cientifica-v7n2

7/24/2019 cientifica-v7n2

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UNIVERSIDAD

CIENTFICA DEL SUR

DIRECTORIO

Ing. Jos Dextre ChacnPresidente del Directorio

RECTOR

Dr. Agustn Iza Stoll

AUTORIDADES

Mg. Roland Leidinger AyllnVicerrector Acadmico y Gerente General

Dr. Jos Amiel PrezVicerrector de Investigacin

MBA. Rafael Su-Nobrega ArimaGerente Pregrado

MA. Tulio Pita ChvarriGerente Postgrado

MBA. Jaime Tamashiro TamashiroDirector Central de Administracin y Finanzas

Dr. Agustn Iza StollDecano de la Facultad de Medicina Humana

Ing. Jorge Ponce UrquizaDecano de la Facultad de Ingeniera

Econmica y de Negocios

Dr. Rodolfo Valdivia MaibachDecano de la Facultad de Estomatologa

Dra. Luzmila Troncoso CorsoDecana de la Facultad de Nutricin y Diettica

Dr. Manuel Rosemberg BarrnDecano de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Ing. Jos Carlos Dextre ChacnDecano de la Facultad de Ingeniera

de Sistemas Empresariales

Dra. Sonia Valle RubioDecana de la Facultad de Biologa Marina y Econegocios

Ing. Jorge Chvez SalasDecano de la Facultad de Administracin

de Turismo Sostenible y Hotelera

Ing. Juan Guerrero BarrantesDecano de la Facultad de Ingeniera y Gestin Ambiental

Dra. Josefina Takahashi SatoDecana de la Facultad de Negocios Agro-Forestales

Dra. Laurietz Seda RamrezDecana de la Facultad de Artes Escnicas y Literatura

Ing. Zandra Rivera ChvezDirectora de la Facultad de Ingeniera

de Sistemas Empresariales

Mg. Larissa Blsamo FasceDirectora de la Carrera de Psicologa

Mg. Humberto Espinosa ArizaDirector de la Carrera de Administracin

de Negocios Internacionales

Mg. Nilda Escobedo RojasDirectora de la Carrera de Marketing y Administracin

Mg. Jenny Canales PeaDirectora de la Carrera de Comunicacin y Publicidad

Abg. Mariano Castro Snchez-MorenoDirector de la Carrera de Derecho

Arq. Ignacio Pacheco DazDirector de la Carrera de Arquitectura

y Urbanismo Ambiental

Lic. Gustavo Lujn ZumaetaDirector de Propuesta Educativa

Lic. Mariza Ros OliveraDirectora de Servicios Acadmicos

Dr. Emilio Guija PomaDirector del Instituto de Investigacin

Percy Encinas CarranzaDirector del Centro Cultural y del Fondo Editorial


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DirectorDr. Jos Amiel PrezVicerrector de investigacinUniversidad Cientfica del Sur

[email protected]

Comit EditorialDr. Emilio Guija PomaDirector del Instituto de InvestigacinUniversidad Cientfica del [email protected]

Dr. Pedro Mendoza AranaDecano de la Facultad de Medicina HumanaUniversidad Cientfica del [email protected]

Dr. Felipe Antonio San Martn HowardPresidente del Consejo deGestin de la InvestigacinUniversidad Nacional Mayor de San [email protected]

Dr. scar Valiente CastilloDecano de la Facultad de MedicinaUniversidad San Antonio Abad del [email protected]

[email protected]

Fondo Editorial. Universidad Cientfica del Sur.Cl. Cantuarias 398. Miraflores. Lima 18, Per.

Tel.: +511 6106400 anexo 164

Tiraje: 600 ejemplares.

Hecho el depsito legal en la Biblioteca Nacional del Per:N 2008-15522 / ISSN: 1997-700X

Asesora de diseo: Erika KohatsuAsistente de prensa: Rodrigo SalazarCorrectora de estilo: Diana Zapata PrattoDiseo y diagramacin: Estudio Ojo Grco

CIENTFICA, revista de ciencias de la UniversidadCientfica del Sur, publica tres nmeros al ao.La revista est dirigida a investigadores cientficos,docentes y estudiantes universitarios.

La Universidad Cientfica del Sur no se solidariza necesariamente

con las opiniones expresadas en los artculos publicadosen esta edicin de CIENTFICA. Se autoriza la reproduccinde los textos siempre que se cite la fuente.

CIENTFICARevista CIENTFICAVol 7 N2, mayo-agosto 2010


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CONTENIDORevista Cientfica Vol 7 N2, mayo-agosto 2010.

ARTCULOS ORIGINALES

ARTCULOS DE REVISIN

COMIT CIENTFICO

EDITORIAL

IDENTIFICACIN DE BACTERIAS NATIVAS QUE DEGRADANHIDROCARBUROS: BIORREMEDIACIN EN SUELOS CONTAMINADOSCON BORRAS MEDIANTE LA TCNICA DE COMPOSTAJEDENTIFICATION OF NATIVE BACTERIA THAT DEGRADE

HYDROCARBONS: BIOREMEDIATION IN SOILS CONTAMINATED

WITH BORRAS USING THE COMPOSTING TECHNIQUE

Pierina Guilln

PURIFICACIN Y PROPIEDADES DE UNA FOSFATASA CIDA DE BAJOPESO MOLECULAR DE HGADO DE ALPACA(Lama pacos)PURIFICATION AND PROPERTIES OF A LOW MOLECULAR WEIGHT

ACID PHOSPHATASE FROM ALPACA LIVER (Lama pacos)

Emilio Guija Poma

OCURRENCIA DE ECTOPARASITISMO DEAmblyomma rotundatumKOCH, 1844 (ACARI: IXODIDAE) EN Bufo marinus LINNAEUS, 1758OCURRENCE OF ECTOPARASITISM OFAmblyomma rotundatum KOCH,

1844 (ACARI: IXODIDAE) ON Bufo marinusLINNAEUS, 1758

Gianmarco Rojas

LA INTEGRACIN DE LA SALUD Y EL AMBIENTE EN LAS POLTICASPBLICAS: EVITANDO LA CONTAMINACIN DEL AIREHEALTH AND ENVIRONMENTAL INTEGRATION IN PUBLIC POLICIES:

PREVENTING AIR POLUTION

Mariano Castro

TENDENCIAS Y DESAFOS DE LA INNOVACIN Y EL ROL DE LASUNIVERSIDADES PRIVADAS EN EL PERTRENDS AND CHALLENGES OF INNOVATION AND THE

ROLE OF PRIVATE UNIVERSITIES IN PERU

Zandra Rivera

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TESIS

CARTAS AL EDITOR

SALA CABIESES

NOTAS

INFORMACIN PARA LOS AUTORES

LA EDUCACIN EN EL PER: LA IMPORTANCIA DE LA INVERSINEN EDUCACIN COMO PORCENTAJE DEL GASTO PBLICO 1936-2007, UNA CARACTERIZACIN EMPRICAEDUCATION IN PERU: THE IMPORTANCE OF INVESTMENT IN

EDUCATION AS A PERCENTAGE OF GOVERNMENT EXPENDITURE.

1936 - 2007, AN EMPIRICAL CHARACTERIZATION.

Jos Ignacio Pacheco Daz

LA PROPUESTA METODOLGICA DE KARL POPPERTHE METHODOLOGICAL PROPOSAL OF KARL POPPER

Jos Eduardo Rosales Trabuco

PROYECTO MAMI-DIGITAL: UNA PROPUESTA PARA DISMINUIRLA MUERTE MATERNA Y PERINATAL UTILIZANDO NUEVASTECNOLOGAS DE INFORMACIN Y COMUNICACIN (NTIC)

Alberto Zapata

DIFERENCIAS MORFOLGICAS DE NDULOS DE Rhizobium Y SURELACIN CON LA PRODUCTIVIDAD DE CULTIVOS DE ARVEJAPisum sativum

Milvio Casaverde Ro

EL PUNTAJE DE LUND-MACKAY Y SU CORRELACIN CLNICA SEGNEL TIPO DE RINOSINUSITIS, HOSPITAL MILITAR CENTRAL 2009

Yanina Bazn Ponte

EL DESAFOFernando Cabieses

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COMITCIENTFICO

Dr. Paul SchillerDepartamento de Bioqumica y Biologa CelularUniversidad de Miami EE.UU

Dr. Emilio GuijaVicerrectorado de InvestigacinUniversidad Cientfica del Sur

Dr. Ricardo Caballero MerinoJefe de servicios de Obstetricia y GinecologaHospiten Rambla-Espaa

Prof. Ramss SalasFacultad de Ciencias Naturales y MatemticasUniversidad Nacional Federico Villarreal

Dr. Javier EncisoVicerrectorado de InvestigacinUniversidad Cientfica del Sur

Dr. James GrahamDepartamento de Farmacognosis. Facultad de FarmaciaUniversidad de Illinois en Chicago EE.UU

Dr. Alejandro BurgaFacultad de Medicina Humana

Universidad Cientfica del Sur

Dr. Pedro San Martn HowardJefe del Departamento de PediatraHospital Nacional Dos de Mayo

Ing. scar PaibaFacultad de Ingeniera de Sistemas EmpresarialesUniversidad Cientfica del Sur

Dra. Nancy LozanoFacultad de Farmacia y BioqumicaUniversidad Nacional Mayor de San Marcos

Ing. Juan Guerrero BarrantesFacultad de Ingeniera y Gestin AmbientalUniversidad Cientfica del Sur

Ing. Jos DvilaFacultad de Ingeniera de Sistemas Empresariales

Universidad Cientfica del Sur

CIENTFICASEENCUENTRAINDIZADAENLATINDEX


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EDITORIALLos mtodos de investigacin en la ciencia

Los procedimientos que utilizan las ciencias para validar los conocimientos que ella reconoce hansido motivo de diversos comentarios y base para la presentacin de interesantes teoras acerca de la

validez de los mtodos de la ciencia.

En este nmero de nuestra revista se publica el artculo La propuesta metodolgica de KarlPopper, en el que Jos Eduardo Rosales Trabuco revisa los conceptos que Karl Popper elabory expuso desde sus notas iniciales, en 1934, hasta los trabajos finales que han sido editados ycomentados incluso en el presente siglo.

En el artculo mencionado se comentan sus criterios sobre demarcacin y conceptos que explicandetalladamente la falsacin. Contrariamente al positivismo de Compte, Popper no acepta comovlidos los procedimientos inductivos que aplicamos para comprobar las afirmaciones cientficasque queremos demostrar como realmente verdicas. En cambio, propone sus teoras fundadas en losintentos de falsacin de las hiptesis que, en vez de verificarse, deben someterse a una exhaustivabsqueda de fallas para convertirse, as, en verdades ms profundas y permanentes.

Con Mario Bunge, aceptamos como mtodo de la ciencia la definicin del problema, la formulacinde la hiptesis de trabajo y su comprobacin, utilizando procedimientos que, para el caso de lasciencias fcticas, necesariamente debern hacerse con hechos y que tienen la virtud de mostrarlas limitaciones de los nuevos conocimientos as adquiridos, confirmando su temporalidad ypermitindonos reconocer que, adems de transitorios, son contextuales.

Este reconocimiento hace posible y estimula el desarrollo de la ciencia, la tecnologa e innovacin,cuyos aportes se vienen utilizando en favor del bienestar del hombre, quien ve, as, un progresocontinuo y optimista de la condicin humana, con la esperanza de un futuro renovado y adecuadoal inexorable crecimiento y expansin del gnero humano.

El desarrollo de la tecnologa de informacin y de los sistemas, que cuentan con un increble soportede computadoras y sus sorprendentes software, permiten manejar muchas ms variables que lasdos fundamentales de siempre, causa y efecto, y ya no es imprescindible reducir tanto el nmero

amplio de variables presentes en un problema cientfico y su solucin, a solamente unas cuantasvariables relevantes. Hoy en da, se incorporan mltiples variables, tan importantes y numerosas,que podemos afirmar, sin duda alguna, que las variables constituyen la unidad fundamental delMtodo Cientfico. Estamos seguros de que este debate, estimulado de manera inequvoca porPopper, continuar. Y nuestra revista est dispuesta a recibir aportes acerca del tema.

Dr. Jos Amiel PrezDirector


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1UNIVERSIDAD NACIONALAGRARIALAMOLINA. DEPARTAMENTODESUELOS

ARTCULOSORIGINALES

IDENTIFICACIN DE BACTERIAS NATIVASQUE DEGRADAN HIDROCARBUROS:BIORREMEDIACIN EN SUELOSCONTAMINADOS CON BORRAS MEDIANTELA TCNICA DE COMPOSTAJE

IDENTIFICATION OF NATIVE BACTERIA THAT DEGRADEHYDROCARBONS: BIOREMEDIATION IN SOILS CONTAMINATEDWITH BORRAS USING THE COMPOSTING TECHNIQUE

Pierina Elizabeth Guilln Zubiate1, Juan Guerrero Barrantes1


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Identificacin de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediacin ensuelos contaminados con borras mediante la tcnica de compostaje

RESUMEN

En esta investigacin se realizarondos pruebas de biorremediacin ensuelos contaminados con hidrocarburo,provenientes de la Refinera Conchn.Inicialmente, en el laboratorio, se lograislar e identificar bacterias y hongosdel hidrocarburo pesado (con 17 a 19grados API), se determin su actividaddegradativa y emulsificante, as como seseleccion el consorcio bacteriano selectoque fue utilizado en las dos pruebas de

biorremediacin. En cuanto a los resultados,en la primera prueba de biorremediacinPrueba en terrarios, se observ en elterrario nmero cinco (T5) que a los 90 das seobtuvo el 79% de remocin del hidrocarburodel suelo; mientras que en la segundaprueba de biorremediacin Prueba decompostaje, se observ que todas lasbiopilas a los 86 das presentaron entre 95%y 99% de remocin del hidrocarburo y losniveles de TPH estuvieron por debajo de loslmites de aceites y grasas determinadospor la normativa del Ministerio de Energa yMinas de Per. Con lo que se puede concluirque, para esta investigacin, la tcnica decompostaje fue el mejor tratamiento para elsuelo contaminado con hidrocarburo.

Palabras clave:biorremediacin, compostaje,terrarios, borras.

ABSTRACT

In this research, two tests have been carriedout concerning to the bioremediation ofcontaminated soils with hydrocarbon fromConchans Refinery. At a beginning in the

laboratory investigation we got to isolate andidentify bacteria and fungus from the heavyhydrocarbon (with a 17 to 19 API degree).It was determined their degradative andemulsifier activity, in the same way the selectbacterial consortium was selected and usedin the two bioremediation tests. As for theresults, in the first test of bioremediationTest in terrariums, was observed interrarium number five (T5), that after 90days it was obtained 79% of hydrocarbon

removal from the soil, while in the secondbioremediation test Proof of compostingwas observed that after 86 days, all biopilespresented between 95% to 99% removal ofhydrocarbon and the TPH levels were belowthe limits of oils and fats determined by theregulations of the Ministry of Energy andMines of Peru. Therefore we can concludethat for this research, the compostingtechnique was the best treatment forhydrocarbon contaminated soil.

Key words: bioremediation, composting,terrariums, borras.

INTRODUCCIN

La Refinera Conchn se encuentra ubicadaal sur de la ciudad de Lima, en el kilmetro38 de la carretera Panamericana Sur y estorientada a la produccin de asfaltos ycombustibles.

Particularmente importante fue quelos residuos industriales de la refinera

provinieron de la limpieza del fondo delos tanques de almacenamiento de crudoy pozas de recuperacin, de la mezclaheterognea de hidrocarburos con slidos yagua entrampada como subproducto comnde la produccin de crudos, o mezcladascon compuestos inorgnicos formadospor arenas, arcillas, lodos provenientesdel pozo y polvos finos que llegan al crudoen la superficie por accin del viento,en suelos expuestos a concentracionestxicas de petrleo, etc. Estos residuosindustriales fueron depositados desde 1989aproximadamente en dos grandes pozasde borra, dispuestas en el suelo de un cerrocercano (figura 1).

La Refinera Conchn brind las muestrasde hidrocarburo de las pozas de borray la investigacin estuvo enfocada enla obtencin de un consorcio de cepasbacterianas y hongos con el objetivo deutilizarlas en la biorremediacin de sueloscontaminados con borras mediante latcnica de compostaje.


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Pierina Elizabeth Guilln Zubiate, Juan Guerrero Barrantes

FIGURA1. POZASDEBORRAUBICADASDENTRODELAREFINERACONCHN

Poza 2

Poza 1

Largo promedio:50,5 mAncho promedio:

15,6 mProfundidad:0,87 m

Largo promedio: 48,1 mAncho promedio: 16,2 mProfundidad: 0,75 m

MATERIALES Y MTODOS

1. Pruebas de laboratorio

a. Aislamiento e identificacin debacterias y hongos de la borra

Se realiz la evaluacin fisicoqumica delhidrocarburo. Del hidrocarburo se aislaronbacterias y hongos en caldo TripticasaSoya (TSB) y fueron incubadas a 42 Cpor 24 horas hasta obtener crecimiento.Luego se ejecutaron diluciones hasta 1:104

unidades formadoras de colonias (UFC)/gr

y fueron sembrados en agar nutritivo y enmedios de cultivos selectivos para bacterias(agar Cetrimide, agar Pseudomona P, agarPseudomona F, agar Plate-Count y agarSabouraud) por duplicado, y se incubarona 37 C por 24-48 h. Para los hongos, sesembraron en agar Sabouraud incubadasa 48 horas. Se realiz el conteo de nmerode colonias, reportndose en UFC/gr.Seguidamente, se realiz la caracterizacinmicroscpica y macroscpica de las cepasbacterianas y se realiz la evaluacin

bioqumica de las cepas bacterianas paradeterminar enterobacterias. Se realiz

tambin la caracterstica microscpica ymacroscpica de las cepas de hongos.

b. Actividad degradativa, emulsificantey aplicacin de la tcnica del AmericanPetroleum Institute (API 20 NE)

Para la evaluacin de la actividaddegradativa, las cepas reactivadas fueroncentrifugadas a 7.000 rpm por 10 minutosa 6 C. Los pellets obtenidos se inocularonen cantidades de 100 l y 50 l en el medio

de cultivo Bushnell-Haas (BH) solidificadocon agar (1), y se utiliz luz ultravioletacomo medio de esterilizacin durante eldesarrollo de la siembra. Se incubaron atemperatura de 30-34 C. Los hongos nofueron centrifugados. Se seleccionaronlas placas que tuvieron mayor actividaddegradativa (consorcio bacteriano selecto),segn los criterios cualitativos de actividaddegradativa determinados durante laobservacin, por los cambios generados delas bacterias y hongos en medio de cultivo

BH con hidrocarburo borra.Para la calificacin de la actividad degradativa,se dio una calificacin alta a las cepas quepresentaron ms de tres perodos del procesode desarrollo de la actividad degradativa pordemostrar mayores reacciones degradativas.Luego se realiz una comparacin de laactividad emulsificante de las bacterias quepresentaron una alta calificacin de actividaddegradativa (2).Seguidamente, se utiliz latcnica API 20 NE para la caracterizacin dealgunas bacterias (3).

2. Prueba de campoa. Prueba de terrarios en arena

Se acondicionaron seis terrarios de arenasin hidrocarburo (4), con sus respectivasrepeticiones y se les agregaron diferentesproporciones de nutrientes (5) (nitrgeno yfsforo: (NH4)2SO4y K2HPO4), agua, solucinsalina (SS) e hidrocarburo (borra). Luego secolocaron en el terrario 3, terrario 4, terrario5 y terrario 6 diferentes cantidades de pelletscon bacterias y hongos con solucin salina(tabla 1 y figura 2).


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FIGURA2. TERRARIOSENARENA

Durante los tres meses que dur la prueba,cada tres das se agregaron 100 ml de aguaa cada terrario y se removi manualmente

para oxigenar al sistema.

b. Prueba de compost

Se utiliz el sistema de compostaje abierto,que es el ms tradicional, en el que lossustratos a compostar se disponen en pilasque pueden estar al aire libre o cubiertas.

Las biopilas de compost tuvieron un volumende 1 m3 y las medidas de las pozas fueron:2,3 m (ancho) x 8,3 m (largo) y 1 m. El suelose nivel, compact y las biopilas fueronrevestidas con una geomembrana. Se utiliz

estircol de vaca, fermentndolo antes de suuso (tabla 2).

Terrario N 1

Terrario N 1,1

Terrario N 1

Terrario N 2,1

Terrario N 3

Terrario N 3,1

Terrario N 4

Terrario N 4,1

Terrario N 5

Terrario N 5,1

Terrario N 6

Terrario N 6,1

N Terrarios

3.000

3.000

3.000

3.000

3.000

3.000

3.000

3.000

3.000

3.000

3.000

3.000

75

75

75

75

75

75

75

75

75

75

75

75

0

0

0

0

150

150

150

150

150

150

150

150

150

150

150

150

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

261,4

261,4

261,4

261,4

261,4

261,4

261,4

261,4

261,4

261,4

261,4

261,4

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Suelo

(gr)

Borra

(gr)

Pellet

(ml)

SS

(ml)

Nutrientes

(ml)

Agua

(ml)

Componente N1

Componente N2

Componente N3

Estircol de vaca

Caa

Brcoli

Paja de maleza seca

Total Insumos

55 kg

30 kg

50 kg

34 kg

5

3

2

7

275 kg

90 kg

100 kg

238 kg

703 kg

InsumoPeso por

carretillaCantidad de

carretillas

Total de

insumos (kg)

TABLA2. CANTIDADENKGDEINSUMOSREQUERIDOSENCADABIOPILADECOMPOST

TABLA1. CONTENIDODECADATERRARIO


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VERTIDODEPAJASECA, ESTIRCOL, BRCOLI VERTIDODELHIDROCARBURO(BORRA)

FIGURA3.ARMADODELASBIOPILAS

La prueba consisti en la formacin de seisbiopilas de compost. La primera biopilafue el control y a las cinco restantes se lesaplicaron diferentes proporciones de borray solamente a dos de estas biopilas se aplicel tratamiento de bioaumentacin (tabla 3).

Luego, las biopilas se humedecieronquincenalmente y fueron volteadas cada

30 das para mejorar la oxigenacin yhomogenizacin del material compostado.Los resultados estuvieron en funcin dela medicin de la temperatura, pH para laobtencin del compost, poblacin bacterianay la degradacin de los hidrocarburos totalesde petrleo (TPH).

Bioaumentacin

Se seleccionaron dos biopilas (CB1 y CB2),a las cuales se les agreg el consorcio

bacteriano selecto. Se sigui el mismoprocedimiento para la obtencin de pellets

que fue desarrollado en la prueba dedegradacin del hidrocarburo en terrarios,con la diferencia de que se prepar mayormaterial bacteriano. Se obtuvieron 358 mlde cada cepa bacteriana en solucin salinay se incorporaron a las biopilas luego delvolteo. Consecuentemente, se regaron lasbiopilas para controlar la humedad duranteel proceso de volteo (figura 4).

Para el armado de las biopilasse demarcel rea de la base de la biopila con tallossecos de caa (tres carretillas), se colocen el centro de la base de la biopila untronco de bamb y se incorpor comobase una mezcla de tres carretillas de pajaseca, encima dos carretillas de estircol y

una carretilla de brcoli. Luego, se echarondos carretillas de estircol mezclada conuna parte de la borra requerida; sobre estose coloc una carretilla de estircol con laltima cantidad de la borra. Finalmente,se termin con tres carretillas de paja,hasta completar la altura de 1 m. Se retirel tronco de bamb al da siguiente delarmado de la biopila (figura 3).

Co

CB1

C1

CB2

C2

C3

Biopila control

Biopila con borra

y mas bioaumentacin

Biopila con borra

Biopila con borra

y mas bioaumentacin

Biopila con borra

Biopila con borra

0

25 kg

25 kg

50 kg

50 kg

75 kg

0

2,5%

2,5%

5%

5%

7,5%

CdigoDescripcin de

las biopilasBorra kg Biopila (%)

en 1 m3

TABLA3. PROPORCIONESDEBORRAPARACADABIOPILA


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PELLETPARALABIOAUMENTACIN AGREGADODELCONSORCIOBACTERIANOALASBIOPILAS

FIGURA4.BIOAUMENTACIN

Prueba de actividad degradativa y emulsificante con 100 l de cepas bacterianas

1,397

1,0290,936 0,909

0,6830,527

0,4660,3

0,214 0,208 0,11 0,088 0,078

B9.2(alta AD)

B1(alta AD)

B9.1(alta AD)

B15(alta AD)

B2(media AD)

B35(media AD)

B5(media AD)

B12(media AD)

B7(baja AD)

B24(baja AD)

B14(baja AD)

B10(baja AD)

B11(baja AD)

Calificacin de la actividad degradativa de las cepas bacterianas

Perodo

de

la

actividad

de

gradativa

4

3

2

1

0

Perodos de act ividad degradat iva (AD) Actividad emulsificante

FIGURA5.

CepasbaCterianas(100 l) ConmayoraCtividaddegradativayemulsifiCante

Se volvi a colocar la caa de bamb en labiopila para mantener aireado el sistema decompostaje y, al cumplir los 120 das quedur la prueba, el material que compona elcompost ya se encontraba descompuesto yde color marrn oscuro, lo que supone unaaceleracin de la descomposicin de loshidrocarburos.

RESULTADOS

a. Resultado de la prueba de laboratorio

Se clasific al hidrocarburo de las pozas de

borra segn su peso API (American PetroleumInstitute) y registr en promedio de 17 a 19grados API. Asimismo, segn el mtodo dereferencia de la EPA (Environmental ProtectionAgency), el anlisis cromatogrfico obtuvo151,495 mg/kg (15%) de hidrocarburos totalesde petrleo, lo cual confirma que las pozas deborra contienen hidrocarburo pesado.

Se identificaron seis cepas de hongosque fueron clasificadas segn gnerotaxonmico: el gnero Rhizopus (cdigosh33, h38 y h39) y el gnero Aspergillus(cdigos h28, h36 y h30).

De la prueba de actividad degradativa con100 l de cepas bacterianas en medioBushnell-Haas se seleccionaron cuatrocepas bacterianas (cepa B9.2 con 1.397unidades de actividad emulsificante (UAE)/ml; cepa B1 con 1.029 UAE/ml; cepa B9.1con 0.936 UAE/ml y cepa B15 con 0.909UAE/ml) que presentaron mayor actividad

degradativa y emulsificante del hidrocarburo.Tambin se observ que nueve cepas(cepas B2, B35, B5, B12, B7, B24, B14, B10y B11) alcanzaron una mediana actividaddegradativa (figura 5). Estas 13 cepasbacterianas (consorcio bacteriano selecto),fueron consideradas para la prueba enterrarios y prueba de compost.


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Al consorcio bacteriano selecto se le aplic latcnica API 20 NE, identificndose solo cuatroespecies de cepas bacterianas: las especies

Aeromonas salm. Masoucida/achromogenes(cepa B1),Brevundimonas vesicularis (cepaB9.2),Agrobacterium radiobacter(cepa B15)y Burkholderia cepacia(cepa B5 y cepa B35).

Se determin tambin la actividaddegradativa de los hongos en medio decultivo Bushnell Haas (BH) con borra,donde se registraron seis hongos (H27,H28, H29, H30, H31 y H39) que presentaronuna calificacin baja, por presentar soloun perodo del proceso de desarrollo dela actividad degradativa; y seis hongos

(H37, H26, H34, H38, H36 y H33) que nopresentaron ninguna reaccin. Del generoRhizopus, la cepa H39 tuvo baja actividaddegradativa, y nula actividad degradativa lascepas H33 y H38; y, del gneroAspergilluscon baja actividad degradativa son lascepas H28 y H30 y, con nula actividad

degradativa, la cepa H36.b. Prueba de campo

Prueba en terrarios

Teniendo el TPH inicial y TPH final de lasmuestras de terrarios evaluadas se determinel porcentaje de remocin del hidrocarburo(figura 6).

El mayor porcentaje de remocin de TPHse observ en los terrarios T5 (79%) yT5.1 (75%), los cuales fueron inoculadoscon el consorcio bacteriano selecto. Losresultados fueron comparados con lanormativa nacional vigente, con el criterio

del nivel de saneamiento de 5.000 mg/kg deTPH (6).

Prueba de compost

El tiempo del seguimiento, control ymedicin de la temperatura fue de 122 das.

En las biopilas Co, C1 y CB1:a los 15 das decompostado, las tres biopilas presentaron

una temperatura termoflica similar. A los30 das (primer volteo), la biopila control(Co) tuvo la temperatura ms alta de 69,8C; a diferencia de las dems biopilas,que aumentaron su temperatura a los 52das (primer volteo), la biopila C1 a 58 C

y la CB1 a 68,7 C. A los 66 das (segundovolteo) la temperatura baj en la biopila Co(45,7 C) y a los 122 das alcanz 23,2 C.Las biopilas C1 y CB1 tuvieron una segundafase termoflica a los 87 das en la biopilaC1 (49,1 C) y baj ms a los 101 das en labiopila CB1 (39,8 C). Luego, a los 120 dasla temperatura disminuy ms para las dosbiopilas (figura 7).

FIGURA6. PORCENTAJEDEREMOCINDETPH ENTERRARIOSVS.NORMATIVAPERUANA

80.00

75.00

70.00

65.0060.00

55.00

50.00

45.00

40.00

35.00

30.00

25.00

20.00

15.00

10.00

5.00

0.00

Terrario

N1

Terrario

N1.1

Terrario

N2

Terrario

N2.1

Terrario

N3

Terrario

N3.1

Terrario

N4

Terrario

N4.1

Terrario

N5

Terrario

N5.1

Terrario

N6

Terrario

N6.1

Porcentaje de remocin de TPH en cada terrario

Tratamientos de los terrarios

TPH inicial (g/kg) TPH final (g/kg) Lmites aceites y grasas 5g/kg MEM Porcentaje de remocin


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117Cientfica 7(2), 2010


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Valor observado de temperatura en la biopila control, biopila C1 y biopila CB1

Valorobservadodetemperatura

Das de compostado

T promedio (C) control Fase Termoflica T prom. en C1 T prom. en CB1

80

70

60

50

40

30

20

10

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Valor observado de temperatura en la biopila control, biopila C2, biopila CB2 y biopila C3

Valorobservadodetemperatura

Das de compostado

80

70

60

50

40

30

20

10

0

T prom. (C) control Fase Termoflica T prom. en C2 T prom. en CB2 T prom. en C3

FIGURA7.variaCintemporaldelatemperaturaenlasbiopilasCo, C1 y Cb1

FIGURA8. variaCintemporaldelatemperaturaenlasbiopilasC2, Cb2 y C3

En las biopilas Co, C2, CB2 y C3: a los 15 dasde compostado, las biopilas presentaron unatemperatura termoflica similar. A los 30 das(primer volteo) la biopila control (Co) tuvo latemperatura ms alta de 69,8 C, seguida porla biopila C2 (61,97 C), y las dems biopilasrecin aumentaron su temperatura a los 38das (primer volteo); en la biopila C3 (50,6

C) y CB2 (52 C). A los 66 das (segundo

volteo), en la biopila Co la temperatura llega 45,7 C y luego baj a 23,2 C a los 122das. La biopila C2 a los 73 das present lasegunda fase termoflica con una temperaturade 47,67 C y, la biopila C3, a 42,4 C. A los94 das, la biopila CB2 recin tuvo la fasetermofilica con una temperatura de 47,7 C.Luego, a los 120 das, la temperatura baj

para las dos biopilas (figura 8).


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118 Cientfica 7(2), 2010


La variacin de pH durante los das decompostado estuvo en el rango de 5,9 a7,2 en las biopilas C1 y CB1; y de 5,9 a 7,5en las biopilas C2, CB2 y C3. La variacinde pH durante los das de compostadopresent similares valores. La evaluacinde TPH y de la densidad poblacional a los

85 das revel un aumento en la densidadpoblacional de bacterias y una disminucinen el nivel de TPH. El nivel de TPH alcanzniveles menores de 5.000 mg/kg de TPH alos 120 das (figura 8). Por tanto, se registrel porcentaje de remocin a los 120 das yestuvo entre 98% a 99% de remocin del

hidrocarburo (figura 9).

Porcentajede

Remocin

105%

100%

95%

90%

85%

80%

75 %

Porcentaje de remocin de TPH en cada biopila

31 das 86 das 120 das

Tiempo del proceso de compost

Biopila C1 Biopila CB1 Biopila C2 Biopila CB2 Biopila C3

FIGURA10. PORCENTAJEDEREMOCINDETPHENCADABIOPILA

Valorobservado

de

TPH

40000

35000

30000

25000

20000

15000

10000

5000

Valor observado de TPH en cada biopila y el nivel de intervencin de TPH del MEM

Biopila C Biopila CB1 Biopila CB2 Biopila C3Biopila C2

Tipos de biopilas

31/03/2004 31 das 28/06/2004 120 das25/05/2004 86 das Nivel de Intervencin MEM

FIGURA9.VARIACINTEMPORALDELACONCENTRACINDETPHENCADABIOPILADECOMPOSTAJE

DISCUSIN

Se aislaron bacterias y hongos de tresmuestras de borra slida, borra lquiday borra con arena, obtenidas de dospozas de hidrocarburos ubicadas pormuchos aos en la Refinera Conchn. Lasupervivencia de bacterias puras en la fasede seleccin en condiciones de laboratoriosugiere que poseen capacidad para utilizarhidrocarburos alifticos y aromticos comodonadores de electrones. En el caso desuelos contaminados con hidrocarburos, se

requiere de una concentracin mnima demicroorganismos especficos degradadores10 x 103 a 10 x 104 UFC/gr de suelo y deorganismos hetertrofos totales de 10 x 105

a 10 x 106UFC/gr de suelo (7).

Para determinar si la bacteria puedeusarse en la biorremediacin, se evalula capacidad emulsificante y actividaddegradativa mediante la prueba en medioBushnell Haas (BH). En cuanto a sucapacidad emulsificante, se obtuvieron

cuatro mejores cepas bacterianas (cepas


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B9.2, B1, B9.1 y B15) con mayor actividaddegradativa que tambin presentaron mayoractividad emulsificante, determinndosecuantitativamente a travs de la conversinde la absorbancia en unidades actividademulsificante/ml. Asimismo, se obtuvierondos cepas del gnero Chryseomonas que

mostraron mejor actividad emulsificantecon 0,51 y 0,48 UAE/ml respectivamente.En la tesis Aislamiento e Identificacinde cepas bacterianas biorremediadorasy su evaluacin sobre suelo contaminadocon petrleo crudo, de Prudencio (2002)(8), se obtuvieron seis cepas con valoresmayores de UAE con tres cepas de Bacilluscon 0,718; 0,679; 0,679 UAE/ml; una cepade Pseudomonas con 0,683 UAE/ml;

Acinetobacter con 0,707 UAE/ml y una cepano identificada con 0,683 UAE/ml.

En nuestro trabajo se obtuvieron tres

cepas con valores mayores de actividademulsificante que fueron identificadas segnsu taxonoma: cepa de Brevundimonasvesicularis (cepa B9.2) con 1,397 UAE/ml; cepa Aeromonas salm. Masoucida/achromogenes (cepa B1), con 1,029 UAE/ml; y cepa Agrobacterium radiobacter (cepaB15), con 0,909 UEA/ml. As como una cepano identificada (cepa B9.1), con 0,936 UAE/ml. No se evalu la actividad emulsificante delos hongos porque no presentaron actividaddegradativa en borras.

De las 27 cepas bacterianas aisladas de laborra se seleccionaron 13 cepas bacterianascon mejor actividad degradativa yemulsificante, las cuales fueron sometidas a laprueba de degradacin de borras en terrariosy a la prueba de degradacin de borras concompost, sin y con bioaumentacin.

La prueba de los terrarios con arenadetermin la buena accin degradativa delas 13 cepas bacterianas, que luego de 90das bajaron la concentracin de TPH en laarena.

En esta investigacin, la prueba decompostaje que dio mejores resultados enla disminucin de TPH fue por el mtodo debioaumentacin en compostaje. Al agregarmicroorganismos exgenos provenientesespecialmente de la borra lquida conuna adecuada actividad degradativa yemulsificante, se estimul que el consumodel hidrocarburo fuera visible a los 31 das,y a los 86 das ya los niveles de TPH seencontraron por debajo de los establecidospor el Ministerio de Energa y Minas (MINEM).Por tanto, una aproximacin muy interesanteconsisti en combinar la bioestimulacin

con la utilizacin de microorganismosautctonos, previamente aislados desde elmedio contaminado, para ser reintroducidosmasivamente (9).

El incremento en la densidad poblacionalse considera una medida indirecta de laactividad metablica de la poblacin (10,11),

debido a que los hidrocarburos constituyenla fuente de carbono necesaria para elcrecimiento microbiano, tal como lo sealaVias (9), quien evalu la capacidad dedegradacin de hidrocarburos provenientesdel petrleo mediante la caracterizacinmicrobiolgica, qumica y ecotoxicolgica.

La disminucin del contenido de loshidrocarburos totales se corresponde con elincremento de la densidad poblacional de loshetertrofos mesfilos en los tratamientos.Es as que la densidad poblacional evaluada

durante tres etapas del proceso decompostaje permiti confirmar el aumentopoblacional de bacterias con la disminucinde TPH a los 85 das de transcurrido elproceso de compostaje.

Se puede dar una aproximacin segn losresultados obtenidos en el presente trabajo:con la incorporacin de 75 kg de borra para 1m3de biopila a los 120 das se obtuvo un nivelde TPH de 4.459 mg/kg, concentracin queest muy cerca de los niveles establecidospor la normativa del MINEM. Es importantedestacar que, si se utilizara mayor cantidad

en kilogramos de borra para un tratamientomediante compostaje, podra sobrepasar loslmites establecidos por MINEM de 5.000mg/kg de TPH (6).

Con la prueba en terrarios se pudo determinarque los niveles de hidrocarburos aromticospolicclicos se encuentran presentes encantidades muy altas, as como en la pruebade compostaje se determin que los nivelesde metales pesados se encuentran presentespero en pequeas cantidades.

CONCLUSIONES

1. El recuento bacteriano present unadinmica poblacional distinta, en lamuestra de borra lquida (superficie de lapoza de borra) con 1,00 x 105hasta 1,83x 106UFC/gr y en la muestra de borraslida (profundidad de la poza de borra)con 7,30 x 105hasta 1,74 x 106 UFC/gr.

2. La prueba de actividad degradativa parabacterias fue mayor cuando se inocularon100 l de cepas bacterianas en mediode cultivo Bushnell Haas, de las cuales


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se seleccionaron 13 cepas bacterianascon mayor actividad degradativa yemulsificante (UAE) identificadas comoconsorcio bacteriano selecto.

3. Se caracterizaron cuatro cepasbacterianas con la tcnica API 20 NEy se las clasific taxonmicamente:cepa de Brevundimonas vesicularis,cepa Aeromonas salm. Masoucida/achromogenes, cepa Agrobacteriumradiobacter y la cepa Burkholderiacepacia. As como dos gneros de

hongos:Aspergillusy Rhizopus.4. La prueba de terrarios y la prueba

de compostaje demostraron mayordegradacin del hidrocarburo del suelocontaminado agregando el consorciobacteriano selecto a las muestras,cuyos microorganismos fueron aisladosdel mismo hidrocarburo borra.

5. Utilizando el consorcio bacterianoselecto se observ que, en la pruebade compostaje, a los 86 das, seobtuvo entre 95 y 99% de remocin del

hidrocarburo y, en la prueba de terrarios,a los 90 das solo se obtuvo entre 75 y79% de remocin del hidrocarburo.

6. En la prueba de terrarios no se logrdisminuir, a los 90 das, los niveles deTPH para obtener un saneamiento menora los 5.000 mg/kg segn la normativaperuana para suelos contaminados conTPH. Por tanto, el nico terrario quepresent una mayor disminucin de TPHfue el terrario T5 con 5.600 mg/kg, el cualse inocul con el consorcio bacteriano

selecto.7. En la prueba de compostaje, los niveles

de TPH disminuyeron a los 86 das entres biopilas: la biopila CB1 (3.008 mg/kg), biopila C2 (3.879 mg/kg) y biopilaCB2 (4.310 mg/kg), presentndose pordebajo de los lmites de aceites y grasas;y a los 120 das se logr alcanzar entodas las biopilas evaluadas un nivel desaneamiento por debajo de 5.000 mg/kg para suelos contaminados con TPH(MINEM).


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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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11. Boopathy R. Factors limiting bioremediation technologies. Bioresource Technology 2000;74: 63-77.

*TRABAJODEINVESTIGACINPRESENTADOPORPIERINAGUILLNZUBIATEPARAOBTENERELGRADODEMAGSTERSCIENTIAEENCIENCIASAMBIENTALES. UNIVERSIDADNACIONALAGRARIALAMOLINA. ESCUELADEPOSTGRADO

JUANGUERREROCORRESPONDENCIA: [email protected]

RECEPCIN: 02/08/2010ACEPTACIN: 30/08/2010


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PURIFICACIN Y PROPIEDADES DE UNAFOSFATASA CIDA DE BAJO PESO MOLECULARDE HGADO DE ALPACA(Lama pacos)

PURIFICATION AND PROPERTIES OF A LOW MOLECULAR WEIGHTACID PHOSPHATASE FROM ALPACA LIVER(Lama pacos)

Emilio Guija Poma1*,Hielke Haak Mares, Fernando Arauco Villar2


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Purificacin y propiedades de una fosfatasa cida de bajo peso molecular de hgado de alpaca ( Lama pacos)

RESUMEN

Se ha puricado 1.306 veces una fosfatasacida de bajo peso molecular de hgadode alpaca. El procedimiento incluyefraccionamiento con sulfato de amonio,tratamiento cido, cromatografa de exclusinmolecular y cromatografa de intercambio

inico utilizando SE-sephadex. La enzimapuricada tiene un peso molecular de 16,4KDa, que se determin utilizando electroforesisen gel de poliacrilamida en presencia dedodecil sulfato de sodio. La enzima catalizapreferencialmente el p-nitrofenil fosfato ymuestra un pH ptimo de 5,0; el valor Kmobtenido a pH 5,0 para el p-nitrofenil fosfatofue de 4,0 x 10-5M y de 1,1 x 10-3M parael fenil fosfato. El magnesio, bario y cobaltono afectaron signicativamente la actividadenzimtica, pero la enzima fue fuertementeinhibida por mercurio.

Palabras clave: fosfatasa cida,puricacin, alpaca, hgado.

ABSTRACT

A low molecular weight alpaca liver acidphosphatase has been puried 1.306-fold.The procedure involves ammonium sulfatefractionation, acid treatment, molecularexclusion chromatography and SE-sephadexion exchange chromatography.

The puried enzyme has a molecular weight

of 16,4 KDa as determined by polyacrilamidegel electrophoresis in the presence ofsodium dodecyl sulphate. The enzymecatalyzes preferencially p-nitrophenylphosphate and shows an optimum pH of5,0; the Km value obtained at pH 5,0 forp-nitrophenyl phosphate was 4,0 x 10-5 Mand 1,1 x 10-3M by using phenyl phosphateas substrate. Magnesium, calcium, bariumand cobalto had no effect on the enzymeactivity signicatively, but the enzyme wasstrongly inhibited by mercury.

Key words:acid phosphatase, purication,alpaca, liver.

INTRODUCCIN

Las fosfatasas cidas (fosfohidrolasas demonosteres ortofosfricos EC 3.1.3.2.)son enzimas de amplia distribucin enla naturaleza, que tienen la propiedadde hidrolizar una diversidad de steresmonofosfricos y de catalizar reaccionesde transfosforilacin (1,2).Se han puricado

fosfatasas cidas de cerdo (3), placentahumana (4), hgado de bovino (5), cerebrode bovino (6), etc.

Esta enzima se presenta en mltiplesformas en un mismo tejido, las que dierenen razn de sus pesos molecularesy propiedades cinticas; as mismo,

muestran especicidades distintas frentea diversos sustratos. Se han separadotres formas distintas de fosfatasa cidaen hgado de bovino (5); de manerasimilar, se ha observado que el hgado dehumano contiene tres formas molecularesde fosfatasa cida, habindose puricadoaquella de ms bajo peso molecular (7).Los iones metlicos afectan de una maneramuy diversa la actividad cataltica de estasenzimas; las fosfatasas cidas de bajo pesomolecular son afectadas por reactivos degrupos sulfhidrilo, en cambio, las fosfatasas

cidas de alto peso molecular son inhibidaspor tartrato y uoruro. Anlogamente, el pHejerce efecto sobre el valor Km, el cual esdependiente de la naturaleza del sustratoutilizado. En el presente trabajo se describela puricacin de una forma de fosfatasacida de bajo peso molecular y algunas desus propiedades cinticas.

MATERIALES Y MTODOS

Material biolgico

Se utiliz hgado de alpaca (Lama pacos) deanimales sacricados en el Camal Municipalde Huancavelica, el que se someti a unainspeccin veterinaria macroscpica con elpropsito de detectar y descartar rganoscon anomalas patolgicas; inmediatamentedespus se procedi a la limpieza ydebridacin para eliminar la mayor parte deltejido conectivo y grasa, luego se congelse traslad a Lima y se guard a unatemperatura de -20 C.

Reactivos qumicos

El sulfato de amonio, sephadex G-75 (45-120), sulfoetil sephadex C-50, p-nitrofenol,fenol, etilendiaminotetraactico (EDTA),D-glucosa-6-fosfato, D-fructosa-6-fosfato,D,L-a-glicerolfosfato y seroalbmina bovinase adquirieron de la Sigma ChemicalCompany; el p-nitrofenil fosfato (saldisdica), fenil fosfato (sal disdica), cidoactico glacial, Folin-Ciocalteu, etanolabsoluto, metanol y glicerol se comprarona la Merck Darmstadt. Todos los otrosreactivos fueron de grado analtico.


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Emilio Guija Poma, Hielke Haak Mares, Fernando Arauco Villar

Medida de la actividad enzimtica

La actividad de la enzima se determinmidiendo la liberacin de p-nitrofenolutilizando como sustrato el p-nitrofenil fosfato.El medio de ensayo, en un volumen de 2.0 mLcontena 50 mmoles de tampn acetato desodio pH 5,0, EDTA 0,2 mmoles, p-nitrofenil

fosfato 2 mmoles y enzima. La reaccin serealiz a 37 C durante 2 minutos y se detuvomediante la adicin de 1 mL de NaOH 1 N. Elp-nitrofenol liberado se midi a 400 nm en unespectrofotmetro Gilford 240. Para realizarlos clculos (6) se utiliz un coeciente deextincin molar de 1,8 x 104 M-1 cm-1. Bajoestas condiciones experimentales, el sustratohidrolizado no excedi el 3%. Una unidadde actividad enzimtica se dene comola cantidad de enzima que libera 1 mmolede p-nitrofenol por minuto. La actividadespecca se expresa como unidades de

actividad enzimtica por mg de protena.La actividad enzimtica tambin se midiutilizando como sustrato fenil fosfato. Elmedio de ensayo en un volumen de 2 mLcontena 50 mmoles de acetato de sodiopH 5,0, EDTA 0,2 mmoles, fenil fosfato 10mmoles y enzima. La medicin se realiza 37 C y el tiempo de reaccin fue de 10minutos, a cuyo trmino se detuvo la reaccinpor adicin de 1 mL de NaOH 1 N. El fenolliberado se midi a 290 nm y el coecientede extincin molar utilizado(8) para realizarlos clculos fue de 2,52 x 103M-1cm-1.

Especicidad de sustrato

Se utilizaron diversos steres monofosfricosa una concentracin nal de 2,0 x 10-3M, enun medio de ensayo que en un volumende 2,0 mL contena 50 mmoles de tampnacetato de sodio pH 5,0, EDTA 0,2 mmolesy enzima, siendo la temperatura de 37 C;el tiempo de incubacin fue de 20 minutos,con excepcin del medio que contenap-nitrofenil fosfato, que fue de 2 minutos.Las reacciones se detuvieron por adicin

de 1 mL de cido tricloroactico al 10% yse midi el fosfato liberado (9), para cuyopropsito se midi una alcuota de 1,0 mL,se aadieron 3,0 mL de agua y 4,0 mL delreactivo de color, se incubaron a 37 C por90 minutos, a cuyo trmino se leyeron a 820nm en el espectrofotmetro, habindosepreparado una curva estndar para realizarlos clculos.

Determinacin de la concentracin deprotena

La determinacin de protena se realiz

por el mtodo de Lowry (10), usando

la albmina srica de bovino comoestndar. La presencia de protenas enlas fracciones que se colectaron de lascolumnas cromatogrcas se evaluaronespectrofotomtricamente midiendo laabsorcin a 280 nm.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

con SDS

La electroforesis se realiz utilizando unsistema vertical en placa de acuerdo conla tcnica descrita por Laemmli (11). Lasconcentraciones nales para el gel deresolucin fueron: acrilamida 15%, Tris-HCl 1.5 M pH 8,8, SDS 0,4%, Temed0,05% y persulfato de amonio 0,0075%.El gel de stacking tena las siguientesconcentraciones: acrilamida 3%, Tris-HCl0,125 M pH 6,8, SDS 0,1%, Temed 0,024%y persulfato de amonio 0,0075%. El tampn

para los electrodos contena: Tris-HCl 0,025M, glicina 0,192 M y SDS 0,1% pH 8,3.

Determinacin del peso molecular de laenzima

La determinacin del peso molecular dela fosfatasa cida se realiz en un gel deresolucin de manera similar al descritoanteriormente, habindose utilizado unaconcentracin de acrilamida de 10% yun kit de protenas estndar (Dalton MarkVI), lisozima de clara de huevo 14,3 KDa,b-lactoglobulina de leche de vaca 18,4

KDa (subunidad), tripsingeno de pncreasde bovino 24 KDa, pepsina de mucosaestomacal de cerdo 34,7 KDa, albmina dehuevo 45 KDa y albmina de plasma bovino66 KDa.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Puricacin de la fosfatasa cida

Para el proceso de puricacin se pesaron250 g de hgado de alpaca y se homogenizaroncon 4 volmenes de tampn acetato de sodio

0,01 M pH 5,0, EDTA 0,001 M en un WaringBlendor, en 3 sesiones de 30 segundos con1 minuto de reposo en un cuarto fro a 4 C.El homogenizado se centrifug a 11.600 gdurante 30 minutos utilizando una centrfugarefrigerada Sorvall RC-2B y al sobrenadanteresultante se le adicion sulfato de amoniopara llevarlo a un 25% de saturacin; luegose centrifug a 11.600 g por 30 minutos yel sobrenadante nalmente se llev a 60%de saturacin con sulfato de amonio y secentrifug como en el caso anterior. Elprecipitado se suspendi con el tampn

de homogenizacin y se ajust el pH a 4,5


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0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

450

480

510

540

570

600

630

660

690

720

750

780

810

840

870

900

930

960

990

1.020

1.050

1.080

1.110

1.140

1.170

1.200

1.230

1.260

1.290

1.320

1.350

1.380

1.410

1.440

1.470

1.500

D.O.

400MmA

ctividadEnz

imtica

D.O.

200Protenas

Volumen mL

FIGURA1. CROMATOGRAFAENSEPHADEXG-75

mediante la adicin de cido actico diluido;se dej agitando durante 30 minutos, a cuyotrmino se centrifug de manera similar a laetapa anterior y el sobrenadante se llev apH 5,0 con una solucin diluida de hidrxidode amonio.

El sobrenadante anterior se llev a 70% de

saturacin con sulfato de amonio y luego secentrifug de manera anloga a las etapasanteriores. El precipitado se resuspendi enel tampn de homogenizacin y se dializcon el mismo tampn durante 15 horas,cambiando de tampn tres veces, hasta

que la reaccin para sulfato de amonio fuenegativa, luego se procedi a centrifugar enlas condiciones antes descritas.

Se aplic el sobrenadante de la etapaanterior a una columna de Sephadex G-75(110 x 4,5 cm) previamente equilibradacon el tampn de homogenizacin, luego

se eluy utilizando el mismo tampn deelusin y se colectaron fracciones de 10 mLa las que se midi la actividad enzimticay la presencia de protenas a 280 nm. Se

juntaron las fracciones con signicativaactividad enzimtica.

El volumen de elusin de la etapa anterior seaplic a una columna de sulfoetil sephadexC-50 (4,0 x 1,1 cm) equilibrada previamentecon el tampn de homogenizacin el quesirvi para eluir la muestra. Cuando ladensidad ptica a 280 nm fue menor a 0,025se aplic una gradiente discontinua defosfato en concentraciones comprendidas

entre 5 x 10-4

M y 1 x 10-2

M en tampn dehomogenizacin a pH 6,0; se colectaronfracciones de 5 mL a las que se determinaronactividad enzimtica y densidad ptica a280 nm como en la columna anterior. Lostubos que contenan razonable actividadenzimtica se mezclaron y se llevaron apH 5,0 mediante adicin de cido acticodiluido.

El eluido de la etapa anterior se aplic auna columna de Sulfoetil sephadex C-50(4,0 x 1,1 cm) equilibrada con tampnde homogenizacin, luego se eluy con

una gradiente lineal de NaCl (0,0-0,2 M).De manera similar a la etapa anterior,los tubos que mostraron alta actividadenzimtica se combinaron y se procedia concentrarlos. Este proceso se realizen dos etapas: primero se dializ contrael tampn de homogenizacin y se aplica una columna de sulfoetil sephadex C-50

(4,0-1,1 cm) equilibrada con el tampnde homogenizacin y se eluy con NaCl0,2 M en el mismo tampn, colectndoselas fracciones con elevada actividadenzimtica; luego se someti a un procesode ultraltracin usando presin positivade nitrgeno en un aparato diseado porAmicon Corporation, utilizando para estepropsito el ltro UM 2, a n de concentrarla enzima a un volumen de 3 mL; todas lasetapas de puricacin se realizaron a unatemperatura no mayor de 4 C. Un resumende la puricacin de la enzima se muestraen la tabla 1.


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ETAPA Volumen

(mL)

Protena

total (mg)

Actividad

total

Actividad especfica

unidades/mg

Recuperacin

(%)

Purificacin

(veces)

Homogenizado

Sulfato de amonio 25-60%

Precipitacin a pH 4,5

Sulfato de amonio 70%

Sephadex G-75

SE-Sephadex C-50 (Fosfato)

SE-Sephadex C-50 (NaCl)

970

250

257

90

784

370

172

27.160

11.937

3.860

1.905

131

8

2

400

224

195

163

98

60

40

0,0147

0,01878

0,0506

0,0859

0,7484

7,85

19,2

100

56

48,9

40,9

24,5

15

10,1

1

1,3

3,4

5,8

50,9

534

1.306

TABLA1. PURIFICACINDELAFOSFATASACIDADEBAJOPESOMOLECULARDEHGADODEALPACA

NOTA: LOSDETALLESEXPERIMENTALESSEDESCRIBENENELTEXTO.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

La enzima puricada se someti a unaelectroforesis en gel de poliacrilamidaal 15% con SDS, habindose obtenidouna banda nica. As mismo, se realizuna corrida electrofortica en gel depoliacrilamida al 10% con SDS paradeterminar su peso molecular, para locual se utilizaron estndares de protenasde peso molecular conocido; ello permitiasignar un peso molecular de 16.400daltons para la fosfatasa cida de bajo peso

molecular de hgado de alpaca.Se han identicado dos fosfatasas cidasutilizando la tcnica de cromatografa deexclusin molecular: una fosfatasa cidade alto peso molecular, cuya actividadcorresponde aproximadamente al 30%de la actividad fosfatsica total, y unafosfatasa cida de bajo peso molecularcon una actividad del 70% de la actividadfosfatsica total, esta observacin es similara la descrita para fosfatasas cidas de otrosorgenes (5,6).

La utilizacin del SE-sephadex en dosetapas del proceso de puricacin permitieliminar una gran diversidad de protenasespecialmente cuando se utiliz fosfatoinorgnico para la elusin, y el uso de unagradiente lineal de NaCl en la ltima etapapermiti obtener 2,1 mg de enzima a partirde 250 g de hgado.

La fosfatasa cida ha sido puricada 1.300veces, lo que ha permitido obtener unaenzima homognea a la electroforesis engel de poliacrilamida con SDS; de maneraanloga, la fosfatasa cida de hgado de rata(12) ha sido puricada 350 veces, mientrasque la de hgado humano lo fue 2.580 veces(7); el hecho de que la enzima se hayamostrado homognea a la electroforesis engel de poliacrilamida en presencia de SDSsugiere que es una enzima monomrica.El peso molecular, determinado utilizandouna columna de exclusin molecular fue de16.400, valor que es similar a las fosfatasasde hgado de bovino (5), hgado de cerdo(3), cerebro de bovino (6) y la aislada deplacenta humana (4). La enzima no requierede cofactor alguno para mostrar actividadcataltica, es decir, no necesita de ionesmetlicos ni coenzimas.

Determinacin de Km

Los valores de Km y Vmax utilizando lossustratos p-nitrofenil fosfato y fenil fosfatose determinaron mediante un grco en

doble recproca de acuerdo con el mtodode Lineweaver-Burk (13); dichos valoresse muestran en la tabla 2. El valor Km dela enzima, utilizando como sustrato elp-nitrofenil fosfato, diere de los valoresobtenidos de las fosfatasas cidas dehgado humano (7), hgado de cerdo (3) y lade Fusarium moniliforme (14); esta diferencia


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Sustrato

(2 x 10-3M)

p-nitrofenil fosfato

Fenil fosfato

Glucosa-6-fosfato

Fructosa-6-fosfato

-glicerofosfato

-glicerofosfato

-naftil fosfato

ATP

100,0

78,0

10,0

3,0

1,5

1,3

0,0

0,0

Actividad

relativa (%)

Sustrato Vmx Km Kcat/Km

4,0 x

10-5 M

1,1 x

10-3 M

7,44 x

108 M-1 min-1

2,51 x

107 M-1 min-1

p-nitrofenil

fosfato

Fenil fosfato

22,95 moles de

p-nitrofenol/min/

mg protena

21,15 moles de

fenol/min/mg

protena

tabla2. valoresKm, vmxyKCat/KmdelafosfatasaCIDADEBAJOPESOMOLECULARDEHGADODEALPACA

TABLA3. ESPECIFICIDADDESUSTRATO

NOTA: LAACTIVIDADDELAENZIMASEDETERMINCONFORMESEDESCRIBEENLAPARTEEXPERIMENTAL.

probablemente est vinculada con elcomportamiento cintico de la enzima, yaque esta no es activada por el anin acetato,como ocurre con la fosfatasa cida dehgado bovino (resultados no publicados).As mismo, el valor Km de la enzima cuandose utiliza el fenil fosfato como sustrato, es de

dos rdenes de magnitud mayor que parael p-nitrofenil fosfato, su valor es similar aldescrito para hgado de bovino (5) y cerebrode bovino (6). La velocidad mxima con lossustratos p-nitrofenil fosfato y fenil fosfatoprcticamente tienen el mismo valor, lo queestara sugiriendo la existencia de una etapalimitante en la secuencia cataltica.

de hgado de cerdo (3) y la de cerebro debovino (6); as mismo, la fosfatasa cida dehgado de alpaca y la de hgado humano(7) no hidrolizan el -naftil fosfato. Unamanera ms apropiada para determinar laanidad de la enzima con los sustratos quemuestra preferencial actividad, es utilizando

la relacin Kcat/Km; conforme se observaen la tabla 2, la enzima tiene preferencialaccin sobre el p-nitrofenil fosfato. Es decir,los sustratos sintticos son compuestosque la enzima reconoce e hidroliza conelevada eciencia.

Especicidad de sustrato

La fosfatasa cida muestra una preferenteaccin cataltica frente al p-nitrofenil fosfato,siendo menor su eciencia cuando se usacomo sustrato al fenil fosfato. En la tabla 3puede observarse que su accin catalticafrente a otros sustratos fue mucho menor,tal como sucede con la glucosa-6-fosfatoy fructosa-6-fosfato, compuestos que sonhidrolizados en forma discreta, no teniendoefecto alguno sobre el ATP y a-naftil fosfato.La fosfatasa cida de hgado de alpacamuestra preferencial accin sobre sustratoscon ncleo aromtico como el p-nitrofenilfosfato y en menor grado por el fenil fosfato;en cambio, no muestra actividad algunafrente al a-naftil fosfato, probablementea causa de impedimento estrico. Lossteres fosfato de compuestos aldehdicospolihidroxilados o glcidos no constituyensustratos adecuados, comportamiento muysimilar al observado con la fosfatasa cida

Determinacin del pH ptimo

La determinacin del pH ptimo de laenzima puricada usando como sustratop-nitrofenil fosfato fue de 5,0; mientrasque cuando se us como sustrato al fenilfosfato el pH ptimo fue de 5,2, valores queson muy similares a los descritos para lasfosfatasas de hgado de bovino (5), hgadode cerdo (3), cerebro de bovino (6) e hgadohumano (7).

Efecto de iones metlicos

Los iones metlicos divalentes bajo la formade cloruros se utilizaron con el propsito deobservar sus efectos sobre la actividad dela fosfatasa cida. Los iones Ca2+y Co2+noejercieron un efecto inhibitorio signicativo;en cambio, los iones Mg2+y Ba2+inhibieronligeramente a la enzima, todos ellos a una


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Ninguno

Ca2+

Co2+

Mg2+

Ba2+

Zn2+

Cu2+

Cu2+

Hg2+

Hg2+

-------

1

1

1

1

1

0,025

0,050

0,0001

0,001

100,0

97,2

97,0

91,6

89,7

51,9

49,1

40,0

0,0

0,0

Metal

aadido

Concentracin

10-3M

Actividad

(%)

La inhibicin ejercida por el mercurioindicara que probablemente la cistenasea un residuo muy importante para lacatlisis. Se ha sugerido la presencia deeste aminocido en el sitio activo de lafosfatasa cida de bajo peso molecular dehgado humano (7), enzima que es inhibidapor iodoacetato y iodoacetamida, efectoque es evitado por la presencia de fosfatoinorgnico. Comportamientos similares sehan descrito para las fosfatasas cidas dehgado de cerdo (3) y cerebro de bovino(6). El etilendiamino tetraactico, un agentequelante de metales, no ejerci efectoalguno sobre la actividad de la fosfatasacida de alpaca, lo que indicara que laenzima no requiere metal para su actividad.Es necesario realizar estudios mecansticospara describir de una forma apropiada el rolsiolgico de esta enzima.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Consejo Nacionalde Ciencia y Tecnologa y al Centro deInvestigacin de Bioqumica y Nutricin dela Facultad de Medicina de la UniversidadNacional Mayor de San Marcos por el apoyoconcedido.

concentracin 0,001 M; el Zn2+a la mismaconcentracin inhibi casi un 50%. El Cu2+,a una concentracin 40 veces menor, inhibiaproximadamente un 50%, mientras que elHg2+ inhibi completamente a la enzima auna concentracin 1 x 10-7M, conforme semuestra en la tabla 4.

TABLA4. EFECTODELOSMETALESSOBRELAACTIVIDADENZIMTICA

NOTA: LAACTIVIDADSEMIDIUSANDOCOMOSUSTRATOELP-NITROFENILFOSFATOAPH 5,0. LOSMETALES

SEUTILIZARONBAJOLAFORMADECLORURO.


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EMILIOGUIJAPOMACORRESPONDENCIA: [email protected]

RECEPCIN:17/06/2010ACEPTACIN: 07/07/2010


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OCURRENCIA DE ECTOPARASITISMODEAmblyomma rotundatumKOCH, 1844 (ACARI: IXODIDAE)EN Bufo marinusLINNAEUS, 1758

OCURRENCE OF ECTOPARASITISM OFAmblyommarotundatumKOCH 1844 (ACARI: IXODIDAE) ON BufomarinusLINNAEUS, 1758

Gianmarco Rojas1, 2, German Chvez2, Rafael Alvis 3,4, Jos Pino3, Betty Shiga3


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Ocurrencia de ectoparasitismo deAmblyomma rotundatumKoch, 1844 (Acari: Ixodidae) en Bufo marinusLinnaeus, 1758

RESUMEN

En las instalaciones del Parque Natural deUcayaliubicado a 8 22 59 S, 74 33 0 Wy a una altitud de 149 msnm, en la provinciade Coronel Portillo, Departamento deUcayali, se encontraron 8 especmenesde Bufo marinus, de vida silvestre, de

diferentes tamaos y sexos e infestadoscon garrapatas de uno y otro sexo y endiferentes estados de desarrollo. Todoslos parsitos colectados fueron fijados enalcohol al 70% para su identificacin. Seidentific la garrapata colectada como dela especie Amblyomma rotundatum (Acari:Ixodidae), entre hembras (n = 36), machos(n = 14) y ninfas (n = 14). En ningn frotissanguneo se pudo detectar hemoparsitosintra- ni extraeritrocitarios. La presenciade eritrocitos malformados y la palidez delos rganos internos encontrados durante

la necropsia sugieren cuadros de anemiadegenerativa.

Palabras clave: Ixodidae, Amblyommarotundatum, Bufo marinus, Bufonidae,garrapata.

ABSTRACT

At the Ucayali Natural Park located8 22 59 S, 74 33 0 W, with an altitudeof 149 masl in the province of CoronelPortillo, Ucayali, were found eight wildlifeBufo marinus specimens of different sizesand infested with ticks of both sexes anddifferent stages of development. All theseticks collected were fixed in 70% alcoholfor identification and they were identified asAmblyomma rotundatum (Acari: Ixodidae)species among females (n = 36), males (n =14) and nymphs (n = 14). It was no observedin any smears the presence or intra orextra haemoparasites. The presence ofmalformed red blood cells and the palenessof the internal organs during the necropsy,suggest some degenerative anemia.

Key words: Ixodidae, Amblyommarotundatum, Bufo marinus, Bufonidae, ticks.

INTRODUCCIN

Las garrapatas (Acari: Ixodidae); soncaros de gran tamao (2-30 mm) yectoparsitos hematfagos obligadosen los estados postembrionales de unaamplia gama de vertebrados terrestres yvoladores, algunas lagartijas y serpientesmarinas (Labruna et al. 2002), e incluso loshumanos. Los ixdidos estn considerados

como los ectoparsitos ms importantes

de los animales (1). En el mundo se handescrito cerca de 850 especies, divididasen tres familias: Argasidae, Nuttalliellidaee Ixodidae. La familia Ixodidae se divideen Prostriata y Metastriata: Prostriatacomprende alrededor de 240 especiescorrespondientes al gnero Ixodes;

Metastriata se divide en cuatro subfamilias:A m b l y o m m i n a e , H a e m a p h y s a l i n a e ,Hyalomminae y Rhipicephalinae (2).

La subfamilia Amblyomminae agrupa losgneros Amblyomma y Aponomma (3,4).De las aproximadamente 130 especiesdel gnero Amblyomma (5), la mayorase distribuyen en la regin neotropical yparasitan reptiles y anfibios. Las garrapatasson de gran importancia desde el puntode vista de la salud animal y pblica, yaque son vectores de un gran nmero deenfermedades (6,7,8); La familia Ixodidae

ejerce en el hospedero una accin mecnica.En infestaciones masivas, estas garrapatasocasionan prdida considerable de sangre,inoculacin de toxinas causantes de parlisistemporales (9), debilitamiento y muerte. Lasheridas producidas por las piezas bucalespredisponen a los animales a daosulcerativos en la dermis, mucosas y rganosanexos, que pueden ser posteriormentecolonizados por hongos y bacterias, o alos ataques por Cochlyomia hominivoraxCockerell (Diptera: Calliphoridae), causantede miasis severas (1), as como posibilitar la

entrada de endoparsitos.Tambin ejercen accin de sustraer lassustancias nutritivas del husped, lo quepuede ocasionar anemia severa, y puedenfuncionar como vectores de protozooshemoparsitos como hemogregarinas,filarias, y retrovirus causantes de laenfermedad por cuerpos de inclusin.Las garrapatas son vectores de un mayornmero de microorganismos que cualquierotro taxn, incluso ms que los mosquitos(10).

En la regin neotropical, el gneroAmblyomma ha tomado recientementemayor relevancia, dado que algunasespecies han sido sealadas comovectores de microorganismos rickettsialespatgenos para humanos. Por ejemplo,en Brasil se demostr la presencia deRickettsia rickettsii, agente etiolgico dela fiebre moteada brasilea y Amblyommacajennense como su principal vector.Adems, se demostr en Uruguay lapresencia de Rickettsia conorii y Rickettsia

parkeri, ambas patgenas para humanos, y

Amblyomma triste como su vector principal.


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Gianmarco Rojas, German Chvez, Rafael Alvis Jos Pino, Betty Shiga

FIGURA1.MAPADELPER. DESTACAELdepartamentodeuCayali, dondeseubiCa

ELPARQUENATURAL, READECOLECTA

Estos hallazgos en Latinoamrica han dadogran importancia al estudio de la biologa,epidemiologa y control tanto de estasrickettsias como de sus vectores del gnero

Amblyomma.

Amblyomma rotundatum Koch 1844 es unagarrapata partenogentica que se distribuye

desde Argentina hasta Mxico. Se le haencontrado tambin en Estados Unidos,donde se ha diseminado a travs de unode sus hospedadores ms importantes, elaltamente invasivo Bufo marinus, siendo losreptiles sus otros hospedadores (11).

Bufo marinus (= Chaunus marinus) Linnaeus,1758, es el representante ms grande yms pesado de los sapos de la familiaBufonidae (12). El color crptico de estaespecie puede variar desde el gris hastael marrn, las glndulas partidas estn

muy desarrolladas (13) y debido a su pesoy tamao, no puede realizar movimientosgiles al saltar. A causa de su distribuciny a su interrelacin con otras especies deanfibios que espacialmente tienen el mismoradio de actividad, se convierte en posibletransmisor de agentes patgenos quepudieran manifestarse en otras especiesdebido a la baja inmunidad de estas haciaagentes patgenos forneos.

Los reptiles y anfibios de vida libre y encautiverio son infectados e infestados poruna gran diversidad de endo y ectoparsitos;

sin embargo, no existen reportesdocumentando epizootias asociadascon parasitismo en poblaciones salvajes.Por otro lado, numerosos parsitos sonresponsables de enfermedades y muertesen reptiles en cautiverio (14).

La especie Amblyomma rotundatum Koch,1844, est conformada por garrapatasespecialistas en parasitar la herpetofaunaneotropical, como serpientes, iguanas ycaimanes en Brasil (15, 16,17); as mismo,existen algunos reportes relacionados con

A. rotundatum como el principal agentecausal de parasitosis de anfibios y reptilesen Argentina. En el Per se ha reportadoa Amblyomma rotundatum parasitandoserpientes, lagartijas, tortugas y sapos (18).

El conocimiento de los modelos biolgicosdel parasitismo de garrapatas sobre lavida salvaje es muy til para clarificar losfactores que han permitido que unas pocasgarrapatas sean pestes econmicamenteimportantes y vectores de agentes deenfermedades tanto al hombre como a losanimales. No se dispone de informacin

relacionada con el impacto del parsitosobre la salud de los animales silvestres;es por esto que el presente trabajo estorientado a subsanar en parte dichadeficiencia.

MATERIALES Y MTODOS

rea de colecta

Parque Natural de Ucayali, ubicado a8 22 59 S, 74 33 0 W a una altitudde 149 msnm, en la provincia de CoronelPortillo, Departamento de Ucayali, Per(figura 1).

Colecta

Los sapos fueron capturados manualmente.Para la extraccin de las garrapatas, se tuvocuidado de no maltratar las estructuras dela cabeza para permitir la identificacinde las mismas. Del mismo modo, secolectaron muestras sanguneas de losanimales infestados para la preparacin depreparaciones microscpicas sanguneas.Igualmente, a los sapos que murierondurante el perodo de evaluacin, se les hizo


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FIGURA2. BUFOMARINUSPARASITADOPORAMBLYOMMAROTUNDATUM(FLECHA)

FOTO: GIANMARCOROJAS.

una diseccin anatmica a fin de evaluar losrganos internos.

Procesamiento de las muestras

Las garrapatas colectadas fueron fijadas yconservadas en alcohol al 70%. Se sigui laclave dicotmica de Arago y Fonseca (19)

y las de Voltzit (11) para la identificacin delos especmenes.

Se obtuvieron preparaciones microscpicasde sangre por cada individuo y se dejaronsecar al aire; posteriormente, fueronfijadasen metanol absoluto por 10 minutos yteidas con el colorante May-Gruwald-Giemsa 2% por 15 minutos. Se observaronen un microscopio ptico de campo claroCarl Zeiss Jena, modelo Amplival y lasfotos se obtuvieron mediante una cmaradigital Canon S50 con adaptador para elmicroscopio.

Las muestras fueron analizadas en elLaboratorio de Reproduccin y Biologade Desarrollo de la Facultad de CienciasBiolgicas de la Universidad NacionalMayor de San Marcos, Lima-Per.

RESULTADOS

Se colect un total de 8 especmenes de B.marinusentre hembras (n = 3) y machos (n= 5). Se contabilizaron en total 64 parsitosentre hembras (n = 36), machos (n = 14)y ninfas (n = 14), con una media de cargaparasitaria de 8 4 parsitos por animal.

Todas las garrapatas se hallaron en el dorsodel husped, principalmente entre las bolsaslinfticas o entre las criptas epidrmicasdel tegumento (figura 2), y se identificaroncomo Amblyomma rotundatumKoch, 1844(Acari: Ixodidae).

Las caractersticas morfolgicas msresaltantes encontradas para los ejemplares

deA. rotundatum son:Hembra: i) dos espinas sobre los metatarsosII al IV, ii) trocnteres sin espinas, iii)coxa I con dos espina iguales, coxa I conuna callosidad anterior aguda y coxa IIcon espinas muy reducidas, iv) escudoampliamente ornamentado con reas clarasy marrones, v) surco marginal completolimitando los festones.

Macho: i) coxa I-IV con dos espolonescortos, ii) coxa II-IV con un espoln

externo grande, iii) coxa II y III sinespolones, iv) apertura genital situado entre

la coxa II, v) trocnteres sin espinas, vi)escudo ornamentado con parches naranjasiridiscentes.

Los animales parasitados presentaban unacondicin corporal de psima a regular; serealiz la necropsia en tres especmenesy, comparndolas con los especmenesno parasitados, se destac una palidezanormal bien marcada de las mucosas yserosas, as como tambin del corazn ydel hgado (figura 3).


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FIGURA3. PALIDEZVISCERALENBUFOMARINUSPARASITADOPORAMBLYOMMAROTUNDATUM(FLECHA)

FOTO: GIANMARCOROJAS.

FIGURA4. ERITROCITOFUSIFORME(FLECHA) OBSERVADOENFRTICESDESANGREPERIFRICADEBUFOMARINUSPARASITADOPORAMBLYOMMAROTUNDATUM.ColoraCinmay-gruwald-giemsa. 400x

FOTO: RAFAELALVIS.

Al observar las preparaciones microscpicas de sangre, destac una alteracin en lamorfologa tpica de los eritrocitos de B. marinus, presentando una forma fusiforme atpica(figura 4). No fueron observados hemoparsitos en las clulas sanguneas ni tampoco fuerade ellas.


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DISCUSIN

En el Per, el estudio de esta especie deectoparsitos de animales silvestres no hatenido la importancia sanitaria que amerita,por lo que no se encuentran reportesde trabajos similares en el pas. Se sabepoco acerca de las relaciones entre las

garrapatas de la familia Ixodidae y sushuspedes en Sudamrica (7), por eso esrelevante conseguir informacin precisa atodo nivel. Los reportes de A. rotundatumparasitando reptiles o anfibios son muyescasos, destacando entre estos los deNeed et al. (18).

Se ha sugerido que las garrapatas jueganun rol importante en regular las poblacionesnaturales de sapos en las regiones tropicaly subtropicales del nuevo mundo (20). Lamayora de los Bufnidos poseen hbitats

terrestres (21), y algunas especies como B.marinustienen un alto grado de agrupacininterespecfica. Esta caracterstica puedefavorecer altos niveles de infestacionespor garrapatas (22). Si esto es verdadero,estos parsitos podran tener un valor comoagente de control biolgico para los saposgigantes, cuyas poblaciones se hanexpandido dramticamente en los ltimosaos (23,20).

Lampo y Bayliss (24) analizaron los patronesde distribucin de especies deAmblyommaen B. marinus de Venezuela y Brasil, y

demostraron que los niveles de agrupacinde la garrapata disminua con la intensidadmedia de la infeccin y la alta prevalenciae intensidad de la infeccin sobre loshuspedes.

En cuanto a las preferencias de infestacin,no existe relacin entre el sexo del huspedy la prevalencia parasitaria. La infestacinde la garrapata solo en la porcin dorsal deB. marinuspodra deberse a adaptacionesdel parsito, especialmente por suspreferencias entre pliegues epidrmicos o

bolsas linfticas o en reas en que no puedeser retirado o comido por el husped. Noexisten referencias con las cuales se puedadiscutir esta hiptesis, ya que la mayora deautores solo menciona que las garrapatasfueron encontradas en el cuerpo delhusped, sin precisar lugar o causal.

Los ndices de infestacin verificados paraB. marinusen el presente estudio, con unaintensidad media de 8,0 garrapatas/sapo

son cercanos a los encontrados por Woehl(23), que encontr 7,4 garrapatas/sapoen Bufo ictericus, a diferencia de Lampo yBayliss (24), quien encontr en B. marinusuna intensidad media de infeccin de 2,48garrapatas/sapo. Esto puede ser explicadoen funcin de los hbitos alimenticios y

de abrigo que comparten las garrapatasy los sapos, donde las condiciones demicrohbitats son ms favorables (23).

Por otro lado, Twersky et al.(25) indujeronanemia en especmenes de Xenopusadultos con fenilhidrazin, encontrando a los7-9 das postratamiento eritrocitos con losextremos en forma de punta (fusiformes),sugiriendo que este morfotipo correspondea un estado celular de la eritrognesisde un anfibio. Nosotros, al observar estaforma celular en los sapos infectados y lapalidez de los rganos internos, podemos

sugerir que A. rotundatum causara uncuadro de anemia regenerativa, que es unacaracterstica de una respuesta a prdidasde sangre crnicas o prolongadas.

A pesar de que las garrapatas de distintasespecies son consideradas como vectoresde hemoparsitos en diferentes animales,en este caso no se pudo detectar ningunoen las preparaciones de sangre de losanimales colectados. Entre las referenciasencontradas, tenemos: tortugas (26),saurios (27) y serpientes (28,29).

CONCLUSIONES

La infestacin de Bufo marinus porAmblyomma rotundatum provocaaparentemente una anemia regenerativa,caracterizada por la presencia de eritrocitosfusiformes. Sin embargo, en animalesinmunodeprimidos o en condicionesambientales inadecuadas puede llegar acausar la muerte del hospedero.

Se necesitan estudios complementariospara describir los posibles patgenos que

podran utilizar aA. rotundatum como vectorde transmisin entre hospederos.

AGRADECIMIENTOS

Al personal del Parque Natural de Pucallpa,en particular el apoyo de Manuel Grillo, a laBlga. Lizette Bermdez, y a la M.V SibylleDuran por su apoyo en la colecta de algunosde los especmenes estudiados.


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GIANMARCOROJASCORRESPONDENCIA: [email protected]

RECEPCIN: 24/06/2010ACEPTACIN: 25/08/2010


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LA INTEGRACIN DE LA SALUD Y ELAMBIENTE EN LAS POLTICAS PBLICAS:EVITANDO LA CONTAMINACIN DEL AIREHEALTH AND ENVIRONMENTAL INTEGRATION IN PUBLICPOLICIES: PREVENTING AIR POLUTION

Mariano Castro Snchez-Moreno*

* UNIVERSIDADCIENTFICADELSUR. FACULTADDEDERECHO.

ARTCULOSDE REVISIN


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La integracin de la salud y el ambiente en las polticas pblicas: evitando la contaminacin del aire

RESUMEN

El ambiente provee servicios para el bienestary desarrollo de la sociedad. Siendo el aire unode sus componentes fundamentales, exigeque lo cuidemos. En los ltimos aos en elPer se han registrado avances y retrocesosen el desempeo de la gestin pblicay privada. El texto presenta la recienteevolucin de este desempeo y muestra losretos de la integracin y coordinacin entrelas principales polticas pblicas.

Palabras clave: calidad del aire, saludpblica, derecho ambiental, poltica pblica.

ABSTRACT

The environment provides services forsocietys development and well-being. Asthe air is one of its key components, it isan obligation to take care of it. In recentyears, in Peru there h

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