v/v), luego
se sonicaron durante 30 min en un sonicador Cole Parmer (Mod. 8892, Chicago,
Illinois). Enseguida, las muestras se centrifugaron a 2800 g durante 15 min en una
centrifuga Beckman Coulter (Modelo, Allegra 6R, E.U.A). El extracto se pasó a
una jeringa de plástico de 3 mL, con un filtro acrodisc de un tamaño de poro de 2
µm (Acrodisc LC13 PVDF) y el filtrado se obtuvo en viales color ámbar de 2 mL.
Se inyectaron 200 µL del extracto en un Cromatografo de Líquidos de Alta
Resolución Varian Modelo ProStar (Varian Co. Santa Clara, California, E.U.A.)
equipado con un detector ultravioleta visible Varian Prostar (Varian Co., Santa
Clara, California, E.U.A.), a una longitud de onda de 365 nm. Ambos equipos
estuvieron conectados a una computadora (DELL, Mod. OPTIPLEXTM 755, Tx,
E.U.A.) con el paquete computacional Galaxie Chromatography Data System
Versión 1.9 (Varian Co. Walnut Creek, CA, E.U.A.) El flujo de los solventes
utilizados fue isocrático de 1mL/min. La columna empleada fue de Nucleosil fase
inversa, C18 de 150 x 4.6 mm, con tamaño de partícula de 5 µm (Supelco, Co., St
Louis, MO, E.U.A)
Parámetros Fisicoquímicos del Agua
Los parámetros físico-químicos del agua de los estanques, como
temperatura y oxígeno disuelto (OD) se midieron todos los días durante la
mañana y tarde empleando un Oxímetro YSI (YSI 55, Yellow Springs, OH, E.U.A).
La salinidad y pH se tomaron semanalmente utilizando un refractómetro Aquatic
Eco-Systems (Vitalsine SR 6, Apopka, FL, E.U.A), y un potenciómetro YSI
(Ecosense pH10, Yellow Springs, OH, E.U.A), respectivamente. Los niveles de
nitrógeno y producción de Amonio Total (TAN por sus siglas en ingles) en el agua
41
de mar fueron medidos semanalmente empleando un fotómetro YSI (Ecosense
9500, Yellow Springs, OH, E.U.A). Durante todo el período experimental fueron
monitoreados y controlados los parámetros fisicoquímicos en los estanques, de
acuerdo a las condiciones establecidas en la granja.
Análisis Estadístico
El análisis estadístico de los datos obtenidos en la evaluación de ganancia
de peso, TCA, talla y sobrevivencia de los camarones, así como de los
parámetros fisicoquímicos de los estanques, se llevó a cabo empleando la prueba
no paramétrica de Rangos Múltiples de Wilcoxon.
Los datos obtenidos de la determinación del daño en órganos y la
evaluación bacteriológica de agua, sedimento y hepatopáncreas de los
camarones tratados con el biocida, fueron analizados estadísticamente
empleando un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías.
Para establecer la relación entre el daño en órganos y la efectividad de la
medicación con OTC se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Así
como la prueba no paramétrica de Rangos Múltiples de Wilcoxon para analizar los
datos bacteriológicos del tratamiento con el antibiótico OTC. Todos los análisis
estadísticos fueron realizados empleando el programa computacional NCSS
2007.
42
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación del Incremento en Talla, Peso y Conversión Alimenticia en Camarón
de Cultivo
Los camarones sometidos al tratamiento con el biocida presentaron un
incremento promedio en talla de 15.7±1.34 mm, mientras que en el grupo control
el incremento fue de 17.1±3.4 mm. El peso final de los camarones se presentó de
forma similar en ambos grupos (P>0.05), los organismos tratados con el biocida
mostraron un incremento en peso de 5.1±1.1 g y en el grupo control éste fue de
5.2±1.3 g. El incremento en peso obtenido en los camarones utilizados en este
estudio, fue mayor al reportado por Paquotte et al. (1998), quienes reportaron una
ganancia en peso de 0.63 a 0.84 g, después de mantener a los organismos en
jaulas durante un mes.
El valor del factor de conversión alimenticia estimado fue de 2.7±0.5 y
2.5±0.3 para el grupo tratado y el control, respectivamente. No se encontró una
diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos a una P>0.05. Este
valor en el Factor de Conversión Alimenticia fue similar al reportado por Chim et
al. (2008), que fue de 2.3±0.19 para camarones alojados en jaulas.
Evaluación de la Sobrevivencia de Camarones
En relación a este parámetro, se obtuvo en ambos grupos de camarones
un porcentaje de sobrevivencia similar, teniendo en los organismos tratados con
el biocida una sobrevivencia de 88.3±8.8 %. Este valor fue similar al obtenido en
otros estudios realizados con camarones alojados en jaulas, donde los rangos de
sobrevivencia estuvieron entre el 87 y 94 % (Zarain-Hezberg et al., 2006; Castex
et al., 2009). En el grupo control la sobrevivencia de los camarones fue de
43
89.1±9.2 %. El análisis estadístico de los datos no mostró una diferencia
estadística significativa a un valor de P>0.05, entre ambos grupos.
Determinación del Daño en los Órganos de Camarón
Los datos obtenidos de las evaluaciones semanales de daños en los
órganos del camarón antes y durante la aplicación del biocida, no mostraron una
diferencia estadística significativa (P>0.05) en ninguno de los parámetros
evaluados como fueron, necrosis en branquias (NEC), ectoparásitos (ECT) y
bacterias filamentosas (BF), así como la presencia de túbulos festonados (TUB) y
lípidos (LIP) en Hepatopáncreas, gregarinas (GRE) y gametocitos (GAM) en el
intestino (Tabla 4). Así mismo, entre los estanques del grupo control y los tratados
con el biocida durante el ciclo de producción presentaron comportamientos muy
similares (Tabla 5).
El análisis en conjunto de todos los parámetros establecidos para la
evaluación del biocida a base de QAC, no mostraron un efecto positivo en el
camarón de cultivo Litopenaeus vannamei. Esto pudo deberse, a que la eficiencia
del biocida puede ser reducida por distintos factores, como es la influencia de la
materia orgánica en el sustrato, ya que estos compuestos se adsorben en él
debido a que son altamente lipofílicos. Las cargas positivas de las QAC tienen
una fuerte afinidad por las cargas negativas de las superficies, ocasionando la
remoción de estos compuestos del medio acuoso y limitando su biodisponibilidad.
Las QAC pueden formar compuestos solubles con pares iónicos cargados
negativamente, como proteínas y lipopolisacáridos, ocasionando que la toxicidad
del biocida en un medio orgánico sea menor que en uno inorgánico (Nalecz-
Jaweki et al., 2003).
44
Tabla 4. Porcentaje de daño en órganos del camarón de cultivo Litopenaeus vannamei antes y durante el tratamiento
con biocida
Órgano Branquias Hepatopáncreas Intestino
Daño NEC (%) ECT (%) BF (%) TUB (%) LIP (%) GRE (%) GAM (%)
Escala de severidad
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Antes
(n=20)
100 0 0 0 0 20 30 20 20 10 65 30 5 0 0 15 15 45 25 0 80 15 0 0 5 95 5 0 0 0 65 20 0 5 10
Durante
(n=20)
100 0 0 0 0 0 45 55 0 0 90 10 0 0 0 0 15 30 50 5 45 45 10 0 0 95 5 0 0 0 65 5 10 15 5
NEC=Necrosis, ECT=Ectoparásitos, BF= Bacterias Filamentosas, TUB=Túbulos, LIP= Lípidos, GRE= Gregarinas, GAM =Gametocitos
0: Ausencia de lesiones
4: Daño severo
45
Tabla 5. Porcentaje del daño en órganos del camarón de cultivo Litopenaeus vannamei tratado con un biocida (T) y sin
tratar (C)
Órgano Branquias Hepatopáncreas Intestino
Daño NEC (%) ECT (%) BF (%) TUB (%) LIP (%) GRE (%) GAM (%)
Escala de severidad
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Control
(n=36)
97 3 0 0 0 8 20 53 11 8 58 42 0 0 0 5 17 56 22 0 86 11 0 0 3 91 3 3 0 3 47 11 6 22 14
Tratamiento
(n=36)
100 0 0 0 0 11 22 50 11 6 69 28 3 0 0 8 14 39 39 0 78 19 0 0 3 95 5 0 0 0 50 14 8 17 11
NEC=Necrosis, ECT=Ectoparásitos, BF= Bacterias Filamentosas, TUB=Túbulos, LIP= Lípidos, GRE= Gregarinas, GAM =Gametocitos
0: Ausencia de lesiones
4: Daño severo
.
46
Evaluación Bacteriológica de Agua, Sedimento y Hepatopáncreas de Camarón
Expuesto al Biocida
El análisis bacteriológico de agua, sedimento y hepatopáncreas mostró la
presencia de bacterias del género Vibrio sp en todos los componentes del sistema
de cultivo, predominando las colonias de color amarillo en las distintas muestras.
El mayor recuento bacteriano se obtuvo en el sedimento de los estanques
utilizados como control (4.6x103±1.2x104UFC/g). En aquellos estanques donde se
aplicó el biocida, las cuentas bacterianas promedio fueron menores
(1.1x103±1.9x103 UFC/g). Ambos valores encontrados en las cuentas bacterianas
son clasificadas en la categoría de “rango bajo” como lo muestra el Comité de
Sanidad Acuícola de Sinaloa (CESASIN, 2003) el cual establece para las
muestras de sedimento recuentos <3.0x104 UFC/g para colonias de Vibrio de
color amarillo.
En hepatopáncreas, las cuentas bacterianas estuvieron en el orden de
2.1x103±1.1x104 y 2.7x102±8.6x102 UFC/g, para el grupo control y tratado
respectivamente. En las muestras de agua, los recuentos bacterianos fueron
similares para ambos grupos en experimentación, siendo de 1.4x102±1.6x102
UFC/mL y 1.6x102±2.7x102 UFC/mL para el grupo control y el tratado
respectivamente. Estadísticamente no se encontró una diferencia significativa
(P>0.05).
En un estudio realizado a nivel laboratorio por Hung-Hung et al. (2003), se
determinó el conteo de bacterias de Vibrio sp en agua salada de un estanque de
producción de camarón (Penaeus monodon) tratado con un producto comercial
compuesto de cloruro de N-alquil-dimetil-bencil-amonio (40%) y urea (60%).
Obteniendo recuentos bacterianos en el orden de 0.7x102±0.4x102 UFC/mL y una
eficiencia del tratamiento del 93% para reducir las bacterias de Vibrio comparados
con el control después de 24 h de incubación, mostrando una diferencia
estadística significativa (P<0.01).
Comparando los resultados obtenidos por este autor con los generados en
nuestra investigación, se puede deducir que la concentración de QAC siguiendo
las indicaciones establecidas en el producto fueron 81 veces menores a la
47
reportada, lo que ocasionó que no fuera apreciado un efecto en el control
bacteriano. Esto aunado a que la presencia de materia orgánica en el estanque
disminuye la concentración efectiva de las QAC.
La producción de camarón Litopenaeus vannamei en la etapa larvaria y
juvenil es afectada drásticamente por patógenos oportunistas pertenecientes a la
familia Vibrionaceae (Hernández y Olmos, 2004; Muñoz et al., 2004). Por ello, fue
importante monitorear el comportamiento que presentaron las bacterias de Vibrio
en órganos tan importantes como el hepatopáncreas del camarón.
Hung-Hung et al. (2003), observaron una disminución de las bacterias de
Vibrio en hepatopáncreas de camarón P. monodon mantenido en un estanque
tratado con un producto comercial compuesto de cloruro de N-alquil-dimetil-
bencil-amonio (40%) y urea (60%), obteniendo en el control una cuenta bacteriana
de 5.3x105 y en el estanque tratado 3.0x105 después de dos aplicaciones. Las
cuentas bacterianas obtenidas en nuestro estudio fueron menores, tanto en el
grupo control como en el tratado. No se encontró una diferencia significativa entre
ambos grupos y esto pudo deberse a las bajas concentraciones del compuesto
activo, comparado con el utilizado por Hung-Hung et al. (2003).
Análisis de Oxitetraciclina en Alimento para Camarón
El uso de alimentos de buena calidad, mejora la producción de camarón y
aumenta los beneficios, además de minimizar el impacto ambiental en las áreas
de producción. La alimentación, es uno de los factores más importantes
involucrados en la producción del camarón, que debe mantenerse bajo una
observación cuidadosa y frecuente (Achupallas, 2000). Para ello, es
recomendable llevar a cabo el análisis de las dietas medicadas y sin medicar,
empleando métodos confiables para confirmar la concentración indicada, o bien,
la ausencia de antibióticos en el alimento (González et al., 2010).
48
El análisis por HPLC realizado a la dieta adicionada con OTC para
camarón, arrojó una concentración de 5,654.90±204.77 µg/g, mayor a la indicada
en las especificaciones del producto (5000 µg/g). Esto pudo ser debido a fallas en
el control de calidad durante la fabricación de las dietas, lo que puede ocasionar
que dietas sin medicar presenten residuos de antibióticos, o bien un mayor o
menor nivel del antimicrobiano en las dietas medicadas (González et al., 2010).
Acumulación de OTC en Músculo y Hepatopáncreas de Camarón
En la evaluación de la acumulación de OTC en los tejidos de camarón
después de las terapias con el antibiótico, se observó que la Cmax en músculo fue
menor en la primera terapia (13.3 ± 2.0 µg/g), que en la segunda (37.7±4.0 µg/g),
lográndose en ésta última la Cmax a los ocho días de haber iniciado la medicación
y en la primera terapia a los cinco días (Figura 3). Los valores obtenidos fueron
similares a los publicados por Gómez- Jiménez et al., (2008), quienes reportaron
una Cmax en músculo de camarón de 33.5 µg/g al día ocho de tratamiento y a los
resultados obtenidos por Santiago-Hernández., (2009), quien encontró una Cmax
de OTC en músculo de 27.9±1.67 µg/g después de 12 días de medicación. Las
Figuras 4 y 5 muestran un cromatograma típico de un estándar de OTC a 1.5
µg/mL y del análisis de una muestra de músculo de camarón durante la etapa de
tratamiento.
Los niveles máximos de acumulación de OTC en el hepatopáncreas de
camarón también fueron menores en la primera terapia (74.21±4.6 µg/g), que en
la segunda (111.9 ±5.8 µg/g) (Figura 6). Estas concentraciones fueron menores a
las detectadas por Santiago-Hernández., (2009) quien reportó niveles de OTC de
212.5±0.4 µg/g al segundo día del tratamiento. La Figura 7 muestra un
cromatograma obtenido de los resultados del análisis de hepatopáncreas de
camarón en la administración de la terapia.
Las concentraciones de OTC acumuladas en ambos tejidos fueron
adecuadas cuando se relacionaron con las Concentraciones Mínimas Inhibitorias
49
(CMI) establecidas para bacterias de Vibrio sp aisladas del mismo sistema de
cultivo, las cuales fueron de 5 a 100 µg/mL para músculo y de 0.75 a 100 µg/mL
para hepatopáncreas (Santiago-Hernández., 2009).
50
Figura 3. Concentración máxima de OTC alcanzada en músculo de camarón
blanco Litopenaeus vannamei.
51
Figura 4. Cromatograma de un estándar de OTC a una concentración de 1.5
µg/mL.
Condiciones de determinación: Cromatógrafo de líquidos de alta
resolución Varian Modelo ProStar. Detector ultravioleta visible
Varian Prostar, λ 365 nm. Columna fase inversa, C18 de 150 x 4.6
mm DI con tamaño de partícula de 5µm. Flujo isocrático de
1 mL/min. Tiempo de corrida de 7 min.
52
Figura 5. Cromatograma de una muestra de músculo de camarón
correspondiente a la etapa de tratamiento.
Condiciones de determinación: Cromatógrafo de líquidos de alta
resolución Varian Modelo ProStar. Detector ultravioleta visible
Varian Prostar, λ 365 nm. Columna fase inversa, C18 de 150 x 4.6
mm DI con tamaño de partícula de 5µm. Flujo isocrático de
1 mL/min. Tiempo de corrida de 7 min.
53
Figura 6. Concentración máxima de OTC alcanzada en hepatopáncreas de
camarón blanco Litopenaeus vannamei.
54
Figura 7. Cromatograma de una muestra de hepatopáncreas de camarón
correspondiente a la etapa de tratamiento.
Condiciones de determinación: Cromatógrafo de líquidos de alta
resolución Varian Modelo ProStar. Detector ultravioleta visible
Varian Prostar, λ 365 nm. Columna fase inversa, C18 de 150 x 4.6
mm DI con tamaño de partícula de 5µm. Flujo isocrático de
1 mL/min. Tiempo de corrida de 7 min.
55
Relación del Daño en Órganos de Camarón y la Aplicación de Terapias con
Oxitetraciclina
Los datos obtenidos de la evaluación de daños en órganos de camarón,
antes y después de la administración de las terapias con OTC, no mostraron una
diferencia estadísticamente significativa (P>0.05) en ninguno de los parámetros
evaluados, como fueron presencia de ectoparásitos, bacterias filamentosas,
túbulos festonados, lípidos, gregarinas y gametocitos (Tabla 6).
Existe poca información publicada relacionada con el efecto de OTC y la
disminución del daño en los órganos del camarón. Sin embargo una posible
explicación de este aspecto cuando se presenta necrosis en branquias
provocada por el hongo Fusarium solani, es debida a que la administración de
antibióticos como oxitetraciclina ó la aplicación de algún tratamiento químico,
resulta no útil (Gomez-Gil et al., 2001).
Distintos factores pueden ocasionar necrosis en branquias, uno de ellos
puede ser una infección con bacterias de Vibrio. También, una disminución del
oxígeno disuelto en el agua del estanque ó bien, una infección con hongos
saprófitos. Una manera de combatir la infección, es a través de medidas
preventivas como, limpiar los estanques ó la filtración de los suministros de agua.
Se debe considerar que la aplicación de estas recomendaciones no asegura la
completa erradicación de hongos o bacterias (Fisher et al., 1978).
Los ectoparásitos ó epibiontes bacterianos más comúnmente reportados
son Leucothrix mucor y Flexibacter spp, debido a los daños que ocasionan en las
branquias del camarón. Éstas son bacterias filamentosas, que atacan
principalmente a los camarones, en estadíos larvarios y postlarvarios.
Poblaciones pequeñas de estos parásitos son inofensivas, pero un incremento de
estas especies resulta peligroso, ya que pueden obstaculizar el intercambio
gaseoso y ocasionar la muerte de los organismos por hipoxia (Gómez-Gil et al.,
2001). La aplicación de baños con OTC se ha recomendado en estadíos larvarios,
baños en concentraciones de 40 a 60 ppm, para inhibir el crecimiento de
bacterias, pero no existen evidencias contundentes de su efectividad contra
56
ectoparásitos que infectan a camarón durante las etapas juvenil ó adulta (Gómez-
Gil et al., 2001; Liao, 1996).
Cuando existe un daño en el hepatopáncreas de camarón, se sospecha
que el agente causal es una bacteria ó un virus. Si es una bacteria intracelular el
agente causal de la infección, se diagnostica como Hepatopancreatitis
Necrotizante (NHP-B), ó bien se denomina Hepatopancreatitis Séptica (SHPNS)
cuando la infección es causada por especies del género Vibrio (Lightner y
Pantoja, 2001). Si la infección es ocasionada por virus, se denomina Parvovirus
Hepatopancreático (HPV) (CESASIN, 2003).
Investigaciones realizadas por Frelier et al. (1992), demostraron que el
daño ocasionado en hepatopáncreas de camarón por la enfermedad
Hepatopancreatitis Necrotizante (NHP) se lleva a cabo a una salinidad entre 20 y
40 ‰, influyendo en el contenido de lípidos de las células epiteliales tubulares.
Esto se observó cuando ocurrió la segunda etapa de la infección con NHP,
presentándose además, hipertrofia en células epiteliales tubulares, congestión
hemocítica y necrosis tubular ligera (Frelier et al., 1992). NHP puede ser
controlada si es tratada adecuadamente durante su desarrollo, administrando
alimento medicado con OTC en concentraciones que van desde 1.5 a 4. 0 Kg/Ton
de alimento durante 10-14 días (Lightner, 1995). Bajo las condiciones
experimentales de este estudio no se detectó presencia de NHP, además, no se
observó una disminución en el daño que presentó el hepatopáncreas del camarón
después de haber administrado las terapias con OTC.
También, pueden presentarse problemas en el intestino del camarón por la
acumulación de gametocitos, que es la fase anterior a la evolución de las
gregarinas y el daño es generado cuando se tiene un gran número de estos
parásitos en el intestino del camarón. Shajahan et al. (2007), demostraron que la
mejor forma de reducir la presencia de gregarinas es utilizando antiparasitarios
como el Metronidazol y la Griseofulvina, y que los antimicrobianos como las
tetraciclinas no tienen un efecto sobre estos parásitos.
Diversas especies bacterianas han sido implicadas como agentes causales
de enfermedades en camarones peneidos. La mayoría de las infecciones
bacterianas reportadas, consideran al género Vibrio como el de mayor
57
predominancia. Estas bacterias habitan en ambientes marinos y constituyen la
microflora normal de camarones silvestres y cultivados (Lightner, 1995).
Factores ambientales como temperaturas elevadas, cambios en la
salinidad y altas concentraciones de nitrógeno así como la baja recirculación del
agua en el estanque, elevan los conteos de bacterias de Vibrio, causando un
deterioro en la salud de los camarones (CESASIN, 2003). Prácticamente todas las
especies de bacterias patógenas reportadas para camarón (especialmente
Vibrio) son oportunistas tanto en la fase larvaria como en la de desarrollo de
camarón (Lightner, 1995; Gomez-Gil, 2001).
Lightner (1993), observó mediante microscopía electrónica de barrido,
infecciones por Vibrio en los apéndices de alimentación y en la cavidad oral de
larvas de camarón, así como lesiones en el hepatopáncreas de camarón
provocadas por Vibrio harveyi. La muerte del camarón es ocasionada por una
severa inflamación de este órgano observándose melanización, fibrosis y
necrosis. En los camarones juveniles de mayor edad (45 días), la infección se
presenta de manera crónica, mostrándose solamente unos cuantos túbulos del
hepatopáncreas afectados, y un crecimiento lento del organismo.
58
Tabla 6. Porcentaje del daño en órganos del camarón de cultivo Litopenaeus vannamei antes y después del tratamiento con
Oxitetraciclina.
Órgano Branquias Hepatopáncreas Intestino
Daño NEC (%) ECT (%) BF (%) TUB (%) LIP (%) GRE (%) GAM (%)
Escala de severidad
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Antes
(n=5)
100 0 0 0 0 0 40 40 20 0 60 20 20 0 0 0 40 40 0 20 80 20 0 0 0 100 0 0 0 0 60 20 20 0 0
Después
(n=5)
100 0 0 0 0 0 20 60 20 0 100 0 0 0 0 0 0 0 100 0 40 60 0 0 0 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0
NEC=Necrosis, ECT=Ectoparásitos, BF= Bacterias Filamentosas, TUB=Túbulos, LIP= Lípidos, GRE= Gregarinas, GAM =Gametocitos
0: Ausencia de lesiones
4: Daño severo
59
Relación de Bacterias en Agua de los Estanques y Hepatopáncreas de Camarón
con el Tratamiento de Oxitetraciclina
Se realizó un recuento de Unidades Formadoras de Colonias de Vibrio sp
en agua y hepatopáncreas de camarón, para confirmar la eficacia de OTC
aplicada con dos terapias consecutivas, buscando establecer una relación en el
crecimiento bacteriano durante y después del tratamiento con el antibiótico. El
análisis estadístico de los datos no mostró una diferencia significativa (P>0.05).
En agar TCBS se desarrollan colonias de Vibrio de color verde y amarillas.
Siendo las verdes las de mayor relevancia por ser las causantes de Vibriosis o
síndrome de la gaviota. Las colonias amarillas pueden estar presentes e indicar
una infección mixta, cada una de ellas, puede tener factores de virulencia distintos
(Lighter, 1995; Gómez-Gil et al., 2001).
El conteo de colonias de Vibrio amarillas y verdes se mantuvieron bajos
según los valores reportados por el Comité de Sanidad Acuícola de Sinaloa
(CESASIN, 2003), que establece para colonias amarillas como rangos bajos
<9.0x104 UFC/g en hepatopáncreas, <3.0x104 UFC/g en sedimento y <5.0x102
UFC/mL en agua, y para colonias verdes <3.0x104 UFC/g en hepatopáncreas y
<3.0x104 UFC/mL en agua.
Los recuentos de colonias de Vibrio verdes y amarillas obtenidas en las
distintas muestras analizadas se aprecian en las Tablas 7 y 8.
60
Tabla 7. Evaluación bacteriológica de Vibrio en hepatopáncreas de camarón
durante y después de las terapias con OTC.
Hepatopáncreas
Colonias
de Vibrio
Terapia 1 (UFC/g) Terapia 2 (UFC/g)
Durante Después Durante Después
Verdes 0±0 0±0 0±0 0±0
Amarillas 2.8x102±4.0x102 0±0 2.0x103±2.8x103 0±0
(n=4), X± DE
61
Tabla 8. Evaluación bacteriológica de Vibrio en el agua del estanque durante
y después de las terapias con OTC.
Agua
Colonias
de Vibrio
Terapia 1 (UFC/g) Terapia 2 (UFC/g)
Durante Después Durante Después
Verdes 0±0 0±0 10±14.1 5±7.1
Amarillas 4.0x101±1.4x101 90±5.6x101 7.0x101±4.2101 1.4x102±1.7x102
(n=4) X ± DE
62
Parámetros Físico-Químicos del Agua
Los cambios en la temperatura, salinidad y oxígeno disuelto del agua de
los estanques influyen en el estado fisiológico del camarón, favoreciendo el que
se genere un daño por patógenos (Castex et al., 2009). Estos factores abióticos
modifican y controlan las condiciones fisiológicas de los organismos (Hernández
et al., 2006), de ahí la importancia de mantener un monitoreo constante de estos
parámetros. Las variaciones particularmente en la temperatura del agua, pueden
afectar el metabolismo, crecimiento, muda y sobrevivencia de los organismos de
cultivo, además de reducir la capacidad del sistema inmune del camarón y la
eficiencia de conversión alimenticia (Martínez-Cordoba, 1998; Hernández et al.,
2006; Abad-Rosales et al., 2011). Los valores de temperatura registrados fueron
de 28.5 ±0.2°C durante la mañana y 31.2 ±0.4°C por la tarde. Estos valores
fueron similares a los encontrados por Hernández et al., 2006, donde reportaron
como temperaturas óptimas para el cultivo de camarón rangos entre los 27.9 y los
31.3° C.
Li et al. (2007), sugirieron que la salinidad óptima para el crecimiento de
camarón L. vannamei se encuentra en un rango de 17 a 20 ‰. La salinidad
promedio registrada en los estanques experimentales fue de 39.8±0.2 ‰. Sin
embargo, reportes realizados por Bartlett et al., (1990) y Ponce-Palafox et al.
(1997), demostraron que el crecimiento de camarón L. vannamei no se ve
reducido en ambientes con salinidades entre los 30 a 45 ‰
Los niveles de OD en los estanques fueron mayores durante la noche
(6.73±0.46 mg O2/L) que en la mañana (4.16±0.4 mg O2/L), Las variaciones del
oxígeno disuelto en el agua de los estanques son frecuentes y pueden ser
debidas a recambios de agua ó al sistema de aireación (Cuzon et al., 2004). El
OD es un parámetro importante ya que está directamente relacionado con el
estrés que sufren los camarones en cultivo (Jiang et al., 2005). Se ha demostrado
que niveles bajos de OD influyen negativamente en el crecimiento de los
organismos, limitando el consumo de alimento y su digestibilidad (Cuzon et al.,
2004).
63
Otro factor que es importante considerar es el pH en el agua de los
estanques, ya que puede causar la muerte de los organismos, a valores extremos
(ácidos ó alcalinos). El valor de pH obtenido fue de 8.3±0.06 sin fluctuaciones
importantes durante todo el desarrollo del experimento. El pH del agua juega un
papel muy importante en la fisiología del camarón, su incremento o disminución
provoca una reducción en los hematocitos, células hialinas y granulares, haciendo
a los organismos susceptibles a enfermedades (Li y Chen., 2008). Generalmente,
el valor de pH en los estanques fluctúa de 6.6 a 10.2, los factores que intervienen
en esta variación pueden ser, lluvias ácidas, remoción de CO2 debido a la
fotosíntesis ó liberación de CO2 por plantas y animales durante la noche.
Los niveles de amonio no ionizado registrados en los estanques fueron de
0.2±0.03 mg/L de NH3, ligeramente mayores al rango óptimo sugerido por el
CESASIN, (2003) el cual es <0.01mg/L de NH3. Sin embargo, no se tuvo un
efecto tóxico en los organismos debido a las bajas concentraciones en que se
mantuvo. El amonio no ionizado, es el producto final principal de los compuestos
nitrogenados, se produce como resultado de los desechos de los crustáceos y la
descomposición de la materia orgánica. Sin embargo, la acumulación de amonio
no ionizado en el agua de los estanques es indeseable por su toxicidad, cuando
se conjuga con otros factores fisicoquímicos como el pH, la temperatura y
salinidad, ocasionando consecuencias serias en la respuesta fisiológica y/o en el
sistema inmune del camarón (Mugnier et al., 2008).
Li et al. (2007), reportaron una concentración letal promedio de amonio no
ionizado (NH3) de 39.54 mg/L, en camarón blanco Litopenaeus vannamei en
condiciones de salinidad semejantes a las obtenidas en este estudio.
64
CONCLUSIONES
La aplicación de sales cuaternarias de amonio en el agua de los estanques
de cultivo de camarón Litopenaeus vannamei, no mostró un efecto positivo en el
crecimiento, ganancia de peso y sobrevivencia de este crustáceo.
No se observó un control inhibitorio significativo en bacterias de Vibrio en
agua, sedimento y hepatopáncreas de camarón con la aplicación del biocida a
base de sales cuaternarias de amonio.
No se encontró una disminución en las lesiones que presentaron los
órganos de camarón L. vannamei ocasionadas por bacterias y parásitos antes y
después de la aplicación de los tratamientos con el biocida y con oxitetraciclina.
Los niveles de acumulación de oxitetraciclina alcanzados en músculo y
hepatopáncreas de camarón L. vannamei fueron adecuados con relación a las
Concentraciones Mínimas Inhibitorias establecidas previamente para bacterias del
género Vibrio aisladas del mismo sistema de cultivo. Sin embargo, no se observó
una disminución de estas bacterias presentes en agua y hepatopáncreas de
camarón.
La aplicación de dos terapias con OTC no tuvo un efecto significativo en la
disminución de las lesiones que presentaron los órganos de camarón, sin
embargo, sí se obtuvo una mayor acumulación del antibiótico en músculo y
hepatopáncreas durante la segunda medicación.
De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio no se observó un
efecto benéfico en la aplicación de los tratamientos, con relación a los daños
ocasionados por bacterias y parásitos que presentan los camarones durante su
cultivo.
Las investigaciones científicas realizadas y publicadas han sido
concluyentes respecto al riesgo sanitario que constituye el uso masivo e ilimitado
de antibióticos y biocidas en la producción acuícola. Las exigencias comerciales
65
en relación a la calidad en los productos acuícolas que exigen los mercados
nacionales y extranjeros, hacen necesario tener un mayor control en el uso de
estos compuestos, con la finalidad de garantizar la inocuidad de los alimentos, y
la protección al medio ambiente. Por lo que se sugiere para un mayor control
sobre las enfermedades del camarón, la implementación de Programas de
Buenas Prácticas de Producción Acuícola (BPPA).
66
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